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SOMMARIO
Sommario ... 1
1. Introduzione ... 3
2. Candida spp: Classificazione e Microbiologia ... 3
3. Fisiopatologia e fattori di virulenza ... 5
3.1 Patogenesi ... 5
3.2 Biofilm ... 6
4. Epidemiologia ... 6
5. Fattori di rischio e SCORE ... 8
5.1 gli SCORE ... 9 6. Percorso diagnostico ... 11 6.1 Indagini di laboratorio ... 11 6.1.1 Emocolture... 12 6.1.2 Sierologia ... 13 6.1.3 Procalcitonina ... 14
7. Storia Naturale e Prognosi ... 14
7.1 Complicanze ... 15
8. Accenni di Terapia ... 16
8.1 Terapia Mirata (paziente non neutropenico) ... 16
9. Lo Studio ... 17
9.1 Materiali e metodi ... 17
9.1.1 Popolazione in studio, variabili e definizioni ... 17
9.1.2 Microbiologia ... 20
9.1.3 Metodi statistici ... 22
9.2 Risultati ... 22
Risultati analisi popolazione ... 22
Analisi dati Microbiologici ... 25
Risultati analisi dati sui DEVICE... 28
Analisi dati Terapia ... 29
9.2.1 Risultati analisi fungicidia ... 30
9.2.2 Risultati analisi filmogenicità ... 31
9.3 Discussione ... 36
9.4 Conclusione ... 41
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1. INTRODUZIONE
Candida spp è il più comune agente eziologico di infezione fungina. Candida spp provoca
infezioni che hanno un ampio range di gravità: dalle semplici colonizzazioni mucocutanee alle colonizzazioni profonde che possono virtualmente coinvolgere tutti gli organi [1].
Definiamo fungemia, o più precisamente candidemia, la situazione in cui un'emocoltura risulti positiva per lieviti del genere Candida [2] .
L'incidenza delle candidemie è in crescita nei reparti ospedalieri a causa del cambiamen-to demografico, all’invecchiamencambiamen-to della popolazione, alla complessità dell’assistenza sanitaria: un aumento dei cosiddetti pazienti ”fragili”, sottoposti a interventi terapeutici e chirurgici invasivi, nonché procedure invasive come il posizionamento di cateteri venosi centrali (CVC) o cateteri venosi centrali ad accesso periferico (PICC), ed è pertanto pro-porzionale all'aumento del rischio infettivo degli stessi [3].
Le infezioni dovute ai lieviti del genere Candida assumono dunque un'importanza cre-scente e il loro impatto in termini di morbilità e di mortalità, paragonabile a quello dello shock settico, non è regredito nel corso degli ultimi tre decenni [4].
2. CANDIDA SPP: CLASSIFICAZIONE E MICROBIOLOGIA
Le Candida spp. sono lieviti formati da cellule di piccole dimensioni (4-6 μm ), ovoidali e con fine parete, che si trovano fisiologicamente negli individui sani; il loro serbatoio prin-cipale è il tratto digestivo [5,6].
In generale i lieviti sono forme di vita unicellulari che si riproducono per gemmazione, al contrario delle muffe, organismi pluricellulari formati da ife. I lieviti come Candida
albi-cans e Cryptococcus neoformans producono cellule riproduttive: i blastoconidi.
C. albicans può anche produrre pseudoife, ife vere, clamidiospore e tubuli germinativi. La
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un lievito e una muffa. Generalmente sia variazioni di temperatura sia riduzioni del pH fa-voriscono la formazione di blastoconidi. Altre sostanze come biotina, cisteina, trasferrina e zinco stimolano il dimorfismo in questi lieviti, intendendo come “dimorfico” un fungo che cresce come una muffa in vitro e come un lievito in vivo.
La parete fungina è una struttura stratificata formata da microfibrille di chitina, inserite in una matrice di piccoli polisaccaridi, proteine, lipidi, sali inorganici e pigmenti che provve-dono a dare forma e sostegno alla cellula stessa. I lieviti in particolare, hanno una parete esterna composta da peptidomannani solubili ed una matrice di α- e β-glucano, manna-no, galattomannamanna-no, e meno frequentemente rhamnomannano che sono i responsabili della risposta immune dell'ospite verso i lieviti patogeni. Questi zuccheri possono essere il target si esami diagnostici sierologici, di sempre più largo impiego nella pratica clinica. Nel caso specifico di C. albicans, la parete cellulare contiene approssimativamente dal 30 al 60 % di glucano, dal 25 al 50 % di mannano, 1-2 % di chitina (sita principalmente a livel-lo del poro di gemmazione), dal 2 al 14 % di lipidi e dal 5 al 15 % di proteine [7, 8, 9].
Questi organismi crescono bene sui terreni artificiali ed in linea di massima non richiedo-no particolari condizioni di coltura. Su mezzi artificiali, Candida spp è identificabile in co-lonie lisce, cremose e bianche. Ci sono più di 150 specie di Candida, ma solo 15 sono iden-tificate come frequenti patogeni umani: C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C.
parapsi-losis, C. krusei, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. pelliculosa, C. kefyr, C. li-polytica, C. famata, C. inconspicua, C. rugosa, e C. norvegensis [6,10,11].
Tra queste C. albicans è, negli esseri umani, la specie più comunemente isolata, essendo un'ospite frequente di orofaringe, cute e mucose, oltre che del tratto respiratorio, gastro-intestinale e genito-urinario .
L'identificazione delle diverse specie ha un'importanza clinica fondamentale, infatti per-mette di individuare le specie più virulente e di verificare la congruità dei test di sensibili-tà; ad esempio le MIC delle echinocandine sono sempre elevate in C. parapsilosis e se pertanto questo non succede si deve ipotizzare un errore nel’identificazione del lievito [6, 12, 13
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3. FISIOPATOLOGIA E FATTORI DI VIRULENZA
3.1 PATOGENESI
Nella maggioranza dei casi l'infezione da Candida origina dalla flora microbica endogena e dalla colonizzazione di cute e mucose, ma anche un'acquisizione nosocomiale è stata di-mostrata [14].
Come per gli altri tipi di micosi, le difese dell'ospite giocano un ruolo chiave nello sviluppo di una candidiasi invasiva [6]. Se avviene uno squilibrio tra colonizzazione ed i normali meccanismi di difesa , rappresentati da polimorfonucleati, macrofagi, immunità cellulo-mediata e umorale ma anche dalla barriera muco-cutanea e dalla flora batterica endoge-na muco-cutanea, Candida è in grado di penetrare nei tessuti più profondi determiendoge-nando una disseminazione multi-organo e, talvolta, una sepsi. Quest’ultima si verifica attraverso tre fasi: colonizzazione, invasione, induzione della risposta infiammatoria dell’ospite defi-nita dai rianimatori come SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) [5].
Candida spp, in particolare C. albicans, espongono proteine di superficie strutturalmente
simili al C3, che ne mascherano l'adesione alle membrane cellulari [14].
Uno dei maggior determinanti della patogenesi è la capacità di adesione alle superficie, anche se non sono ancora state identificate molte adesine tra i patogeni di Candida. Hwp1, Ala1p/Als5p, Als1p sono quattro adesine strutturalmente associate isolate da C.
albicans, mentre Epa1p è stata isolata da C. glabrata [15].
L'espressione selettiva di alcuni geni responsivi alle condizioni ambientali, è determinante nella patogenesi di infezione nei mammiferi.
Sono state dimostrate due fasi d'infezione: early phase e late phase. Nella early phase so-no interessati geni che rispondo al fattore di trascrizione Rim101, geni rispondenti alle concentrazioni di zinco e ferro e geni caratteristici delle cellule di ife invasive. Nella late phase invece abbiamo risposte stimolate dalla fagocitosi macrofagica [16].
6 3.2 BIOFILM
Per biofilm intendiamo una matrice polimerica glicoproteica autoprodotta da cellule bat-teriche o fungine per difendersi dall'ambiente, con la quale queste aderiscono a superfici biologiche o inerti, come i cateteri intravascolari. I micro-organismi all'interno del biofilm creano una comunità complessa, strutturata e funzionale, crescono in modo differente, comunicano con gli altri esseri viventi e cambiano il loro metabolismo (quorum sensing) inoltre sono più resistenti agli antimicrobici [17,18, 19 ]. Già nel giro di pochi giorni dopo l'in-serimento di un catetere le Candide possono aderire alla superficie inerte, coadiuvate da un film di proteine eso-cellulari come fibrina, fibrinogeno, fibronectina, collagene, elasti-na, laminielasti-na, vitronectina e trombospondina [20]. La formazione del biofilm è un fattore di virulenza considerato più rilevante per le specie di Candida non-albicans [21] rispetto a
C. albicans anche se non tutti gli autori sono concordi [22]; il biofilm stesso, inoltre, è un reservoir per infezioni persistenti [4,17].
La produzione di biofilm da parte delle specie di Candida risulta associata ad una mag-giore mortalità, probabilmente correlata con la scarsa permeabilità della matrice ai farmaci antifungini; in particolare gli azoli non hanno attività contro il biofilm [17, 21, 23 ] mentre echinocandine e Amfotericina B possiedono un'elevata attività antibiofilm [1] . E' stato identificato un ruolo per il gene SMI1 nella produzione del glucano della matrice, as-sociato al fenotipo di resistenza: agirebbe attraverso la trascrizione del fattore Rlmp e del-la glucano-sintasi Fks1p [24]. La stessa matrice dona anche protezione nei confronti del si-stema immunitario dell'ospite [25].
