Una volta recuperato il pellet vengono aggiunti 2 ml di HBSS ( Hank’s Balanced Salt Solution ) per mantenere il PH e l’osmolarità fisiologica delle cellule, da questa sospensione vengono presi 10 µL, diluiti 1:10 oppure 1:100 in PBS + Trypan Blu 0.2% e viene fatta la conta dei neutrofili utilizzando la camera di Burker. Il numero di cellule della sospensione viene ottenuto mediante questa formula:
N°cellule = Media conta di tre campi x Fatt. dil x 104 x Vol. sospens
Dove Fatt. dil rappresenta il fattore di diluizione della sospensione nel Trypan Blu ed è uguale ad 1:10 o 1:100; Vol sospens rappresenta il volume di HBSS nel quale sono risospese le cellule prima della conta, in genere pari a 2 ml.
A questo punto i neutrofili così ottenuti possono essere indotti a produrre NET e studiati mediante immunofluorescenza oppure utilizzati per ottenere NET che verranno recuperati per stimolare i monociti e/o i linfociti ottenuti dal sangue di pazienti AR ACPA positivi.
Trattamento dei neutrofili per l’analisi dei NET mediante Immunofluorescenza
I neutrofili vengono piastrati a 300.000 cellule per pozzetto in 100µL/pozz in una piastra da coltura cellulare da 24 nella quale erano stati precedentemente sistemati dei vetrini rotondi dal diametro di 12 mm. La piastra viene incubata per 30 minuti a 37 C°, per lasciar stratificare le cellule sul vetrino. A questo punto si procede con la stimolazione, in un volume finale di 300 l, seguendo questo schema:
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Immediately fixed: questo campione serve ad analizzare la tendenza alla produzione spontanea di NET che hanno i neutrofili. Al termine del periodo di 30’ vengono rimossi i 100 µL di HBSS e le cellule vengono fissate 300 µL di paraformaldeide 4% in PBS (PFA 4%) che viene lasciata agire per 10 minuti RT. Viene quindi rimossa la PFA e viene fatto un lavaggio con 500 µL di D-PBS ed il vetrino viene poi lasciato in D-PBS overnight.
PMA 100 nM: questo campione rappresenta il controllo positivo, dato che la PMA (estere del
forbolo) è considerato il più potente induttore di NET. La PMA viene incubata in HBSS in presenza di CaCl2 2 mM, elemento necessario per l’attivazione delle via di signalling
intracellulare che portano alla formazione dei NET
Blank: rappresenta il controllo “negativo” o almeno il controllo di produzione di NET
spontanei, nel periodo di incubazione.
SN B95-a: i neutrofili vengono incubati con il SN B95a ottenuto come descritto sopra, diluito
1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
EBV Pellet: i neutrofili vengono incubati con il campione di “EBV pellet” ottenuto come
descritto sopra, diluito 1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
Mock EBV: i neutrofili vengono incubati con il campione di “Mock” ottenuto come descritto
sopra, diluito 1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
Mock SN fibroblasti: i neutrofili vengono incubati con il campione di “Mock HDF” ottenuto
come descritto sopra, diluito 1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
La piastra con gli stimoli viene lasciata ad incubare per 3 ore a 37 C°, dopo di che i pozzetti vengono lavati con 300µL di D-PBS e vengono poi fissati con 300µL di PFA 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine dopo aver rimosso la PFA ed aver fatto un lavaggio con D-PBS, i pozzetti vengono lasciati in 300µL di D-PBS overnight.
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Trattamento dei neutrofili per la produzione di NET da usare per lo stimolo di monociti e linfociti.
I neutrofili vengono piastrati a 2.000.000 cellule per pozzetto in 600µL/pozz in una piastra da coltura cellulare da 6 pozzetti. La piastra viene incubata per 30 minuti a 37 C°, per lasciar stratificare le cellule sul fondo del pozzetto. A questo punto si procede con la stimolazione, in un volume finale di 1800 l, seguita dal trattamento con DNAse I che agendo sulle fibre di cromatina dei NET libera le proteine rilasciate dai neutrofili durante tale processo. Nell’esperimento
abbiamo seguito questo schema:
NET spontanei: questo campione serve a analizzare la tendenza alla produzione spontanea di NET che hanno i neutrofili. Al termine del periodo di 30’ vengono rimossi i 600 µL di HBSS e le cellule vengono trattate con DNasi I 100 U/ml in PBS + CaCl2 2mM per 20 minuti a 37°C. Al termine di questo periodo di incubazione l’attività della DNAsi I è bloccata mediante aggiunta di EDTA 5mM ed i NET ottenuti vengono recuperati. Si recupera poi il surnatante del pozzetto da utilizzare per la stimolazione delle B memory e dei monociti.
