Formulazioni nanostrutturate contenenti Imiquimod per il trattamento del cancro della pelle

UNIVERSITA’ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Tesi di laurea magistrale

Formulazioni nanostrutturate contenenti Imiquimod per il

trattamento del cancro della pelle

Relatori:

Dott.ssa Silvia Tampucci

Dott.ssa Daniela Monti

Candidata: Miguela Silva Schott

Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-09 ANNO ACCADEMICO 2018-2019

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Ai miei genitori

Ingrid e José Silva

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RIASSUNTO

Il lavoro della presente tesi ha riguardato la preparazione e caratterizzazione di formulazioni nanomicellari a base di liquidi ionici contenenti Imiquimod per il trattamento del cancro di pelle. L'impiego di sistemi nanoparticellari per il drug delivery ha l’obiettivo di migliorare la biodisponibilità dei farmaci e ridurre i fenomeni irritativi, evitando il contatto diretto del farmaco con la superficie cutanea. Inoltre, l’impiego delle nanotecnologie può incrementare la quantità di farmaco che permea attraverso lo strato corneo, principale barriera alla penetrazione, e favorire una distribuzione selettiva nel tessuto, riducendo al minimo gli effetti collaterali di tipo sistemico. Le formulazioni preparate sono state caratterizzate dal punto di vista chimico/fisico in termini di dimensioni e indice di polidispersità, determinate mediante dynamic light scattering (DLS) e di contenuto di principio attivo e capacità di carico mediante analisi HPLC. Inoltre, le preparazioni sono state sottoposte a studi per verificare la capacità delle nanomicelle di modificare la loro struttura in base al pH in modo da poter sfruttare una eventuale destabilizzazione del sistema nei compartimenti acidi (es. endosomi/lisosomi; ambiente extracellulare tumorale) per controllare il rilascio del farmaco solo in determinati tessuti o cellule. Infine, sono stati condotti studi di permeazione/penetrazione attraverso cute di orecchio di maiale per verificare la capacità dei sistemi nanomicellari preparati di favorire la penetrazione del farmaco negli strati cutanei interessati dalla patologia.

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INDICE

INTRODUZIONE ... 6

1. STRUTTURA DELLA CUTE ... 7

1.1 Epidermide ... 8

1.2 Derma ... 11

1.3 Ipoderma ... 12

1.4 Annessi Cutanei... 13

2. PERMEAZIONE CUTANEA: ... 14

2.1 Vie di penetrazione attraverso la cute ... 14

2.2 Meccanismo di passaggio di un farmaco attraverso la barriera cutanea: ... 16

2.3 Fattori che influenzano l’assorbimento cutaneo ... 18

2.3.1 Caratteristiche chimico-fisiche del farmaco ... 19

2.3.2 Formulazione del veicolo ... 20

2.3.3 Condizione dello strato corneo ... 21

2.3.4 Promotori della permeazione ... 23

3. METODI PER VALUTARE LA PENETRAZIONE E LA PERMEAZIONE CUTANEA IN VITRO ... 23

4. CANCRO DELLA PELLE ... 27

4.1 Lesione pre-cancerogena: Cheratosi attinica ... 27

4.1.2 Terapia farmacologica ... 28

4.2 Cancro della pelle non-melanoma ... 29

4.2.1 Patogenesi di cancro di pelle di tipo non-melanoma: ... 30

4.2.2 Basalioma (BCC-carcinoma baso-cellulare) ... 31

4.2.3 Spinalioma (SCC-carcinoma spino-cellulare) ... 32

5. NANOSISTEMI IMPIEGATI NEL DRUG DELIVERY ... 33

5.1 Nanosistemi impiegati nel trattamento del cancro della pelle ... 34

5.2 Meccanismo di rilascio dei sistemi nanostrutturati ... 36

6. NANOMICELLE ... 37

6.1 Nanomicelle tensioattive ... 37

6.2 Nanomicelle polimeriche ... 38

6.3 Metodi de preparazione delle nanomicelle ... 39

6.4 Nanomicelle pH sensibili ... 40

6.5 Applicazione cutanea ... 41

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7.1 Proprietà chimico-fisiche ... 42

7.2 Liquidi ionici nell’ambito della ricerca ... 43

7.2.1 Applicazioni industriali dei liquidi ionici ... 43

7.3 Liquidi ionici come tensioattivi ... 44

PARTE SPERIMENTALE ... 45

1. SCOPO DELLA TESI ... 46

2. MATERIALI ... 47

2.1 Liquidi ionici ... 47

2.2 Vitamina E-TPGS ... 48

2.2.1 Vitamina E-TPGS nei sistemi di drug delivery ... 49

2.3 Imiquimod ... 51

2.3.1 Imiquimod per il cancro di pelle di tipo non-melanoma ... 52

3. METODI ... 53

3.1 Preparazione delle nanomicelle ... 53

3.2 Caratterizzazione fisico-chimica delle nanomicelle ... 53

3.2.1 Analisi dimensionale ... 53

3.2.2 Entrapment e loading ... 54

3.3 Metodica analitica HPLC ... 55

3.4 Studio di rilascio in vitro del farmaco dalle nanomicelle ... 55

3.5 Studi di permeazione in vitro attraverso cute di orecchio di maiale ... 56

3.6 Determinazione della quantità di farmaco accumulata nella cute di orecchio di maiale.. 58

3.7 Studio di stabilità ... 59 3.8 Liofilizzazione ... 59 4. RISULTATI ... 60 BIBLIOGRAFIA ... 65 TABELLE ... 71 FIGURE ... 80

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1. STRUTTURA DELLA CUTE

La cute è l’organo più esteso del nostro corpo, costituisce circa il 16% del suo peso e ricopre un’area da 1.5 a 2 m2_{. Ha uno spessore che varia tra 0,5 e 2 mm a seconda dell’individuo e}

della regione anatomica: è massimo sul palmo delle mani e la pianta dei piedi, e minimo sulle palpebre e nella regione auricolare posteriore; la pelle maschile è tipicamente più spessa di quella femminile. Essa è un organo sensoriale che svolge molte funzioni; la sua funzione principale è quella di creare una barriera tra il nostro organismo e l’ambiente esterno per proteggere il corpo dalle aggressioni di microrganismi esterni, dai raggi ultravioletti, da agenti tossici e insulti meccanici. Le sue altre funzioni sono di controllo nella perdita d’acqua, elettroliti e sostanze varie e di termoregolazione.

La cute, nello strato più interno, contiene fino al 70% di acqua con pH analogo a quello fisiologico, mentre salendo in superficie, il contenuto di acqua scende intorno al 10-15% e il pH risulta compreso tra 4.2 e 5.6. Il pH è dato da una serie di fattori endogeni ed esogeni ma principalmente è dato dal film idrolipidico e dai processi biochimici che hanno luogo nell’epidermide come l’idrolisi dei lipidi ad acidi grassi liberi, la presenza di acido lattico e la formazione di acido urocanico. Il valore del pH è anche influenzato dal mantello idrico che è dato dal sudore, a sua volta costituito da diverse sostanze come sali minerali, urea, ammonio ed acido lattico. Il sudore può variare da individuo a individuo e come conseguenza pure il pH. La cute è un organo dinamico che subisce continui cambiamenti nel corso della vita 1-5.

Nella cute si possono distinguere 3 strati funzionali (Fig. 1):

• Epidermide: strato più esterno non vascolarizzato costituito principalmente da cheratinociti, con funzione di barriera;

• Derma: strato intermedio, con funzione di supporto. È uno strato altamente vascolarizzato costituito da collageno ed elastina.

• Ipoderma: è il tessuto sottocutaneo costituito da tessuto adiposo e tessuto connettivo e agisce come ammortizzatore meccanico, isolante termico e riserva calorica.

Distribuiti nella cute si trovano gli annessi cutanei che, impiantati nel tessuto adiposo sottocutaneo, si estendono fino alla superficie e sono:

• Follicoli piliferi con annesse ghiandole sebacee; • Ghiandole sudoripare eccrine;

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Fig.1-Organizzazione strutturale della cute.6

1.1 Epidermide

L’epidermide ha una struttura complessa, è costituito da un tessuto epiteliale di rivestimento di tipo pavimentoso pluristratificato cheratinizzato. È un derivato principalmente dell’ectoderma, colonizzato successivamente da pigmenti contenenti melanociti originati dalla cresta neurale, cellule di Langerhans originate dal midollo osseo e cellule sensitive di Merkel sempre originate dalla cresta neurale. Essendo lo strato più superficiale della cute è disegnato per proteggere l’organismo dall’ambiente, e per questo conta con queste cellule specifiche3.