Forte del concetto per il quale c'è mancanza di un'efficace terapia nei confronti dell'infe-zione da biofilm, la soludell'infe-zione ottimale è rimuovere il device [24].
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4. EPIDEMIOLOGIA
La candidiasi invasiva rimane una reale complicanza in pazienti con una o più patologie sottostanti, o sottoposti ad interventi di chirurgia maggiore. In recenti studi di prevalenza la candidemia ha un'incidenza di 6,9/1000 ricoveri in ICU ed il 7.5% dei pazienti in ICU ri-ceve una terapia antifungina [26, 27]. Nell'esperienza pisana la percentuale maggiore dei casi (studiati tra il 2012 ed il 2013) avviene in medicina, specie se si studiano i casi per 10.000 giorni ricovero [3] .
La candidemia aumenta il tasso di mortalità del 20-49% [26]. Per molto tempo C. albicans è stata la specie maggiormente isolata nelle emocolture ma recentemente c'è stato un cambiamento a favore di altre specie non-albicans, specialmente nei reparti intensivi e nei pazienti sottoposti a trapianto di midollo [28] .
Generalmente le infezioni da specie non-albicans si associa più frequentemente a ceppi resistenti , risultando più difficili da eradicare, ciò comporta una maggiore mortalità ri-spetto a C. albicans [29]. In particolare la mortalità più elevata è associata ad isolamen-to di C. krusei; C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis sono ritenute ad un livello inter-medio mentre la più bassa mortalità è associata a C. parapsilosis [30] .
Figura 1- Indagine European Confederation of Medical Mycology (ECMM): Candida spp.
respon-sabili di candidemia in Europa e in alcuni Paesi europei. Tratta da: Tortorano AM, Peman J, Ber-nhardt H, et al. Epidemiology of candidaemia in Europe: results of 28-month European
Confedera-tion of Medical Mycology (ECMM) hospital based surveillance study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
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5. FATTORI DI RISCHIO E SCORE
Lo studio di fattori di rischio per lo sviluppo di una candidiasi invasiva è stato ed è oggetto di diversi studi.
Possiamo intanto suddividere i fattori di rischio in “non modificabili”, come età, diabete mellito, immunocompromissione e “modificabili”, oggetto auspicabilmente d'intervento preventivo, come la presenza di CVC e la terapia antibiotica protratta [28,30,31,33]
Nello specifico, diabete mellito e immunocompromissione sono collegati. Infatti tale pato-logia è associata ad una diminuzione dell'attività fagocitaria dei macrofagi[34], alla ridu-zione dell'attività cellulo-mediata e tendenza alla glicosilaridu-zione del frammento C3 del complemento con conseguente difetto di opsonizzazione.
Altre patologie di base possono compromettere la normale attività delle difese dell'ospi-te:
l'insufficienza renale cronica, dove l'uso di cateteri, accessi vascolari e dialisi peri-toneale crea porte di ingresso per patogeni come Candida spp. La sindrome nefro-sica è invece causa di dispersione urinaria di IgG e del loro aumentato cataboli-smo;
la BPCO riduce notevolmente i meccanismi di clearence muco-ciliare e l'attività dei macrofagi alveolari e spesso questi pazienti sono trattati con cicli ripetuti di anti-biotici;
epatopatia ed epatite autoimmune possono essere considerate fattori di rischio sia per un meccanismo di disimmunità proprio della patologia, che legato ai far-maci immunosoppressivi e ai cicli di antibiotico-terapia che la patologia stessa ri-chiede;
Tumori solidi in fase avanzata. Ne sono causa lo stato di malnutrizione che spesso affligge il paziente, l'uso di chemioterapici, la presenza di cateteri venosi centrali, le terapie antibiotiche ad ampio spettro e la nutrizione parenterale totale [14];
neoplasie ematologiche maligne che compromettono la produzione midollare. Sottolineiamo il ruolo chiave della neutropenia nello sviluppo di candidiasi invasi-ve [14, 35]
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Il paziente con più di 65 anni è più vulnerabile alla candidemia poichè l'età avanzata è sta-tisticamente più associata a comorbidità, aumentati livelli di colonizzazione orofaringea, maggior utilizzo di farmaci e cambiamenti fisiologici correlati all'invecchiamento. Se pen-siamo che i pazienti in questa fascia d'età costituiscono la maggioranza della popolazione ospedalizzata, possiamo capire la dimensione del problema [30].
Per quanto riguarda i fattori di rischio modificabili, abbiamo già menzionato l'utilizzo di CVC. Lo studio di Yoshino et al. del 2014 ha inoltre provato che la candidemia associata a catetere è caratterizzata da un'alta mortalità, probabilmente dovuta a fattori come la lunga permanenza del catetere stesso e il ritardo nell'inizio della terapia antifungina [36]. Lo studio di Lorente et al. aggiunge una specificità: sarebbe l'accesso femorale il sito di ca-teterizzazione più a rischio, probabilmente perché più soggetto a colonizzazione di mate-riale intestinale [37].Oltre all'utilizzo di CVC risultano fattori di rischio altre procedure in-vasive come la ventilazione meccanica, la nutrizione parenterale totale e la chirurgia maggiore addominale, ma anche la perforazione gastroenterica e la permanenza in un re-parto di Terapia Intensiva [14, 35, 38]. L’alimentazione parenterale determina un appiatti-mento dei villi intestinale ed una maggiore traslocazione dei microorganismi intestinali, compresa Candida spp.
Studi multicentrici riportano che il 30-40% dei pazienti era ricoverato in ICU al momento della diagnosi [32]. Approfondendo il concetto di rischio per quanto riguarda la manipola-zione addominale, viene così spiegato: l'apertura o perforamanipola-zione dell'intestino provoca la fuoriuscita della flora digestiva e la contaminazione del peritoneo. In molti casi la pulizia chirurgica dell'addome e il lavaggio con soluzioni disinfettanti risulta comunque efficace; tuttavia esiste la possibilità di sviluppo di candidiasi invasiva e peritonite micotica ricor-rente in seguito a perdita dal sito dell'anastomosi [39].
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5.1 GLI SCORE
Intendiamo come sistemi di scoring dei sistemi di attribuzione di punteggi crescenti basati sul rilievo di fattori di rischio nel paziente. Superata una data soglia la possibilità di svilup-pare una candidiasi invasiva si fa sempre più forte ed è giustificato l'inizio di una terapia antifungina empirica. Questi score hanno basso valore predittivo positivo ma alto valore predittivo negativo: il loro utilizzo serve principalmente ad evitare un ricorso eccessivo ad una terapia empirica [40]
Uno dei primi sistemi studiati fu il Candida Colonization Index (CCI), datato 1994 [41]. Il CCI consiste nel rapporto fra il numero di siti non sterili positivi per Candida spp ed il numero di siti campionati: un rapporto di 0,5 indica alta intensità di colonizzazione e dunque alto rischio di evoluzione in forma invasiva [41, 42]
Successivamente sono sopraggiunti altri sistemi, come quello di Paphitou et al. del 2005, che utilizza delle “prediction rules” basate su dati del paziente reperibili durante la de-genza: uso di antibiotici ad ampio spettro, degenza in ICU ≥ 3 giorni, nutrizione parentera-le totaparentera-le, recente emodialisi e diabete mellito [43]. Nello studio di Swindell et al. del 2009 l'uso di formulazioni lipidiche per la nutrizione parenterale totale è stato riconosciuto come fattore di rischio per la formazione di biofilm e infezioni da Candida catetere-relate [44].
Nel 2006 Leon et al. hanno creato il “candida score”, che è uno sviluppo del CCI: Chirurgia maggiore [odds ratio (OR): 2.71; 95% intervallo di confidenza (CI): 1.45e5.06], colonizza-zione multifocale (OR: 3.04; 95% CI: 1.45e6.39), nutricolonizza-zione parenterale totale (OR: 2.48; 95% CI: 1.16e5.31), e sepsi severa (OR: 7.68; 95% CI: 4.14e14.22), risultano predittivi di candidiasi invasiva con l' 81% di sensibilità e il 75% di specificità. Ai primi tre parametri viene assegnato un punto, mentre allo stato di sepsi severa ne vengono assegnati 2. Nei pazienti con CS inferiore a 3 è altamente improbabile lo sviluppo di una candidiasi invasi-va (rischio < 5%). Il recente studio di Eggiman et al. ha dimostrato che l'accuratezza pre-dittiva di un candida score di 3 è maggiore di quella di un CCI di 0,5 [39, 45].
Nel 2007 Ostrosky-Zeichner et al hanno rivisto il “prediction rules “ del 2005 aggiungen-do qualche fattore. Come risultato abbiamo questo score: uso di qualsiasi antibiotico a
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largo spettro o presenza di CVC e almeno due tra nutrizione parenterale totale, dialisi, chirurgia maggiore, pancreatite, uso di steroidi, uso di altri agenti immunosoppressivi [46]. Nel 2011 in uno studio prospettico, Posteraro et al hanno comparato gli score precedenti con la ricerca su sangue del paziente del (1-3 )β-D- glucano. Questo studio afferma che la ricerca del BG su campione ematico all'inizio dello stato settico,da sola o in combinazione con il calcolo del Candida Score, può effettivamente guidare nella decisione di iniziare una terapia precocemente nei pazienti a rischio [47].
