Tecniche di individuazione dei parassit

3.3.1 Speratura

La speratura è una delle tecniche più comunemente impiegate per la ricerca di larve anisakidi nei filetti di pesce. Questi vengono posti su una lastra di vetro al di sotto della quale vi è una sorgente luminosa, costituita da tubi al neon in grado di produrre, al di sopra del piano di lavoro, circa 400 lux a una distanza di 13 cm. Tale tecnica è indicata dal Codex Alimentarius come metodo ufficiale per il rilevamento dei nematodi nei blocchi surgelati di filetti di pesce e, in alcuni paesi quali il Canada, viene utilizzata durante le fasi di lavorazione del prodotto in modo da poter eliminare, a seconda del grado di infestazione, la sola porzione infestata o l’intero filetto. Tuttavia, l’efficienza della speratura non risulterebbe molto alta, consentendo di rilevare non oltre il 33 % dei pesci infestati con l’utilizzo di filetti spellati e percentuali ancora minori con quelli non spellati (Karl H. and Leinemann M., 1997; McClelland G., 2002). I risultati possono essere migliorati utilizzando sorgenti luminose con diverse lunghezze d’onda e/o intensità al fine di aumentare il contrasto tra parassita e tessuti del pesce, anche se permangono grosse difficoltà nell’utilizzare la speratura su filetti di pesci con carni scure (Pozio E., 2005; Lymbery A.J. and Cheah F.Y., 2007), data la già scarsa penetrazione della luce bianca nel muscolo di pesce (Hafsteinsson H. and Rizvi S.S.H., 1987).

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Un altro accorgimento utilizzabile per aumentare sensibilmente l’efficienza della speratura è quello di comprimere, tra due lastre di Plexiglass (polimetilmetacrilato), filetti dello spessore di circa 3-4 mm per poi sottoporli a speratura con una sorgente luminosa da 1500 lux (Karl H. and Leinemann M., 1997).

Una variante della speratura classica prevede l’utilizzo dei raggi ultravioletti (UV) e sfrutta la fluorescenza post-mortem degli anisakidi in presenza di lunghezze d’onda di circa 366nm. In alcuni nematodi, questa fluorescenza sembrerebbe dovuta ad un estere dell’acido antranilico (derivato del triptofano) che viene accumulato nei granuli delle cellule intestinali e rilasciato nel citoplasma alla morte del parassita(Coburn C. et

al., 2013). La percentuale di rilevamento con questa tecnica (60 %) risulta migliore rispetto alla speratura classica, ma i nematodi situati nelle parti più profonde dei tessuti risultano difficilmente individuabili. Per ovviare a questa difficoltà, anche per la speratura ai raggi UV, si può attuare una preventiva compressione dei filetti secondo il metodo precedentemente illustrato (UV press-method). In questo caso però, prima di procedere alla speratura bisogna congelare i filetti per alcune ore allo scopo di devitalizzare le larve e quindi favorirne la fluorescenza. I risultati ottenibili con la combinazione dei raggi UV e della compressione risultano migliori rispetto a quelli delle altre tecniche di speratura (Karl H. and Leinemann M., 1997).

3.3.2 Eluizione

Questa tecnica consiste nel distribuire uniformemente un campione in diversi setacci (solitamente quattro per 200 g di tessuto). Ogni setaccio viene posto in un imbuto, chiuso nella parte inferiore con un morsetto, sorretto in posizione verticale e quindi riempito con una soluzione di NaCl al 0,85 %. Dopo 16 o 18 ore, mediante l’apertura del morsetto, viene drenato il sedimento formatosi. Questo verrà posto in piastre Petri e se necessario diluito, per essere osservato al microscopio ad un ingrandimento di 10x al fine di ricercare le larve anisakidi che eventualmente abbiano migrato dai tessuti verso la soluzione salina. L’utilizzo dell’eluizione richiede tempi molto lunghi e non garantisce un sicuro rilevamento del parassita, per cui spesso vengono preferite altre metodiche di rilevamento (Jackson G.J. et al., 1981).

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3.3.3 Digestione

La digestione è una tecnica distruttiva che, mediante l’utilizzo di enzimi e soluzioni acide, permette di rilevare le larve presenti nei tessuti, sfruttando l’elevato grado di resistenza ai processi digestivi della cuticola dei nematodi parassiti. Nonostante gli ottimi risultati ottenibili, probabilmente migliori rispetto alle altre tecniche di rilevamento, l’utilizzo della digestione è limitato dal numero relativamente piccolo di campioni che possono essere digeriti e dai lunghi tempi di reazione necessari per disintegrare i tessuti (Karl H. and Leinemann M., 1997).

Comunque, grazie a questa tecnica può essere valutata la vitalità delle larve presenti in prodotti già sottoposti a processi di lavorazione, quali ad esempio la salagione, e per i quali potrebbero non essere applicabili le altre metodiche di rilevamento. In tal modo è possibile valutare oltre alla commerciabilità del prodotto, anche il grado di efficacia nel devitalizzare le larve con il trattamento di preparazione applicato (CODEX STAN 224-2004).

Nel corso degli anni sono state sviluppate differenti tecniche di digestione, messe a punto su specie diverse, al fine di evidenziare la localizzazione parassitaria a livello viscerale e muscolare(Tab. 3.3).

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Tab. 3.3 – Metodiche utilizzate per la digestione enzimatica dei tessuti, al fine di rilevare le larve dei parassiti anisakidi. In fondo alla tabella, a scopo comparativo, è riportata anche la metodica utilizzata per la ricerca di trichine nelle carni dei mammiferi.

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3.3.4 Ultrasuoni

Secondo alcuni studi sperimentali le larve anisakidi (in particolare P. decipiens), localizzate nei tessuti profondi della muscolatura dei pesci, possono essere individuate anche con l’ausilio degli ultrasuoni. L’attenuazione di questi (dovuta all’impedenza acustica del mezzo attraversato) è stata studiata su varie specie di pesci, quali Gadus

morhua, Melanogrammus aeglefinus e Anarhichas lupus, nel range di frequenza tra 1.0

e 12.25 MHz, consentendo di constatare che la differenza di attenuazione tra parassiti e tessuti dell’ospite aumenterebbe in funzione della frequenza. La causa di tale differenza è attribuibile al maggiore contenuto di collagene nei tessuti dei parassiti: utilizzando onde con frequenza di 10 MHz sarebbe possibile rilevare i nematodi in tessuti spessi anche 4 cm (Hafsteinsson H. et al., 1989). L’efficacia di questa tecnica, come per altre ancora in fase di sperimentazione (ad esempio la speratura laser), non è comunque in grado di giustificarne l’utilizzo a livello commerciale a causa del conseguente incremento dei costi di produzione (Lymbery A.J. and Cheah F.Y., 2007).