Ha uno spessore di circa 0,2 mm, è priva di vasi e nutrita per diffusione di sostanze nutritive dal letto dei capillari del derma. Salendo dalla profondità alla superficie, si distinguono 5 diversi strati (Fig. 2) di cellule cheratinocitiche:

• Basale o germinativo; • Spinoso;

• Granuloso; • Lucido; • Corneo;

Queste cellule cheratinocitiche vengono prodotte nello strato più interno (strato basale) e migrano verso la superficie della pelle; contemporaneamente alla sua migrazione queste cellule maturano e subiscono un processo di trasformazione chiamato cheratinizzazione (o

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corneificazione). Questi strati differiscono dal diverso stadio di maturazione dei cheratinociti e dall’eventuale presenza di altri tipi di cellule.7

Fig. 2 - Organizzazione strutturale dell’epidermide7

Strato basale:

Anche chiamato strato germinativo perché produce costantemente cellule nuove. Separa l’epidermide dal derma. È costituito da uno strato di cellule basali, cubiche, disposte a palizzata e mitoticamente attive che aderiscono alla membrana basale attraverso emidesmosomi. Queste cellule si dividono costantemente spostando le cellule meno nuove verso la superficie. Questo strato contiene i melanociti che producono il pigmento melanina, il quale conferisce il colore alla pelle e la protegge dei raggi UV.7,8

Strato spinoso:

Questo è lo strato più spesso dell’epidermide. È costituito da vari strati di cellule che derivano dalle cellule basali, queste cellule sono poliedriche di contorno irregolare, dotate di prolungamenti con i quali entrano in contatto tra loro. Inoltre, nello strato spinoso si trovano le cellule di Langerhans. Queste cellule hanno una struttura dendritica ed hanno un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria della pelle.

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Strato granuloso:

Le cellule sono ulteriormente appiattite, ma contengono ancora il nucleo e gli organuli citoplasmatici. Sono intensamente basofile per la presenza di granuli di cheratoialina, che è un precursore delle fìlaggrine, a loro volta aggreganti dei filamenti di cheratina. Questi granuli potrebbero contenere anche loricrina, che assieme alla precedente, contribuisce a formare l'involucro interno cornificato.

Strato lucido:

Strato presente solo in alcune aree del corpo, nella pelle più spessa come nel palmo delle mani, nella pianta dei piedi, e nelle punte delle dita. Composto da 2-3 strati di cheratinociti appiattite ancora vitali ma prive di nucleo. Queste cellule hanno un citoplasma ricco di eleidina, sostanza proteica derivata dal catabolismo dei granuli di cheratoialina, e tonofilamenti. Questa sostanza ha proprietà rifrangenti e impedisce l’abbronzatura delle sedi dove è presente.9

Strato corneo:

È lo strato più superficiale dell’epidermide, a contatto con l’ambiente esterno. Costituito da 8-16 strati di cellule che costituiscono il risultato finale della cheratinizzazione. Sono cellule non vitali, appiattite, corneificate, senza nucleo; immerse in una matrice di doppi strati lipidici, con struttura molto regolare, in forma lamellare, contenente ceramidi, colesterolo e acidi grassi a lunga catena, in definito rapporto molare di 1:1:1. Questi strati di cellule servono per prevenire la penetrazione di organismi patogeni e per proteggere gli altri strati della pelle. Queste cellule prendono il nome di corneociti, sono costituite essenzialmente da proteine fibrose, e vengono rinnovate continuamente per esfoliazione, e sostituite da nuove unità provenienti dallo strato germinativo tramite un processo che dura in media 2 settimane3,8,10,11.

Considerando la composizione lipidica epidermica si può osservare un’evoluzione che procede parallelamente alla differenziazione cellulare: negli strati basale e spinoso si trovano steroli liberi e fosfolipidi, mentre nel granuloso questi ultimi si riducono ed aumentano invece glicosfingolipidi ed esteri del colesterolo. A livello dello strato corneo si trovano ceramidi, colesterolo ed acidi grassi a lunga catena. La perdita di fosfolipidi e glicolipidi nello strato corneo lo rende più resistente all’acqua, mentre l’assenza di zuccheri e fosforo

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aumenta la resistenza ai batteri e fa si che il film lipidico sia in fase di gel a temperatura corporea.

I corneociti sono circondati da un rivestimento corneo, che è un involucro proteico che durante il processo di differenziazione dei cheratinociti va gradualmente sostituendo la membrana cellulare con una serie di proteine: involucrina, loricrina, cheratolinina (o cistatina) e SPRRs (Small proline-Rich Proteins). Questo involucro conferisce la cute con una resistenza ai traumi di tipo meccanico e agli insulti chimici.

I cheratinociti sono fortemente sovrapposti e sono composti per il 70% da proteine fibrose, α-cheratina (50%) e β-cheratina (20%), immerse in una matrice di lipidi (20%) e proteine non fibrose. La matrice lipidica rappresenta il materiale che tiene uniti i corneociti.

Per far si che la barriera cutanea rappresentata dallo strato corneo sia efficiente, è necessario che il contenuto idrico rimanga costante. In questo strato l’acqua rappresenta solo il 15% del peso cellulare, ma è fondamentale sia per mantenere la flessibilità cellulare, sia per il mantenimento delle attività enzimatiche.9

1.2 Derma

Deriva principalmente dal mesoderma. Strato della cute situato sotto l’epidermide; ha come funzione primaria sostenere e supportare l’epidermide, con la quale entra direttamente a contatto attraverso la membrana basale. Il Derma essendo riccamente vascolarizzato proporziona ossigeno e nutrienti all’epidermide. Grazie al suo contenuto di collagene ed elastina, conferisce alla pelle la sua resistenza ed elasticità. Inoltre, il derma svolge un ruolo fondamentale per la cicatrizzazione e la termoregolazione.12

Il suo spessore può variare in un range da 0.6 mm sulle palpebre a 3 mm sul dorso, sul palmo delle mani e sulla pianta dei piedi.

Contiene collagene che costituisce il 70% del derma, fibre elastiche, vasi sanguigni, strutture sensoriali e fibroblasti, che sono le cellule più abbondanti a questo livello.

I fibroblasti producono e secernono il procollagene, che viene idrolizzato da enzimi proteolitici in collagene, il quale si aggrega e assume una struttura reticolare in grado di conferire grande resistenza meccanica. Producono anche elastina e proteoglicani strutturali: infatti le fibre (collagene ed elastina) sono disperse in un gel acquoso, costituito da glicosamminoglicani (principalmente acido ialuronico e dermatansolfato) e proteoglicani, che provvedono a garantire caratteristiche di appropriata viscosità e idratazione alla pelle. Gran parte delle riserve di acqua dell’organismo sono stoccate nel derma.

12 Il derma è suddiviso in 2 parti:

• Strato papillare o superficiale. • Strato reticolare o profondo.

Lo strato papillare è localizzato sotto l’epidermide anche se no a diretto contatto con questa; tra questi due strati della pelle si trova la giunzione dermo-epidermica che permette il passaggio di nutriente dal derma all’epidermide. Lo strato papillare è costituito da tessuto connettivo lasso contenente capillari, fibre elastiche, reticolari e collagene.

Lo strato reticolare si estende dallo strato papillare fino all’ipoderma. È costituito da tessuto connettivo denso contenente vasi sanguigni, mastociti, terminazioni nervose, e vasi linfatici. A questo livello le fibre di collagene formano fasci robusti intrecciati con disposizione parallela alla superficie della cute. Tra i fasci si intersecano reti di fibre elastiche che conferiranno alla cute maggiore o minore caratteristiche di estensibilità. Le fibre elastiche sono particolarmente numerose attorno ai follicoli piliferi e agli adenomeri delle ghiandole. Con l’invecchiamento il numero delle fibre di collagene che costituiscono il derma diminuisce e diventano più fragili; questo porta alla formazione delle rughe.8,13

1.3 Ipoderma

Rappresenta lo strato più profondo della cute; esso mette in comunicazione il derma con le fasce muscolari e con il periostio, che è la membrana di tessuto connettivo che riveste totalmente le ossa, ad eccezione delle zone dove esse sono legate a legamenti, tendini o cartilagini.

Lo spessore dell’ipoderma varia da persona a persona a seconda dell’età, della razza, al sesso, della regione corporea considerata, del sistema endocrino e dello stato nutrizionale dell’individuo. Il suo spessore varia in media tra 0,5 e 2 cm. In alcune zone (naso, palpebra, padiglione dell’orecchio) l’ipoderma è assente, mentre in altre (regioni glutee, palmo della mano, pianta del piede) il suo spessore è massimo.

L'ipoderma è fortemente innervato e vascolarizzato; è formato da tessuto connettivo lasso ricco di fibre elastiche, che permette il reciproco scorrimento del derma e degli strati connettivali profondi.