6. PERCORSO DIAGNOSTICO
Molto spesso le caratteristiche cliniche della candidiasi invasiva si sommano alla clinica di base del paziente, rendendo difficoltoso il riconoscimento dell'infezione fungina in tempi adeguati. Inoltre la classica diagnosi colturale ha di per sé alcuni problemi: il prelievo dei tessuti in pazienti critici e nei pazienti ricoverati in terapia intensiva, può essere tutt'altro che semplice ed inoltre le colture ematiche hanno bassa sensibilità e specificità (intorno al 50% )[48 ]. In studi effettuati tramite autopsia provante un'effettiva candidiasi invasiva, la sensibilità antemortem delle emocolture risultava in un range del 21%-71% [49 ]. Va sotti-lineato come un ritardo di sole 12 ore nell'inizio della terapia antifungina può ridurre sen-sibilmente la sopravvivenza del paziente [50].
L' ITALIC ha stilato tre categorie diagnostiche per la candidemia:
candidemia certa : crescita di Candida spp dall'emocoltura del paziente;
candidemia probabile : comorbidità del paziente predisponenti a candidemia, adeguati fattori di rischio calcolati tramite gli SCOREs e almeno un test antigenico positivo (BDG, mannano/antimannano);
candidemia possibile : comorbidità del paziente predisponenti a candidemia, adeguati fat-tori di rischio, segni di infezione attiva ma nessuna conferma microbiologica [51].
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6.1 INDAGINI DI LABORATORIO
Come riportato prima le emocolture sono gravate da scarsa sensibilità e tempi di positi-vizzazione (TTP, Time To Positivity) piuttosto lunghi. Ad oggi il target è trovare nuovi strumenti diagnostici complementari alle colture, per “identificare” quel 50% di pazienti le cui emocolture risultano negative. La ricerca dell'antigene mannano e dell'anticorpo anti-mannano, la ricerca del β-D-glucano (BDG) e la tecnica PCR possono diagnosticare una candidemia più precocemente di un' emocoltura, con buona sensibilità e buona spe-cificità; tuttavia non sono ancora metodiche ampiamente utilizzate. Il valore predittivo positivo dei tests non-colturali è limitato dalla bassa prevalenza della candidiasi invasiva. Quando usati come biomarkers che stimano il rischio di un paziente di avere una candi-diasi invasiva, i tests possono facilitare l'inizio di una terapia pre-emptive. Dato il loro ec-cellente valore predittivo negativo, i tests sono utili nell'escludere una forma invasiva e terminare quindi una non necessaria terapia antifungina [49].
6.1.1 EMOCOLTURE
L'emocoltura rimane il gold standard per la diagnosi di candidemia; tuttavia necessita di almeno 24-48 h per positivizzarsi [52]. Lo studio di Chen et al. del 2013 insiste sul possibile utilizzo del TTP come indicatore della specie di Candida in coltura, avendo ciascuna di queste una propria velocità di crescita. Indica inoltre come fattori determinanti il TTP, la nutrizione parenterale totale effettuata dal paziente e l'eventuale utilizzo profilattico di fluconazolo: in generale, il primo parametro tenderebbe a ridurre il TTP favorendo la cre-scita dei lieviti (entro 48h); il secondo paramentro allungherebbe il TTP. Quest'ultimo pa-rametro necessita tuttavia di ulteriori studi [53]. Ben-Ami et al. riportano nel loro studio che il TTP potrebbe essere un marker di candidemia associata a catetere vascolare (cut-off 30h) [54].
Nell'esperienza del laboratorio di Pisa il TTP di Candida albicans è di 27,3 ore, mentre
Candide non-albicans si positivizzano dopo 27,6 ore; ma se si analizza nello specifico il TTP
per Candida tropicalis, la specie gravata dalla più alta mortalità, si vedrà che è di 8,86 ore (sottintendendo un alto inoculo), mentre Candida glabrata si positivizza dopo 48,79 ore. Tali differenze derivano anche dalla patogenesi; infatti quest’ultima Candida deriva quasi esclusivamente da pazienti che hanno subito chirurgia sull’addome e pertanto il passaggio di Candide nel torrente circolatorio è più difficile, ad esempio rispetto a un CVC infetto, e
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pertanto l’inoculo è più basso [55]. Inoltre se abbiamo nell’incubatore due coppie di botti-glie della stessa venipuntura, aerobia e anaerobia, e se si positivizza l’anaerobia per lieviti prima dell’aerobia, allora è molto probabile che tale lievito sia Candida glabrata [56].
In caso di sospetta candidemia , le emocolture andrebbero effettuate ogni 2-3 giorni. Una sola emocoltura positiva è sufficiente per porre diagnosi. Dopo il riscontro di positività l'emocoltura va ripetuta ogni giorno fino ad ottenere il primo risultato negativo [49, 57,58]. I falsi negativi possono essere spiegati dalla rapida eliminazione delle cellule fungine dal sangue. Ciò riduce il periodo finestra in cui Candida spp. può essere isolata dal sangue [49]. Si utilizzano preparazioni aerobie perchè possiedono maggior sensibilità. Le preparazioni anaerobie hanno scarsa efficacia e sono eseguite principalmente come esame comple-mentare delle aerobie [59, 60, 61].
6.1.2 SIEROLOGIA
Mannano/Antimannano Il test per la rivelazione dello zucchero mannano nel siero umano è un test immunoenzimatico. Si ipotizza che il mannano sia presente nel siero anche senza Anticorpi anti-mannano (AbMn) e che questi compaiano in un secondo tempo [62]. Si è pertanto provato a combinare insieme i due test per avere un livello di sensibilità adeguata. La sensibilità di Mn e AbMn dipende anche dalla specie di Candida infettante [63]. I valori di Mn considerati positivi sono quelli superiori a 0,5 ng/ml, mentre per gli AbMn si considerano 10 UA/ml ; valori di MN tra 0,25 e 0,5 e di AbMn tra 5 e 10 sono considerati indeterminati [64]. I due test combinati hanno una sensibilità dell'83% ed una specificità dell' 86% . Non si pos-sono sostituire alle emocolture ma anzi pos-sono complementari per quei casi di can-didiasi invasiva (IC) dove le emocolture risultano negative [65].
Beta-D-Glucano Come spiegato nel capitolo della microbiologia di Candida, il Be-ta-D-Glucano è un componente della parete cellulare di molti funghi. La sensibilità varia dal 57 al 97% e la specificità dal 56 al 93% [66]. Per essere sicuri di un test al glucano positivo bisogna ottenere almeno due esami positivi [67]. Il valore di
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off di 80 pg/ml pare essere il valore che meglio distingue i veri infetti. Data la spe-cificità non elevata, in alcuni lavori intorno al 60% , la problematica del test è quel-la dei falsi positivi, specie nei pazienti ad alto rischio come quelli ricoverati in UTI, spesso affetti da batteriemie sia da Gram positivi che da Gram negativi e trattati con antibiotici (che spesso possono dare falsi positivi) [68]. Il test è anche associa-to a falsi positivi se contemporaneo a somministrazione di albumina, Ig endovena, antibiotici (colistina) o utilizzo di garze chirurgiche . Tuttavia la caratteristica prin-cipale di questo test è un elevato valore predittivo negativo, che serve per esclu-dere le infezioni fungine invasive compresa la candidiasi [47, 69 ].
6.1.3 PROCALCITONINA
La procalcitonina sta ricevendo attenzioni negli ultimi anni come nuovo biomarker per di-stinguere processi infettivi batterici da altre forme di infiammazione. In particolare è uti-lizzata nella diagnosi differenziale della sepsi batterica e delle affezioni respiratorie [70]. Uno studio del 2009 ha identificato i livelli ematici positivi, ma di valore non elevato, di procalcitonina come possibile ulteriore parametro per il CS [71], ma tale ipotesi è stata successivamente smentita [72].
7. STORIA NATURALE E PROGNOSI
La mortalità associata a candidemia varia dal 40 al 70% ma è sicuramente influenzata dal-le condizioni cliniche di base del paziente [73] . Zaoutis et al., analizzando nel loro studio l’epidemiologia e l’outcome di pazienti adulti e pediatrici ospedalizzati per candidemia negli Stati Uniti, trovarono un tasso di mortalità cruda del 35,2%. In particolare, negli a-dulti la mortalità saliva al 49%, con un incremento associato di degenza ospedaliera di cir-ca 10 giorni [74]. In un recente studio di coorte su 224 pazienti in stato di shock settico e con emocoltura risultata positiva per Candida, si sono trovate due diverse percentuali di mortalità: una mortalità ospedaliera globale del 52,8% ed una del 97,6%. La prima era
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riferita a quei pazienti con controllo dell'infezione e che avevano iniziato una terapia ade-guata entro 24h dall'emocoltura, la seconda era riferita a quei pazienti che non avevano raggiunto quei target. Lo studio conclude che il trattamento antifungino ritardato o non appropriato
ed il mancato controllo della sorgente dell’infezione, che in questo studio era principal-mente la rimozione del catetere venoso centrale, sono i principali determinanti
dell’outcome infausto di questi pazienti con shock settico da Candida. Questo studio, inol-tre, sottolinea come sia possibile che le candidemie si associno spesso a shock settico, pertanto ne deriva che il medico attento debbasaper riconoscere i fattori di rischio per la candidemia nel paziente critico e poterli trattare in modo adeguato e puntuale [75].
