Studio della funzionalità dei linfociti B.
Per l’analisi della memoria immunologica B, i PBMC purificati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio sono stati trattati con diversi stimoli, al fine di indurre attivazione specifica dei linfociti B di memoria e loro differenziazione a cellule secernenti anticorpi. I PBMC sono stati messi in coltura in piastre da 96 pozzetti, 150.000 cellule/pozzetto in 200 µl/pozzetto di RPMI completo, 10% FCS suddividendo la piastra tra le seguenti condizioni
Nessun stimolo
CpG ODN-2006 (MicroSynt) (2,5µg/ml) che agisce sui recettori TLR-9 e IL2 (500U/ml) che mima lo stimolo da parte dei linfociti T.
CpG ODN-2006 (2,5µg/ml), Pansorbin-StaphA (1:10000) un estratto di cellule di Staphilococcus aureus uccise al calore che agisce su numerosi recettori TLR e PokeweedMitogen (PWM) (1µg/ml), che conferisce una attivazione generale di linfociti T e monociti.
Le colture così allestite sono state lasciate nell’incubatore a 37°C e CO2 5% per 15 giorni al termine dei quali sono stati recuperati i surnatanti e congelati a -70°C.
Studio della funzionalità T
Per l’analisi della funzione T, i PBMC (3 x 105
cellule/pozzetto) sono stati messi in coltura in piastre da 48 pozzetti, per 5 giorni a +37°C, 5%CO2 in RPMI completo addizionato con Human Serum 5% e in tre condizioni differenti:
Nessun stimolo
Fitoemoagglutinina (PHA), una lectina derivata dal Phaseulus vulgaris, capace di agire cross legando diverse proteine di membrana attraverso i loro residui glicosilati ed inducendo in questo modo attivazione e proliferazione cellulare.
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Pansorbin-StaphA (1:10000) che svolge la sua azioni attraverso il legame ai numerosi TLR espressi sui linfociti T, in particolar modo attraverso il TLR2.
Le colture così allestite sono state lasciate nell’incubatore a 37°C e CO2 5% per 5 giorni, i surnatanti sono stati prelevati al giorno 1, al giorno 3 ed al giorno 5, dall’inizio della stimolazione e poi congelati a -70°C fino al momento del dosaggio di specifiche citochine.
Test ELISA per la determinazione delle citochine nei surnatanti di coltura
Abbiamo valutato nel supernatante dei PBMC attivati con PHA e/o con StaphA, la concentrazione delle seguenti citochine: IL-2, IL-5, IL-10, INF-gamma e TNF-alfa mediante Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) sandwich. Sono stati utilizzati kit per ogni singola citochina (R&D System). I kit in questione forniscono due anticorpi specifici per la citochina da analizzare: un anticorpo monoclonale, che viene immobilizzato sulla piastra e serve per “la cattura” della citochina presente nel surnatante di coltura, ed un antisiero policlonale coniugato con la biotina, che serve per la rilevazione della citochina catturata dal monoclonale. Nel kit è fornita anche la citochina ricombinante che viene usata per la costruzione di una curva standard che permette l’analisi quantitativa della citochina nei campioni in studio.
Determinazione anticorpi anti ds-DNA
Per la determinazione di questi anticorpi nel siero dei pazienti e nei surnatanti di cellule in coltura si procede mediante la preparazione di piastre Costar half well area nel seguente modo. Come prima operazione si procede al precoating con 25 μl pozzetto di poly-Lys diluita a 50μg/ml in PBS sia nelle piastre che verranno coatate con il ds-DNA che in quelle non coatate che rappresenteranno il controllo. Una volta depositato il precoating si incuba il tutto per 45 minuti a temperatura ambiente in agitazione. Al termine di questo si procede alla rimozione della poly-Lys in eccesso tramite svotamento della piastra e lavaggi con TBS a 75 μl/pozzetto. Successivamente si prepara il coating diluendo il ds-DNA a 20 μg/ml in TBS, EDTA 10 mM e si dispensa 25 μl/pozzetto di questa soluzione. Nella piastra che verrà impiegata come controllo viene dispensato solo TBS, EDTA 10mM. Le piastre vengono incubate a 4°C per tutta la notte. Al termine dell'incubazione si eseguono due lavaggi con 75μl/pozzetto di TBS. Dopo questa operazione si procede alla procedura
