3. METODI
3.7 Studio di stabilità
La stabilità delle formulazioni è stata valutata nel tempo conservando le nanomicelle in frigorifero ad una temperatura di 4 °C.
Le formulazioni sono state caratterizzate dopo 3 mesi in termini di dimensioni, concentrazione di farmaco e aspetto visivo e confrontate con gli stessi parametri al tempo zero.
3.8 Liofilizzazione
Poiché́ le nanomicelle sono sistemi dinamicamente instabili110 è altamente desiderabile stabilizzare le particelle con un processo di liofilizzazione.
La liofilizzazione o crioessiccamento è un processo industriale che consiste nel rimuovere l’acqua da prodotti previamente congelati mediante sublimazione, in particolari condizioni di temperatura (minore di zero gradi) e pressione (sottovuoto). Questo processo può generare stress alle nanomicelle e per evitare questo si possono usare crioprotettori, che proteggono il sistema nanostrutturato da fenomeni di aggregazione.111
In questo studio, la formulazione Nano C8C14-TPGS è stata sottoposta a processo di
liofilizzazione, sia come tale che in presenza di crioprotettore.
I crioprotettori saggiati sono stati: trealosio, mannitolo, D-(+)-glucosio, e idrossipropil-β- ciclodestrina. Sono state preparate soluzioni acquose contenenti 10% p/p di crioprotettore e miscelate in rapporto 1:1 con le soluzioni nanomicellari, in modo che la concentrazione finale di crioprotettore nel preparato da liofilizzare fosse il 5% p/p. (fig.27). Le soluzioni erano quindi trasferite in vials di vetro in aliquote da 1 ml.
Il processo di liofilizzazione è stato condotto utilizzando il liofilizzatore VirTis AdVantage 2.0 munito di software di comando Wizard 2.0.
La fase di congelamento spinto veniva effettuata alla temperatura di -40°C in 120 minuti, seguita da una fase di extrafreeze a -36°C per 10 minuti, ad una pressione di 400 Torr. L’essiccamento primario veniva effettuato in 4 step:
• Step 1: -25°C per 360 minuti a 100mTorr (rate: 1.8°C/h) • Step 2: -10°C per 240 minuti a 100 mTorr (rate: 3.75°C/h) • Step 3: +5°C per 420 minuti a 100 mTorr (rate: 2.1 °C/h) • Step 4: +25°C per 240 minuti a 100 mTorr.
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Al termine del processo di liofilizzazione i campioni erano conservati in un essiccatore sottovuoto per essere poi ricostituiti con acqua depurata.
Per valutare l’efficacia e la fattibilità del processo di liofilizzazione, il liofilizzato, ricostituito con acqua depurata in modo da ripristinare la formulazione iniziale, era sottoposto ad analisi dimensionale ed analisi HPLC, per evidenziare, rispettivamente, cambiamenti nelle dimensioni ed eventuali variazioni nella concentrazione di farmaco rispetto alla formulazione al tempo zero, prima della liofilizzazione.
La stabilità della Nano IMQ/C8C14-TPGS liofilizzata è stata analizzata al tempo zero e dopo
15 e 30 giorni, mantenendo i campioni liofilizzati in essiccatore.
Fig. 27- Formulazioni liofilizzate.
4. RISULTATI
Negli ultimi decenni i sistemi di rilascio di farmaci per via topica basati sulle nanotecnologie hanno ricevuto una crescente attenzione per il trattamento dei tumori della pelle e sono stati studiati per migliorare la biodisponibilità dei farmaci applicati topicamente e la loro distribuzione cutanea. Inoltre, la messa a punto di sistemi di rilascio pH responsivi, consente di sfruttare una eventuale destabilizzazione del sistema nei compartimenti acidi (es. endosomi/lisosomi; ambiente extracellulare tumorale) per controllare il rilascio del farmaco solo in determinati tessuti o cellule. A questo scopo, nella presente tesi è stata valutata la capacità di una nuova serie di liquidi ionici (CnTMG) di comportarsi come tensioattivi e formare micelle con dimensioni dell'ordine di grandezza del nanometro, allo scopo di sviluppare un sistema nanostrutturato di drug delivery per l'applicazione cutanea nella terapia del cancro della pelle.
