Test utilizzat

Al termine del tempo di trattamento, le biopsie branchiali sono state prelevate dai pozzetti e inserite in Eppendorf da 2 ml a cui sono stati aggiunti 500 μl di dispasi (1,5 mg/ml), un enzima digestivo utile per la dissociazione tissutale. Le Eppendorf sono state poste in un bagnetto termostatato per 20 minuti a +37ºC, temperatura che rende attivo l'enzima digestivo. Al termine del tempo è stata bloccata l'attività enzimatica aggiungendo in ciascuna provetta 1 ml di HBSS 20‰ freddo. Il contenuto di ogni provetta è stato filtrato con retini di nylon (ø = 100 nm) e raccolto in piastre Petri con l'aggiunta di 500 μl di HBSS freddo per favorire il recupero della sospensione cellulare trasferita in seguito in Eppendorf da 2 ml. Il materiale cellulare cosi ottenuto è stato utilizzato per allestire i test di geno- e citotossicità.

4.2.1. Trypan blue per la vitalita cellulare

La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il Trypan Blue exclusion test. Questo test è stato effettuato, a seguito del filtraggio, prelevando 10 μl di sospensione cellulare per ciascun trattamento a cui sono stati aggiunti altri 10 μl di colorante. Il Trypan blue è un colorante vitale diazoico

utilizzato per valutare la vitalità cellulare e si basa sul principio che le cellule sono molto selettive riguardo ai composti che possono attraversare la membrana cellulare; infatti, in una cellula vitale, dato che ha una membrana intatta, il colorante non è in grado di oltrepassare la membrana, mentre risulta libero di attraversarla in una cellula morta (Strober, 2001). Le cellule non vitali, se osservate al microscopio, risulteranno di colore blu, mentre in quelle vitali non si modifica la colorazione della cellula stessa. E stato, quindi, effettuato un conteggio delle cellule vive (bianche) e morte (blu) e la vitalità, espressa in percentuale. I valori di vitalità cellulare non differivano statisticamente da quelli del controllo e questo ci ha permesso di eseguire i test successivi (Comet assay, Diffusion assay e Cytome assay).

4.2.2. Comet assay

Le sospensioni cellulari sono state centrifugate a 1000 rpm (rotazioni per minuto) per 10 minuti e il sopranatante è stato aspirato e scartato. Le provette sono state poste nuovamente all'interno del bagnetto termostatato a 37ºC e a ciascuna di esse sono stati aggiunti 75 μl di LMA (low melting agarose) 0.5% dissolto in PBS a 37°C per ogni vetrino. In questo studio, sono stati allestiti 3 vetrini da ciascun trattamento (due per il Comet assay e uno per il Diffusion assay) quindi il quantitativo di gel per ogni provetta è stato triplicato (225 μl di LMA per Eppendorf). 75 μl della soluzione ottenuta dal mescolamento del precipitato con LMA, sono stati stratificati su un vetrino da microscopia, adagiato su vassoio metallico freddo e precedentemente trattato con uno strato di NMA (normal melting agarose) 1%. Quindi sul vetrino è stato posto un coprioggetti con lo scopo di far distendere uniformemente lo strato di gel. Il vetrino è stato posto a solidificare per circa 10 minuti a 4°C. E stato, dunque, tolto il coprioggetti e sono stati aggiunti 85 μl di LMA. Il vetrino, di nuovo coperto con il coprioggetti, è stato lasciato solidificare a +4°C per circa 10 minuti. Dopo la solidificazione del terzo strato di gel, è stato delicatamente tolto il vetrino coprioggetti ed i vetrini sono stati immersi nella soluzione di lisi e tenuti in frigorifero, al buio, a +4°C. La soluzione di lisi viene preparata a partire da una soluzione detta di “prelisi” (NaCl 2.5 M, Na2EDTA 100 mM, TRIZMA BASE 10 mM, NaOH, a pH 10) alla quale, poco prima dell’uso, vengono aggiunti dimetilsolfossido (DMSO) 10% e TRITON X100 (1%).

I vetrini cosi preparati possono rimanere in lisi per un tempo minimo di un'ora e massimo di un mese. Tutte le operazioni sono state condotte ad una temperatura di +20°C ed in condizione di luce gialla, allo scopo di evitare l’introduzione di danno aggiuntivo al DNA.

I vetrini preparati sono stati tolti dalla soluzione di lisi e disposti in una camera elettroforetica orizzontale; sono stati ricoperti con una soluzione tampone alcalina fredda (acqua distillata, NaOH

10 N, EDTA 200 mM, pH >13) allo scopo di denaturare la doppia elica del DNA rompendo i legami a idrogeno tra le basi, per un tempo di 10 minuti. Il pH>13 è stato scelto per mettere in evidenza, oltre alle rotture a singolo e doppio filamento, anche quelle dovute alla presenza di siti labili agli alcali, i quali vanno incontro a rottura solo se sottoposti a condizioni drastiche, come ad esempio un pH molto elevato (Lindahl e Andersson, 1972).

Avvenuta la denaturazione del DNA, è stata eseguita la corsa elettroforetica della durata di 5 minuti a 25 V e 300 mA, in modo da far migrare nel campo elettroforetico i frammenti di DNA eventualmente presenti. Dopo la corsa i vetrini sono stati trattati per tre volte con 2 ml di una soluzione neutralizzante (0,4 M di Tris-HCl, pH 7,5) al fine di ripristinare un pH quasi neutro e consentire la successiva colorazione. Successivamente, è stato effettuato un passaggio in etanolo puro e freddo per permettere un piu veloce essiccamento del gel ed una migliore conservazione del preparato. I vetrini cosi ottenuti sono stati lasciati ad asciugare a temperatura ambiente e successivamente conservati in scatole portavetrini con grani di silice per mantenerli in ambiente asciutto.

