Il termine “incretine” è stato coniato nel primo ventennio del secolo scorso per identificare i potenziali fattori con cui l’intestino partecipa alla regolazione della secrezione insulinica. Nel 1960 fu possibile dosare l’insulina nel plasma e dimostrare che il tratto intestinale riveste un ruolo importante nel controllo della secrezione endocrina pancreatica. Gli studi clinici mostrarono, infatti, che, confrontando un carico endovenoso e orale di glucosio, caratterizzati dallo stesso profilo glicemico, la risposta secretoria insulinica era maggiore se il glucosio era somministrato per via orale (Figura 6) (109). Tale fenomeno fu definito effetto incretinico e fu stabilito che il 50-70% della quantità totale di insulina secreta in risposta all’ingestione di glucosio dipende direttamente da tale fenomeno.
Figura 6: Effetto incretinico in soggetti con normale tolleranza al glucosio.
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Le incretine sono ormoni secreti dal tratto gastrointestinale nella circolazione sistemica per stimolare la secrezione insulinica glucosio- dipendente in risposta all’ingestione di nutrienti. Il primo ormone incretinico fu isolato dall’intestino tenue del maiale e definito “Gastric Inhibitory Polipeptide” (GIP) per la sua proprietà di inibire la secrezione acida gastrica. Successivamente fu scoperto che il GIP è in grado di stimolare la secrezione insulinica sia nel modello animale che nell’uomo e per tale motivo fu nuovamente definito “Glucose-dipendent Insulinotropic Polipeptide” mantenendo l’acronimo GIP (110). In studi successivi emerse che una volta neutralizzata l’attività endogena del GIP si assisteva all’attenuazione piuttosto che all’abolizione dell’effetto incretinico (111). La spiegazione fu trovata con la scoperta di un altro ormone incretinico, il Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1), contibuendo così ad ampliare le nostre conoscenze relative alla fisiologia del sistema incretinico e della fisiopatologia del diabete. Il GLP-1 potenzia la secrezione insulinica glucosio-dipendente ed è responsabile della maggior parte dell’effetto incretinico in risposta all’ingestione di nutrienti. Recentemente, sono stati identificati altri agenti con attività incretino-simile: ormoni, nutrienti, acidi biliari e alcuni lipidi sono secreti dopo ingestione di nutrienti, attivano specifici recettori sulla β- cellula e stimolano, spesso solo debolmente, la secrezione insulinica glucosio-dipendente.
Il gene del GIP è espresso principalmente nelle cellule entero- cromaffini, definite anche cellule K, della porzione prossimale dell’intesrtino tenue. Il gene del pro-glucagone è invece espresso in cellule entero-cromaffini, dette anche cellule L, presenti nell’intestino tenue e nel colon, in cui l’attività di una pro-convertasi è responsabile della produzione di GLP-1(112). Il GIP è un polipeptide di 42 aminoacidi e peso molecolare pari a 49kDa, mentre il GLP-1 è prodotto
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sotto forma di peptide inattivo composto da trentasette aminoacidi con un peptide C-terminale contenente glicina e peso molecolare pari a 32kDa. La forma attiva di GLP-1 deriva del clivaggio post-traslazionale di sei aminoacidi dalla porzione N-terminale in posizione 1-37, la forma tronca risultante (GLP-1 7-37) e quella amidica a livello della glicina nella porzione N-terminale (GLP-1 7-36 amide), rappresentano le forme principali di GLP-1 circolante. Entrambe le forme attive presentano attività insulinotropica (Figura 7) (112).
Figura 7: Processi di clivaggio del proglucagone e sintesi di GLP-1
I recettori del GIP sono espressi in molte tipologie cellulari, sopratutto a livello della β-cellula e dell’α-cellula pancreatica, stomaco, tessuto adiposo e Sistema Nervoso Centrale (SNC). I recettori del GLP-1, oltre ad essere espressi in α- e β-cellula pancreatica, sono ampliamente
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espressi nelle cellule parietali dello stomaco, piloro, e analogamente al GIP, a livello dell’SNC (112).
