I soggetti risultati idonei a partecipare allo studio, e che quindi vi hanno aderito, si sono sottoposti ad un esame di Risonanza Magnetica (RM), una settimana prima dell’inizio del protocollo riabilitativo. Le immagini di RM sono state ottenute con diversi tipi di scanner (GE Signa, Siemens Avanto e Area, Philips Achieva, Intera e Panorama), con campo magnetico di 0,23 Tesla per un solo soggetto e di 1,5 Tesla per gli altri 14 pazienti.
I soggetti si sono presentati la mattina per sottoporsi all’esame di RM. L’acquisizione delle immagini avviene secondo vari tipi di sequenze ad alta risoluzione:
• Sequenze T1 pesate (T1w); • Sequenze T2 pesate (T2w); • Sequenze FLAIR T2.
Le immagini così ottenute permettono di studiare in maniera approfondita la funzione e la struttura dell’encefalo e del tronco encefalico dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla.
4.3.2 Elaborazione ed analisi del segnale
Per ogni soggetto è stata eseguita una differente analisi delle immagini avvalendosi del programma FSL. Per prima cosa è stata eseguita una “brain-extraction” utilizzando FSL-BET, in modo da ottenere una maschera dell’encefalo privata del cranio, sulla quale calcolare il Volume Intracranico/Intra-Cranial Volume (ICV). Sull’immagine risultante, avvalendosi di FSL-FAST, è stata eseguita una segmentazione dei vari tipi di tessuto: sostanza grigia (GM), sostanza bianca (WM) e liquido cefalorachidiano (CSF). A questo punto il Volume Parenchimale Totale-Total Brain Volume (TBV) è stato ottenuto sommando i volumi della sostanza grigia e bianca, in modo da stimare il
volume parenchimale finale. Una stima dell’atrofia cerebrale totale è stata ricavata dal rapporto TBV/ICV.
Sulla base della metodica utilizzata da Glasser e Van Hessen (2011), è stata eseguita anche una combinazione delle acquisizioni T1 pesate (T1w) e T2 pesate (T2w) in modo da ottenere una mappatura del contenuto di mielina in vivo, saggiata sui voxel. Questo dato è ottenibile dal rapporto T1w/T2w. Inoltre, le informazioni estrapolate dalle mappe di mielinizzazione, vengono integrate con quelle ottenute grazie alle sequenze FLAIR T2. Usando questi due tipi di acquisizioni di immagini, due esaminatori esperti hanno suddiviso manualmente le lesioni per ogni soggetto. Le risultanti maschere di lesione sono importanti per stimare il Volume Lesionale Totale sia in mm3 che in percentuale, stimato come rapporto tra LV e TBV moltiplicato per 100, dove LV corrisponde al Volume Lesionale-Lesion Volume. Le maschere di lesione di ciascun soggetto sono state poi normalizzate nello spazio standard MNI (Montreal Neurological Institute) in modo da eliminare ogni differenza per dimensione complessiva, posizione e forma.
Figura 4.2: Processo di identificazione delle lesioni
Infine, abbiamo segmentato manualmente la sezione del Corpo Calloso (CC) ed abbiamo normalizzato il dato nello spazio MNI. Seguendo l’Atlante della sostanza bianca (ICBM DTI 81 White Matter Atlas), la superficie del CC è stata quindi suddivisa in tre porzioni: CC anteriore, CC medio, CC posteriore. Per ridurre gli effetti della
variabilità data dalle dimensioni e dalla forma, abbiamo stimato la superficie del CC sulla base delle immagini originali di ciascun soggetto. In conclusione, il nostro scopo è stato quello di studiare una possibile correlazione tra il miglioramento delle performance motorie dopo il trattamento ed i parametri appena citati.
4.3.3 Parcellizzazione del Corpo Calloso
Il Corpo Calloso (CC) è una struttura composta da varie parti, che in senso anteroposteriore sono Rostro, Ginocchio, Tronco e Splenio. Esso è costituito da più di 200 milioni di assoni e rappresenta un’importante via di comunicazione inter- emisferica. La valutazione del Corpo Calloso è fondamentale nello studio dei soggetti affetti da Sclerosi Multipla, in quanto rappresenta un utile marcatore alla Risonanza Magnetica nella valutazione della terapia farmacologica da intraprendere o modificare. L’utilizzo del CC come biomarker prevede una misurazione manuale che permette di stimare la Corpus Callosum Area (CCA); a questa valutazione si aggiunge il calcolo del Corpus Callosum Index (CCI). Entrambi questi dati risultano essere velocemente ottenibili, inoltre sono metodi semplici attraverso i quali sia possibile quantificare l’atrofia del CC.
Per poter calcolare la CCA ed il CCI è necessario selezionare una fetta sagittale nella linea mediana, evidenziata dalla fessura inter-emisferica, dalla vena di Galeno e dall’acquedotto cerebrale. Una volta trovata la fetta giusta, la CCA si misura tracciando il contorno esterno del Corpo Calloso; mentre il CCI si calcola sommando la larghezza anteroposteriore del Ginocchio (a;a’) e dello Splenio (b;b’) e l’altezza craniocaudale del Tronco (c;c’) del CC, la somma ottenuta viene poi divisa per la lunghezza (a;b) del CC.
Figura 4.3: Sulla sinistra misurazione della CCA; sulla destra misurazione del CCI
La CCA è accurata nel differenziare pazienti con forme RR da pazienti che presentano una fase progressiva e presenta una correlazione maggiore, rispetto al CCI, con il deterioramento sia fisico che cognitivo; il calcolo del CCI invece si dimostra una tecnica più veloce rispetto alla misurazione della CCA. Quindi si raccomanda l’uso
della CCA, a meno che non sia essenziale il fattore tempo, il che rende consigliabile l’utilizzo del CCI.
Inoltre tutti i parametri ottenuti dallo studio del CC risultano migliori o analoghi rispetto agli altri ottenibili dallo studio con RM dei pazienti con SM. Si può dire, quindi, che l’atrofia del Corpo Calloso è un biomarker importante e sia la CCA che il CCI sono più sensibili e specifici delle misurazioni volumetriche convenzionali (Granberg T., 2015). Alla luce dell’importanza del Corpo Calloso nello studio dei pazienti affetti da Sclerosi Multipla, abbiamo deciso di eseguirne la parcellizzazione, che consiste nel calcolo del volume delle singole parti della struttura.
La parcellizzazione del CC ha previsto un lavoro diviso in 6 steps:
• Selezione delle acquisizioni adatte, per questo motivo abbiamo utilizzato solo 13 (9 femmine e 4 maschi) delle 15 acquisizioni che avevamo, dal momento che 2 risultavano inadatte;
• Selezione della fetta corretta; • Segmentazione manuale del CC;
• Esecuzione di una Brain Extration, in modo da creare una maschera;
• Sovrapposizione sulla maschera dell’immagine del cervello medio nello spazio affine, tratta dall’atlante Atlas;
• Utilizzo della divisione topografica del CC, registrata nell’immagine del cervello medio, per frazionare quello dei singoli pazienti.
A questo punto abbiamo eseguito uno studio di correlazione tra la superficie delle singole parti del CC (anterior, midium e posterior), normalizzate per lo spessore totale dello stesso, ed i valori dei delta delle scale di valutazione funzionale dei pazienti, corrette per l’età.
Figura 4.4: Procedimento utilizzato per eseguire lo studio di parcellizzazione