48 di post coating con 25μl/pozzetto di Acido Poly-Glutammico diluito a 50μg/ml in TBS, EDTA 10 mM sia nella piastra coatata con il ds-DNA che nella piastra non coatata che funge da controllo. Si incubano le piastre 45 minuti a temperatura ambiente in agitazione. Al termine si ripetono i lavaggi sopracitati e si procede alla saturazione di tutti i pozzetti con 50 μl di PBS BSA 3% incubando le piastre per 45 minuti in agitazione a temperatura ambiente. Al termine della fase di saturazione i sieri del paziente in analisi e dei controlli diluiti 1:250 in PBS BSA 1% Tween-20 0,05% ed i surnatanti delle colture indiluiti vengono dispensati nella piastra a 25 μl/pozzetto. Le piastre vengono quindi incubate per 3 ore a temperatura ambiente in agitazione. Terminata questa operazione si procede a 3lavaggi di cui uno con 75μl di PBS Tween-20 1% e due con 75μl di PBS 1X. Si procede successivamente all'incubazione di 25μl/pozzetto di anticorpo secondario anti- human IgG coniugato alla fosfatasi alcalina diluito 1:3000 in PBS BSA 1% Tween-20 0,05% e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 2,5 ore. Al termine si eseguono i lavaggi gia citati con PBS Tween-200,05% e PBS 1X e si procede allo sviluppo. Questa operazione si esegue con una soluzione di paranitro-fenil-fosfato (PNPP - substrato cromogeno della fosfatasi alcalina) in tampone carbonato a cui e stato aggiunto MgCl2 1M come catalizzatore dell'enzima. La lettura si esegue alla lunghezza d'onda di 405 nm.
Determinazione degli anticorpi anti-C1q
Per la ricerca di questi autoanticorpi si impiegano piastre Costar half well area coatate con25μl/pozzetto di C1q diluito a 20μg/ml in tampone carbonato e si lascia incubare over night a 4°C.
Il mattino seguente si eseguono 3 lavaggi con 75 μl di PBS Tween-20 0,05% per eliminare l'eccesso di antigene che altrimenti interferirebbe con l'analisi. Terminati i lavaggi si procede a caricare in duplicato 25μl di siero del soggetto in esame e dei controlli diluiti 1:25 in PBS FCS 1% Tween- 200,05% NaCl 1M e dei surnatanti indiluiti. La piastra viene quindi incubata a 37°C per 1 ora. Terminato ciò si ripetono i lavaggi gia citati e si procede a piastrare 25μl di anticorpo secondario anti-human IgG coniugato a fosfatasi alcalina diluito 1:3000 in PBS Tween-20 0,05% e si incuba 3ore a temperatura ambiente in agitazione. Terminata l'incubazione si procede nuovamente ai lavaggi e una volta terminati si procede allo sviluppo con (PNPP), il substrato cromogeno della fosfatasi alcalina. La lettura si esegue alla lunghezza d'onda di 405 nm.
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Ricerca anticorpi anti-peptidi citrullinati (ACPA) nei pazienti con AR
La ricerca degli ACPAè stata eseguita con una metodica immunoenzimatica in cui piastre ELISA (Nunc Maxisorp Denmark) sono state caricate con diversi peptidi sintetici corrispondenti a sequenze derivate da proteine dell’Epstein Barr Virus oppure a sequenze derivate dall’istone H4 in cui tutte le arginine sono state sostituite con citrulline, tutti diluiti a 5μg/ml in PBS o tampone Sodio Carbonato/Bicarbonato 50mM. Le piastre sono poi state bloccate con PBS BSA3% e i sieri, diluiti 1/200 in PBS, BSA1%, Tween-20 0.05%, sono stati incubati a temperatura ambiente per tre ore. Sono stati effettuati un lavaggio con 150 μl PBS, Tween-20 1%, e due con 150 μl di PBS, ed e stato caricato l’anticorpo secondario anti-Human-IgG coniugato alla fosfatasi alcalina, diluito 1:3000 nello stesso tampone di diluizione dei sieri, e incubato per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo lavaggi effettuati come in precedenza, e stato aggiunto (PNPP), il substrato cromogeno della fosfatasi alcalina, e le piastre sono state lette a 405 nm.
I risultati sono stati espressi in percentuale rispetto ad un controllo positivo molto alto a cui viene attribuito arbitrariamente il valore di 100.
Il cut off è stato definito studiando una popolazione di soggetti di controllo (NHS) e calcolato al 97.5° percentile di tale popolazione.