La secrezione delle incretine ha un andamento circandiano e le concentrazioni aumentano rapidamente, in circa 15 minuti, con l’ingestione di un pasto e raggiungono approssimativamente 200 pmol/L per il GIP e circa 50 pmol/L per il GLP-1. Normalmente queste concentrazioni si mantengono per 30-40 minuti per poi ritornare ai valori basali in 2-3 ore (113). Inoltre, GIP e GLP-1 sono caratterizzati da una breve emivita (3-5 minuti) a causa delle rapida inattivazione da parte di proteasi, soprattutto DiPeptidil-Peptidasi-4 (DPP-4) e altre endopeptidasi (114). L’enzima DPP-4 è un enzima ubiquitario, appartenente alla famiglia della serina-proteasi, espresso sulla superficie cellulare ma presente anche nel sangue circolante e, oltre a GIP e GLP-1, riconosce numerosi substrati. L’inattivazione delle incretine da parte di DPP-4 è mediata dal clivaggio di due aminoacidi N-terminali che portano alla formazione della forma inattiva di GIP (3-42) e GLP-1 (9-36 amide), inoltre, entrambe le forme agiscono da antagonisti sui rispettivi recettori. Affinchè il GIP e soprattuto il GLP-1 stimolino la secrezione insulinica, è necessaria l’ingestione di carboidrati perchè, a differenza di quanto accade con proteine e acidi grassi, solo in questo caso si ha un aumento delle concentrazioni circolanti di glucosio necessarie per la risposta β- cellulare. Nel caso dell’ingestione di proteine e acidi grassi si ha secrezione di GLP-1 e GIP ma non di insulina.
La capacità delle cellule L di rispondere al glucosio è dovuta all’espressione e all’attivazione di specifici recettori definiti “Test Receptors” (T1R2 e T1R3). Questi recettori sono associati a una proteina G, detta gustoducina, si attivano in presenza di glucosio nel lume intestinale e modulano la secrezione di GLP-1. Il Sodium-dependent Glucose coTrasporter isoform 1 (SGLT1), trasportatore presente nelle
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cellule intestinali e deputato al trasporto di glucosio dal lume intestinale al lume vascolare, interviene nei processi assorbitivi intestinali e la sua attivazione è controllata dal recettore T1R3-gustoducina (115,116). Anche altre sostanze, come per esempio gli acidi grassi, stimolano sia la secrezione insulinica che di GLP-1, mediante un meccanismo specificamente enterale dopo somministrazione per via orale (117,118). Il metabolismo intestinale e post-assorbitivo degli acidi grassi rappresenta uno dei più importanti fattori, direttamente ed indirettamente, di regolazione della secrezione di incretine nell’uomo. La secrezione di GLP-1 è influenzata anche dagli acidi biliari che agiscono sulle cellule L mediante il recettore T1R5. L’attivazione di questi recettori comporta la stimolazione della secrezione di GLP-1 cAMP- dipendente ed il miglioramento della tolleranza glicemica nel modello animale di diabete mellito tipo 2 (119,120). In fine altre molecole come alcuni aminoacidi, ormoni e citochine, in particolare la glutammica (121,122), l’insulina (123) e la IL6 (124) rispettivamente, sono fattori efficaci nel potenziare la secrezione di GLP-1 nelle cellule enteroendocrine.
Effetti pancreatici del Glucagone-like Peptide-1 (GLP-1)
Il GLP-1 si distingue per le modulazione della funzione e massa β- cellulare. Durante il digiuno le concentrazioni plasmatiche di GLP-1 attivo sono ai limiti della dosabilità. Acutamente il GLP-1 stimola la secrezione insulinica glucosio dipendente, seguita dal potenziamento della trascrizione del gene dell’insulina e della biosintesi ormonale (125). Questi effetti risultano mediati dall’attivazione dell’adenilato- ciclasi e dall’aumento dei livelli intracellulari di cAMP. Sebbene l’esatto meccanismo molecolare con cui il GLP-1 agisce sulla β-cellula sia
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ancora sconosciuto, la modalità con cui stimola la secrezione insulinica dipende dalla combinazione di effetti a più livelli (126) che coinvolgono il cAMP, il trasportatore di glucosio (127), i canali del potassio (128,129) e del calcio (130), così come le protein-chinasi cAMP- dipendenti e l’esocitosi dei granuli secretori contenenti insulina (131,132) (Figura 8).