Inoltre, è stato valutato l'effetto dei CnTMG nella formazione di nanomicelle miste contenenti un tensioattivo non ionico, la vitamina E TPGS. Rispetto alle nanomicelle a base
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di singolo tensioattivo, infatti, i sistemi micellari misti presentano i seguenti vantaggi: miglioramento della stabilità termodinamica (più bassa CMC) e cinetica, maggiore capacità di carico del farmaco e controllo più accurato delle dimensioni
È stato scelto di usare la vitamina E-TPGS sia per le sue capacità di emulsionare, disperdere, gelificare e solubilizzare farmaci con una bassa solubilità in acqua; sia per il suo potenziale nel superare la resistenza multifarmaco nel tumore grazie all’inibizione della glicoproteina P, che per gli effetti citotossici selettivi contro le cellule tumorali.
In una prima fase del lavoro sono state preparate formulazioni nanomicellari senza farmaco, al fine di valutare la riproducibilità della metodica di preparazione e la stabilità delle nanomicelle vuote nel tempo, evitando eventuali sprechi di principio attivo, risultato essere molto costoso.
Le nanomicelle preparate sono state caratterizzate dal punto di vista chimico/fisico in termini di dimensioni e indice di polidispersità, determinate mediante dynamic light scattering (DLS).
Nelle tabelle 1, 2 e 3 sono riportate la composizione ed i risultati dell’analisi dimensionale delle nanomicelle preparate senza farmaco.
Dai risultati riportati in tabella 1, relativi alla formulazione a base di solo C14TMG, si può
evidenziare come i tre lotti preparati abbiano fornito risultati simili, indice di una buona riproducibilità della metodica di preparazione. La dimensione delle nanomicelle era di circa 250 nanometri, con un baso indice di polidispersità, indicativo di una distribuzione dimensionale uniforme.
Per la preparazione di nanomicelle miste con il liquido ionico C14TMG e la vitamina E TPGS
(Nano C14-TPGS), sono state saggiate due metodiche di preparazione diverse, indicate in tabella 2 come metodo A e metodo B, che consistevano rispettivamente nella semplice agitazione della miscela di tensioattivi in acqua alla temperatura di 50°C e nella fusione dei tensioattivi separatamente prima dell’aggiunta di acqua. Dai risultati ottenuti è evidente che il metodo per fusione porta all’ottenimento di nanomicelle di dimensioni più piccole e più omogenee (diametro idrodinamico di ≅15 nm; PI 0.1-0.5) rispetto al metodo per agitazione (diametro idrodinamico di 30.5 e 88.4 nm ai due angoli 90° e 62.6°, rispettivamente; PI ≅1). Infine, sono state preparate nanomicelle contenenti due diversi liquidi ionici, uno con la catena alchilica a 8 atomi di carbonio (C8TMG) e l’altro a 14 atomi di carbonio (C14TMG),
sempre in associazione con la vitamina E TPGS. I risultati dell’analisi dimensionale della formulazione Nano C8C14-TPGS sono riportati in tabella 3, da cui si può notare come la
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miscela ternaria di tensioattivi porti ad una diminuzione del diametro idrodinamico (≅10 nm) e ad un indice di polidispersità più basso (range 0.05-0.4) indicativo di una popolazione con dimensioni omogenee. Inoltre, il confronto dei risultati ottenuti con i diversi lotti preparati mostra che la metodica di preparazione con il metodo per fusione fornisce nanomicelle riproducibili.
Uno step successivo ha quindi riguardato l’aggiunta di imiquimod alle nanomicelle messe a punto in precedenza, al fine di trovare le condizioni migliori per incapsulare una quantità adeguata di farmaco. Ai formulati sono state aggiunte due diverse concentrazioni di imiquimod (5 e 10 mM) e le nanomicelle ottenute sono state caratterizzate in termini di dimensioni ed entrapment.