Analisi dell'immagine

Al momento dell’osservazione i vetrini sono stati colorati con 100 μl di bromuro di etidio (2 μg/ml), coperti con un vetrino coprioggetti ed analizzati al microscopio a fluorescenza (400X). La migrazione del DNA verso l’anodo, avvenuta durante la corsa e proporzionale al danno genetico, è stata valutata mediante un sistema di analisi dell’immagine collegato al microscopio (Komet 5, Kinetic imaging, Ltd). Il software utilizzato è in grado di calcolare diversi parametri come la percentuale di DNA migrato (la cosiddetta “coda”) misurata come intensità di fluorescenza, o la lunghezza o il “momento” della coda (lunghezza della coda x intensità di fluorescenza). In questo caso il parametro prescelto per valutare il danno al DNA è stato la percentuale di DNA migrato nella coda, dato che la lunghezza della coda ed il tail moment sono parametri influenzabili da variabili sperimentali (ad esempio le dimensioni della vasca elettroforetica) (McKelvey-Martin et al., 1993). Per ogni trattamento sono stati preparati 2 vetrini, per ogni vetrino sono state lette 25 cellule random.

4.2.3. Diffusion assay

I vetrini sono stati preparati con lo stesso procedimento illustrato per il test della cometa. A differenza di quest'ultimo, è stata omessa la corsa elettroforetica. Dopo un’ora i vetrini sono stati tolti dalla soluzione di lisi, lavati con 2 ml di soluzione neutralizzante (Tris-HCl, pH 7,5) per 3 volte

a intervalli di 5 minuti, quindi sono stati aggiunti 80 μl di etanolo freddo (-20°C) a ciascun vetrino per un piu veloce essiccamento e vengono lasciati asciugare.

Analisi dell'immagine

Come per il test Comet, al momento dell’osservazione i vetrini sono stati colorati con 100 μl di bromuro di etidio (2 μg/ml), coperti con un vetrino coprioggetti ed analizzati al microscopio a fluorescenza (400X). Le cellule apoptotiche sono riconosciute e quindi quantificate in base al particolare pattern di diffusione del loro DNA. Le cellule vengono ripartite in classi dalla numero 1 alla numero 5, dove il numero della classe indica un danno genetico crescente; per cui si ha la classe 1 con un danno genetico minimo fino alla classe 5 che indica il danno massimo, una cellula apoptotica. In quest'ultimo caso il nucleo appare ampiamente diffuso, omogeneo e presenta confini indistinti rispetto alle cellule integre; inoltre, il diametro risulta circa tre volte piu grande rispetto alle dimensioni medie, a causa dell'elevata dispersione di DNA durante il processo apoptotico (Singh, 2000).

La quantificazione delle cellule apoptotiche e l’attribuzione nelle altre classi di danno è stata effettuata su un campione di 100 cellule per vetrino.

Tutte le operazioni sono state effettuate in condizioni di luce gialla allo scopo di evitare l'introduzione di un danno aggiuntivo al DNA.

4.2.4. Cytome assay

Per condurre questo test, sono stati prelevati 500 μl dalla sospensione cellulare ottenuta a seguito del filtraggio della sospensione di cellule branchiali. Dopo centrifugazione a 2000 rpm per 5 minuti, è stato eliminato il sopranatante e il precipitato è stato trattato per 20 minuti con 800 μl di una soluzione di prefissativo, costituita da: Acido Acetico al 5%, etanolo al 3% e 92% di HBSS 20‰ e tenuto a temperatura ambiente. Successivamente è stata effettuata un'ulteriore centrifugazione a 2000 rpm per 5 minuti. E stato eliminato il sopranatante e il precipitato è stato fissato con una soluzione di fissativo costituito da acido acetico e etanolo con un rapporto rispettivamente di 1:7 e i preparati sono stati messi in frigorifero a +4°C per minimo 20 minuti e massimo di diversi giorni. In seguito sono stati allestiti i vetrini con la seguente procedura: a seguito di una centrifugazione a 2000 rpm per 5 minuti, il precipitato è stato trattato nuovamente con una soluzione di fissativo (acido acetico e etanolo in rapporto 1:7). Questo processo è stato ripetuto per due volte, e successivamente si è proceduto a risospendere il precipitato finale (circa 0.5 ml), che è stato poi gocciato su vetrini (2 per ciascun trattamento) freddi (- 20°C). Dopo averli fatti asciugare all'aria, i

vetrini sono stati colorati con una soluzione di GIEMSA al 5% in H2O distillata al buio per 10 minuti. Sono stati quindi risciacquati per eliminare il colorante in eccesso con H2O distillata. Una volta asciugati, per poter procedere alla lettura al microscopio ottico, è stato necessario incollare vetrini coprioggetto su ogni vetrino, utilizzando il collante istologico DPX. Sono stati, quindi, annotati il numero di micronuclei ed altre anomalie nucleari presenti su 500 cellule per vetrino.

Analisi dell'immagine

I vetrini sono stati analizzati al microscopio ottico (100X); per ognuno di essi sono stati analizzati il numero di cellule micronucleate ed altre anomalie nucleari presenti. Per ogni vetrino sono state osservate 500 cellule il cui citoplasma risultava ben definito e conservato. Per ogni trattamento sono stati allestiti 2 vetrini per un totale di 1000 cellule lette.