Figura 8: Regolazione della secrezione insulinica glucosio-dipendente
La più importante proprietà fisiologica del GLP-1 in combinazione agli effetti del GIP è quella di promuovere la secrezione insulinica e regolare l’omeostasi del glucosio senza provocare ipoglicemie (133-134).
Tra i vari effetti del GLP-1 ci sono anche quelli trofici e protettivi sulla β-cellula. Il GLP-1 è in grado di stimolare la proliferazione e la neogenesi di β-cellule dalle cellule duttali sia nell’animale che nell’uomo (135). L’effetto stimolatorio di GLP-1 sulla β-cellula si associa
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all’effetto anti-apoptotico che è possibile osservare anche in colture di isole umane sottoposte a glico-, lipo- e glucolipotossicità. Entrambi, l’effetto proliferativo ed anti-apoptotico, sono mediati dall’attivazione della protein-chinasi B (PKB) (136). Il GLP-1 modula il funzionamento anche del reticolo endoplasmatico della β-cellula, sottoposto a cosiddetto stress durante iperglicemia cronica. La compromissione del reticolo endoplasmatico è parte attiva nei processi molecolari che conducono alla disfunzione β-cellulare e all’apoptosi, il GLP-1 riduce i marcatori di stress del reticolo endoplasmatico (137) migliorando anche la sopravvivenza della β-cellula. Nell’uomo sebbene le proprietà trofiche ed anti-apoptotiche di GLP-1 in vivo siano ancora tutte da dimostrare, gli effetti in vitro fanno ben sperare che l’azione farmacologia sul sistema incretinico mediante gli analoghi o l’inibizione dell’enzima DPP-4 possa preservare la massa funzionale β-cellulare nel diabete.
Oltre gli effetti sulla β-cellula, il GLP-1 è in grado di sopprimere la secrezione di glucagone da parte delle α-cellule. Molto probabilmente l’effetto inibitorio è indirettamente causato dalla stimolazione della secrezione di insulina e somatostatina con conseguente regolazione paracrina della secrezione del glucagone. La modulazione del rapporto insulina/glucagone è responsabile, almeno in parte, della riduzione dell’insulino-resistenza sia nel fegato che nei tessuti periferici (138). D’altra parte un effetto diretto di GLP-1 non può essere completamente escluso dal momento che le cellule α-pancreatiche esprimono il recettore per il GLP-1 (131). Inoltre, poiché la soppressione della secrezione di glucagone è glucosio-dipendente, la risposta contro-regolatoria necessaria per la prevenzione dell’ipoglicemia non risulta compromessa (134). Inoltre il recettore del GLP-1 è espresso anche sulle cellule δ- pancreatiche e l’attivazione di esso comporta il rilascio di somatostatina (139).
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La partecipazione di tutte le componenti endocrine dell’isola pancreatica in risposta al GLP-1 suggerisce che il bilanciamento dell’omeostasi glicemica è il risultato di una complessa interazione tra tutti gli ormoni capaci di modificare direttamente o indirettamente la glicemia.
Effetti extra-pancreatici del Glucagone-like Peptide-1 (GLP-1)
Il GLP-1 esercita effetti inibitori sulla secrezione e sulla motilità gastrica, in particolare rallenta lo svuotamento gastrico (130). La somministrazione di GLP-1 a dosi fisiologiche in soggetti normo- tolleranti riduce lo svuotamento gastrico in modo dose-dipendente e riduce l’assorbimento di glucosio che rappresenta uno dei principali fattori coinvolti nella riduzione della glicemia post-prandiale (130). Questi effetti suggeriscono che il GLP-1 partecipa al cosidetto “ileal brake”, fenomeno con cui i nutrienti presenti nella parte distale dell’intestino tenue riducono la secrezione e la motilità delle porzioni prossimali. I meccanismi alla base degli effetti di GLP-1 sulla motilità e sulla secrezione intestinale sono mediati dal sistema nervoso centrale e periferico, soprattutto mediante l’attivazione del nervo vago. Il ruolo fisiologico di GLP-1 è, quindi, quello di regolare la capacità assorbitiva del glucosio, a livello intestinale, e la quantità di chimo, modulando la motilità e la secrezione intestinale di enzimi digestivi. In condizioni fisiologiche l’azione gastrointestinale di GLP-1 riveste probabilmente un ruolo più importante rispetto all’azione insulinotropica (130).