I risultati sono riportati nelle tabelle 4, 5 e 6 per le diverse formulazioni saggiate ed evidenziano che le nanomicelle a base di solo C14TMG, mantengono una buona uniformità
di distribuzione e dimensioni di circa 200 nm, ma mostrano una scarsa capacità di incapsulare il farmaco (circa 0.03 μmoli/ml). Allo stesso modo, le Nano IMQ/C8C14-TPGS mantengono piccole dimensione dell’ordine dei 10 nm e basso PI, ma mostrano un entrapment % di 3.58 e 0.18 μmoli/ml di imiquimod incapsulato. Le Nano IMQ/C14-TPGS presentano dimensioni di circa 200 nm, con una bassa uniformità a 90.0°, ma mostrano un entrapment % di 16.642 e 0.8311 μmoli/ml di imiquimod incapsulato.
Le formulazioni nanomicellari sono state quindi sottoposte ad uno studio di rilascio in vitro attraverso membrana da dialisi in due diverse soluzione tampone a pH 5 e a pH 7.4 al fine di verificarne il comportamento pH-sensibile.
Come evidente dal grafico riportato in figura 28 in cui è riportata la percentuale di imiquimod rilasciato nel tempo nelle due condizioni di pH saggiate, tutte le formulazioni mostrano un profilo di rilascio sensibile al pH, ma mentre la formulazione Nano IMQ/C14-TPGS rilasciava circa il 12% e la Nano IMQ/C14 circa il 20% di farmaco dopo 4 ore di esposizione a pH 5.5, la formulazione Nano IMQ/C8C14-TPGS era in grado di rilasciare dopo 4 ore a pH 5.5 circa il 70% del farmaco incapsulato ed il 93% alle 24 ore, rappresentando quindi un buon punto di partenza per la messa a punto di un sistema a rilascio prolungato di farmaco. La capacità delle nanomicelle preparate di cambiare la loro struttura quando esposte ad un pH acido, come quello dei tessuti tumorali, è stata ulteriormente valutata tramite analisi dimensionale; infatti, un collassamento della nanomicella dovrebbe risultare in un aumento del diametro idrodinamico della nanomicella stessa. Per dimostrare i cambiamenti strutturali delle micelle nell'ambiente acido, le formulazioni nanomicellari Nano IMQ/C14 e Nano IMQ/C8C14-TPGS sono state analizzate come tali al tempo zero e poi incubate in una
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soluzione tampone a pH 5.5. Ad intervalli di tempo predeterminati di 30 minuti, 1 ora, 4 ore e 24 ore, la dimensione delle particelle e la distribuzione delle dimensioni sono state determinate ed i risultati ottenuti, confrontati con quelli delle stesse dispersioni in tampone PBS a pH 7.4. I risultati ottenuti sono riportati graficamente in figura 29.
Tutte le formulazioni preparate mostravano al tempo zero un intervallo di dimensioni ristrette, le quali aumentavano nel tempo in seguito all’esposizione al pH acido fino ad arrivare ad oltre 1000 nm. Diversamente questo non avveniva a pH fisiologico. Inoltre, è interessante notare che le formulazioni Nano C14 e Nano C8C14-TPGS mostravano dimensioni diverse dopo poco tempo dall’esposizione al pH acido (Figura 29). I risultati ottenuti confermano quanto evidenziato con lo studio di rilascio, ovvero la sensibilità delle nanomicelle al pH acido, le quali potrebbero essere rotte rapidamente in condizioni endo/lisosomiche acide delle cellule tumorali, mentre potrebbero restare stabili in condizioni di pH fisiologico.