Analisi statistica
Per lo studio statistico e’ stato utilizzato il Software GraphPad ed il programma GraphPad Prism 5 per l’ analisi dei dati. I valori delle citochine (gruppo di controllo verso trattamenti con PHA e StA) al giorno 1, 3 e 5 sono stati analizzati mediante il test one-way ANOVA con successivo Turkey’s Test. La probabilità inferiore a 0.05 e’ stata considerata statisticamente significativa.
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RISULTATI
Tipizzazione ed Analisi della funzionalità T in pazienti con IDCV
In una prima fase del lavoro, le sottopopolazioni linfocitarie T circolanti sono state analizzate mediante citometria a flusso (FACS) utilizzando specifici antisieri marcati con fluorocromi e studiando le % di: Linfociti T Totali CD3+, Linfociti T CD4+, Linfociti T CD4+ central memory (CM), Linfociti T CD4+ effector memory (EM), Linfociti T CD4+ naive, Linfociti T CD4+ terminally differentiated (TEMRA), Linfociti T CD8+, Linfociti T CD8+ CM, Linfociti T CD8+ EM, Linfociti T CD8+ naive, Linfociti T CD8+ TEMRA.
Sono stati analizzati i profili di 18 pazienti con IDCV e di 11 controlli sani: nelle figure 1 e 2, sono riportati i grafici con i valori di cellule/mcl rilevate al citofluorimetro.
In generale, il numero di linfociti T dei pazienti con IDCV è nel complesso normale.
Come possiamo osservare dai grafici seguenti, non si osservano differenze statisticamente significative tra IDCV e NHS nelle diverse sottopopolazioni di linfociti T, anche se l’eterogeneità all’interno dei due campioni di soggetti è notevole.
Ci sono infatti all’interno della popolazione di IDCV, pazienti con valori molto alti dei vari parametri e pazienti con valori molto bassi.
Una analisi più approfondita dimostra che si tratta di pazienti sempre diversi. Inoltre una valutazione più accurata di parametri clinici che possano spiegare tale eterogeneità non ha rilevato alcuna possibilità stratificazione dei pazienti per subset di malattia che possa dare conto dell’eterogeneità nei grafici.
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52
Figura 4. Analisi al FACS delle sottopopolazioni di linfociti T, in particolare di linfociti T CD8+
53 analizzando le citochine prodotte nel surnatante di coltura a diversi tempi ed inseguito a diversi stimoli. Tale studio è stato effettuato su n=13 pazienti affetti da IDCV e su 5 soggetti sani.
I PBMC purificati da sangue periferico sono stati stimolati con PHA (Phyto Hemo Agglutinine) e Staph.A-Pansorbin (StA), incubati a 37°; il sopranatante è stato raccolto a 1 (T1), 3 (T2) e 5 (T3) giorni e congelato. Successivamente i sopranatanti sono stati saggiati con metodica ELISA a sandwich per la produzione di IL-2, IL-5, IL-10, TNF-alfa e IFN-gamma.
Contemporaneamente sono stati analizzati 5 soggetti di controllo, scelti tra personale di laboratorio, i PBMC dei quali sono stati trattati come sopra descritto. La tabella seguente indica i valori di citochine rilevati nei surnatanti delle colture dei PBMC dei pazienti e dei controlli sani (NHS).