La mortalità varia anche in base al tempo di insorgenza della candidemia. Per la prima vol-ta De Rosa et al. hanno svol-tabilito come EOC ( Early Onset Candidemia) e LOC ( Late Onset Candidemia), rispettivamente una candidemia sviluppatasi nei primi 10 giorni e una svi-luppatasi oltre il 10 giorno dall'ammissione. In questo studio la mortalità dei pazienti con EOC era del 38,8%, mentre i pazienti con LOC avevano una mortalità del 47,5%. Le infe-zioni precoci tuttavia, nonostante un trend di mortalità più basso, sono ad alto rischio di trattamento inadeguato.
Nel gruppo EOC sono stati identificati come fattori indipendenti di mortalità a 30 giorni l'inadeguata terapia iniziale, l'età avanzata e la candidemia sostenuta da C. albicans; in aggiunta a questi nel gruppo LOC altro fattore indipendente era l'insufficienza epatica. Nel gruppo LOC, l'analisi multivariata stabiliva come un trattamento definitivo con caspo-fungina riducesse drasticamente il tasso di mortalità. All'analisi univariata anche l'uso di Amfotericina B era predittore di sopravvivenza [76].
La tempestività della terapia antifungina può essere considerata un fattore favorevole nel ridurre la mortalità. Infatti, Morrell et al. osservarono che solo i pazienti trattati entro le prime 12 ore dal prelievo di una emocoltura che poi è risultata positiva per Candida pote-vano beneficiare, in modo significativo, di una mortalità più bassa [77].
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7.1 COMPLICANZE
E' raccomandato un esame oftalmologico . Quest'esame nel paziente con candidemia è importante per due motivi: escludere una localizzazione oculare come complicanza di dif-fusione ematica del fungo e ricercare un marker di malattia disseminata che richiederà un intervento terapeutico più importante [78].Si raccomanda di ripetere l’esame fondoscopi-co dopo 10 gg da un primo esame negativo in caso di terapia fondoscopi-con farmaci che non pene-trano nell’occhio come le echinocandine.
Il paziente con candidemia può sviluppare un'endocardite infettiva (EI) in un numero di casi stimato all' 8.3% [58]. I tassi di mortalità nosocomiale per EI da Candida spp variano dal 30.3% al 46.6% [ 79, 80 ]. L'ecocardiografia transesofagea è uno strumento indispensabi-le per dimostrare eventuali vegetazioni [81].
8. CENNI DI TERAPIA
Coesistono diversi approcci terapeutici nel combattere le infezioni profonde da Candida
spp. sia che queste siano “sospettate” o documentate. Recentemente lo studio ITALIC ha
cercato di mettere ordine in tali approcci, definendo come: terapia anticandida empirica, quella instaurata in un paziente con fattori di rischio e sintomi, ma senza esami microbio-logici positivi; terapia pre-emptive quella somministrata a pazienti con fattori di rischio, senza sintomi, ma con esami sierologici positivi; terapia presumptive quella iniziata in pa-zienti con fattori di rischio, sintomi ed esami sierologici positivi; terapia mirata quella ba-sata sulle emocolture positive [51]. Non analizzeremo nel dettaglio i vari approcci, ma ci soffermeremo per introdurre il nostro studio solo sulla terapia mirata.
Ricordiamo i principali strumenti terapeutici utilizzati contro Candida spp.(testati negli an-tibiogrammi del nostro studio):
1. classe delle echinocandine: Micafungina, Anidulafungina, Caspofungina; 2. classe dei polieni: Amfotericina B;
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8.1 TERAPIA MIRATA (PAZIENTE NON NEUTROPENICO)
In accordo con i dati della letteratura, attualmente le echinocandine sono state inserite come prima scelta nelle linee guida internazionali per il trattamento mirato delle candi-demie; fanno eccezione quelle sostenute da C. parapsilosis, per le quali il fluconazolo ri-mane la molecola raccomandata [58, 78 ]. All'interno delle stesse linee guida l'utilizzo dell'Amfotericina B desossicolato, farmaco che tuttavia mantiene un'alta efficacia contro
Candida, è sconsigliato, per i suoi documentati effetti tossici. Nonostante ciò il complesso
lipidico di Amfotericina B risulta essere nettamente meno nefrotossico della forma desos-sicolata ma con medesima efficacia clinica [82].
Andes et al. in una recente review sistematica che includeva 1.915 pazienti con candide-mia e candidiasi invasiva, ha dimostrato come il regime terapeutico con echinocandine, rispetto agli altri regimi a base di triazoli e/o polieni sia gravato da una minor mortalità (27% vs 36%) e da un maggior successo clinico. In tale review si è anche sottolineato co-me la rimozione di CVC durante il trattaco-mento auco-mentava la sopravvivenza dei pazienti in modo sensibile [83].
Nessun dato in letteratura dimostra la superiorità di un’echinocandina sull'altra .
Attualmente sta emergendo il problema dell'aumento di resistenza di Candida glabrata verso le echinocandine come espresso da alcuni studi: Alexander et al., in uno studio por-tato avanti dal 2001 al 2010 , trovò che la percentuale di resistenza (dati relativi a candi-demie sostenute da C. glabrata) era passata dal 4,9% di inizio studio al 12,3%. Da notare che tra gli isolati resistenti agli azoli, il 14,1% era resistente anche ad una o più echino-candina [84].
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9. LO STUDIO
9.1 MATERIALI E METODI
9.1.1 POPOLAZIONE IN STUDIO, VARIABILI E DEFINIZIONI
Per questo studio sono stati valutati tutti i pazienti ricoverati consecutivamente dal 1 Gennaio 2012 al 31 Dicembre 2013 nell' Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana. Tutti i reparti sono stati presi in considerazione.
Sono stati arruolati quei pazienti che, durante il periodo del ricovero, hanno presentato almeno un'emocoltura positiva per Candida spp. Ricordiamo, come riportato in letteratu-ra, che anche un'unica emocoltura positiva è diagnostica per candidemia. Secondo questo principio i pazienti reclutati sono stati 229. I dati raccolti tuttavia provengono da 167 pa-zienti, per irreperibilità delle cartelle cliniche dei restanti pazienti.
I 167 pazienti erano distribuiti tra :
7 reparti di medicina generale (U.O .Medicina Generale 1°, U.O. Medicina Genera-le 2°, U.O. Medicina GeneraGenera-le 4°, U.O. Medicina GeneraGenera-le 5°, U.O. Medicina d’Urgenza Ospedaliera, U.O. Medicina d’Urgenza Universitaria, Sez. Dip. Geriatria);
7 reparti di Anestesia e Rianimazione (U.O. Anestesia e Rianimazione1°, U.O. Ane-stesia e Rianimazione2° Neurochirurgica, U.O. AneAne-stesia e Rianimazione3 °, U.O. Anestesia e Rianimazione4°, U.O. Anestesia e Rianimazione5° Cardiotoracica, U.O. Anestesia e Rianimazione6°-Pronto Soccorso, Sez. Dip. Anestesia e Rianimazione nel Trapianto di Fegato);
9 reparti chirurgici ( S.D. Chirurgia Generale, U.O. Endocrinochirurgia, U.O. Neuro-chirurgia II, U.O. Chirurgia Generale e dei Trapianti, U.O. Chirugia Epatica e dei Trapianti di Fegato, U.O. Chirurgia Vascolare SSN, U.O. Chirurgia generale e d'ur-genza, U.O. Chirurgia dell'esofago, U.O. Chirurgia toracica);
14 reparti di medicina specialistica (U.O. Malattie infettive, U.O. Nefrologia Tra-pianti e Dialisi SSN, U.O. Pneumologia I, U.O. Pneumologia II, U.O. Malattie Car-diovascolari II, U.O. Neuroriabilitazione/ Sez. Dip. Gravi Cerebrolesioni Acquisite, U.O. Reumatologia, U.O. Radioterapia Univ., U.O. Gastroenterologia Univ., U.O.
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Neonatologia, U.O. Traumatologia Univ., U.O. Oncologia, U.O. Ematologia, U.O. Centro Ustioni SSN ).
Per ogni paziente è stata considerata la prima emocoltura positiva per Candida spp. Questo è uno studio retrospettivo, individuando tutti i casi attraverso i database dei labo-ratori microbiologici delle U.O. di Malattie Infettive e di Microbiologia dell’AOUP, dove confluiscono tutte le emocolture dell’ospedale, e analizzando le cartelle cliniche dei pa-zienti arruolati.