In aggiunta il GLP-1 riduce l’introito calorico e aumenta il senso di sazietà mediante l’azione diretta sul sistema nervoso centrale e periferico. In soggetti normo-tolleranti la somministrazione endovenosa di GLP-1 a dosi sovra-fisiologiche aumenta il senso di sazietà e riduce
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l’introito calorico (140). Il meccanismo con cui il GLP-1 modula il senso di sazietà non è ancora completamente chiaro ma probabilmente esercita un ruolo nell’attivazione delle fibre afferenti vagali che a loro volta interagiscono direttamente con il SNC. Questa ipotesi è supportata dall’evenienza secondo cui i neuroni contenenti GLP-1 nel nucleo del tratto solitario hanno connessioni neuro-trasmettitoriali con le regioni talamiche ed ipotalamiche coinvolte nella regolazione dell’introito di alimenti. Un’altra possibilità riguarda l’azione centrale del GLP-1 su specifici recettori espressi da aree cerebrali come l’area postrema e l’organo subfornicale che tipicamente non presentano barriera emato- encefalica e sono, a volte, in diretta connessione con le aree cerebrali coinvolte nel controllo dell’omeostasi dei nutrienti. Infine, il rallentamento dello svuotamento gastrico partecipa alla genesi della sensazione di sazietà partecipando indirettamente alla regolazione dell’introito calorico.
Per quando riguardo gli effetti del GLP-1 sul metabolismo epatico,
in vitro, l’esposizione degli epatociti al GLP-1 si associa o inibizione
della glicogenolisi glucagone-dipendente senza agire in competizione con il glucagone sullo stesso recettore (141). Sebbene nell’uomo gli epatociti non esprimono il recettore di GLP-1, l’esposizione agli analoghi del GLP-1 si associa ad attivazione di una serie di cascate molecolari che si traducono in aumento delle trascrizione di una serie di fattori e proteine associati alla proliferazione e all’espressione del gene dell’insulina (142).
I recettori del GLP-1 sono ampiamente espressi nel cuore e nei vasi, in particolare nelle cellule muscolari lisce, cardiomiociti, endocardio e cellule endoteliali muscolari e cardiache (143,144). L’attivazione del recettore del GLP-1 è in grado di esercitare un’ampia gamma di effetti sul sistema cardiovascolare modulando frequenza
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cardiaca, pressione arteriosa, tono vascolare e contrattilità miocardica (145-148). In aggiunta, numerose evidenze riportano che sia in modelli sperimentali che nell’uomo, il GLP-1 è in grado di migliorare significativamente molte delle alterazioni che caratterizzano le malattie cardiovascolari, in particolare la cardiopatia ischemica e lo scompenso cardiaco, anche in pazienti con diabete di tipo 2 (149-152). Inoltre sia in soggetti normo-tolleranti che affetti da diabete di tipo 2, il trattamento acuto con GLP-1 è in grado di indurre vasodilatazione endotelio- dipendente dell’arteria brachiale (150, 153).
Gli agonisti del recettore del GLP-1 e gli inibitori del DPP-4 sono anche in grado di ridurre i livelli post-prandiali di lipoproteine soprattutto mediante l’inibizione delle sintesi dei chilomicroni ed indipendentemente dagli effetti sul peso corporeo. Come dimostrato per altri effetti fisiologici, l’abolizione selettiva dell’espressione del recettore incretinico si associa ad aumento post-prandiale dei livelli di trigliceridi ricchi di lipoproteine (154). Risultati analoghi sono stati registrati in soggetti affetti da diabete mellito tipo 2 in cui sia l’inibizione che la somministrazione di analoghi del GLP-1 riducono significativamente le concentrazioni circolanti di lipoproteine post-prandiali (155-157).