Le formulazioni Nano IMQ/C14 e Nano IMQ/C8C14-TPGS sono quindi state valutate in studi di permeazione in vitro attraverso cute di orecchio di maiale, per analizzarne la capacità di veicolare il farmaco all’interno della cute, sito d’azione per la terapia topica del cancro della pelle, riducendo il più possibile l’assorbimento sistemico.
I risultati ottenuti sono riportati graficamente in figura 30 per quanto riguarda la quantità di farmaco permeato e in figura 31 relativamente alla quantità di farmaco accumulata nel tessuto. La figura 32 riporta inoltre il fattore di accumulo, calcolato come rapporto tra la quantità di farmaco accumulata nella cute e la quantità di IMQ applicata durante le prove di permeazione, per ciascuna formulazione.
Dai risultati ottenuti, appare evidente che con tutte le formulazioni saggiate si ottiene una permeazione transcutanea di farmaco dipendente dal pH della fase ricevente; in particolare sia il prodotto commerciale di riferimento Immunocare che la Nano IMQ/C8C14-TPGS tendono a produrre una maggiore permeazione in ambiente a pH 5.5, probabilmente dovuta anche ad una maggiore solubilità dell'IMQ.
Per quanto riguarda la quantità di farmaco accumulata nella cute, i risultati ottenuti mostrano che la formulazione commerciale porta ad un accumulo di IMQ nel tessuto superiore di circa 30 e 100 volte in valore assoluto rispetto alle formulazioni nanomicellari, ad entrambi i pH saggiati. Deve però essere tenuta in considerazione la maggiore quantità di farmaco presente nel formulato commerciale rispetto ai formulati in forma di nanomicelle e pertanto è necessario normalizzare il dato dell'accumulo alla reale concentrazione di farmaco applicata sulla cute, calcolando il fattore di accumulo FA. E' interessante notare, osservando la figura
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31 che le formulazioni nanomicellari tendono a favorire l'accumulo del farmaco nel tessuto ed in particolare che la formulazione Nano IMQ/C8C14-TPGS produce un accumulo maggiore a pH acido rispetto a quello ottenuto a pH fisiologico; dato questo importante per un eventuale applicazione sul tessuto tumorale. Inoltre, c'è da far notare che la formulazione commerciale è una formulazione in gel, mentre le formulazioni messe a punto in questa tesi sono dispersioni colloidali in forma liquida, che andranno in futuro formulate con un agente reologico in modo da poter essere applicate sulla superficie cutanea e favorire inoltre un maggior contatto del farmaco con la cute.
È stata quindi valutata la stabilità nel tempo per un periodo di 3 mesi delle formulazioni Nano IMQ/C14 e Nano IMQ/C8C14-TPGS, mantenute ad una temperatura di 4°C in vials chiuse. Dai risultati ottenuti, riportati in tabella 7, si può osservare che sia il contenuto di farmaco incapsulato nella Nano IMQ/C8C14-TPGS che le dimensioni delle nanomicelle rimanevano pressochè costanti, sebbene l'incremento del PI da 0.19 a 0.88 suggerisca la presenza di fenomeni di aggregazione. Al contrario, il contenuto di farmaco nella Nano IMQ/C14 subiva una diminuzione nel tempo di circa 5 volte, segno dell'instabilità del formulato.
Per stabilizzare il sistema nanostrutturato è stata valutata la possibilità di liofilizzare le nanomicelle, processo che favorirebbe lo stoccaggio del formulato per una successiva ridispersione in acqua al momento dell’uso.
