Validazione di un metodo analitico

L’ampia porzione introduttiva dell’elaborato è stata utile ad illustrare il problema biologico da analizzare. La fibrosi cistica è una patologia insidiosa e complessa per la quale l’elaborazione di una diagnosi precisa da comunicare al paziente è un elemento fondamentale. Esistono ancora oggi delle criticità nella produzione della diagnosi per determinate categorie di pazienti in cui sono stati rilevati valori intermedi di cloro nel campione di sudore. Per queste persone il test del sudore non risulta diagnostico e la diagnosi di patologia non può essere confermata dal diagnosta.

Per questo motivo si rende necessaria la produzione di una metodica affidabile che cerchi di limitare il più possibile le incertezze nella classificazione dei pazienti.

Per garantire l'affidabilità, la riproducibilità e la robustezza dei dati al fine della validazione di un nuovo metodo, deve essere eseguita una convalida dettagliata della procedura analitica, con riferimento a selettività, accuratezza, precisione, sensibilità e stabilità, in conformità con le linee guida EMA.

L’ EMA (Agenzia Europea per i Medicinali) ha elaborato le nuove linee guida (aggiornate nel 2017) per la validazione di questi protocolli con il fine di determinare una standardizzazione dei parametri di rilevazione ma soprattutto delle soglie utili a classificare i pazienti a seconda della situazione clinica e dei risultati ottenuti con il test del sudore.

Tali linee guida coprono vari aspetti tra i quali troviamo: - Informazione al paziente

- Idoneità del soggetto da sottoporre al test - Raccolta e analisi del campione di sudore - La qualità

- Valori di riferimento e interpretazione

- Responsabilità dell’esecuzione del test e la formazione del personale

Determinare la concentrazione del cloro all’interno delle matrici ricavate dai pazienti non è un lavoro semplice per i tecnici e per il personale sanitario che deve effettuare i prelievi e le misurazioni analitiche.

Infatti, come già illustrato in precedenza, il problema più rilevante è rappresentato dalla scarsa quantità di campione a disposizione, che può inficiare l’attendibilità dei risultati; nonché le differenze fisiologiche che riguardano e caratterizzano la composizione del sudore dei vari pazienti soprattutto in base all’età.

Riproducibilità: rappresenta il grado di concordanza che sussiste tra una serie di

misure effettuate sul medesimo oggetto dello studio nel momento in cui variano una o più condizioni tra le quali troviamo:

- Metodo di misurazione

- Modificazione nell’utilizzo della strumentazione o dell’oggetto della misurazione

Selettività/Specificità: è definita come la capacità del metodo analitico di misurare e

differenziare l'analita e l'IS dagli altri componenti del campione che, comportandosi come potenziali composti interferenti, influenzano l'accuratezza delle misurazioni principalmente quando si misurano bassi livelli.

La linearità di un metodo analitico è la sua capacità di ottenere risultati direttamente

proporzionali alle concentrazioni dell'analita nel campione entro un intervallo definito, detto campo di validità.

Questa linearità deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di correlazione della curva di taratura.

Curve di taratura effettuate su matrici differenti o per soluzioni standard possono essere utilizzate previa specifica delle motivazioni del metodo di prova e sono generalmente accettati coefficienti di correlazione pari almeno a 0,99 (r secondo il metodo dei minimi quadrati).

Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l’utilizzo di funzioni di taratura non lineari oppure restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera a livello sperimentale.

È opportuno effettuare da tre a sei repliche di quattro o più concentrazioni e nella validazione del metodo devono essere riportati:

- Il coefficiente di correlazione - La pendenza

- L’intercetta - I residui

- Il grafico dei dati sperimentali e della curva calcolata

La precisione di un metodo analitico è la vicinanza del valore sperimentale alla

concentrazione nominale dell'analita, espressa in percentuale (precisione%); rappresenta la vicinanza tra le misurazioni individuali ripetute dell'analita ed è espressa come percentuale di deviazione standard relativa (% di RSD).

La si può descrivere anche come il livello di concordanza fra misurazioni indipendenti della concentrazione di un particolare analita e deve avvalersi di un ferreo controllo di tutto il processo di analisi, a partire dalla raccolta del campione, dalla sua conservazione, dalla preparazione (estrazione e purificazione) e infine dall’analisi strumentale.

La precisione, da un punto di vista statistico, rappresenta l’errore sulla misura che si distribuisce secondo una distribuzione gaussiana.

L’ampiezza della campana descrive la distribuzione gaussiana e indica il livello di precisione: se la campana è più larga, l’imprecisione è maggiore e i dati sono più dispersi (Figura 20).

Se la campana è stretta, i dati sono meno dispersi e l’imprecisione è decisamente contenuta.

Fig. 20

Possono essere utilizzati materiali di controllo per vari livelli di concentrazione (ciò consente anche di valutare effetto matrice) e la concentrazione dei materiali da studiare deve essere scelta in modo tale da coprire l’intero intervallo di misurazione includendo anche un valore soglia o di decisione clinica.