L’ipoderma rappresenta una riserva energetica per il nostro corpo perché è la sede del deposito di adipe che costituisce il pannicolo adiposo sottocutaneo. Inoltre, l’ipoderma svolge un ruolo nella protezione contro i traumi e nel processo di termoregolazione.

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All’interno dell’ipoderma sono localizzati la base dei follicoli piliferi, i nervi cutanei, la porzione secretrice delle ghiandole sudoripare. Da qui prendono origine i plessi cutanei (che interessano il tessuto adiposo, connettivo e la parte superiore del derma) e i plessi capillari che raggiungono la parte superiore del derma e la rete capillare intorno agli annessi cutanei.14

1.4 Annessi Cutanei

Gli annessi cutanei sono strutture che hanno legame funzionale e comune origine embriologica con la pelle. Essi comprendono:

• Peli: Originano dai bulbi piliferi; sono costituiti da cellule epidermiche differenziate e organizzate a formare il pelo. Sono presenti su tutta la cute tranne nel palmo delle mani e nella pianta dei piedi. Il numero di peli varia a seconda della zona corporea considerata e a seconda delle caratteristiche di ogni individuo. Sono numerosi sul volto e sul cuoio capelluto.

La struttura di ogni pelo consiste di:

➢ Follicolo pilifero: È il bulbo dal quale origina il pelo. È accolto in una invaginazione tra epidermide e derma.

➢ Radice affondata nel derma.

➢ Muscolo erettore del pelo: Si trova nella radice del pelo e quando si contrae provoca il raddrizzamento dell’asta.

➢ Asta o fusto: parte del pelo che sporge dalla cute. Consiste in una cuticola esterna che riveste una corteccia di cheratinociti e un midollo interno di cellule vitali.15

• Ghiandole sebacee: Ghiandole che derivano da cellule epidermiche. Distribuite su tutta la superficie corporea tranne nelle zone più cheratinizzate come il palmo delle mani e la pianta dei piedi. Sono ghiandole alveolari composte, costituite da un dotto escretore unico capaci di secernere sebo all’interno del follicolo pilifero. Secrezione continua. Il meccanismo di secrezione prevede un progressivo accumulo di sebo all'interno delle cellule secernenti, che aumentano sempre più di dimensioni, fino a scoppiare. Per questo motivo all'interno del follicolo pilifero viene riversato non solo il sebo, ma anche il residuo delle cellule che l'hanno prodotto. Questa necrosi è compensata dalla continua produzione di nuove popolazioni cellulari. Il sebo prodotto da queste ghiandole fa parte della pellicola idrolipidica che influenza le caratteristiche di permeabilità dell’epidermide ed ha caratteristiche difensive, protegge contro i raggi UV. Inoltre,

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queste ghiandole sebacee costituiscono un segnale ormonale e trasportano antiossidanti sulla superficie cutanea.

• Ghiandole sudoripare: Ghiandole che si trovano nel derma. Esistono due tipi di ghiandole sudoripare:

➢ Eccrine: sono ghiandole esocrine. Contribuiscono alla regolazione dell’equilibrio idrico fisiologico e del film idrolipidico cutaneo, ma sono essenzialmente implicate nella funzione termoregolatrice. Affondano fino all'ipoderma e comprendono una parte convoluta, che rappresenta l'unità secernente, ed un dotto escretore che si apre sulla superficie corporea. Ogni ghiandola sudoripara è riccamente vascolarizzata e circondata da una rete di terminazioni prevalentemente adrenergiche. La secrezione è discontinua, è regolata da vari stimoli. Il secreto è particolarmente fluido e trasparente.

➢ Apocrine: Ghiandole che si aprono nel follicolo pilifero. Si trovano solo in alcune regioni anatomiche: nel cavo ascellare, intorno alle areole mammarie, nella regione pubica e a livello del perineo.

Sono formate da una porzione secernente raggomitolata e da una porzione tubulare semplice.

La secrezione è continua, e avviene mediante parziale perdita dell’apice cellulare. Il secreto si accumula nel lume e viene eliminato per contrazione delle cellule mioepiteliali innervate da fibre adrenergiche. Il secreto delle ghiandole apocrine è viscoso e opaco; la presenza di acidi grassi esterificati può far variare il suo colore da latteo a giallastro.

Il sudore ha un pH che varia tra 4 e 6.5; è costituito per il 98-99% di acqua e 1% di soluti (¾ sostanze inorganiche, prevalentemente NaCl e ¼ sostanze organiche: urea, acido urico, creatinina, acido lattico).15-17

2. PERMEAZIONE CUTANEA:

2.1 Vie di penetrazione attraverso la cute

La cute è una via alternativa per la penetrazione di farmaci, con diversi vantaggi come, migliore accettazione da parte del paziente, riduzione degli effetti collaterali causati dalla somministrazione orale e parenterale, ampia superficie per la amministrazione del farmaco, e bassa degradazione enzimatica.

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Il processo di assorbimento cutaneo si divide in tre step: 1. Penetrazione: la sostanza entra nella cute.

2. Permeazione: la sostanza passa da uno strato cutaneo ad un altro. 3. Assorbimento: la sostanza raggiunge il sistema vascolare.

Fig. 3 - Vie di penetrazione cutanea18

Un farmaco per essere assorbito deve attraversare tutte gli strati della pelle, ma la permeazione cutanea di un farmaco è fortemente limitata dallo strato corneo, a causa della bassa permeabilità dei suoi elementi cellulari alla maggior parte dei soluti. Ci sono tre vie di penetrazione attraverso lo strato corneo (fig.3).

• Via intercellulare o via lipofila: la penetrazione avviene tra le cellule dello strato corneo. Via preferita dai farmaci idrofobici.

• Via transcellulare o via idrofila: la penetrazione avviene attraverso le cellule dello strato corneo. Via preferita dai farmaci idrofili. Le molecole che seguono questa via devono comunque attraversare la via intercellulare per passare da un corneocito all’altro. • Via pilosebacea: la penetrazione avviene attraverso i follicoli piliferi e le ghiandole

sudoripare o sebacee. Il contributo di questa via è irrilevante in quanto solo 0.1% della superficie corporea è coperta da queste strutture. Per le nano e micro particelle la via attraverso i follicoli piliferi è la via principale di penetrazione.

Seguendo il modello di diffusione passiva attraverso lo strato corneo, il trasporto del principio attivo è controllato dal suo coefficiente di diffusione dentro i lipidi dello strato corneo, dalla ritenzione per assorbimento alla cheratina dei corneociti, e dal suo coefficiente di ripartizione tra la formulazione del principio attivo e i lipidi dello strato corneo. A sua volta, questi parametri dipendono da la massa molare del farmaco, dal numero di donatori e accettori di legami a idrogeno che ha nella sua struttura, e dal coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua. Seguendo la regola di Lipinski, anche chiamata

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regola del 5, se una molecola ha massa molare maggiore di 500, ha più di 5 donatori di legami a idrogeno, più di 10 accettori di legami a idrogeno e un coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua maggiore di 5, si potrà aspettare una ridotta permeazione da parte di questa molecola.19

2.2 Meccanismo di passaggio di un farmaco attraverso la barriera

cutanea:

Le sostanze permeano attraverso lo strato corneo principalmente attraverso diffusione passiva. In accordo con la legge di Fick, la diffusione avviene secondo il gradiente di concentrazione, le sostanze tendono a muoversi dalla zona di concentrazione maggiore a la zona di concentrazione minore. Lo strato corneo si comporta come una membrana pseudomogenea; la quantità Q di una sostanza che passa attraverso una barriera di area A nell’unità di tempo, è conosciuta con il termine Flusso, J:

J =

𝑑𝑄

𝐴 𝑑𝑡

Il flusso è proporzionale al gradiente di concentrazione dC/dx, quest’ultimo è dato dal rapporto tra la differenza di concentrazione ai due lati della membrana e lo spessore della membrana stessa (X):

J = - D

𝑑𝐶

𝑑𝑋

dove D rappresenta il coefficiente di diffusione del penetrante, C la concentrazione, X la distanza percorsa dal permeante attraverso la barriera.

Da qui la I legge di Fick può essere riscritta come20:

dQ (C1-C2) J = --- = ---

A dt h

dove:

dQ/dt = velocità di permeazione cutanea della sostanza attiva

(C1-C2) = indica la concentrazione del farmaco ai lati della membrana D = coefficiente di diffusione della sostanza attiva

A = superficie interessata dall’assorbimento h = spessore dello strato corneo

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Il coefficiente di diffusione D di un composto dà un’indicazione circa la resistenza della barriera al passaggio attraverso di essa, ed è dato dalla legge di Stokes-Einstein:

D = KT / 6 π ν r

dove K è la costante di Boltzman; T è la temperatura assoluta; r il raggio idrodinamico del principio attivo che diffonde; ν la viscosità.