A questo scopo, un’aliquota da 1 ml di dispersione nanomicellare Nano C8C14-TPGS è stata sottoposta a processo di liofilizzazione, sia come tale che dopo aver aggiunto un crioprotettore (mannitolo, trealosio, glucosio, Idrossipropil-β-ciclodestrina). Il liofilizzato ottenuto (figura 27) aveva un aspetto soffice ed era facilmente ridispersibile con acqua deionizzata, a formare una soluzione limpida e incolore. I risultati dell’analisi dimensionale eseguita sui liofilizzati ricostituiti sono riportati in tabelle 8 e 9. Dopo ricostituzione con acqua del liofilizzato appena preparato era possibile ottenere nanomicelle con dimensioni paragonabili a quelle originali e con una distribuzione uniforme, ad eccezione del formulato contenente mannitolo che è quindi stato scartato. L'analisi dimensionale liofilizzato, conservato in essicatore per un periodo di 30 giorni e ricostituito prima dell'analisi, ha mostrato un aumento di dimensioni di più del doppio (2.8 volte) per il formulato crioprotetto con trealosio, mentre in tutti gli altri casi il formulato si è rivelato stabile nel periodo di osservazione.
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BIBLIOGRAFIA
1. Menon GK. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug
delivery reviews 2002; 54: S3-S17.
2. Structure and Function of Skin. https://courses.lumenlearning.com/wmopen- biology2/chapter/structure-and-function-of-skin/2019).
3. Capire la pelle
La struttura e la funzione della pelle. https://www.eucerin.it/tutto-sulla-pelle/conoscenza-di- base-sulla-pelle/struttura-e-funzione-della-pelle.
4. Matthew Hoffman M. Human Anatomy. 2014. https://www.webmd.com/skin- problems-and-treatments/picture-of-the-skin#1.
5. Elizabeth H. Page M, Harvard Medical School. Struttura e funzione della cute. feb 2017 https://www.msdmanuals.com/it/casa/patologie-della-cute/biologia-della- pelle/struttura-e-funzione-della-cute.
6. Struttura della cute. 2019 2018. https://medicinagram.altervista.org/struttura-della- cute/2019).
7. Epidermide. 2018. https://medicinagram.altervista.org/epidermide/.
8. Layers of the Skin. https://training.seer.cancer.gov/melanoma/anatomy/layers.html. 9. L'EPIDERMIDE. https://www.purapelle.it/content/65-la-struttura-e-gli-strati-della- nostra-epidermide-.
10. Epidermis. https://courses.lumenlearning.com/wm-biology2/chapter/epidermis/. 11. Gli Strati della Pelle. https://www.melanomaitalia.org/trova-le-risposte/il- melanoma-ed-altre-lesioni/lesioni-benigne-lesioni-che-non-sono-cancerose/gli-strati-della- pelle/.
12. Il derma e le fibre proteiche. https://www.cellcosmet-cellmen.com/it/N3446/il- derma-e-le-fibre-proteiche.html.
13. Derma - Com'è Fatto e Come Funziona . .
https://www.antirughe.info/pelle/derma.html.
14. Ipoderma. 12 Gennaio 2020 2011.
https://www.medicinapertutti.it/argomento/ipoderma/.
15. Apparato tegumentario. http://www.sapere.it/sapere/medicina-e-salute/atlante- anatomico/apparato-tegumentario.html.
16. Ghiandole sudoripare apocrine. 18 Gennaio 2020 2012.
https://www.medicinapertutti.it/argomento/ghiandole-sudoripare-apocrine/.
17. Ghiandole sudoripare eccrine. 25 Gennaio 2020 2012.
https://www.medicinapertutti.it/argomento/ghiandole-sudoripare-eccrine/. 18. Guidotti M. farmacocinetica. http://www.galenotech.org/farmcocin1.htm.
19. Bolzinger M-A, Briançon S, Pelletier J, Chevalier Y. Penetration of drugs through skin, a complex rate-controlling membrane. Current Opinion in Colloid & Interface Science 2012; 17(3): 156-65.
20. Couto A, Fernandes R, Cordeiro MNS, Reis SS, Ribeiro RT, Pessoa AM. Dermic diffusion and stratum corneum: A state of the art review of mathematical models. Journal of
Controlled Release 2014; 177: 74-83.
21. Wurster DE, Taylor PW. Dissolution Kinetics of Certain Crystalline Forms of Prednisolone. Journal of Pharmaceutical Sciences 1965; 54(5): 670-6.