Effetti modesti sembrano avere gli analoghi del GLP-1 nelle cellule muscolari e adipose. Sebbene non sia stato ancora identificato lo specifico recettore con cui GLP-1 agisce, l’incubazione con GLP-1 di miociti muscolari si associa a una serie di effetti metabolici come: attivazione della sintesi di glicogeno, potenziamento dell’ossidazione del glucosio e inibizione della glicogeno-fosforilasi (158).
Infine il GLP-1 sembra modulare direttamente il metabolismo osseo anche se lo specifico recettore è normalmente espresso. Come dimostrato nel modello animale, l’abolizione dell’espressione recettoriale causa alterazione delle densità osse, osteopenia corticale e
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aumento delle fragilità causata da aumentati riassorbimento. Uno dei meccanismi con cui il GLP-1 agisce indirettamente sull’osso è la riduzione delle produzione di calcitonina da parte delle cellule C della tiroide (159). Il recettore incretinico è espresso nel rene e l’attivazione comporta il rapido incremento della natriuresi mediante meccanismi non ancora definiti (160). L’effetto natriuretico del GLP-1 sembra essere mediato dall’inibizione del riassorbimento dello ione Na a livello del tubulo prossimale (161).
Nella Figura 9 sono riportati i maggiori effetti sia pancreatici che extrapancreatici del GLP-1.
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Effetti delle Incretine nel diabete tipo 1
Il GLP-1, e le incretine in genere, potrebbero essere utili nell’ottica di ulteriori approcci, nel diabete tipo 1, atti ad integrare promettenti trattamenti immunologici e sostenere effetti terapeutici a lungo termine. A questo proposito, in studi preclinici, come abbiamo già sottolineato, è stato evidenziato come il GLP-1 possa ridurre l’apoptosi della beta-cellula, stimolare la proliferazione e migliorare la sopravvivenza della beta-cellula. Inoltre, studi clinici pilota hanno rivelato effetti benefici, clinicamente rilevanti del GLP-1, con la soppressione del glucagone post-prandiale, ritardato svuotamento gastrico e perdita di peso per aumento del senso di sazietà.
Così, il GLP-1 o gli agonisti del recettore, oltre agli inibitori del DPP-4 possono essere clinicamente utili come terapie supplementari nei pazienti con diabete tipo 1 (162).
GLP-1 mimetici o analoghi del GLP-1 nel diabete di tipo 1
Hadjiyanni et al. hanno dimostrato che la somministrazione di exendin-4, un GLP-1 mimetico, equivalente all’exenatide, in topi NOD, determina una riduzione significativa del tasso di insulite, aumenta la massa beta-cellulare e migliora la tolleranza al glucosio (163). In diversi altri studi si è ipotizzata un’inversione dell’evoluzione del diabete tipo 1, inducendo la rigenerazione beta-cellulare. Ad esempio, exendin-4, in combinazione con una terapia anti-CD3, ha dimostrato un effetto benefico sulla massa beta-cellulare in Topi NOD (164). Come previsto, questa combinazione di farmaci, ha determinato un miglioramento significativo della risposta insulinica al glucosio, un incremento del
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contenuto totale di insulina nelle isole, aumentando, così, il tasso di remissione del diabete.
Suares-Pinzon et al. hanno dimostrato che un amide sintetico del GLP-1 umano (7-36), somministrato insieme alla gastrina, è capace, nei topi NOD, dopo la comparsa acuta di diabete, restaurare la normoglicemia (165). Questo effetto è stato attribuito al ripristino parziale della massa beta-cellulare. Tian et al. hanno evidenziato che l’exendin-4, sempre nei topi NOD, se somministrato insieme all’adiuvante completo di Freund, stimola la replicazione delle beta- cellule residue (166).
Nonostante i molteplici effetti benefici del GLP-1 osservati in studi preclinici, studi sulle ricadute cliniche della terapia con GLP- 1/analoghi mimetici sono stati condotti in un numero limitato di pazienti affetti da diabete tipo 1.