Il coefficiente di diffusione è, quindi, inversamente proporzionale alla viscosità del mezzo. La dipendenza di D dal peso molecolare è minima, poiché è necessaria una grande variazione di questo per influenzare significativamente il raggio medio r21.

Elemento fondamentale del processo di diffusione è il coefficiente di ripartizione K, ottenuto dal rapporto tra la solubilità della sostanza nello strato corneo (di natura lipofila) e nel veicolo, indicando l’affinità del principio attivo per lo strato corneo.

Visto che non si conoscono C1 e C2, ma si conoscono le concentrazioni nella fase donatrice (veicolo o formulazione) e nella fase ricevente (fluidi biologici), si assume che all’interfaccia barriera-fase donatrice e barriera-fase ricevente esiste un equilibrio termodinamico, che può essere descritto per mezzo del coefficiente di ripartizione del diffondente tra membrana e fase donatrice o ricevente come segue:

K =

𝐶1 𝐶𝑑

=

𝐶2 𝐶𝑟

=

𝐶𝑑 𝐶𝑟

In cui Cd e Cr sono le concentrazioni della sostanza attiva nella fase donatrice e nella fase ricevente.

Un basso valore di K corrisponde ad una tendenza della sostanza a rimanere nel veicolo; un elevato valore di K, d’altra parte, indica una limitata affinità per il veicolo ed una elevata velocità di rilascio.

Quindi, considerando che Cd = KC1 e Cr = KC2, la I equazione di Fick diventa:

𝑑𝑄 𝐴 𝑑𝑡

=

𝐾 𝑥 𝐷 𝑥 (𝐶𝑑−𝐶𝑟) ℎ

18

Poiché la concentrazione della sostanza attiva nei fluidi biologici è molto più piccola di quella nel veicolo, Cr può essere considerata irrilevante e la formula può essere riscritta:

𝑑𝑄 𝐴 𝑑𝑡

=

𝐾 𝑥 𝐷 𝑥 𝐶𝑑 ℎ

Inoltre, il coefficiente di ripartizione K, il coefficiente di diffusione D e lo spessore h possono essere raggruppati nel coefficiente di permeabilità, P:

P =

𝐾 𝑥 𝐷

ℎ

Quindi il flusso può essere riportato come segue:

J = P x Cd

Durante gli studi in vitro è possibile seguire nel tempo la permeazione cutanea di una sostanza attiva attraverso la barriera dello strato corneo, monitorando la quantità di prodotto presente nella fase ricevente, da cui viene costruito un grafico riportando la concentrazione di principio attivo che diffonde attraverso la barriera. Il periodo in cui non è ancora stato raggiunto lo stato stazionario è denominato lag time, una misura del tempo necessario al principio attivo per saturare la barriera cutanea, ed è influenzato notevolmente dallo spessore della membrana e dal coefficiente di diffusione del principio attivo secondo la seguente relazione:

Lag time = h2 / 6D

Una volta raggiunto lo stato stazionario, il flusso rimane costante.

2.3 Fattori che influenzano l’assorbimento cutaneo

L’assorbimento cutaneo di una sostanza è un processo dinamico influenzato da vari fattori prima di riuscire ad avere l’ingresso sistemico della sostanza.

19

Il grado di penetrazione di un principio attivo attraverso la pelle dipende da diversi fattori, tra i quali possiamo trovare: le caratteristiche chimico-fisiche del farmaco, la formulazione del veicolo e le condizioni dello strato corneo.22

2.3.1 Caratteristiche chimico-fisiche del farmaco

Da queste caratteristiche dipenderanno le interazioni che la sostanza avrà con i componenti della pelle e il suo grado di penetrazione.

La permeazione attraverso la cute può essere influenzata da proprietà come la solubilità del farmaco in acqua, le sue dimensioni molecolari, il suo comportamento a seconda del pH, la sua concentrazione, e la sua stabilità.

Solubilità:

Le sostanze che hanno un logP [coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua] tra 1 e 3 e che hanno buona solubilità in solventi lipofili e in acqua, permeano bene attraverso la cute.23 Le molecole che hanno scarsa solubilità in acqua possono dare origine ad un deposito, diventando sorgenti costanti di farmaco, anche se la quantità disponibile per l’assorbimento può risultare insufficiente.

pH:

Un farmaco nella forma non ionizzata attraversa lo strato corneo più facilmente della forma ionizzata, perché è più liposolubile, quindi le condizioni di pH, influenzando il grado di dissociazione del farmaco, possono modificare la permeazione transdermica.24

Dimensioni molecolari:

La dimensione molecolare regola la diffusione delle molecole di farmaco attraverso le membrane biologiche e può diventare un ostacolo alla permeazione. Un peso molecolare intorno a 800 Da è il limite massimo per poter diffondere liberamente attraverso lo strato corneo.22,25

Concentrazione:

Determina l’attività termodinamica e influenza la diffusione del farmaco dentro e fuori il veicolo; per una diffusione ottimale la concentrazione dovrebbe essere mantenuta alla saturazione.26

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Stabilità del farmaco:

È una condizione essenziale per l’applicazione del prodotto sulla cute; può essere significativamente influenzata da enzimi metabolici cutanei implicati in reazioni di ossidazione, idrolisi, e deaminazione in grado di modificare chimicamente le sostanze applicate con possibile perdita di biodisponibilità. La stabilità di un principio attivo può influenzare le sue dimensioni, la sua forma, le sue proprietà superficiali, e di conseguenza il suo coefficiente di diffusione tra il veicolo e la cute. 26

2.3.2 Formulazione del veicolo

Il veicolo è definito dalla tipologia di formulazione e dagli eccipienti27_{. Il veicolo e gli}

eccipienti possono influenzare la velocità e l’intensità dell’assorbimento e conseguentemente la biodisponibilità e l’efficacia; sono infatti in grado di influire su caratteristiche dello strato corneo quali la sua idratazione, e sul coefficiente di ripartizione/diffusione del principio attivo. Per idratare la cute si possono usare, per esempio, veicoli con caratteristiche occlusive tali che la loro applicazione formi una pellicola in grado di impedire l'evaporazione dell'acqua. In questo modo l'acqua, che è presente negli strati più profondi della pelle, raggiunge gli strati superficiali aumentandone l'idratazione che passa dal normale 10% a circa 50%; in queste condizioni la penetrazione di corticosteroidi attraverso la cute può aumentare di circa 100 volte. Viceversa, la cessione di principi attivi lipofili può risultare molto ridotta a causa dell’elevata affinità per il mezzo disperdente; i glicoli, sotto forma liquida come il glicol propilenico o semisolida come il glicol polietilenico, influenzano la ripartizione tra veicolo e strato corneo aumentando la solubilità dei farmaci lipofili all’interno di esso. Infatti, assorbono acqua endogena dall’epidermide e diminuiscono l’idratazione dello strato corneo.

Al contrario i solventi aprotici come il dimetilsolfossido, DMSO, aumentano significativamente la velocità di penetrazione dei farmaci idrofili attraverso la cute, in quanto il loro carattere di igroscopicità provoca una forte idratazione dello strato corneo; sono però dotati di una certa tossicità ed il loro uso è limitato.

Facendo considerazioni sul pH, ad esempio, l’assorbimento di principi attivi con caratteristiche acide potrà essere aumentato usando un veicolo acido, in quanto quest'ultimo favorirà la forma indissociata, priva di carica.

Gli emulsionanti e tutte le sostanze tensioattive in genere offrono la possibilità di accelerare la penetrazione di un farmaco svolgendo un’azione complementare al veicolo.

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Tra le diverse forme farmaceutiche gli idrogeli, le sospensioni acquose e le emulsioni O/A si comportano sulla pelle come mezzi acquosi, mentre gli unguenti, le paste anidre e le emulsioni A/O funzionano come sistemi lipidici.

