L’esame dello striscio di sangue inizia dalle regioni più spesse e procede verso la coda utilizzando in un primo momento un obiettivo 10x o 20x. Questo basso ingrandimento permette di valutare la qualità della colorazione, lo spessore generale, il degradare
37 uniforme dello striscio, la distribuzione delle cellule [62], la presenza d’impilamento o agglutinazione eritrocitaria [26] e l’adeguatezza del monostrato. L’esame a basso ingrandimento verifica la presenza di aggregati leucocitari o piastrinici, microfilarie e cellule anormali [41], fagocitanti organismi [62] altrimenti non visibili durante la conta differenziale dei leucociti. E’ importante soprattutto esaminare la porzione distale dello striscio poiché aggregati leucocitari o piastrinici di grosse dimensioni, possono concentrarsi in quest’area. Al contrario se si utilizza la tecnica di preparazione su vetrini coprioggetto gli aggregati cellulari tendono a localizzarsi al centro del preparato anziché alla periferia[41].
A basso ingrandimento si può anche grossolanamente stabilire l’ematocrito del paziente. Strisci di soggetti non anemici in genere nel monostrato hanno eritrociti fittamente disposti gli uni vicini agli altri e nelle estremità più spesse gli strati sovrapposti impediscono la penetrazione di luce più condensata. Al contrario, negli strisci di pazienti moderatamente o marcatamente anemici gli eritrociti sono nettamente separati gli uni dagli altri nella zona del monostrato e sono presenti solo uno o due strati di cellule nell’estremità spessa condensata [38,62]. Nelle aree troppo spesse, le dimensioni eritrocitarie sono sottostimate, mentre in quelle sottili sono sovrastimate[50]. Queste stime andrebbero sempre controllate, a fronte di un ematocrito adeguatamente misurato. Infine a basso ingrandimento si può fare una stima approssimativa della conta leucocitaria e classificarla come bassa, normale o alta [62].
La morfologia delle cellule ematiche è valutata ponendo l’obiettivo ad immersione (oculare 10x, obiettivo 100x, ingrandimento finale 1000). E’ possibile anche eseguire una valutazione dello striscio a 400 ingrandimenti (oculare 10x, obiettivo 40x) ma la caratterizzazione cellulare è più difficoltosa [38].
L’area ottimale per la valutazione è il monostrato (dove per monostrato s’intende la parte del vetrino in cui gli eritrociti sono molto vicini tra loro e circa metà delle cellule viene a contatto) che si trova oltre la metà dello striscio subito dopo l’area stratificata [26]. Negli eritrociti (a forte ingrandimento) si deve osservare:
• volume: variazioni (anisocitosi), normo- macro microciti • colore: normo- ipo-iper cromici
38 • forma: variazioni (poichilocitosi), cellule bersaglio, sferociti, acantociti, spinociti,
schistociti
• distribuzione: isolati, impilati, agglutinati.
• condizioni anormali: policromasia (eritrociti bluastri), i, globuli rossi nucleati, corpi di Howell-jolly (residui nucleari para – periferici), parassiti.
Nei leucociti (a forte ingrandimento) si deve osservare: • la stima numerica
• il volume cellulare
• il citoplasma: colore, quantità relativa rispetto al nucleo, granuli (caratteristici e anormali come corpi di Dohle) ed eventuali corpi inclusi (Ehrilichia,
Hepatozoon, inclusi da cimurro, batteri.)
• nucleo: forma, colore, struttura della cromatina (e dei nucleoli.) • conteggio differenziale
Per i trombociti o le piastrine occorre verificare:
• Stima del numero presente nel campione, classificando genericamente come normale, aumentato o diminuito (ingrandimenti 200,400 o 1000); è considerata normale la presenza di 10-20 trombociti per campo microscopico usando un obiettivo a immersione (1000x).
• Variazione in volume e morfologia
• Presenza di aggregazione, spesso i trombociti si riuniscono in gruppi di alcuni o tanti elementi, ma nei campioni prelevati e conservati bene si ritrovano anche isolati.
• Eventuale presenza di parassiti (es. Ehrlichia platis) [38].
1.7.1 Conteggio differenziale leucocitario
Il conteggio leucocitario differenziale esprime la percentuale relativa dei differenti tipi di leucociti presenti nel sangue e si esegue enumerando e classificando almeno cento leucociti durante l’osservazione dello striscio ematico. In caso di valori totali alterati o di distribuzione anormale è necessario e consigliabile contarne 200-300.
39 Dopo aver completato la conta, si calcola la percentuale di ogni frazione cellulare presente e si moltiplica per il numero totale dei leucociti così da ottenere il valore assoluto dei singoli tipi presenti per millilitro di sangue. E’ il numero assoluto di ogni tipo cellulare ad essere importante, perché i valori relativi (percentuali) possono trarre in inganno se il numero totale di leucociti è alterato. Infatti, se la percentuale di un tipo cellulare è aumentata, potrebbe dipendere da un incremento di questo tipo cellulare o da una diminuzione delle cellule di un altro tipo. Se il numero totale di una qualsiasi classe leucocitaria è aumentato, si parla di “ aumento assoluto”; ma se è aumentata solo la percentuale, perché gli altri tipi leucocitari sono diminuiti, si parla di “aumento relativo”. Il conteggio leucocitario differenziale dovrebbe essere valutato insieme al conteggio leucocitario totale per avere sempre il numero assoluto di ciascun tipo di leucocita.
Quando il leucogramma è calcolato con metodi manuali o con contaglobuli a impedenza, gli eritrociti nucleati (NRBC) sono classificati come leucociti. Diventa quindi necessario contarli separatamente, usandoli poi per correggere il conteggio leucocitario totale secondo la formula:
Numero di globuli bianchi corretto = [100/ (100+ numero globuli rossi nucleati)] x numero di globuli bianchi.
Se la conta leucocitaria è eseguita con contaglobuli di ultima generazione ed è in grado di distinguere i reticolociti dai leucociti non è più necessario applicare la formula sopra indicata. In ogni caso il numero di NRBC deve essere sempre annotato.
Il conteggio leucocitario differenziale si può eseguire poco sotto i bordi dello striscio, attraverso tutto il vetrino (metodo della W) e con la tecnica della battaglia navale. Nella coda si vanno in genere ad addensare le cellule con volume maggiore. I neutrofili tendono ad essere più abbondanti lungo i margini dello striscio, mentre i linfociti sono a poca distanza dal margine. I monociti e gli eosinofili sono distribuiti in tutto il vetrino. La parte centrale del vetrino è generalmente povera di leucociti a causa della marginazione degli stessi.
E’ quindi consigliabile eseguire la lettura lungo i margini del corpo del vetrino con il metodo della battaglia navale [38]. Infine la presenza di leucociti con struttura anomala come alterazioni tossiche del citoplasma dei neutrofili o aumento di linfociti reattivi
40 (quando sono >5%) deve comparire sul referto con i risultati finali. La frequenza dei neutrofili tossici può essere ridotta (del 5-10%), moderata (11-30%) o elevata (> 30%) e la gravità delle alterazioni tossiche varia da +1 a +3 [41].
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