Per ogni paziente arruolato sono stati considerati i seguenti parametri:
Parametri anagrafici e relativi al ricovero: età, sesso, provenienza del paziente, precedenti ospedalizzazioni, reparto d'ammissione, giorni di ricovero, modalità di dimissione;
Caratteristiche del prelievo: data della prima emocoltura, laboratorio d'analisi, sito del prelievo(puntura venosa,arteriosa, prelievo da CVC o PICC), terreno di coltura (aerobio/anaerobio), Tempo di positivizzazione (TTP);
Caratteristiche del lievito/dei lieviti in coltura: specie di appartenenza, antimico-gramma. Testati i principali azoli (fluconazolo, itraconazolo, voriconazolo, posaco-nazolo) , echinocandine (anidulafungina, micafungina, caspofungina,) Amfotericina B e Flucitosina;
Evidenza di colonizzazione, esame del fundus oculi ed ecocardiogramma;
Terapie farmacologiche steroidee e antibiotiche durante il ricovero e nei 30 giorni precedenti: durata e tipo;
Terapia antifungine: pregresse, empiriche e mirate;
Eventuale immunosoppressione in atto;
Dati anamnestici: spettro delle comorbidità, infezioni pregresse o in atto, chirurgia maggiore e dialisi effettuate nei 30 giorni precedenti l'emocoltura positiva. Mano-vre invasive (localizzazione di cateteri venosi centrali (CVC), nutrizione parenterale
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(NP), infusioni continue di volumi elevati di fluidi, posizionamento di catetere ve-scicale (CV), sondino nasogastrico (SNG) e altri eventuali presidi ;
Parametri ematochimici di laboratorio e vitali al momento del prelievo (emocro-mo, creatinina, albumina, bilirubina, glicemia, procalcitonina (PCT), proteina C re-attiva (PCR), profilo della coagulazione,colesterolemia, trigliceridemia, valore dell'emoglobina glicata, valori emogasanalitici, sodiemia e potassiemia, pressione arteriosa(PA), frequenza cardiaca (FC), e respiratoria (FR), saturazione emoglobini-ca arteriosa, diuresi nelle 24 ore), Glasgow Coma Semoglobini-cale (GCS)
In base alla data di ammissione in reparto e dell'emocoltura positiva sono state individua-te tre caindividua-tegorie: VEOC ( Very Early Onset Candidemia) entro 48h dall'ingresso, EOC (Early Onset Candidemia) entro 10 giorni , LOC (Late Onset Candidemia) oltre 10 giorni [76].
Per poter valutare e confrontare i pazienti dal punto di vista della gravità e della criticità del quadro clinico di base, sono stati calcolati per ciascuno di essi il Charlson’s Score ( an-che Age-Adjusted)[85].
9.1.2 MICROBIOLOGIA
I campioni ematici per le emocolture sono stati processati attraverso il sistema automati-co BACTEC (Becton Dickinson, INC, Sparks, MD). Le specie sono state identificate tramite reazione biochimica con il sistema API-20C (bioMerieux 55 Vitek, Inc, St.Louis, MI) nel la-boratorio della U.O. Malattie Infettive, e tramite spettroscopia con il metodo MALDI-TOF nel laboratorio della U.O. Microbiologia. La suscettibilità ai farmaci antifungini delle spe-cie identificate è stata testata utilizzando il sistema di microdiluizione in brodo Sensititre® Yeast One . Le MIC sono state interpretate in accordo con il documento della “Clinical and Laboratory Standards Institute M27-A3” [Clinical and Laboratory Standards Institute (2008) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Ap-proved standard M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA].
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La fungicidia è stata effettuata successivamente alla determinazione della MIC. L’inoculo fungino era di 3 x 103 CFU, la lettura della MIC veniva effettuata dopo 24 ore ed era rap-presentata dalla minor concentrazione di un dato antifungino capace di inibire la crescita fungina. La concentrazione minima fungicida (MFC) veniva determinata sub-coltivando i pozzetti del test nei quali non vi era crescita microbica. Tutto il contenuto dei pozzetti (100 l) veniva pertanto sub-coltivato in piastre di Agar Sabouraud e dopo 48 ore le colo-nie contate. Per i batteri si determina la concentrazione minima battericida come la con-centrazione che è in grado di abbattere l’inoculo di almeno 3 potenze base 10 o del 99,9%, questo è possibile perché si parte da un inoculo di 105 batteri. Per i funghi, è più difficile da determinare una MFC al 99,9% perché si parte da un inoculo più basso. Pertan-to abbiamo consideraPertan-to una fungicidia del 90%, cioè capace di uccidere il 90% dell’inoculo (questo concetto è diverso dalla MFC90 che è la concentrazione minima capace di uccide-re il 90% dei ceppi testati, non il 90% dell’inoculo). La fungicidia è stata determinata solo per anidulafungina, micafungina, caspofungina ed amfotericina B. Per gli azoli, farmaci fungistatici, la fungicidia non è stata determinata.
La quantificazione del biofilm si può basare sulla misura della matrice, senza considerare le cellule vive presenti nel biofilm, tali metodi utilizzano coloranti come il cristal violetto [19]. Per gli stessi isolati è stata testata la formazione di biofilm in gruppi, usando il meto-do basato su una piastra da 96 pozzetti seconmeto-do Pierce et al.[87]. In alternativa si possono usare coloranti vitali come XTT che cambia colore se le cellule vive lo metabolizzano; per-tanto se dopo coltura e lavaggi ripetuti vi è un cambiamento cromatico, questo è dovuto alla presenza di cellule adese al supporto della coltura e quindi, si ipotizza, indovate nel biofilm [87]. Ogni pozzetto della piastra micro titolata è stato inoculato con una sospen-sione di cellule di Candida così composta: 3,6 x107 cfu/mL in brodo Sabouraud dextrose all’ 8% di glucosio.
Dopo 4h d’incubazione, le cellule fungine nei pozzetti sono state eliminate lavando gli stessi manualmente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 0,15 M, le rimanen-ti cellule rimaste adese alla superficie plasrimanen-tica (biofilm) sono state quanrimanen-tificate con:
1. un saggio di riduzione al tetrazolio XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide];
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2. misura diretta dell’assorbanza.
Nel primo metodo, un’aliquota di 100 mL della soluzione salina di XTT (Sigma; 1 mg/ mL in PBS) e 1mM di soluzione di menadione (Sigma; preparato in acetone) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto prelavato con biofilm ed ai pozzetti di controllo( per misurare i livelli ba-se di riduzione della soluzione di XTT). Le piastre sono state incubate al buio ad una tem-peratura di 37°C per 5 ore, e la quantità di formazano (derivato da XTT) formatasi è stata misurata con un lettore di piastra micro titolata (microplate reader model 550; Bio-Rad) a 490 nm. Gli isolati per i quali la densità ottica era < 0.1, sono stati definiti come non-filmogeni.
Il ceppo SC5314 di C.albicans è stato usato come ceppo di controllo in ogni esperimento.
9.1.3 METODI STATISTICI
Le variabili continue sono state riportate come media e deviazione standard oppure come mediana e range interquartile, a seconda della loro distribuzione. Le variabili discrete so-no state riportate come proporzioni. I confronti tra gruppi soso-no stati effettuati con il test di Student a due code per dati non accoppiati, con il test di Mann-Whitney o con il test del chi-quadrato con correzione di Yate, a seconda della distribuzione delle variabili. L’analisi della varianza è stata effettuata con il test di Fisher o con il test di Kruskal-Wallis, a seconda della distribuzione delle variabili. I confronti multipli sono stati aggiustati con il metodo di Bonferroni.
La distribuzione delle variabili è stata studiata con il test non parametrico di Kolmogorov-Smirnov. Un valore di p minore di 0.05 è stato ritenuto essere statisticamente significati-vo.
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9.2 RISULTATI
RISULTATI ANALISI POPOLAZIONE
Totale Pazienti (n=167) MWs (n= 93) Surg/ICU (n=74) p-value Età(anni) 71 ± 15 75 ± 14 67 ± 14 <0.001 Sesso maschile 88/167 (52%) 40/93 (43%) 48/74 (65%) <0.001 Provenienza: 0.1 -Domicilio 99/167 (59%) 59/93 (60%) 43/74 (58%) -Ospedale di comunità 18/167 (11%) 13/93 (14%) 5/74 (7%) -Trasferito da medicina 23/167 (14%) 14/93 (15%) 9/74 (12%) -Trasferito da chirurgia 27/167 (16%) 10/93 (15%) 17/74 (23%) Charlson score 7.20 ± 2.93 7.19 ± 2.80 7.22 ± 3.11 0.9 Concomitanti infezioni 95/162 (59%) 54/89 (61%) 41/73 (56%) 0.674
Tab 1. Caratteristiche di popolazione suddivise tra reparti medici e chirurgici/intensivi
Sono stati analizzati 167 pazienti suddivisi tra reparti medici (Medical Ward:MWs) e chi-rurgici/intensivi (Surg/ICU ) così ripartiti: 93 pazienti provenivano da MWs e 74 da Surg/ICU Questi ultimi pazienti sono stati incorporati nello stesso gruppo perché la mag-gior parte di essi sono stati trasferiti dalla chirurgia in unità intensiva e viceversa. Nel gruppo delle medicine sono stati inclusi i pazienti ricoverati sia in medicina generale sia nelle medicine specialistiche; nonostante questi due gruppi di pazienti hanno peculiarità diverse in quanto nei reparti di medicina interna generale si trovano la maggior parte dei pazienti “fragili” mentre nelle medicine specialistiche sono presenti specifiche
comorbidi-24
tà. Questa scelta è stata fatta per avere un numero consistente di pazienti e per avere una situazione simile a quella degli ospedali e della letteratura anglosassone, dove non si fa distinzione tra medicina generale e specialistica.
L'età media risulta più alta nei pazienti dei MWs con una media di 75±14 anni contro i 67±14 anni di media dei Surg/ICU , (p:<0.001)
Il sesso maschile è più rappresentativo nei pazienti provenienti dai Surg/ICU che dai MWs (65% versus 43%),(p:<0.05).
Non vi sono differenze statisticamente significative sulla gravità (Charlson score 7.19±2.8 vs 7.22±3.11).
Dall'analisi dei dati risulta che la maggior parte pazienti candidemici siano femmine e più anziane nei reparti medici. Specularmente paiono essere più giovani e maschi nei reparti chirurgici/intensivi.