2.3.3 Condizione dello strato corneo

Lo strato corneo fornisce una barriera fisica sia contro agenti patogeni, irritanti e radiazioni UV sia contro l’assorbimento dei farmaci. Inoltre, protegge l’organismo da perdita di acqua e soluti. Lo strato corneo è costituito da corneociti anucleati ricchi di filamenti di cheratina e di una matrice lipidica la quale ha come componenti principali ceramidi, acidi grassi e colesterolo. Il contenuto di acqua nello strato corneo va dal 10 al 15% ed è prevalentemente associato alla cheratina intracellulare. Il grado di idratazione dello strato corneo dipende dalla quantità di acqua assorbita dagli strati sottostanti, dalla quantità di acqua persa per evaporazione, determinata da fattori ambientali quali temperatura, umidità e ventilazione, così come dalla capacità dello strato corneo di trattenere l'acqua28. La regolazione dell'idratazione della cute è dovuta al NMF (natural moisturizing factor, fattore di idratazione naturale), un insieme di sostanze solubili in acqua presenti nello strato più esterno della cute. Queste sostanze, in parte provengono dalla secrezione delle ghiandole sudoripare e sebacee, e in parte dalla degradazione della cheratina e dei lipidi.29

La composizione del NMF è data da: aminoacidi 40%, acido piroglutamico 12%, lattato di sodio 12%, urea 7%, glucidi 4%, sali 25%30_{. Queste sostanze, oltre all’idratazione, regolano}

anche il pH cutaneo in un range tra 5.5 – 6.5 (funzione tampone). Mantenere l’idratazione cutanea a livelli opportuni è fondamentale per facilitare il passaggio delle sostanze polari: la porzione proteica si rigonfia per assorbimento di acqua, aumentando la grandezza dei pori.31 Nello spazio intercellulare il basso contenuto di acqua legata ai gruppi polari non altera l'organizzazione dei lipidi e non ne riduce la permeabilità. Tuttavia, sembra esistere un meccanismo omeostatico che previene l’iperidratazione della cute; l'occlusione può aumentare notevolmente l'assorbimento di sostanze idrofile, ma in molti casi si tratta di un effetto riserva.

Un altro fattore importante è la temperatura: aumentando la temperatura si ha una diminuzione di viscosità del veicolo, con conseguente aumento della diffusione attraverso di esso.29

Alterazioni dell'umidità esterna possono influire sulla proteolisi della fìlaggrina, sulla sintesi di lipidi, DNA e proteine all'interno dei cheratinociti.

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Inoltre, l’assorbimento è molto influenzato dalle caratteristiche anatomiche della cute al sito di assorbimento: decresce progressivamente dalle palpebre alla pianta del piede, perché la permeabilità è inversamente proporzionale allo spessore. Subentrano poi, altri fattori che determinano il grado di penetrazione come la densità degli annessi cutanei, l’area superficiale dei corneociti, il contenuto di lipidi intercellulari. Alterazioni della barriera cutanea sia attraverso metodi chimici che fisici, possono produrre un'alterazione del TEWL (transepidermal water loss) in seguito a variazioni di tipo strutturale, con variazioni nel processo di assorbimento transdermico19.

Altri aspetti connessi con le condizioni dello strato corneo, che possono alterare la permeabilità sono:

• Integrità dello strato corneo: eventuali lesioni dovute ad insulti meccanici o termici possono far variare l’assorbimento.

• Presenza di patologie cutanee: i processi patologici possono compromettere la barriera cutanea in modi diversi:

→ Influenzando direttamente la composizione di proteine e lipidi, come nel caso dell’ittiosi, dermatite atopica e dermatite da contatto.

→ Alterando il processo di proliferazione dei corneociti, come nella psoriasi.

• Esposizioni ai raggi UV: Se è cronica si avrà un aumento del contenuto lipidico della cute e di conseguenza si avrà un incremento della barriera. Mentre se è acuta si avrà una diminuzione della funzione barriera data da intensa desquamazione.

• Età: La cute del neonato ha una aumentata capacità di assorbimento rispetto a quella dell’adulto, questo per via che il suo strato corneo è molto più sottile e idratato. Nell’anziano il rinnovamento cellulare cutaneo e lo spessore epidermico sono ridotti, mentre lo strato corneo risulta ispessito e meno permeabile; questo provoca un rallentamento sia dell’assorbimento cutaneo che della capacità di ripristino della barriera in seguito a danneggiamento.

• Razza: Lo strato corneo di individui di etnia nera presenta una maggiore stratificazione ed è generalmente meno permeabile rispetto a quello di individui caucasici, sebbene lo spessore sia analogo.

• Sede anatomica: L’assorbimento è molto influenzato dalle caratteristiche anatomiche della cute al sito di assorbimento; la permeabilità è inversamente proporzionale allo spessore, per cui si avrà un assorbimento maggiore alle palpebre e minore alla pianta

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del piede. Altri fattori che determinano il grado di penetrazione sono la densità degli annessi cutanei, l’area superficiale dei corneociti e il contenuto dei lipidi intercellulari. • Variabilità individuale: a parità di età, sesso e sito di applicazione, l’assorbimento

cutaneo può variare per cause costituzionali ed endocrine.

2.3.4 Promotori della permeazione

L’assorbimento cutaneo di sostanze attive da formulazioni topiche è circa l’1-5 % della dose applicata, è per questo che diventa fondamentale l’utilizzo dei promotori della permeazione, i quali sono sostanze che facilitano la permeazione dei principi attivi attraverso la pelle diminuendo temporalmente la impermeabilità della pelle. Il promotore ideale dovrebbe essere farmacologicamente inerte, non tossico, non irritante, non allergenico, compatibile con il principio attivo e con gli eccipienti del farmaco, economico, buone proprietà come solvente e non dovrebbe avere colore né sapore. Al togliere il promotore, la pelle dovrebbe immediatamente riguadagnare le sue proprietà di barriera. Ad ora, non esiste un promotore con tutte queste caratteristiche.32

Tutte le sostanze che alterano lo stato di idratazione della pelle possono essere considerate promotori della permeazione cutanea.23

3. METODI PER VALUTARE LA PENETRAZIONE E

LA PERMEAZIONE CUTANEA IN VITRO

Gli studi di permeazione e penetrazione dei farmaci possono essere condotti in vivo seguendo protocolli sperimentali ed in vitro mediante celle di diffusione. Con la sperimentazione in vitro è possibile definire la cinetica di permeazione delle sostanze attive attraverso cute isolata, eliminando i problemi derivanti dalla farmacocinetica della molecola in esame. I metodi in vitro sono utili nella fase preformulativa e di sviluppo formulativo. Gli studi in vitro possono essere condotti su cute umana, cute animale o su cute ricostituita. La cute umana, difficilmente reperibile, ha un’enorme variabilità da campione a campione, dovuta a differenze di localizzazione anatomica, età, sesso, causa di morte e metodo di conservazione. Rappresenta comunque il metodo più valido per valutare la capacità dei farmaci di penetrare e permeare la cute cute.33

I problemi legati alla reperibilità di pelle umana ed alla riproducibilità dei dati ottenuti vengono superati con l’uso di modelli animali, in particolare topi “hairless”, ratti, cavie, conigli e maiali. La pelle animale può essere scelta, a seconda delle esigenze sperimentali e

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delle caratteristiche richieste, non solo in base alla specie ma anche in base all’età ed al sesso34.

Il problema maggiore, quando viene usata la pelle di animali come modello di cute umana, è la sopravalutazione della permeabilità cutanea, conseguente anche a condizioni sperimentali non conformi alla situazione fisiologica ad esempio l’idratazione elevata dovuta all’esposizione prolungata della pelle di roditore alla fase ricevente e donatrice del sistema di diffusione; questo comporta una marcata riduzione delle proprietà di barriera della cute. La pelle di roditore, usata da molto tempo, ha delle limitazioni che riguardano, principalmente, il più basso spessore del derma (0.84 mm) rispetto a quello umano (2.5 mm) rendendo l’influenza di questo strato sulla permeabilità cutanea trascurabile anche se lo spessore dello strato corneo è simile a quello umano; inoltre differenze marcate riguardano la composizione dei lipidi e la loro organizzazione. Il maiale è stato usato come modello alternativo. Le caratteristiche istologiche della cute di maiale sembrano comparabili a quelle della cute umana con notevoli similitudini nello spessore e nella composizione dell’epidermide, nella densità follicolare, nella struttura del derma, nel contenuto lipidico e nella morfologia generale. Nel maiale, il diametro follicolare è maggiore, per cui la via attraverso gli annessi cutanei può diventare importante ed avere effetto significativo sulla permeabilità cutanea di alcune sostanze. Studi comparati utilizzando diversi substratihanno determinato la permeabilità in vitro di composti idrofili e lipofili attraverso cute di maiale, pelle umana e ratto. I risultati ottenuti con cute di maiale erano comparabili a quelli con pelle umana (parte addominale) e ratto (parte dorsale).33

La pelle dell'orecchio di maiale è stata utilizzata nell'ambito di studi in vitro come sostituto rispetto alla cute dell'uomo. La struttura di questo tessuto è stata studiata sia qualitativamente che quantitativamente e dalle informazioni disponibili sugli studi comparati di penetrazione nell’uomo e nel maiale risulta che, rispetto alla pelle proveniente da altre zone del corpo di questo animale, quella dell’orecchio rappresenta il modello migliore che possa essere utilizzato per gli studi di penetrazione transdermica35. In uno studio di Rolland et al.36 è riportata una buona correlazione tra la pelle del cuoio capelluto umano e la pelle dell’orecchio di maiale in rispetto al diametro follicolare e all’assorbimento cutaneo ed una buona correlazione tra la pelle del cuoio capelluto umano e la testa di maiale in rispetto alla densità follicolare (Fig.4).19

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Fig.4- Assorbimento percutaneo in vitro. (La quantità permeata è espressa in % di dose applicata).19

La cute di orecchio di maiale è istologicamente simile alla pelle dell'uomo (Fig. 5): lo spessore dello strato corneo è di 21-26 µm, rispetto a quello umano il cui spessore varia in un range di 6-19 µm, in base alla regione del corpo considerata; sono stati ritrovati cheratinociti a livello dell'epidermide vitale e, al confine con il derma, sono state individuate cellule basali. Lo spessore dell’epidermide vitale di circa 72 µm è comparabile con quello nell’uomo a livello delle spalle di 70 µm. I sottostanti strati di pelle, principalmente costituiti dal derma, sono spessi circa 1,86 mm, mentre negli esseri umani, lo spessore massimo che raggiunge il derma è stato osservato a livello della schiena pari a 1.8-1.9 mm; nelle altre regioni del corpo si arriva ad uno spessore di 1 mm.