T1
RPMI PHA St.A
NHS IDCV NHS IDCV NHS IDCV
IL-2 0,64 ± 1,30 21,44 ± 17,46 17,63 ± 28,85 55,62 ± 100,1 1,19 ± 1,56 25,55 ± 21,24 IL-5 10,45 ± 6,75 50,52 ± 36,55 28,23 ± 17,63 66,80 ± 99,56 13,69 ± 4,81 52,36 ± 36,55 IL-10 47,47 ± 34,16 97,1 ± 131,4 106,7 ± 40,3 275,1 ± 481,7 225,3 ± 207,1 132,4 ± 116,8 IFN-gamma 10,55 ± 20,92 3,72 ± 7,98 58,78 ± 49,64 559,3 ± 631,9 57,46 ± 21,39 68,08 ± 204,6 TNF-alfa 199,2 ± 195,5 50,26 ± 39,31 1040 ± 615,2 1082 ± 878,3 1645 ± 1133 557,1 ± 522,3 T2
RPMI PHA St.A
NHS IDCV NHS IDCV NHS IDCV
IL-2 0,05 ± 0,02 22,58 ± 16,55 2,69 ± 4,88 30,27 ± 38,73 3,01 ± 6,41 27,59 ± 23,25 IL-5 5,30 ± 4,55 49,63 ± 33,69 24,55 ± 15,52 57,61 ± 71,51 6,81 ± 4,80 52,90 ± 34,18 IL-10 31,88 ± 26,7 74,5 ± 44,8 134,7 ± 146,8 332,8 ± 519,4 229,1 ± 229,9 151,4 ± 167,3 IFN-gamma 6,32 ± 11,47 14,29 ± 27,49 78,54 ± 99,41 1071 ± 578,8 70,62 ± 90,54 141,2 ± 240,3 TNF-alfa 196 ± 202,5 42,69 ± 24,27 1219 ± 613,7 1075 ± 880,3 1716 ± 1164 587,1 ± 536,4 T3
RPMI PHA St.A
NHS IDCV NHS IDCV NHS IDCV
IL-2 5,65 ± 8,27 34,68 ± 69,50 4,33 ± 5,01 33,62 ± 65,21 2,77 ± 4,61 22,75 ± 16,32 IL-5 8,88 ± 13,34 50,54 ± 36,16 32,28 ± 19,34 63,23 ± 61,50 12,41 ± 13,81 49,36 ± 31,62 IL-10 56,55 ± 59,7 70,1 ± 31,5 145,2 ± 92,4 288,1 ± 480,4 283,1 ± 281,4 120,4 ± 83,5 IFN-gamma 30,02 ± 45,53 4,99 ± 14,38 102,5 ± 72,35 947,2 ± 584,7 94,92 ± 92,70 319,2 ± 640,5
TNF-alfa 186,8 ± 256,2 146,4 ± 302,2 1122 ± 534,7 949,2 ± 766,7 1760 ± 883,5 639,3 ± 669,7
Tabella 5. Livelli medi delle citochine misurate nella popolazione degli pazienti con IDCV e dei controlli
54 Analizzando i grafici e la tabella riassuntiva citochina per citochina osserviamo che:
IL-2: i pazienti con IDCV rispondono molto bene agli stimoli sia al T2 che al T3. Nel caso dei
soggetti di controllo osserviamo un picco con PHA al T1, dopo di che non si osserva produzione della citochina ai tempi successivi
IL-5: la produzione di questa citochina segue lo stesso pattern nei pazienti e nei controlli, in termini
di risposta agli stimoli; in termini di quantità di citochina prodotta, i pazienti con IDCV hanno una capacità di produzione più elevata rispetto ai controlli.
IL-10: in questo caso si osserva un notevole aumento di produzione di IL-10 in risposta allo stimolo
con PHA nei pazienti con IDCV: la quantità di citochina prodotta è in genere 2-3 volte più alta che nei controlli. Questo comportamento altera la stratificazione dei pazienti in relazione agli stimoli. I soggetti di controllo infatti hanno una risposta alla StA maggiore che alla PHA, mentre nei pazienti con IDCV è vero il contrario.
IFN-gamma: anche in questo caso, i pazienti con IDCV sono capaci di rispondere ai due diversi
stimoli in modo più elevato. Infatti, la PHA induce la produzione di IFN-gamma in media 6-10 volte maggiore che nei controlli; la StA, risulta più elevata al T3 nei pazienti che nei controlli, ma la differenza è decisamente minore che nel caso della PHA.
TNF-alfa:dal punto di vista della risposta agli stimoli, entrambi i gruppi – pazienti IDCV e soggetti
sani – sono in grado di produrre TNF-alfa ad elevate concentrazioni. Quello che si nota è l’inversione del comportamento in risposta a stimoli diversi: infatti, i soggetti di controllo rispondono più alla StA, mentre i pazienti producono più TNF-alfa dopo stimolo con PHA. Il comportamento nei tre tempi è, invece, pressoché identico.
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Figura 5. Analisi della produzione di IL-2, IL-5 e IL-10 nei surnatanti di PBMC di pazienti con IDCV e di soggetti di controllo.
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Figura 6. Analisi della produzione di IFN-gamma e TNF-alfa nei surnatanti dei PBMC di pazienti con IDVC e di soggetti di controllo
Tipizzazione ed Analisi della funzionalità B in pazienti con IDCV
L’analisi in citometria a flusso (FACS) per una tipizzazione fine delle sottopopolazioni dei linfociti B è stata effettuata utilizzando specifici antisieri marcati con fluorocromi e studiando le % di: linfociti B totali, linfociti B naive, linfociti B attivati (CD21low), linfociti B della zona marginale (MZ), linfociti B transazionali, linfociti B di memoria (SM), plasmablasti.