22. Mardhiah Adib Z, Ghanbarzadeh S, Kouhsoltani M, Yari Khosroshahi A, Hamishehkar H. The Effect of Particle Size on the Deposition of Solid Lipid Nanoparticles in Different Skin Layers: A Histological Study. Adv Pharm Bull 2016; 6(1): 31-6.
66
23. Hadgraft J, Lane ME. Skin permeation: The years of enlightenment. International
journal of pharmaceutics 2005; 305(1): 2-12.
24. Cázares-Delgadillo J, Naik A, Kalia YN, Quintanar-Guerrero D, Ganem-Quintanar A. Skin permeation enhancement by sucrose esters: A pH-dependent phenomenon.
International journal of pharmaceutics 2005; 297(1): 204-12.
25. Bos JD, Meinardi MMHM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs. 2000; 9(3): 165-9.
26. Nafisi S, Maibach HI. Chapter 3 - Skin penetration of nanoparticles. In: Shegokar R, Souto EB, eds. Emerging Nanotechnologies in Immunology. Boston: Elsevier; 2018: 47-88. 27. Canonico PFRePL. Terapia topica in ambito dermatologico 2015.
28. Middleton JD. THE MECHANISM OF WATER BINDING IN STRATUM
CORNEUM. British Journal of Dermatology 1968; 80(7): 437-50.
29. Pham QD, Björklund S, Engblom J, Topgaard D, Sparr E. Chemical penetration enhancers in stratum corneum — Relation between molecular effects and barrier function.
Journal of Controlled Release 2016; 232: 175-87.
30. Marty JP. [NMF and cosmetology of cutaneous hydration]. Ann Dermatol Venereol 2002; 129(1 Pt 2): 131-6.
31. Rawlings AV, Harding CR. Moisturization and skin barrier function. Dermatologic
Therapy 2004; 17(s1): 43-8.
32. Sinha VR, Kaur MP. Permeation Enhancers for Transdermal Drug Delivery. Drug
Development and Industrial Pharmacy 2000; 26(11): 1131-40.
33. Abd E, Yousef SA, Pastore MN, et al. Skin models for the testing of transdermal drugs. Clin Pharmacol 2016; 8: 163-76.
34. Todo H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species.
Pharmaceutics 2017; 9(3): 33.
35. Jacobi U, Kaiser M, Toll R, et al. Porcine ear skin: An in vitro model for human skin.
Skin research and technology : official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI) 2007; 13: 19-24.
36. Rolland P, Bolzinger MA, Cruz C, Briançon S, Josse D. Human scalp permeability to the chemical warfare agent VX. Toxicology in Vitro 2011; 25(8): 1974-80.
37. Debeer S, Le Luduec J-B, Kaiserlian D, et al. Comparative histology and immunohistochemistry of porcine versus human skin. European journal of dermatology :
EJD 2013; 23: 456-66.
38. Paolino G, Donati M, Didona D, Mercuri SR, Cantisani C. Histology of Non- Melanoma Skin Cancers: An Update. Biomedicines 2017; 5(4): 71.
39. Glogau R. The risk of progression to invasive disease. Journal of the American
Academy of Dermatology 2000; 42: 23-4.
40. Benjamin CL, Ananthaswamy HN. p53 and the pathogenesis of skin cancer. Toxicol
Appl Pharmacol 2007; 224(3): 241-8.
41. Stockfleth E, Kerl H. Guidelines for the management of actinic keratoses - Developed by the Guideline Subcommittee of the European Dermatology Forum. European
journal of dermatology: EJD 2006; 16: 599-606.
42. Joseph Jorizzo M. Treatment of actinic keratosis. 2019.
https://www.uptodate.com/contents/treatment-of-actinic-keratosis/print2020).
43. John NMaSM. 14.5 million European workers unprotected from risks of skin cancer.
European Academy of Dermatology and Venereology 2016.