Come nell’uomo le ghiandole sebacee sono associate al follicolo pilifero e le ghiandole sudoripare osservate nel derma sono connesse alla superficie cutanea attraverso un condotto, similarmente all’organizzazione delle ghiandole sudoripare eccrine umane.

Paragonabile tra le due specie è l'intensa densità di follicoli piliferi che, nella pelle dell'orecchio del maiale è di 20/cm2, mentre nell'uomo soprattutto a livello del cuoio capelluto si osserva una densità di follicoli piliferi massima di 14-32/cm2. L’estensione dei peli e degli infundiboli (parte tra pelo e follicolo) attraverso il derma è molto simile fra le due specie, differisce il diametro sia del pelo, che degli orifizi infundibolari in quanto più largo nella pelle dell’orecchio del maiale. L’ipoderma appare come un tessuto connettivo, ben vascolarizzato, posto all’interfaccia tra derma e strutture sottostanti e la popolazione cellulare che lo caratterizza è costituita da adipociti. In particolare, negli adipociti suini l’espressione pericellulare di vimentina e proteina S100 è scarsa come nella pelle umana. Dallo studio condotto da Debeer et. al è stato osservato oltre alle analogie, le differenze istologiche principali tra la cute di maiale e la cute umana che a carico della pelle di maiale

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sono: un minore spessore dello strato granulare; minore quantità di melanina e di melanociti nello strato cellulare basale; maggiore distribuzione delle ghiandole sudoripare apocrine rispetto a quelle eccrine; e più sparse ma di dimensioni minore ghiandole sebacee.37

Fig. 5 - Aspetti istologici della pelle del maiale (A) e dell’uomo (B). HF: follicolo pilifero, Mu: muscolo

erettore del pelo, SwG: ghiandola sudoripara, SG: ghiandola sebacea, Ad: adipociti.37

Il contenuto lipidico dello strato corneo umano è noto per la sua importanza in qualità di regolatore della permeabilità cutanea e un aspetto importante dell’impiego della pelle di orecchio del maiale nell'ambito di studi di permeazione condotti su molecole lipofile e/o idrofile è che la permeabilità dello SC nell’orecchio del maiale è simile a quella della pelle umana. Questa familiarità sarebbe da attribuire proprio all'assetto lipidico del componente più esterno dell’epidermide, allo spessore della pelle, e agli aspetti morfologici della pelle sia dell'uomo che dell'animale. La distribuzione dei lipidi nello SC di entrambe le specie differisce marcatamente: nello SC dell’orecchio dei suini i lipidi sono disposti prevalentemente a formare un reticolo esagonale, mentre quelli nell’uomo si organizzano in un più denso reticolo di forma ortorombica. Nell'uomo analogamente al maiale le classi prevalenti di lipidi sono: ceramidi, colesterolo, e acidi grassi liberi.

Al di là delle analogie riscontrate, la pelle dell'orecchio del maiale è anche un substrato facilmente reperibile e standardizzabile dal punto di vista di sesso, razza, età, peso dell’animale e regione anatomica considerata; inoltre la validità di impiego di questo substrato negli studi di permeazione in vitro è stata dimostrata in diversi ambiti.

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4. CANCRO DELLA PELLE

4.1 Lesione pre-cancerogena: Cheratosi attinica

La cheratosi attinica (AK) è una condizione pre-cancerosa caratterizzata dalla presenza di macule o papule ben demarcate di colore rosso-bruno, ricoperte da squame bianco giallastre tenacemente aderenti, secche e ruvide al tatto. Il loro spessore è variabile e rientra all’interno di un range che va da 1mm fino a 20 mm. Dal punto di vista isto-patologico si osserva una proliferazione intraepidermica di cheratinociti atipici. Patologicamente AK è caratterizzata da ipercheratosi orizzontale di tipo paracheratosica e ortocheratosica con epidermide atrofica o acantosica (fig. 6).38 In base a studi clinici è stato stabilito che tra 0.025 e 16% dei casi di cheratosi attinica degenerano in carcinoma spinocellulare (SCC) invasivo.39

La causa principale della cheratosi attinica è radiazione non ionizzante, principalmente radiazioni UV associata ad una esposizione cronica al sole. Le radiazioni causano cambiamenti nel DNA e mutazioni del soppressore del tumore p53, quindi in assenza dei corretti meccanismi di riparazione questi cambiamenti rappresentano l’inizio delle mutazioni dei cheratinociti e possono progredire allo sviluppo di cheratosi attinica. Inoltre, le mutazioni del gene onco-soppressore p53 possono avere un ruolo nella conversione delle lesioni pre-cancerose a SCC.40

Fig.6- Cheratosi attinica dal punto di vista isto-patologico.38

La cheratosi attinica ha un’alta incidenza in popolazioni con pelle di fototipo chiaro 1 e 2. La diagnosi di AK si basa dall’osservazione dei tipici aspetti clinici; se esiste dubbio, si fa una conferma istologica. La biopsia viene fatta del derma quando è necessario escludere un coinvolgimento più profondo.41

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4.1.2 Terapia farmacologica

Attualmente sono possibili diverse opzioni per il trattamento della cheratosi attinica, esse comprendono metodi fisici e metodi chimici.

Le metodiche fisiche comprendono:

- Crioterapia per mezzo di azoto liquido che congela e promuove la necrosi delle lesioni; - Curettage (raschiamento delle cicatrici, esclude l'intervento chirurgico per rimuovere le lesioni), escissione, peeling chimici, laser.

Questi metodi non specifici hanno il rischio di distruggere non solo le cellule atipiche, ma anche quelle sane circostanti la lesione, e di incorrere in difetti estetici da ipopigmentazione sulla parte trattata.

Un altro tipo di terapia che si può usare è la terapia topica che viene usata in pazienti con lesioni multiple.

I farmaci più utilizzati sono: • 5-fluorouracile (5-FU). • Imiquimod.

• Diclofenac sodico.

• Altri agenti topici sotto studio per il trattamento di AK come: ingenolo mebutato, resiquimod, acido betulinico, piroxicam, 5-FU combinato con acido salicilico e il fitoterapico epigallocatechina gallato.

Tra questi farmaci, dal punto di vista dell'efficacia non sono state osservate differenze statisticamente significative; ma ben diversi sono i dati relativi la clearance e il rischio di reazioni avverse.

In figura 7 è riportato uno schema di trattamento per la cheratosi attinica. I metodi di distruzione fisica (crioterapia o curettage ed elettrocoagulazione) sono indicati come trattamenti di prima linea per un numero isolato o ridotto di lesioni, mentre l'intervento chirurgico o la terapia laser sono proposti come trattamento di seconda linea in caso di recidiva e resistenza alla terapia.42

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Fig.7-Algoritmo di trattamento per la cheratosi attinica.42

4.2 Cancro della pelle non-melanoma

Per cancro della pelle non melanoma (NMSC-non melanoma skin cancer) ci si riferisce a tutti i tipi di cancro della pelle che non sono melanoma.

Tra due e tre milioni di persone in tutto il mondo vengono diagnosticate con cancro di pelle di tipo non-melanoma ogni anno, questo fa che sia tra i primi cinque tipi di cancro più costosi per il sistema della salute in diversi paesi europei. Ad esempio, in Germania il costo per il trattamento supera €130 milioni all’anno. La causa principale di questo cancro è la esposizione alle radiazioni solari UV, quindi è importante la prevenzione, quali l'uso di prodotti per la protezione solare, l'uso di indumenti adeguati come cappelli e camicie a maniche lunghe ed evitare il sole nelle ore di maggiori intensità della radiazione (dalle 11 alle 15).43

I due tipi principali di questo tipo di cancro sono: • Basalioma (carcinoma baso-cellulare). • Spinalioma (carcinoma spino-cellulare).