La precisione deve essere valutata per un minimo di tre livelli di concentrazione (basso, medio, elevato), con almeno dieci misurazioni indipendenti per ogni livello di concentrazione ed è espressa come coefficiente di variazione percentuale:

La precisione deve essere valutata sia nella stessa seduta analitica, che tra sedute analitiche differenti. Quest’ultima è una valutazione della precisione nel tempo ed è consigliato utilizzare operatori, calibratori, reagenti differenti all’interno di un arco temporale che non superi i trenta giorni al fine di minimizzare gli effetti dovuti ad altre variabili nelle condizioni sperimentali.

Accuratezza ed esattezza: L’esattezza o inesattezza (bias) identifica il grado di

concordanza tra il valore medio ottenuto a partire da diverse determinazioni dello stesso misurando e un valore di riferimento accettato (valore vero del misurando). Il bias è lo scostamento rispetto al valore vero, ovvero la differenza tra il valore ottenuto attraverso gli approcci sperimentali effettuati dall’operatore e il valore vero e può essere positivo oppure negativo.

Il significato scientifico di esattezza non è sovrapponibile a quello dell’accuratezza: quest’ultima infatti è utilizzata per indicare il grado di concordanza tra il risultato di una singola misurazione e il valore vero della grandezza che si intende misurare. L’esattezza dipende da una serie di fattori: da quanto è accurata la scelta dei materiali di calibrazione, dalla loro concentrazione e dalla scelta della matrice. Utilizzare più di un approccio è una scelta oculata perché contribuisce ad assicurare una valutazione accurata e completa dell’esattezza.

L’esattezza deve essere valutata analizzando per almeno cinque misurazioni replicate in tre differenti sedute analitiche per concentrazione, utilizzando almeno tre campioni a concentrazioni rilevanti a livello clinico e tali da coprire l’intero intervallo di calibrazione del metodo.

L’esattezza è valutata come bias percentuale per mezzo della seguente formula: Bias % = [(valore medio delle misurazioni – valore vero) / valore vero] * 100 Un approccio alternativo per effettuare la valutazione dell’esattezza è la comparazione con un metodo di riferimento riconosciuto a maggiore livello di standardizzazione.

Il bias % per ogni livello di concentrazione non deve essere superiore al 15%, l’esattezza al valore di LOQ (Limite di Quantificazione) non deve essere superiore al 20%.

L’accuratezza è, come definita dalla statistica, la contemporanea presenza di esattezza e precisione.

LOB, LOD, LOQ: LOB viene definita come la massima concentrazione apparente

dell'analita che si prevede di trovare quando vengono replicati i replicati di un campione in bianco, contenente nessun analita.

LOD è la più bassa concentrazione di analita chiaramente distinguibile da LOB, e LOQ è la più bassa concentrazione a cui l'analita può essere quantificato in modo affidabile, che di solito è LOD.

Stabilità: lo studio della stabilità è una parte importante della validazione ed è

effettuata con il fine di garantire una corretta gestione di tutti i reagenti e dei campioni durante il delicato processo di analisi.

Lo studio della stabilità prevede la valutazione di tutte le soluzioni, i reagenti e dei campioni nelle varie fasi del processo sperimentale:

- Raccolta dei campioni (prelievo)

- Stoccaggio dei campioni a breve termine - Stoccaggio dei campioni a lungo termine - Cicli di congelamento/scongelamento

- Stoccaggio dopo processamento/estrazione (prima dell’analisi).

I parametri da valutare dovrebbero coprire i normali tempi delle procedure di campionamento e di analisi.

Le condizioni minime da valutare sono: stabilità a differenti tempi di conservazione e a differenti temperature, stabilità alla luce (diretta e indiretta), stabilità a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento17_.

2. SCOPO

Lo scopo di questa tesi sperimentale è quello di procedere all’individuazione, alla validazione e alla successiva applicazione di una nuova metodica a casi clinici reali, basandoci sull’utilizzo della spettrometria di massa. L’obbiettivo principale è quello di migliorare i risultati della diagnosi di fibrosi cistica e della classificazione dei pazienti affetti.

I metodi in uso, come la colorimetria, la fotometria a fiamma e le misure di conduttanza, non sono stati validati per matrici come il sudore e così la loro applicazione a fini diagnostici si è rivelata spesso inconcludente.

La mancanza di risultati precisi, che siano in grado di fornire una classificazione puntuale ed esaustiva della condizione clinica dei pazienti che si sottopongono ai test clinici, genera malessere nel paziente stesso e nei suoi familiari, aggravando ulteriormente una situazione già molto critica.

La spettrometria di massa, potenzialmente consente, per le sue proprietà intrinseche, di analizzare con accuratezza e sensibilità i campioni di sudore raccolti dai pazienti, e di raggiungere risultati che potrebbero contribuire a promuovere un avanzamento concreto in questo ambito della ricerca biomedica.

Inoltre, i risultati delle analisi dei campioni mediante ausilio dell’ICP-MS potrebbero fornire una caratterizzazione più precisa per quanto riguarda la concentrazione di cloro nel sudore, garantendo così ai pazienti una maggiore certezza nella produzione della diagnosi, un aumento delle possibilità di cura e un eventuale recupero parziale o completo della loro qualità di vita prima delle manifestazioni patologiche.