44. Bastiaens MT, Huurne JACt, Kielich C, et al. Melanocortin-1 Receptor Gene Variants Determine the Risk of Nonmelanoma Skin Cancer Independently of Fair Skin and Red Hair. The American Journal of Human Genetics 2001; 68(4): 884-94.
67
45. Madan V, Lear JT, Szeimies R-M. Non-melanoma skin cancer. The Lancet 2010;
375(9715): 673-85.
46. Otto AI, Riou L, Marionnet C, Mori T, Sarasin A, Magnaldo T. Differential Behaviors toward Ultraviolet A and B Radiation of Fibroblasts and Keratinocytes from Normal and DNA-Repair-deficient Patients. Cancer Research 1999; 59(6): 1212.
47. Pacifico A, Goldberg LH, Peris K, Chimenti S, Leone G, Ananthaswamy HN. Loss of CDKN2A and p14ARF expression occurs frequently in human nonmelanoma skin cancers. British Journal of Dermatology 2008; 158(2): 291-7.
48. Lear JT, Heagerty AHM, Smith A, et al. Multiple cutaneous basal cell carcinomas: glutathione S-transferase (GSTM1, GSTT1) and cytochrome P450 (CYP2D6, CYP1A1) polymorphisms influence tumour numbers and accrual. Carcinogenesis 1996; 17(9): 1891- 6.
49. RANNUG A, RANNUG U, ROSENKRANZ H, et al. Certain photooxidized derivatives of tryptophan bind with very high affinity to the Ah receptor and are likely to be endogenous signal substances. 1987; 262(32): 15422-7.
50. Klingelhutz AJ. Telomerase activation and cancer. Journal of Molecular Medicine 1997; 75(1): 45-9.
51. Silva Schott EJ. Ulcere atipiche: Studio epidemiologico 2013-2018 nella U.O. Dermatologia di Pisa: Universita di Pisa; 2019.
52. Bianchi L, Costanzo A, Campione E, Nisticò S, Chimenti S. Superficial and nodular basal cell carcinomas treated with an immune response modifier: a report of seven patients.
Clinical and Experimental Dermatology 2003; 28(s1): 24-6.
53. Pedrazzoli DM. Il basalioma.
http://www.maxillofaccialemilano.com/basalioma.htm.
54. Rubin A, Chen E, Ratner D. Basal-Cell Carcinoma. The New England journal of
medicine 2005; 353: 2262-9.
55. Gallagher RP, Hill GB, Bajdik CD, et al. Sunlight Exposure, Pigmentary Factors, and Risk of Nonmelanocytic Skin Cancer: I. Basal Cell Carcinoma. Archives of Dermatology 1995; 131(2): 157-63.
56. Mahmoud BH, Olbricht SM. Squamous cell carcinoma. Treatment of Skin Disease Comprehensive Therapeutic Strategies: Elsevier: 780-4.
57. Stratigos A, Garbe C, Lebbe C, et al. Diagnosis and treatment of invasive squamous cell carcinoma of the skin: European consensus-based interdisciplinary guideline. European
Journal of Cancer 2015; 51(14): 1989-2007.
58. Leigheb G CE, Gattoni M, Meli F. . Iperplasie e neoplasie cutanee. . Manuale di dermatologia medica: Edra; 2015.
59. Wagner E. Programmed drug delivery: nanosystems for tumor targeting. Expert
Opinion on Biological Therapy 2007; 7(5): 587-93.
60. Abeylath SC, Ganta S, Iyer AK, Amiji M. Combinatorial-Designed Multifunctional Polymeric Nanosystems for Tumor-Targeted Therapeutic Delivery. Accounts of Chemical
Research 2011; 44(10): 1009-17.
61. Leroux J-C, Allémann E, De Jaeghere F, Doelker E, Gurny R. Biodegradable nanoparticles — From sustained release formulations to improved site specific drug delivery. Journal of Controlled Release 1996; 39(2): 339-50.
62. Hossen S, Hossain MK, Basher MK, Mia MNH, Rahman MT, Uddin MJ. Smart