Scuola di Specializzazione in Patologia Clinica
Tesi di specializzazione
CONFRONTO TRA GALATTOMANNANO E (1-3)-β-D-GLUCANO PER LO
SCREENING DI ASPERGILLOSI INVASIVA
Relatore: Prof.ssa Maria Adelaide Pronzato
Correlatore: Prof. Claudio Viscoli
Candidata: Dott.ssa Elisa Furfaro
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INTRODUZIONE
L’incapacità di esprimere un’efficiente risposta immunitaria è un forte fattore predisponente all’insorgenza di micosi opportunistiche, in cui organismi fungini normali commensali dell’organismo (es. Candida), se non innocui saprofiti dell’ambiente aereo (es. Aspergillus), divengono patogeni grazie ad un adattamento parassitario che in breve può portare a gravi complicanze, talvolta con esito letale.
L’incidenza delle infezioni fungine invasive è aumentata in modo importante nelle ultime due decadi soprattutto nei pazienti immunodepressi e, nonostante la disponibilità di terapie antifungine efficaci, è associata ad una elevata mortalità che varia tra il 36% e il 63% per la candidosi invasiva [1], e tra il 30% e 70% per l’aspergillosi invasiva [2].
La diagnosi classica di queste infezioni si basa sull’identificazione dei funghi in prelievi tissutali, eventualmente supportata dalla crescita in coltura, ma nei pazienti immunodepressi le gravi condizioni cliniche spesso impediscono procedure diagnostiche invasive e molte infezioni fungine vengono così diagnosticate troppo tardi. Per sopperire a questo deficit diagnostico da molti anni si studiano e si mettono a punto nuovi test diagnostici non invasivi, possibilmente rapidi, economici ed affidabili, come ad esempio test per la ricerca di antigeni fungini.
La ricerca del galattomannano (GM) e dell’ (1-3)-β-D-glucano (BDG), hanno permesso di raggiungere un accettabile grado di certezza diagnostica per l’aspergillosi invasiva in popolazioni di pazienti immunodepressi.
Altri test, quali la ricerca dell’antigene mannano, la ricerca di anticorpi anti-mannano e il test per la ricerca di anticorpi verso il tubulo germinativo di Candida albicans (CAGTA) sono utilizzati solo in alcuni centri per la diagnosi di candidemia [3, 4].
Inoltre, recentemente è stato sviluppato un test diagnostico basato sulla tecnologia di nano-particelle che permette di individuare infezioni da Candida in campioni di sangue intero in meno di 2 ore con un’altissima sensibilità, specificità e accuratezza, ma per il momento i costi sono ancora proibitivi [5, 6].
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1.1 DEFINIZIONI DI ASPERGILLOSI
Aspergillus è un fungo filamentoso ubiquitario in grado di adattarsi a una vasta serie di condizioni ambientali; la sua nicchia ecologica è probabilmente il materiale vegetale in decomposizione. Classicamente, le forme patologiche causate da Aspergillus, definite aspergillosi, vengono suddivise in:
1) Forme invasive 2) Forme saprofitiche 3) Forme allergiche
L’incidenza delle infezioni da Aspergillus è aumentata negli ultimi anni, principalmente a causa dell’incrementato numero di pazienti immunodepressi che si incontrano nella pratica clinica con l’avvento di trapianti di organo solido o di midollo, il crescente uso di corticosteroidi e di altri farmaci immunomodulatori. Questi pazienti possono presentare varie forme di aspergillosi, dovute sia alla peculiarità della malattia, sia alla necessità di terapie di supporto che questa richiede nel lungo termine.
L’aspergillosi potrebbe quindi estrinsecarsi in diverse forme cliniche contemporaneamente o in maniera dinamica, evolvendo dalla colonizzazione a forme invasive e allergiche (Fig. 1)
Figura 1: Forme di infezione da Aspergillus in base allo stato immunitario
Immunodeficienza Immunocompetenza Iperattività immunitaria Aspergillosi broncopolmonare allergica
(ABPA) Aspergillosi
invasiva acuta
Aspergillosi cronica non invasiva (con cavitazione o
fibrosi) Aspergilloma Aspergillosi invasiva
subacuta
Sinusite allergica Asma grave con sensibilizzazione ad Aspergillus (SAFS) In cid en za Aspergillosi polmonare cronica (CPA)
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2. L’ ASPERGILLOSI INVASIVA
Si tratta della forma clinica più grave e meglio definita. Si osserva prevalentemente in pazienti con neutropenia in atto o pregressa e in soggetti sottoposti a prolungate terapie steroidee. È quindi una patologia frequente nel paziente leucemico, nel trapiantato di midollo e in pazienti con malattie linfoproliferative [7]. Inoltre, anche una rara condizione ereditaria, la malattia granulomatosa cronica, che provoca un abbassamento delle difese immunitarie, può esporre ad un moderato rischio di contrarre l’AI [8].Una volta stabilitasi, l’infezione in questi pazienti è alquanto difficile da eradicare, dipendendo dalla difficoltà della diagnosi, da un limitato numero di agenti antifungini efficaci e dalla crescente comparsa di resistenza ai farmaci antifungini [9]. In tabella 1 sono riportate le popolazioni a rischio di sviluppare AI.