La maggior parte dei pazienti entra in reparto provenendo dal proprio domicilio, con per-centuali simili (MWs: 60% e Surg/ICU: 58%). Il 14% dei pazienti in MWs proviene da un ospedale di comunità a fronte di solo il 7% dei Surg/ICU. I ricoveri per trasferimento da un reparto medico sono superiori, ma non di molto, nei MWs (15% versus 12%); mentre è nettamente maggiore la percentuale di pazienti dei Surg/ICU trasferita lì da un altro re-parto chirurgico (23% versus 11%).
Più della metà dei pazienti in entrambe le tipologie di reparto aveva una concomitante in-fezione. Le percentuali sono simili ed elevate con il 60% in MWs e il 57% in Surg/ICU.
All Patients (n = 167) MWs (n = 93) Surg/ ICU (n = 74) p- value Previous admission(s) 1[0-1] 1[0-1] 0 [0-1] 0.001
Hospital stay (days) 34[11-50] 20[8-27] 49[28-69] < 0.001
Time to Onset of Candidemia (days)
17[3-24] 10[1-12] 25[12-34] < 0.001
Tab 2. Analisi di variabili continue di popolazione
Per i successivi dati, basata su variabili continue, è stata usata la distribuzione di popola-zione su percentili:
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• la popolazione che in MWs aveva effettuato ulteriori ricoveri nei 3 mesi precedenti ricadeva nel 75 percentile, mentre lo stesso tipo di popolazione nei Surg/ICU ricade nel 25%;
• i giorni medi di degenza dei pazienti nei MWs sono 20, nei Surg/ICU 49, ovvero più del doppio, p: <0,001;
• il tempo medio di onset della candidemia, ovvero il tempo espresso in giorni dal primo di ricovero a quello della prima emocoltura positiva, è 10 giorni per i MWs e 25 per i Surg/ICU.
Hospital Wards N. admission N. episodes Rate
candidemia/ 1000 admission Rate candidemia/ 10.000 days of hospitalization All patients 100.896 211 2,09 3,44 MWs 38.876 111 2,85 4,5 Surg/ICU 60.292 100 1,65 3,92 General Medicine 15.167 78 5,14 10,2 Specialized Medicine 23.709 33 1,39 2,94 Surgery 51.859 53 1,02 2,59 ICUs 8.433 47 5,57 9,35
Tab 1bis. Incidenza di candide mia durante il periodo Gennaio 2012- Dicembre 2013
La tabella precedente, si riferisce ad un campione di popolazione più ampio, ovvero la totalità dei pazienti candidemici per il periodo di riferimento indicato. Sono 211 pazienti contro i 167 pazienti presi in esame per l’analisi statistica di questo studio. Solo di 167 pazienti infatti avevamo un database più completo e quindi più omogeneo per l’analisi stessa. Da questi dati risulta che l’incidenza di candidemia, dato espresso come casi su 1000 ricoveri, nei reparti medici (MWs) è maggiore (2,85)a quella dei Surg/ICU (1,65).
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Questo può essere spiegato dall’età generalmente più avanzata dei pazienti ricoverati in medicina generale, rispetto agli altri reparti, qui nello specifico le ICU.
Se andiamo ad analizzare l’incidenza per 10.000 giorni ricovero il tasso di candidemie risulta di 4,5 casi nei MWs e 3,92 nei Surg/ICU.
ANALISI DATI MICROBIOLOGICI
All Patients (n = 167) MWs (n = 93) Surg / ICU (n = 74) p- value Classification of Candidemia Onset <0.001 VEOC 40/167(24%) 37/93(40%) 3/74(4%) < 0.001 EOC 41/167(25%) 28/93(30%) 13/74(18%) 0.091 LOC 86/167(51%) 28/93(30%) 58/74(78%) < 0.001 Candida albicans 84/166(51%) 48/93(52%) 36/73(49%) 0.890 Overall mortality 61/167(37%) 33/93(37%) 28/74(38%) 0.879
Tab 3. Distribuzione e caratteristiche degli isolati nelle due tipologie di reparto
Le percentuali di C. Albicans isolate sono simili in entrambi i campioni: 52% in MWs e 49% in Surg/ICU. Le percentuali di tutti i ceppi isolati sono riportati nella seguente tabella e nel successivo grafico
Candida spp. All patients MWs Surg/ICU
C. albicans 84/167 (50%) 48/93 (52%) 36/74 (49%) C. non albicans C. famata 1/167 (0.6%) 1/93 (1%) 0 C. guillermondii 1/167 (0.6%) 0 1/74 (1.3%) C. kefyir 1/167 (0.6%) 0 1/74 (1.3%) C. lusitaniae 2/167 (1.2%) 2/93 (2.1%) 0 C. glabrata 13/167 (7.8%) 5/93 (5.4%) 8/74 (10.8%) C. kruzei 4/167 (2.4%) 2/93 (2.1%) 2/74 (2.7%) C. tropicalis 11/167 (6.6%) 10/93 (10.7%) 1/74 (1.3%) C. parapsilosis 48/167 (28.7%) 25/93 (26.9%) 23/74 (31.1%)
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Fig 2. Distribuzione di Candida spp. tra gli isolati.
Fig 3. Distribuzione Candida spp. nell’intera popolazione in studio.
Il tasso di mortalità grezza complessivo durante il ricovero è stato del 37% , con concor-danza tra MWs e Surg/ICU: 37% e 38% rispettivamente.
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Dall'analisi del tempo d'insorgenza della candidemia, risulta che le candidemie classifica-bili come Very Early Onset (VEOC) risultano il 40% nei MWs, contro soltanto il 4% nei Surg/ICU. Meno di un terzo dei pazienti in MWs risultava con EOC (28 pazienti, 30%) an-cora meno nei Surg/ICU dove le EOC sono il 18%. La situazione per le LOC si ribalta: nei MWs la percentuale è uguale alle EOC (30%) mentre nei Surg/ICU la percentuale sale al 78%.
Candida albicans rimane il principale isolato tra le candidemie analizzate senza distinzioni
significative tra I reparti.
I dati di onset delle candidemie suggeriscono come l'infezione disseminata da Candida spp. si sviluppi durante il ricovero nei pazienti dei Surg/ICU, dato anche il tempo di
degenza prolungato ed il tipo di chirugia effettuato (principalmente addominale). La bassa percentuale nei MWs indica invece che il paziente probabilmente entra già in ospedale con l'infezione in atto, o comunque svincolata dalla durata della degenza o dalle pratiche nosocomiali.
RISULTATI ANALISI DATI SUI DEVICE
All Patients (n = 167) MWs (n = 93) Surg / ICU (n = 74) p- value IV Device <0,001 No Device 18/167 (11%) 11/93(12%) 7/74(10%) 0.811 CVC 60/167(36%) 19/93(20%) 41/74(55%) < 0.001 PICC 89/167(53%) 63/93(68%) 26/74(35%) < 0.001 Continuous infusions 115/158(73%) 53/87(61%) 62/71(87%) < 0.001 Total parenteral nutrition (NPT) 88/165(53%) 49/92(53%) 39/73(53%) 0.892 Nasogastric tube 63/165(38%) 26/90(29%) 37/74(50%) < 0.001 Bladder catheter 136/164(83%) 76/90(84%) 60/74(81%) 0.718 Tab 5. Utilizzo di iv device e dei presidi nei reparti in esame.
Per quanto riguarda l'utilizzo di CVC e PICC si segnalano due risultati speculari: più della metà (55%) dei pazienti in Surg/ICU sviluppava candidemia ed era al contempo portatore di CVC, mentre i malati in MWs portatori di CVC erano solo il 20%; in MWs tuttavia la per-centuale dei candidemici portatori di PICC raggiunge il 68% ed in Surg/ICU rimane al 35%.
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Questo dato statistico ha una significatività importante con p value molto al di sotto dello 0,001.
Il 73% dei pazienti in generale era sottoposto ad infusioni continue ma con una differenza significativa tra i due campioni (p<0,001): nei reparti medici i pazienti infusi sono il 61% mentre negli altri reparti quasi la totalità: 87%. Per quanto riguarda la nutrizione parente-rale totale non ci sono differenze: era somministrata al 53% dei pazienti in entrambi i casi. Sottolineiamo comunque l'alta correlazione tra Infusioni continue, NPT e candidemia. Dato simile per quanto riguarda il catetere vescicale: nessuna significativa differenza tra i reparti (84 in Mws e 81% in Surg/ICU) ma alta correlazione tra presidio ed infezione. Invece i dati sul sondino naso gastrico sono significativamente differenti: ben la metà dei pazienti candidemici in Surg/ICU ne era portatore, contro il 29% di quelli in MWs.
I nostri risultati mostrano come un presidio ampiamente usato all'interno dei MWs come il PICC possa essere associato ad infezione disseminata da Candida spp. Nello specifico: i ricoverati in MWs provengono per il 74% da casa propria e da ospedali di comunità e sono per la maggior parte portatori di PICC. Essendo le candidemie in questo tipo di reparti per il 70% EOC e VEOC possiamo dedurre come la cattiva gestione domiciliare od anche il solo utilizzo di tale device intravascolare possa essere fonte di una candidemia già sviluppan-tesi domiciliarmente, prima cioè dell'arrivo in ospedale e riconducibile in ultima analisi al device stesso.