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4.2.1 Patogenesi di cancro di pelle di tipo non-melanoma:

Ci sono diverse vie coinvolte nella patogenesi del cancro della pelle di tipo non-melanoma (fig.8). Le diverse vie non hanno gli estesi effetti nella patogenesi del carcinoma a cellule basali e dello spino-cellulare.

ASIP e TYR, varianti del gene del recettore della melanocortina-1 (MC1R), sono associate a pelle chiara, capelli rossi, un aumento del rischio di sviluppare melanoma e potrebbero essere importanti fattori di rischio per il carcinoma cutaneo di tipo non-melanoma.44 Una delle principali lesioni del DNA indotte dai raggi UV è la produzione di dimeri di pirimidina ciclobutano (CPD), la quale contribuisce ai processi della morte cellulare e della formazione del cancro.45

Le lesioni nel DNA causate dalle radiazioni UV vengono riparate attraverso la via di riparazione dell’escissione nucleotidica, via che può essere suddivisa in riparazione accoppiata alla trascrizione e riparazione globale del genoma. La proteina XPC è una proteina specifica per la riparazione del genoma che riconosce le lesioni nell’elica e inizia la riparazione. Mutazioni che inattivano questa proteina si osservano nello xeroderma pigmentoso, una malattia caratterizzata da elevata sensibilità alle radiazioni UV e associata a carcinomi cutanei multipli.45,46

L’inattivazione del gene p53 ha un ruolo importante nell’induzione del cancro di pelle di tipo non-melanoma, perché rende le cellule resistenti all’apoptosi, risultando in una espansione clonale dei cheratinociti pre-cancerogeni. Approssimativamente, nei 90% de casi di carcinoma spino-cellulare e nel 50% dei casi di carcinoma baso-cellulare esiste una mutazione nel gene p53. Inoltre, l’inattivazione del locus CDKN2A che codifica una proteina inibitrice del ciclo cellulare è stata rilevata nel carcinoma spino-cellulare nei pazienti con xeroderma pigmentoso e carcinoma cutaneo sporadico di tipo non-melanoma.40,45,47

Nella famiglia del citocromo P450 esistono più di 30 isoforme che catalizzano la biotrasformazione di diversi xenobiotici. CYP1A1 partecipa nella difesa contro lo stress ossidativo. Studi in vitro hanno evidenziato che le radiazioni UV ossidano amminoacidi presenti nella cute, ad esempio il triptofano; per questo motivo mutazioni in CYP1A1 potrebbero aumentare la suscettibilità al cancro.48,49

La telomerasi è un enzima che rigenera i telomeri, aggiungendo segmenti formati da unità ripetitive per compensare la perdita di telomeri durante la divisione cellulare. A differenza delle cellule sane, le cellule tumorali hanno una notevole attività della telomerasi e non mostrano alcuna perdita netta della lunghezza dei telomeri durante la proliferazione

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cellulare. Questo fa sì che le cellule tumorali siano immortali. L’attivazione della telomerasi è importante nella patogenesi del carcinoma baso-cellulare e spino-cellulare.45,50

Fig.8-Vie coinvolte nella patogenesi del cancro di pelle di tipo non-melanoma.45

4.2.2 Basalioma (BCC-carcinoma baso-cellulare)

Tumore a lento accrescimento e ad aggressività locale, privo della capacità di metastatizzazione; deriva dalle cellule dello strato basale dell’epidermide. Clinicamente si può presentare inizialmente come una papula o un nodulo finemente lobulato di colore roseo o grigio perla per la presenza di depositi di melanina, a contorni ben definiti e presenza di vascolarizzazione evidente nella superficie. Il tumore può andare incontro ad ulcerazione, con formazione di una lesione a stampo o a margini irregolari, con fondo granuleggiante e bordi netti rilevati, con estensione in senso centrifugo.51

I due tipi principali di carcinoma baso-cellulare sono di tipo nodulare e superficiale. Le lesioni del tipo superficiale sono rosse, corrugate e ridimensionate in modo definitivo; presentano piccole ulcerazioni superficiali e spesso hanno diametro maggiore di 1 cm.52 Queste lesioni restano nell’epidermide e non invadono il derma.53 _{Il basalioma nodulare si}

presenta spesso come una massa rilevata a superficie irregolare traslucida, perlacea; a volte può essere ulcerata nella porzione centrale. Questi lesioni possono diventare grandi e distruggere strutture più profonde.52,53

Il basalioma rappresenta circa l’80% di tutte le tipologie di cancro della pelle di tipo non-melanoma.54 L’esposizione alle radiazioni ultraviolette rappresenta la causa principale di questo tipo di cancro; il rischio è aumentato dall’esposizione al sole durante l’infanzia e la adolescenza.55

Il trattamento standard per BCC include escissione chirurgica (rimozione del basalioma e del tessuto sano al suo intorno), terapia fotodinamica per distruggere le cellule tumorali,

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criochirurgia, curettage, e terapia farmacologica topica. L’imiquimod, farmaco immunomodulatore, si è dimostrato efficiente e sicuro in diversi studi clinici dove veniva usato come crema al 5%. In uno studio di Bianchi et al52 quattro pazienti con BCC superficiale e tre con BCC nodulare sono stati trattati con imiquimod crema 5%. In questi sette pazienti il problema è stato risolto completamente in un periodo dalle 10 alle 18 settimane (fig.9). I pazienti trattati hanno mostrato lesioni topiche locali come effetto collaterale che si sono risolte una volta interrotto il trattamento.

Fig.9- A) Carcinoma baso-cellulare nella fronte. B) Carcinoma baso-cellulare risolto dopo 16 settimane di

trattamento.52

4.2.3 Spinalioma (SCC-carcinoma spino-cellulare)

Anche chiamato carcinoma squamo-cellulare (fig.10). È il secondo tipo più comune di cancro di pelle; il rischio di sviluppare questa malattia è aumentato in tutto il mondo da un 50% a 300% negli ultimi trent’anni. È una neoplasia maligna che origina nello spessore dell’epidermide presentandosi clinicamente come una papula cheratosica o un nodulo eritematoso, in molti casi preceduto da una cheratosi solare. Lo SCC si allarga progressivamente, si può ulcerare e sanguinare. Si tratta di un tumore caratterizzato da proliferazione lobulare dei cheratinociti, invasione intradermica e produzione di cheratina. I tumori di questo tipo hanno un diametro superiore a 2 cm e presentano una scarsa differenziazione istologica.56 La forma clinica più comune di SCC è una cheratosi attinica che diventa ipercheratosi.57 Nel SCC si trova frequentemente una mutazione nel soppressore del tumore p53. Questa mutazione si trova già nella cheratosi attinica, indicando che la perdita della corretta funzione di p53 avviene prima alla invasione tumorale.

La causa più comune di SCC è la esposizione cumulativa alle radiazioni UV, per questo le sedi più colpite sono quelle foto-esposte, come capo, volto, collo, dorso delle mani, ma ogni regione cutanea può essere interessata, incluse glande, vulva, regione perianale e cavo orale. La metastatizzazione inizia tramite via linfatica.51,58 Il carcinoma spino-cellulare viene diagnosticato istologicamente. Una volta identificato si sceglie la terapia migliore per quel

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determinato paziente tenendo in considerazione il sito e le dimensioni della lesione, effetti collaterali del trattamento, la condizione medica del paziente e la sua preferenza.56 Si può usare una terapia distruttiva come la crioterapia, terapia fotodinamica, curettage; oppure si possono usare agenti topici come 5-fluorouracile, imiquimod, diclofenac e ingenolo mebutato. La terapia topica ha un basso tasso di guarigione, quindi viene usato per i pazienti con SCC non candidati per trattamenti chirurgici o radiologici a causa di uno stato avanzato della malattia e/o a un grande numero di lesioni. Il trattamento sistemico (chemioterapia) viene usato nei pazienti che hanno sviluppato metastasi.56

Fig.10-Carcinoma spino-cellulare.56

5. NANOSISTEMI IMPIEGATI NEL DRUG DELIVERY

Negli ultimi anni l’impiego delle nanotecnologie ha portato allo sviluppo di sistemi nanostrutturati impiegati nel drug delivery per la loro capacità di controllare la cinetica di rilascio dei principi attivi e la loro distribuzione nei tessuti. I “drug delivery systems” sono quei sistemi in grado di rilasciare farmaci in maniera controllata, ossia con velocità di rilascio programmate, con dosi ben precise, per periodi di tempo predefiniti e in zone specifiche. I nanosistemi possono essere sviluppati in modo da ottenere un rilascio del farmaco in risposta a stimoli fisici o biologici, come variazione di pH, di potenziale redox o presenza di enzimi specifici.59

Ci sono alcune questioni da considerare al riguardo dei nanosistemi impiegati per il drug delivery, un aspetto importante è il trasferimento tecnologico, ovvero il complicato processo che comporta il trasferimento della produzione di questi sistemi dal laboratorio alla produzione industriale su grande scala60.