In un “case study” (167) viene segnalato come la terapia con exenatide, in un paziente di 40 anni con diabete tipo 1, sia capace di ridurre l’HbA1c da 8,7% a 7,3% dopo 11 mesi di trattamento, con una riduzione dell’insulina basale e la sospensione dell’insulina pre- prandiale. In un altro “case study” (168) viene indicato come, in un paziente C-peptide-negativo, l’exenatide, dopo diversi mesi sia in grado di migliorare i livelli di HbA1c, con una riduzione complessiva del 2%. Siccome, però, i livelli di C-peptide non sono aumenati ciò suggerisce che gli effetti benefici non sono attribuibili alla secrezione insulinica, ma potrebbe essere coinvolti altri meccanismi incretino-mediati.
In altri ”reports”, è stato dimostrato che la somministrazione di GLP-1 o exendin-4 porta ad una riduzione della glicemia a digiuno nei pazienti con diabete tipo 1, soprattutto riducendo i livelli di glucagone (169,170). Inoltre, il trattamento con exenatide è stato valutato nell'arco di alcuni mesi, in pazienti con lunga durata di malattia, ed è stato
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riportato un aumento della secrezione insulinica. Ciò, tuttavia, non è stato ritenuto clinicamente significativo (171).
Più recentemente, alcuni studi clinici hanno tentato di studiare gli effetti benefici sull’iperglicemia e sul regime insulinico, prodotti dal GLP-1 nativo (172) o dalla liraglutide (173,174), in pazienti con diabete tipo 1, con e senza livelli residui di C-peptide. In primo luogo, la risposta glicemica ad un pasto misto, è migliorata, durante terapia incretinica nei pazienti con funzione beta-cellulare residua. In secondo luogo, sia l’infusione di GLP-1 che la somministrazione di un’iniezione giornaliera di liraglutide, ha comportato una significativa riduzione della dose insulinica, che risultava maggiore nei pazienti C-peptide-positivi. Da notare, che due pazienti C-peptide-positivi hanno dovuto interrompere completamente la terapia insulinica, mantenendo un buon controllo glicemico. In terzo luogo, anche i livelli di HbA1c sono diminuiti in maniera significativa, dopo 24 settimane di trattamento con liraglutide.
Gli effetti a breve e lungo termine, osservati nel diabete di tipo 1, dopo somministrazione di GLP-1, exenatide, o liraglutide necessitano di ulteriori studi sia in pazienti di nuova insorgenza che in quelli con maggiore durata di malattia. Inoltre, i meccanismi molecolari sottostanti che determinano il miglioramento dell’omeostasi glucidica, della funzione, della sopravvivenza e della possibile rigenerazione delle beta- cellule, rimangono ancora da esplorare.
Terapia con inibitori del DPP-4 nel diabete tipo 1
Il DPP-4 è un enzima che catalizza la conversione del GLP-1 attivo nella sua forma inattiva. È noto, anche, come antigene di superficie cellulare CD26 (DPP-4/CD26). Il DPP-4/CD26 è espresso in
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una varietà di tipi cellulari, compresi i linfociti T, le cellule endoteliali, i linfociti B, i macrofagi e le cellule NK. È stato dimostrato, inoltre, che rappresenta un marcatore di attivazione della cellula T (175), e ha un ruolo di co-stimolazione nell’attivazione delle stesse. L'espressione di DPP-4/CD26 aumenta significativamente dopo stimolazione, da parte di mitogeni, di cellule mononucleate o linfociti T di sangue periferico umano (176). Nel sangue periferico, cellule T DPP-4+/CD4+ sono coinvolti nella regolazione della differenziazione monociti CD14+ in cellule dendritiche dopo la stimolazione antigenica. L’attivazione delle cellule dendritiche aumenta la risposta immunitaria cellule T-mediata tramite un effetto diretto sulla presentazione dell’antigene alle cellule (177).
Nei topi privi di DPP-4/CD26, sono stati riportati una maggiore secrezione d’insulina ed un miglioramento della tolleranza al glucosio (178). Alcuni gruppi hanno anche esaminato il sistema immunitario nei