57 Sono stati analizzati i profili di 18 pazienti con IDCV e di 11 controlli sani: nella figura 5, sono riportati i grafici con i valori di cellule/mcl rilevate al citofluorimetro.
In questo caso, possiamo innanzitutto notare che esiste una differenza statisticamente significativa tra numero di linfociti B circolanti nei soggetti di controllo e numero di linfociti B circolanti nei pazienti con IDCV (p=0.02).
Tale differenza si perde nell’analisi di alcune sottopopolazioni (linfociti B attivati, linfociti B naive, linfociti B transazionali) mentre si mantiene nel caso dei linfociti B della zona marginale (p=0.005), dei linfociti B di memoria (p= 0.0002) e dei plasmablasti (p=0.02).
Anche nel caso di questa analisi ci sono sia tra i pazienti che tra i controlli soggetti che mostrano valori molto elevati, decisamente lontani dalla media dei valori. Anche in questi casi, però, una analisi più approfondita di dati clinici in nostro possesso non ha permesso di comprendere il perché di questi valori o di definire sottogruppi specifici.
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Figura 7. Analisi dei livelli di subset di linfociti B nei pazienti con CVID e nei soggetti sani (HC). I valori sono espressi in n°cellule/mcl. Per ogni grafico sono riportati anche i valori di p derivanti dall’analisi statistica.
59 La funzionalità delle cellule B, in particolar modo lo studio approfondito della memoria cellulare B è stato effettuato in 9 pazienti con IDCV e in 11 controlli sani.
I PBMC purificati da sangue periferico sono stati messi in coltura in differenti condizioni: senza alcun stimolo, stimolati con CpG e IL-2, stimolati con CpG, StA e PWM.
Le cellule sono state lasciate 14 giorni in coltura e al 14° giorno i surnatanti sono stati prelevati e congelati a -70°C.
La produzione di anticorpi totali di classe IgG e di anticorpi specifici per antigeni vaccinali (FluA) è stata misurata mediante test ELISA.
Nel test sono stati analizzati un minimo di 30 pozzetti per stimolo. Sono stati considerati come positivi i pozzetti con una OD450nm maggiore del 97.5° percentile della popolazione dei non stimolati. La frequenza di pozzetti positivi è stata poi espressa come percentuale rispetto al totale di pozzetti per ogni stimolo.
Nella figura 8 sono mostrate le frequenze percentuali di positività con i diversi stimoli in riferimento alla produzione di IgG totali e di anticorpi anti antigene influenzale (FluA).
Come si osserva dai grafici, ci sono differenze notevoli tra i soggetti di controllo ed i pazienti con IDCV.
Tali differenze sono statisticamente significative nel caso della produzione di anticorpi anti-FluA in risposta allo stimolo con CpG, IL-2 (p=0.005); non raggiungono la significatività statistica ma sono comunque elevate nel caso della produzione di anticorpi anti Flu in risposta al CpG, StA, PWM e della produzione di IgG totali in risposta al CpG, IL-2; non ci sono invece nel caso della produzione di IgG totali in risposta al CpG, StA, PWM.
Anche in questo caso si rilevano deviazioni standard particolarmente elevate con estremi notevolmente distanti tra loro.
Anche in questo caso, come per le analisi sulla produzione di citochine, una prima analisi di parametri clinici al fine di rilevare differenze tra i pazienti che si posizioni agli estremi delle deviazioni standard non ha rilevato alcuna differenza.
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Figura 8. Memoria immunologica - Analisi della produzione di IgG totali e anticorpi anti Flu in
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Analisi della memoria immunologica in pazienti con malattie autoimmuni.
Al fine di approfondire l’analisi della memoria B in diverse patologie a carattere immunologico, abbiamo studiato anche alcuni pazienti con malattie autoimmuni, in particolare LES e AR.
In questi pazienti oltre ad una valutazione di risposta contro antigeni vaccinali, abbiamo anche valutato la produzione di autoanticorpi malattia-specifici: gli ACPA, nel caso dell’AR e gli anti- dsDNA e gli anti-C1q nel caso del LES.
I valori ottenuti non sono stati riportati come grafico ma solo come tabella a causa del numero esiguo di pazienti e anticorpi utilizzati per lo studio. Tale tabella, mostra una prima categorizzazione dei pazienti in base alla patologia e al tipo di anticorpo analizzato.
I pazienti con AR sono stati testati per ACPA1, ACPA2, ACPA3 ed ACPA4, peptidi citrullinati derivati da EBNA1, EBNA2 e istone H4 (due diverse sequenze situate nella zona amminoterminale della molecola).