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5.1 Nanosistemi impiegati nel trattamento del cancro della pelle

Il cancro è una malattia complessa ed eterogenea dovuta alla caratteristica tipica delle cellule cancerose di mutare e adattarsi all’ambiente, diventando sempre più aggressive. Inoltre, le cellule tumorali sviluppano resistenza multi-farmaco che porta al fallimento della terapia.60

I sistemi convenzionali di somministrazione cutanea o topica, soffrono di limitazioni farmacocinetiche, ovvero non vi è sincronia tra il tempo richiesto affinché la concentrazione del principio attivo raggiunga il valore soglia utile ai fini terapeutici, ed il profilo di rilascio del farmaco che segue meccanismi diffusionali. In tal modo, il farmaco si distribuisce più o meno estesamente a livello sistemico e pertanto, affinché venga raggiunta una concentrazione di farmaco efficace nel sito d’azione per il periodo di trattamento terapeutico, è necessaria la somministrazione in dosi elevate e ripetute con il conseguente instaurarsi di effetti tossici secondari.61 L’utilizzo di nanocarriers ci permette di sfruttare la loro capacità di trasportare e rilasciare in modo selettivo i farmaci nel sito d’azione aumentando l’efficacia terapeutica. Inoltre, questi sistemi proteggono i principi attivi da inattivazione da parte dell’ambiente fisiologico prima di raggiungere il target. Da questo concetto di base sono stati sviluppati numerosi sistemi di drug delivery, formati da strutture colloidali, quali liposomi, micelle e dendrimeri (fig.11).60

Fig.11- Struttura di alcuni sisitemi nanostrutturati: dendrimeri, micelle e liposomi .62

Le dimensioni nanometriche conferiscono a questi sistemi proprietà chimico-fisiche e farmacocinetiche uniche. I nanosistemi possono infatti transitare all’interno dei piccoli capillari, attraversare le barriere biologiche e penetrare nelle cellule, favorendo l’accumulo dei farmaci a livello dei siti bersaglio e in distretti altrimenti inaccessibili.63 Le nanoparticelle polimeriche, ad esempio, sono particelle sferiche solide con diametro medio compreso tra 10 e 1000 nm e, proprio grazie alle loro dimensioni, hanno la capacità di agire da carrier per veicolare il farmaco nel sito d’azione, cosa che non solo aumenta l’efficacia terapeutica ma permette di ridurre la dose totale del farmaco somministrata e, quindi, gli effetti collaterali. La modalità di rilascio del farmaco da questi sistemi è determinata principalmente dalle

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proprietà chimico-fisiche e meccaniche del materiale polimerico impiegato per la preparazione e dalle tecnologie di formulazione. La grande varietà di polimeri a disposizione, assieme alla possibilità di introdurre variazioni nella composizione della matrice polimerica, permette quindi di sviluppare molteplici dispositivi con una diversa capacità di controllo sul rilascio del farmaco. In particolare, le nanoparticelle polimeriche, principalmente ottenute da poliesteri, poliammidi e poliuretani, presentano un’elevata biodegradabilità e biocompatibilità che le rende adatte per il drug delivery. Queste possono intrappolare al loro interno il farmaco e rilasciarlo nel tempo, permettendo ad esso di raggiungere meglio il sito d’azione.

Le micelle polimeriche sono composte comunemente da copolimeri a blocchi, costituiti da un segmento idrofilico (polietilenglicole) coniugato ad una catena polimerica idrofobica (poliesteri, poliacrilati, polipeptidi). Questi polimeri tendono ad organizzarsi in strutture ordinate di tipo “core-shell”, in cui il core o nucleo è formato dalla frazione idrofobica e può essere caricato con farmaci lipofili, mentre l’involucro esterno di natura idrofilica conferisce solubilità al sistema, prolungando così l’emivita in circolo delle molecole veicolate64 (Fig.12).

Fig.12- Nanosistema polimerico multifunzionale usato per il rilascio di farmaco.60

Gli agenti terapeutici contenuti all’interno delle micelle possono essere rilasciati per diffusione attraverso la matrice idrofobica o a seguito del disassemblamento della micella stessa, indotto solitamente da particolari stimoli microambientali come variazioni di pH e temperatura. Grazie alla peculiare struttura delle nanomicelle, questi sistemi vescicolari

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possono trasportare farmaci lipofili, poco solubili nei fluidi biologici, migliorandone la solubilità in acqua.65

5.2 Meccanismo di rilascio dei sistemi nanostrutturati

L’impiego di nanoparticelle polimeriche permette il direzionamento specifico dei farmaci verso i distretti dell’organismo in cui risiede il loro target farmacologico, potenziandone l’efficacia terapeutica e riducendo al minimo le interazioni non specifiche.

Attualmente, ci sono diversi nanosistemi impiegati per il trattamento di diversi tipi di cancro; ad esempio Genexol-PM®, nanomicella polimerica approvata per il trattamento di tumori al seno, ai polmoni e alle ovaie in Corea del Sud.66 I nanosistemi in uso hanno dimostrato avere proprietà positive come un tempo di circolazione prolungato, migliori profili farmacologici, minori effetti avversi, e migliore tolleranza ai farmaci rispetto agli approcci clinici convenzionali. Tuttavia, tante di queste nanoformulazioni hanno un lento e insufficiente rilascio di farmaco nel sito patologico; questo può risultare in che i benefici terapeutici siano compromessi.67

Negli ultimi anni, particolare attenzione è stata data allo sviluppo di nanosistemi responsivi all’ambiente intracellulare che siano stabili in condizioni extracellulari e che rilascino il farmaco rapidamente una volta arrivati al target terapeutico (cellule cancerogene). L’aumentata permeabilità vascolare, che si riscontra a livello delle masse tumorali e dei tessuti in stato infiammatorio, permette ai carriers di dimensioni comprese tra 10 e 300 nm di attraversare l’endotelio ed occupare gli interstizi cellulari. Polimeri sensibili a variazioni di pH o temperatura possono essere impiegati per liberare il principio attivo in distretti infiammati e tessuti tumorali. Il rilascio di farmaci caricati nelle micelle avviene a seguito dell’interazione con la superficie cellulare: generalmente si verifica la fusione della sua porzione lipidica con la membrana citoplasmatica con conseguente trasferimento del principio attivo nello spazio intracellulare, oppure le micelle vengono assorbite dalle cellule attraverso un processo di endocitosi.68 Le cellule cancerogene hanno un pH più basso nei compartimenti endo/lisosomiali, hanno un numero abbondante di enzimi nei lisosomi , e un alto potenziale redox nel citosol e nel nucleo cellulare (fig.13). Queste caratteristiche vengono sfruttate come stimoli interni per avere il rilascio del farmaco dai nanosistemi all’interno delle cellule cancerose.67,69

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Fig.13-Rappresentazione grafica dei nanosistemi responsivi all’ambiente intracellulare delle cellule

cancerose.67

La composizione chimica del polimero risulta determinante per permettere la realizzazione della cinetica di cessione del farmaco desiderata con conseguente ottimizzazione del suo profilo di attività70.

6. NANOMICELLE

Le nanomicelle sono principalmente utilizzate per preparare soluzioni acquose di farmaci insolubili in acqua. Queste particelle nanostrutturate sono formate da molecole anfifiliche (tensioattivi o polimeri) che si auto-assemblano in acqua a creare strutture con dimensioni da 10 a 100 nm e forma sferica, cilindrica o a stella, a seconda del peso molecolare. Queste strutture permettono l’incapsulamento di farmaci lipofili aumentando la loro solubilità̀ in acqua grazie alla formazione di interazioni idrofobiche, forze di Van der Waals e legami a idrogeno.71

6.1 Nanomicelle tensioattive

I tensioattivi sono molecole anfifiliche con testa idrofila e coda idrofobica. La testa idrofila può essere caricata (anionica o cationica), zwitterionica o non ionica. I tensioattivi hanno la capacità di alterare proprietà interfacciali e di superfici e di auto-assemblarsi e solubilizzarsi in micelle; per questo motivo vengono usati per preparare le nanomicelle.72

In soluzioni acquose, concentrazioni diluite di tensioattivo (al di sotto della CMC) si comportano come elettroliti normali; mentre ad elevate concentrazioni (ad elevati valori di CMC) formano aggregati di un gran numero di molecole, chiamati micelle, in cui le parti