ANALISI DATI TERAPIA
All Patients (n = 167) MWs (n = 93) Surg / ICU (n = 74) p- value
Previous antifungal therapy 0,055
No treatment 113/159(71%) 66/86(77%) 47/73(64%) Azole 39/159(25%) 19/86(22%) 20/73(27%) Echinocandins 7/159(4%) 1/86(1%) 6/73(8%)
Previous antibiotic therapy 70/162(43%) 51/88(58%) 19/74(26%) < 0.001
Antibiotic therapy during H stay 46/162(28%) 30/88(34%) 16/74(22%) 0.114 Antifungal therapy < 0.001 No treatment 34/162(21%) 27/89(30%) 7/73(10%) 0.003 Azole 77/162(48%) 49/89(55%) 28/73(38%) 0.079 Echinocandins 51/162(31%) 13/89(15%) 38/73(52%) < 0.001
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In questa analisi definiamo "terapia precedente" qualsiasi tipo di terapia antifungina somministrata prima dell'emocoltura positiva, a prescindere dalla clinica e dalla sierologi-a. Risulta che la terapia preventiva non veniva effettuata in più di 3/4 (77%) dei pazienti in MWs (che poi avrebbero invece sviluppato candidemia). In Surg/ICU la percentuale è mi-nore ma sempre elevata 64%. Quando la terapia veniva eseguita era quasi sempre a base di azoli (22% e27% rispettivamente) anzichè con echinocandine.
La terapia antifungina mirata, cioè basata sulla positivizzazione dell'emocoltura, in MWs è prevalente a base di azoli (55% vs 38%; p:0.079) rispetto ad una prevalenza delle echino-candine in Surg/ICU (52% vs 15%; p:< 0,001). Da notare che in medicina il 30% dei pazienti non riceveva nessun trattamento, rispetto al 10% del gruppo Surg/ICU, questo dato non è significativo sebbene si avvicini al valore di significatività (p=0.056), ma lo stesso preoccu-pante.
Abbiamo indagato anche l’utilizzo di antibiotici precedentemente e durante il ricovero stesso. Prima del ricovero in generale il 43% die pazienti aveva effettuato terapia antibio-tica con una significativa differenza però tra i MWs e i Surg/ICU: infatti i primi erano il 58%, il doppio della percentuale die secondi (26%); p<0,001. Durante la degenza invece non c’era una differenza significativa tra i due campioni, il 34% dei MWs assumeva terapia contro il 22% dei Surg/ICU.
9.2.1 RISULTATI ANALISI FUNGICIDIA
Abbiamo determinato l’attività fungicida delle Candide isolate nel laboratorio di Malattie Infettive. Abbiamo individuato 34 ceppi isolati da pazienti con candidemia inclusi in que-sta casistica, per i quali era que-sta effettuata la fungicidia. Abbiamo pertanto calcolato la MFC90 cioè la concentrazione che era capace di uccidere il 90% dei ceppi testati e la MFC50, cioè la concentrazione capace di uccidere il 50% dei ceppi testati.
La MFC90 di tutti i ceppi testati mostra che il valore minore è quello dell’amfotericina B, le echinocandine risentono della ridotta sensibilità nei confronti di C. parapsilosis che in
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questo sottogruppo di ceppi sono molto rappresentate: 15/34. Nella MFC50 si hanno va-lori più bassi, perché si riferiscono alle altre specie, in questo caso la micafungina è la mo-lecola più efficace, seguita da anidulafungina e caspofungina. L’amfotericina B mantiene un valore stabile di 1 mg/L., infatti la sua attività anti-candida non dipende dalle specie saggiate. Se poi esaminiamo la fungicidia escluse le C. parapsilosis, si nota che i valori si riducono, sia per la MIC90 che MIC50. Anche in questo caso la micafungina è la molecola più efficace (tabella 7).
Candide MFC90 mg/L Anidulafungina MFC90 mg/L Micafungina MFC90 mg/L Caspofungina MFC90 mg/L Am-fotericina B Tutti i ceppi di Candida spp (34) > 8 8 >8 2 Ceppi di Candida spp esclusa C. pa-rapsilosis 2 0,125 >8 8 MFC50 mg/L Anidulafungina MFC50 mg/L Micafungina MFC50 mg/L Caspofungina MFC50 mg/L Am-fotericina B Tutti i ceppi di Candida spp (34) 1 0,125 4 1 Ceppi di Candida spp esclusa C. pa-rapsilosis 0,125 0,015 0,25 1
Tab 7. Analisi fungicidia per echincandine e Amfotericina B
9.2.2 RISULTATI ANALISI FILMOGENICITÀ
Sono stati analizzati globalmente 28 ceppi isolati da pazienti inclusi nella nostra casistica, tra i quali 17 (60.72%) isolati da pazienti ricoverati in Surg/ICU e 11 (39.28%) provenienti da MWs (tabella 8):
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Reparto Globale
(n=28)
Ceppi Filmogeni (n=21)
Ceppi non Filmogeni (n =7)
Area chirurgica/UTI 60,72% (17) 57.14% (12) 71.42% (5)
Area medica 39.28% (11) 42,86% (9) 18.18% (2)
Precedenti ricoveri ne-gli ultimi 3 mesi
71.43% (20) 80.95% (17) 42.86% (3)
LOC 60.72% (17) 61.90% (13) 28.57%(2)
EOC 25.00% (7) 23.8% (5) 28.57% (2)
VEOC 14.28% (4) 14.28% (3) 14.28 % (1)
Tab 8. Confronto tra ceppi filmogeni e non filmogeni
Fig 4. Reparti. Confronto tra ceppi filmogeni e non filmogeni
La fimogenicità è elevata sia in area chirurgica sia in UTI infatti tra i 17 ceppi analizzati provenienti da pazienti dell’area chirurgica/UTI, il 70,50% è risultato produttore di bio-film, mentre gli 11 ceppi provenienti dall'area medica risultano filmogeni nell’81% dei ca-si.
Inoltre i pazienti con ceppi filmogeni hanno nel 80,9% dei casi avuto precedenti ricoveri negli ultimi tre mesi contro 42,8% nei non filmogeni (Fig 5) .
Ceppi analizzati MWs Surg/ICU 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 0,75 0,8182 0,7059 0,25 0,1818 0,2941 filmogeni non filmogeni
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Fig 5. Ricoveri precedenti. Confronto tra ceppi filmogeni e non filmogeni.
Cerchio esterno: casistica globale, cerchio medio:casistica Surg/Uti, cerchio interno: casistica Mws.
Permanere in ospedale facilita l’acquisizione di ceppi filmogeni, infatti chi ha una candi-demia insorgente dopo 10 gg di ricovero ha un ceppo filmogeno nel 61,9% dei casi, contro il 14,2% dei casi precoci (Fig 6).
Fig 6. LOC, EOC, VEOC. Confronto tra ceppi filmogeni e non filmogeni
La tabella 9 mostra la distribuzione delle varie specie di Candida nei ceppi risultati produt-tori di biofilm e non produtprodut-tori di biofilm. C. albicans rappresenta il 46.43% della popola-zione globale ceppi analizzati per la produpopola-zione di biofilm, mentre C. parapsilosis il 35,7%.
C.albicans è la specie più rappresentativa dei ceppi risultati filmogeni (57.1% vs 14.3% dei
non filmogeni) a differenza di C. parapsilosis, che è la più rappresentata tra i ceppi non produttori di biofilm (57.1% vs 28.6%), seguita da C. glabrata (28.5%) (Tab 9).
34 Candida spp. Globale
(n=28)
Ceppi Filmogeni (n=21)
Ceppi non Filmogeni (n =7) C. albicans 46.43% (13) 57.14% (12) 14.28% (1) C. glabrata 0% (0) 0% (0) 28.57% (2) C. krusei 3.57% (1) 4.76% (1) 0% (0) C. parapsilosis 35.71% (10) 28.57% (6) 57.14% (4) C. tropicalis 7.14% (2) 9.52%(2) 0% (0)
Tab 9. Distribuzione Candida Spp. - Confronto tra Ceppi Filmogeni e non Filmogeni
Tra le specie C. albicans sottoposte all’analisi della produzione di biofilm il 92% è risultata filmogena, contrariamente a quanto riportato in letteratura, mentre C.parapsilosis è risultata non filmogena nel 60% dei casi. Il campione analizzato era esiguo per poter confermare la filmogenicità del 100 in C.kruzei e C. tropicalis, viceversa per C.glabrata, che è risultata non produttrice di biofilm (Fig 7).
Fig 7. Risultati filmogenicità nelle Candida spp analizzate.
0,923 0 1 0,6 1 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% 100,00% non filmogeni filmogeni
35 Device ed infusioni Globale
(n=28)
Ceppi Filmogeni (n=21)
Ceppi non Filmogeni (n =7) Nessun CVC 10.71% (3) 14.29% (3) 0% (0) CVC 57.14% (16) 42.86% (9) 100% (7) PICC 32.14% (9) 42.85% (9) 0% (0) Infusioni Continue 82.14% (23) 80.95% (17) 85.71% (6) NPT 60,71% (17) 61.90% (13) 57.14%(4) SNG 46.43% (13) 47.62% (10) 14.28% (3) CV 57.14% (16) 61.90% (13) 14.28% (3)
Tab 10. Device ed infusioni- Confronto tra Ceppi Filmogeni e non Filmogeni
Dalla precedente tabella si nota che i ceppi filmogeni sono associati a CVC, PICC, cateteri vescicali e SNG; dunque le pratiche sanitarie, specialmente se reiterate ed effettuate in contemporanea, possono esporre il paziente alla colonizzazione di ceppi virulenti come quelli produttori di biofilm. I ceppi non produttori si avvalgono solo del CVC e non degli altri device, forse perché il CVC è più corto e riescono a colonizzare solo questo e non il PICC che in genere è circa 20 cm più lungo.
