Lo Scratch Assay è una tecnica standardizzata largamente utilizzata proprio allo scopo di valutare la migrazione di popolazioni cellulari su due dimensioni. Il saggio prevede una semina di cellule in piastra in modo da ottenere un monostrato a confluenza parziale e di rimuovere un segmento di cellule in modo meccanico, termico o mediante un danno di tipo chimico. Lo scratch, che può essere di qualche millimetro, è l’area che verrà analizzata per studiare la capacità di migrare del campione in esame.
Questa tecnica viene utilizzate per valutare diverse linee cellulari in contesti fisiologici o patologici diversi, come ad esempio metastasi del cancro, la morfogenesi embrionale (Pouliot N., et al. 2000) e la guarigione delle ferite (Reinhart-King C.A. 2008).
Le informazioni di base che si ottengono da questo saggio sono i tassi di chiusura dello scratch, ovvero una misura di velocità da parte di un campione cellulare di invadere una superficie libera in un intervallo di tempo. Solitamente un esperimento di Scratch Assay mette a confronto due cloni cellulari, uno dei quali può essere stimolato o inattivato mediante stimoli di tipo fisico o di tipo chimico, mentre il secondo funge da controllo. La differenza temporale ottenuta nella chiusura dell’area da parte di entrambe i lembi dello scratch sarà il risultato finale. I dati possono essere standardizzati e facilmente riproducibili.
La variabilità del saggio è data dai molti metodi che si possono utilizzare per effettuare lo scratch e per esegure l’analisi dei dati, utilizzando immagini o time laps.
Per ottenere buoni risultati è fondamentale avere un alto livello di accuratezza e di riproducibilità dell’esperimento. Ad esempio, risulta molto importante la dimensione dello scratch e soprattutto la sua riproducibilità in termini di dimensioni paragonabili dell’area generata tra i singoli campioni dell’esperimento.
I test di guarigione della ferita utilizzano solitamente linee cellulari standard o linee primarie isolate da sangue o tessuto (Philippeos C., et al. 2012). Mentre per le prime i protocolli sono di facile standardizzazione, per le linee primarie ogni laboratorio produce un proprio protocollo ottimale, quindi la qualità del saggio dipende direttamente dalla professionalità degli operatori.
Se tutti questi aspetti vengono rispettati e riprodotti il risultato finale sarà uno sScratch Assay con comparabilità e riproducibilità elevate.
Un altro aspetto che determina la qualità del saggio è la densità di semina e il tempo di incubazione delle cellule. Questi due parametri influiscono sulla confluenza del monostrato cellulare, sulla base dell’esperimento. Chiaramente, questa tecnica è vincolata alla linea cellulare utilizzata e all’utilizzo
33 del clone specifico in base al numero di passaggi effettuati in piastra. Quindi è preferibile, per aumentare la riproducibilità dei dati, usare campioni cellulari che siano ad uno stesso numero di passaggi di piastra.
La valutazione della migrazione cellulare può tuttavia essere alterata dall’attività di proliferazione delle stesse cellule. Per evitare questo falso positivo in molti lavori viene inibita la proliferazione, ad esempio utilizzando farmaci come la actinmycin C (Reinhart-King C.A. 2008), in grado di arrestare la mitosi, o la starvazione, una semplice tecnica non farmaceutica comunemente utilizzata che riduce fortemente l’attività proliferativa del campione semplicemente riducendo al minimo la quantità di siero fetale bovino presente nel terreno di cultura. Quest’ultima tecnica non può essere utilizzata su linee cellulari primarie, in quanto esse non sopportano bene l’assenza di siero andando in contro ad apoptosi.
Qualunque sia il metodo utilizzato, per manipolazione diretta o tramite l’utilizzo di inserti in plastica, è importante notare che recenti ricerche suggeriscono che la geometria dello scratch influenza il tasso di chiusura indipendentemente dall'uniformità della superficie di gap (Arciero J.C., et al. 2013; Vedula S.R., et al. 2012).
La prima tecnica è quella classica, viene effettuata manualmente dall’operatore utilizzando la punta di una pippetta sterile, un ago o un altro strumento appuntito in grado di creare lo scratch. Risulta molto importante inclinare correttamente la pipetta e applicare una pressione costante per creare una larghezza di spaziatura coerente tra tutti i campioni (Straatman K. 2008). Questa tecnica non è molto indicata nel caso di saggi che utilizzano matrici o comunque gel di supporto per la cultura cellulare in esame, in quanto l'applicazione di troppa pressione può danneggiarle e di conseguenza influenzare i tassi di migrazione (Hulkower K.I., et al.2011).
L’utilizzo di inserti ha effetti positivi evidenti sul saggio, in quanto permettono di ricreare in ogni campione uno scratch omogeneo e costante grazie alla loro geometria. Il test di guarigione della ferita viene avviato rimuovendo l'inserto. Va però mantenuta attenzione, le cellule possono aderire all'inserto ed essere strappate dal monostrato al momento della sua rimozione, lasciando i bordi frastagliati. Inoltre, può verificarsi una perdita di adesione dell’inserto dal fondo del supporto (piastra o pozzetto) permettendo alle cellule di migrare in anticipo nell’area di migrazione. Queste condizioni provocherebbero una conformazione dei lembi dello scratch non più uniforme e più difficilmente comparabile con gli altri campioni. Ciò significa che l’utilizzo degli inserti non è necessariamente più efficacie rispetto ad uno scratch prodotto manualmente.
Acquisire i dati in questi saggi significa effettuare valutazioni sul tasso di migrazione dei campioni presi in esame. Per questo scopo, per lo più, si effettuano indagini in microscopia, con la quale si verificano i vari stadi di avanzamento della chiusura del gap negli intervalli di tempo prestabiliti.
34 Nello Scratch Assay la microscopia a trasmissione è solitamente sufficiente per monitorare l’area di interesse nel tempo (De Rossi G., et al. 2013).
Allo scopo di effettuare analisi ottimali è consigliato acquisire immagini a vari intervalli, che posso essere di 15 minuti o di alcune ore in base al campione cellulare in esame. Il microscopio potrebbe essere dotato anche di software per l’acquisizione di immagini.
Lo scopo è chiaramente quello di raccogliere dati sulla chiusura nel tempo, solitamente nelle 24-48 ore.
Tracciare linee lungo i bordi principali e misurarne la distanza media o la superficie residua dello scratch, valutandone la diminuzione in funzione del tempo, è un buon metodo comodo e semplice. In alcuni studi si cerca di valutare il tempo di esatta chiusura del gap per osservazione diretta, ma questo ovviamente comporta un impegno notevole ed una presenza continua dell’addetto nell’intervallo di tempo preso dall’intero esperimento.