I pazienti con LES sono stati testati per anti dsDNA, anti fattore 1q del complemento (entrambi anticorpi molto specifici per il LES e associati a fasi di attività o riacutizzazione della malattia). Tutti e due i gruppi di pazienti sono stati testati per anti-EBNA e per anticorpi specifici per le neuraminidasi del virus dell’influenza.
Come possiamo osservare, la distribuzione delle frequenze è molto variabile.
I pazienti con AR mostrano eterogeneità nelle frequenze di memory B specifiche per gli ACPA nel sangue periferico.
Tra gli antigeni di controllo, i pazienti con AR mostrano frequenze maggiori nei confronti delle neuraminidasi dell’influenza che non verso gli antigeni dell’Epstein Barr Virus.
Per quanto riguarda i pazienti con LES, la frequenza di memory B specifiche per auto antigeni è decisamente alta, in generale, al pari di quella per i recall antigens. Anche in questa patologia i livelli sono molto eterogenei.
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Tabella 6. Frequenza di cellule B produttrici di autoanticorpi e anticorpi diretti contro recall antigens in seguito a stimolazioni.
CpG IL-2
AutoAg Recall Ag RA ACPA1 ACPA2 ACPA3 ACPA4 EBNA1 FLU A FLU B
RA1 8,3 6,7 3,3 13,3 RA2 2,5 15 37,5 45 RA3 10 12,5 5 2,5 RA4 8,4 9.7 81,6 10 CpG IL-2 AutoAg Recall Ag SLE ssDNA dsDNA C1Q EBNA FLU A FLU B
SLE1 56,7 46,7 50 SLE2 6,7 3,3 21,7 SLE3 33,3 38,9 55 SLE4 1,5 0 27,5 15,5 SLE5 37,5 38,5 5,6 SLE6 3,5 0 0 SLE7 14 50 0 CpG StA PWM Auto Ag Recall Ag RA ACPA1 ACPA2 ACPA3 ACPA4 EBNA1 FLU A FLU B
RA1 0 1,7 0 5 RA2 0 2,5 5 65 RA3 2,5 2,5 2,5 7,5 RA4 1,7 90 25 CpG StA PWM Auto Ag Recall Ag SLE ssDNA dsDNA C1Q EBNA FLU A FLU B
SLE1 60 36,7 23,3
SLE2
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DISCUSSIONE
Gli anticorpi sierici sono prodotti da plasmacellule che originano nella maggior parte dei casi nei centri germinativi, derivando da cellule B attivate selezionate per la loro capacità di legare ad alta affinità un antigene. Un subset di plasmacellule darà origine a cellule long lived, da cui dipende la risposta umorale che persiste per decadi, o per tutta la vita dell’individuo.
Poiché l’emivita delle IgG circolanti è di circa 3-5 settimane, titoli costanti di anticorpi IgG sono probabilmente mantenuti dalla continua secrezione di anticorpi da parte di plasmacellule, presumibilmente a lunga vita. Con la riesposizione ad un antigene, nuove plasmacellule derivano dalle cellule B di memoria già presenti nel sangue periferico.
Alterazioni che conducano ad un difetto o ad un eccesso nell’attività di sintesi anticorpale da parte delle cellule B possono condurre a quadri di immunodeficienza o al contrario condurre a manifestazioni autoimmuni.
La malattia più comune in cui si osserva un deficit di produzione anticorpale è la IDCV, caratterizzata da ipogammaglobulinemia e da infezioni ricorrenti, ma anche da un complesso insieme di manifestazioni autoimmuni e linfoproliferative. La classificazione attuale dei pazienti affetti da IDCV è basata sui livelli di immunoglobuline e sul numero di cellule B, in particolare tenendo conto del numero totale delle B e del numero di switched memory. Le cellule B di memoria sono componenti fondamentali dell’immunità ed è stata riportata una riduzione del loro numero nella IDCV, ma i dati sulla loro funzione sono al momento ancora limitati.
In questa tesi abbiamo valutato un gruppo di pazienti affetti da IDCV, in cui sono stati studiati gli aspetti morfologici e funzionali di cellule B e T nel sangue periferico.
64 Il pool di cellule B circolanti consiste di almeno 6 popolazioni distinte (naive, B della zona marginale, switched memory, attivate, transazionali e plasmablasti) e riflette la differenziazione delle cellule B, in modo antigene-dipendente o indipendente, negli organi linfatici primari e