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Terapia Globale
(n=28)
Ceppi Filmogeni (n=21)
Ceppi non Filmogeni (n =7) Precedente terapia antifungina 14.28% (4) 19.05% (4) 0% (0) Terapia preventiva 3.57% (1) 4.76% (1) 0% (0) Nessuna terapia empirica 28.57% (8) 28.57% (6) 57.14% (4)
Terapia empirica con azoli
50% (14) 57.14% (12) 28.57% (2)
Terapia empirica con echinocandine
14.28% (4) 14,28% (3) 14.28% (1)
Terapia empirica con AmpB
0%(0) 0% (0) 0%(0)
Nessuna Terapia
mirata 3.57% (1) 0% (0) 14.28% (1)
Terapia mirata con azoli
21.43% (6) 14.28% (3) 42.86% (3)
Terapia mirata con echinocandine
71.43% (20) 85,71% (18) 28.57% (2)
Terapia mirata con AmpB
3.57% (1) 0%(0) 14.28% (1)
Tab 11. Terapia - Confronto tra Ceppi Filmogeni e non Filmogeni
La terapia empirica con azoli predispone all’acquisizione di ceppi filmogeni, questo può essere spiegato dall’assenza dell’attività antibiofilm di questa classe di anti-fungini (tab 11).
Globalmente 42,86 %(12 su 28 analizzati) dei pazienti analizzati per la produzione di bio-film, hanno avuto come esito il decesso.
Tra i 7 pazienti dai quali sono stati isolati ceppi non produttori di biofilm abbiamo osser-vato 4 decessi, pari al 57.14% del sottogruppo esaminato. Analizzando i ceppi produttori di biofilm invece osserviamo una mortalità del 38% (8 pazienti su 21).
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Nello specifico abbiamo osservato che tra i ceppi produttori di biofilm trattati con anidu-lafungina la mortalità è risultata del 40% (5 pazienti trattati, 2 decessi, specie isolata: C.
albicans); tra i pazienti trattati con caspofungina la mortalità è risultata del 50% (4
pazien-ti trattapazien-ti, 2 decessi, specie isolata: C. parapsilosis). Tra i pazienpazien-ti con ceppi produttori di biofilm, trattati con micafungina la mortalità risulta del 10% (9 pazienti trattati, 1 decesso, specie isolata: C. albicans).
9.3 DISCUSSIONE
La casistica esaminata in questa tesi permette di affermare che probabilmente ci trovia-mo di fronte ad un’epidemia d’infezione invasiva da Candida spp, in particolare di candi-demia. Infatti si può notare come le pratiche sanitarie influenzino l’insorgenza della can-didemia in malati molto compromessi, ma anche il numero di ricoveri gioca un suo ruolo: questo è infatti direttamente proporzionale alla quantità di manovre invasive alle quali il paziente può essere soggetto. Aumenta quindi la possibilità che vengano applicati CVC, cateteri vescicali (CV), sondini naso-gastrici (SNG) ed altri device responsabili di colonizza-zione; pensiamo che il numero dei ricoveri incida anche sulla possibilità, aumentandola, di venire a contatto con ceppi virulenti epidemici, ipotesi che però al momento non è stata ancora provata per Candida spp.
Tuttavia alcune caratteristiche dei risultati riscontrati dai nostri pazienti possono far pen-sare ad un andamento epidemico. In letteratura, casi di outbreak da Candida spp nei re-parti ospedalieri sono stati seguiti e studiati per il sospetto appunto che fossero sostenuti da un unico ceppo epidemico. Boccia et al. già nel 2002 avevano dimostrato, tramite ana-lisi genotipica, l'unicità del ceppo di C.albicans che stava sostenendo infezioni sistemiche nei pazienti del reparto di Terapia Intensiva Neonatale [88]. In un altro studio, del 2008, sempre attraverso la tecnica del DNA fingerprints si scoprì che anche C.parapsilosis pote-va sostenere epidemie nosocomiali e non solo essere un'infezione endogena coadiupote-vata da cateteri ed altri device intravascolari. Un ceppo epidemico era stato infatti isolato in un UTI neurologica [89].
Pertanto non si può escludere a priori che ci siano elementi legati alla virulenza della
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possano configurare la diffusione epidemica dell’infezione. In primo luogo, l’elevata per-centuale di produzione di biofilm depone per la selezione di ceppi più virulenti. In partico-lare nella nostra casistica si rileva un’elevata percentuale di produzione di biofilm in C.
al-bicans (92%) rispetto al 60% di C. parapsilosis (Fig. 7)
Questa caratteristica è stata raramente rilevata in letteratura, anzi la produzione di bio-film viene descritta ad appannaggio di altre specie : C. parapsilosis, C. tropicalis. Infatti Pannanusorn ha rilevato la produzione di biofilm solo nel 40% di C. albicans e nell’88% di C. non-albicans e tra queste nel 100% di C. tropicalis (8 ceppi), 95% di C. glabrata (81 cep-pi) e nel 66% di C. parapsilosis (33 cepcep-pi) [21].
C. albicans è la specie più frequentemente isolata dalle candidemie e dalle candidiasi
in-vasive; la relativamente rara produzione di biofilm di questa specie, chiaro fattore di viru-lenza per Candida, non riusciva a spiegare la sua spiccata invasività e viruviru-lenza. I nostri da-ti invece potrebbero dare una spiegazione alternada-tiva alla virulenza di questa specie. Non pensiamo che questi risultati siano legati a fattori tecnici, perché la metodica è oramai abbastanza standardizzata; inoltre il tempo di incubazione molto più breve (3h), utilizzato in questo lavoro, rispetto ad altre esperienze (24h) [23] conferma più che negare i nostri risultati. E’ vero che in letteratura la maggior parte delle esperienze rileva una più rara produzione di biofilm da parte di C. albicans [90, 9192]. Pannanusorn et al nel loro studio del 2013 affermavano che gli isolati di Candida non-albicans risultavano significativamen-te più positivi per la formazione di biofilm (88.7%) a confronto degli isolati di C.albicans (40.3%) (P< 0.0001). Inoltre gli isolati di Candida non-albicans possedevano più spesso la capacità di formare una grande quantità di biofilm rispetto a C.albicans. Lo studio si con-cludeva attribuendo a C.albicans altri fattori di virulenza per giustificarne la capacità di sviluppare infezioni invasive, a fronte della scarsa capacità di produzione di biofilm [21].
Alcuni studi, invece, hanno anch’essi riscontrata un’elevata percentuale di produzione di biofilm in C. albicans, che risultava in quelle esperienze, la specie che produceva più bio-film in assoluto [22, 93 ].
Le differenze così marcate tra differenti studi potrebbero essere dovute a diversi fattori; fra tutti l’origine e la selezione dei ceppi studiati. Non si può escludere a priori che i ceppi
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studiati non facciano parte di un solo clone, magari epidemico. Ovviamente questo si po-trebbe dimostrare effettuando studi di geno- o feno-tipizzazione [94].
Inoltre problemi tecnici anche se si cerca di standardizzare la metodica al massimo po-trebbero rendere conto delle differenze; la scelta del medium di coltura, la plastica dei pozzetti dove si effettua il test, l’incubazione statica o in agitazione[95, 9697]. Lo scarso numero dei ceppi da noi testati potrebbe essere un altro fattore confondente, però biso-gna dire che gli stessi risultati si sono avuti su di una casistica di 109 candidemie da C.
al-bicans studiate ad Udine con produzione di biofilm del 91% (Prof Cardinali Microbiologia
Dipartimento di Farmacia Università di Perugia; comunicazione personale).
L’altro dato rilevante della nostra casistica è che i malati in MWs hanno come fattore di rischio la presenza del PICC (72%) nei pazienti con candidemia e che provenivano molto spesso da domicilio o da RSA. Questo aspetto è legato molto all’organizzazione degli o-spedali in Toscana. Le medicine hanno come obiettivo regionale di ridurre la durata dei ricoveri, per ottenere questo obiettivo si dimettono a domicilio o in RSA, malati molto an-ziani, fragili e con co-morbidità (Charlson elevato) con catetere venoso centrale per effet-tuare terapia infusionale. Abbiamo contattato la Prof.ssa Scocca della Terapia del Dolore dell’Ospedale di Pisa che ci ha confermato che a Pisa vengono posizionati circa il 3% dei PICC sull'intero territorio nazionale e che la maggior parte viene posizionato alla dimissio-ne del paziente e non all’ingresso; pertanto è molto probabile che sia poi gestito a domici-lio, probabilmente da personale o familiari non formati al mantenimento della sterilità del presidio.
I dati di onset delle candidemie suggeriscono come l'infezione disseminata da Candida spp. si sviluppi durante il ricovero nei pazienti dei Surg/ICU, dato anche il tempo di degen-za prolungato ed il tipo di chirugia effettuato (principalmente addominale). La bassa per-centuale nei MWs indica invece che il paziente probabilmente entra già in ospedale con l'infezione in atto, o comunque svincolata dalla durata della degenza o dalle pratiche no-socomiali.