PMA 100 nM: controllo positivo del test; la PMA viene incubata in HBSS in presenza di
CaCl2 2 mM, elemento necessario per l’attivazione delle via di signalling intracellulare che
portano alla formazione dei NET
Blank: rappresenta il controllo “negativo” o almeno il controllo di produzione di NET
spontanei, nel periodo di incubazione.
SN B95-a: i neutrofili vengono incubati con il SN B95a ottenuto come descritto sopra, diluito
1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
EBV Pellet: i neutrofili vengono incubati con il campione di “EBV pellet” ottenuto come
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Mock EBV: i neutrofili vengono incubati con il campione di “Mock” ottenuto come descritto
sopra, diluito 1:2 in HBSS, in presenza di CaCl2 2 mM
La piastra con gli stimoli viene lasciata ad incubare per 3 ore a 37 C°, dopo di che i neutrofili vengono trattati con DNasi I 100 U/ml per 20 minuti a 37°C ed EDTA 5 mM.
Il surnatante così ottenuto, contenente i NET rilasciati da
i neutrofili, è stato centrifugato a 400g per 15’ per eliminare detriti cellulari. I NET sono stati quindi utilizzati per la stimolazione dei monociti.
6.4 Immunofluorescenza
L’analisi dei NET prodotti dai neutrofili ottenuti da 5 soggetti sani e da 5 AR è stata fatta mediante immunofluorescenza. Al termine dell’incubazione overnight della piastra da 24 il D-PBS è stato rimosso da ogni pozzetto e i vetrini sono stati saturati mediante aggiunta di tre gocce di Protein block Dako per ogni pozzetto e lasciato agire per 10 minuti. Successivamente i vetrini sono stati incubati per 1 ora a RT con un anticorpo primario anti-MPO (Polyclonal Rabbit Anti-Human Myeloperoxidase) diluito 1:300 in Antibody Diluent Dako. Successivamente viene rimosso il primario e vengono fatti tre lavaggi da 5 minuti in PBS. Viene poi aggiunto l’anticorpo secondario un Goat anti-RabbitigG (H+L) (AlexaFluor Plus 488) sempre in un rapporto 1:300 in Antibody diluent, e la piastra viene incubata a RT per un’ora al buio, in modo da non sottoporre il fluorocromo legato all’anticorpo secondario all’azione della luce. I pozzetti post incubazione vengono lavati con PBS, in totale tre lavaggi da 5 minuti l’uno, e successivamente viene aggiunto il DAPI (4-6 diamidin-2-fenilindolo) un colorante organico fluorescente che lega fortemente regioni del DNA ricche di A-T. Il DAPI viene aggiunto in un rapporto 1:5000 in PBS, 300µL a pozzetto per 10 minuti incubando sempre la piastra al buio per evitare esposizione alla luce. Successivamente vengono fatti tre lavaggi con PBS da 5 minuti, a questo punto vengono
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recuperati i vetrini e posizionati su vetrini portaoggetti dopo aver dispensato una goccia di Mounting medium; vengono lasciati poi a seccare overnight. I vetrini verranno poi visualizzati con il microscopio ottico a fluorescenza Olympus.
In alcuni casi i neutrofili stimolati secondo lo schema descritto precedentemente sono stati incubati con un anticorpo anti cleaved caspase 3, al posto dell’anti-MPO. Questo serve a verificare che gli stimoli utilizzati non inducano attivazione dei processi di apoptosi delle cellule. I numerosi stimoli capaci di indurre apoptosi convergono, infatti, nel taglio della caspasi 3 a claved caspase 3, che rappresenta quindi un ottimo controllo di induzione di apoptosi.
Per questo tipo di valutazione i neutrofili sono stati incubati anche con Cicloesimide 1 g/ml + TNF-alfa 100 ng/ml, potente induttore di apoptosi per i neutrofili, che rappresenta quindi il controllo positivo dell’esperimento.