Tabella 1: Popolazioni a rischio di sviluppare AI
Popolazioni a rischio Commento
Neutropenici Neutropenia grave (< 100 neutrofili/µl) e prolungata (> 10 gg)
I pazienti a più elevato rischio sono quelli che ricevono chemioterapia citotossica per leucemia acuta e anemia aplastica
Riceventi trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (Allo-HSCT)
Rischio elevato nel 1° mese dopo regime di condizionamento
1-6 mese durante la parziale immunoricostituzione permane un rischio di AI
> 6 mesi riduzione del rischio (se non vi è necessità di regimi immunosoppressori per GVHD)
Riceventi trapianto autologo di cellule staminali emopoietiche (Auto-HSCT)
Rischio inferiore di AI rispetto agli allotrapianti
Rischio più elevato nei trepiantati con cellule CD34+
Rischio maggiore nei soggetti sottoposti a più di un HSCT e quelli con precedenti trattamenti con terapie immunosoppressive per malattia refrattaria
Trapiantati di organo solido I soggetti sottoposti a trapianti si polmone sono a rischio più elevato
Il principale fattore di rischio è rappresentato dall’intensità del regime immunosoppressivo per controllare il rigetto
Pazienti sottoposti a terapie immunosoppressive per malattie autoimmunitarie
Dosi elevate di steroidi per via sistemica (> 20mg/die di prednisone per > 3 settimane); inibitori della calcineuria
AIDS Pazienti gravemente immunodepressi (< 50 linfociti CD4+/µl)
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2.1 Sito della malattia
L’AI è una malattia che si localizza principalmente nel tratto respiratorio, coinvolgendo principalmente il parenchima polmonare [10], ma può coinvolgere anche la pleura, la trachea e i bronchi [11]. Nel 10 – 25 % dei casi è possibile che avvenga disseminazione della malattia, poiché il fungo può diffondersi, attraverso il sangue, dai polmoni al cervello e ad altri organi come gli occhi, il cuore, i reni e la cute [12, 13]. Anche i seni paranasali sono un importante sito di ingresso dell’aspergillosi [14].
2.2 Eziologia della malattia
Gli aspergilli sono funghi ubiquitari a lenta crescita, assai diffusi sia in ambienti outdoor (terreno, fieno, paglia, foraggi, cereali) che indoor (ospedali, condizionatori)[15]; essi costituiscono le comuni muffe, di abituale osservazione negli ambienti umidi e scarsamente soleggiati.
Sebbene siano state identificate oltre 185 diverse specie, solo una ventina sono patogeni per l’uomo [16, 17]. La maggior parte delle aspergillosi sono causate dalle specie di A. fumigatus, seguite da A. flavus, A. niger, e A. terreus [18]. A. terreus è associata ad un’elevata mortalità. Altre specie associate all’aspergillosi invasiva, soprattutto in pazienti con malattia granulomatosa cronica, includono A. nidulans [19], cosi come A. ustus, A. lentulus e A. versicolor [20, 21]. Gli aspergilli colonizzano l’organismo prevalentemente per via inalatoria; A. flavus è la causa più comune nelle sinusiti, mentre A.niger è la specie più frequentemente associata all’otite [22]. Tuttavia in alcuni casi, per esempio in pazienti sottoposti a cateterismo venoso, la colonizzazione può avvenire anche per via gastrointestinale o cutanea [17]. In tali casi il patogeno più spesso implicato è l’Aspergillus flavus [23]. In tabella 2 sono descritte le caratteristiche delle principali specie patogene di Aspergillus.
5 Tabella 2. Caratteristiche delle principali specie patogene di Aspergillus spp.[22, 24]
Specie Distribuzione Patogenicità Presentazione clinica
A.fumigatus Ubiquitario; la sua nicchia ecologica è il materiale vegetale in decomposizione; ritrovato nelle aree rurali; comune in casa.
Specie più patogena: isolato nel 66% dei casi.
Responsabile in più del 90% dei casi di AI; spesso è causa di aspergillosi polmonare, aspergilloma, e aspergillosi allergica broncopolmonare.
A. flavus Si ritrova nel terreno e nella vegetazione in decomposizione
Isolato in circa il 14% dei casi Comunemente Isolato nelle sinusiti e nelle infezioni invasive
A.terreus Si ritrova nel terreno Isolato in circa il 5% dei casi È causa delle infezioni invasive nei pazienti immunodepressi
A.niger Si ritrova nel terreno, piante, cibi e condimenti (es. pepe)
Isolato in circa il 5% dei casi È causa di micosi superficiali (ad es. otiti); spesso è un colonizzante
A.nidulans Si trova nel materiale vegetale in decomposizione;
isolato in bassa percentuale Causa infezioni specialmente nei pazienti con CGD
A ustus Si trova nel materiale vegetale in decomposizione;
isolato in bassa percentuale È causa di infezioni disseminate; otiti, negli ustionati e nelle infezioni cutanee.
2.3 Patogenesi
L'infezione viene contratta generalmente per via respiratoria: le spore aspergillari hanno dimensioni di 2,5-3 micron e possono raggiungere gli alveoli polmonari dove, in caso di inadeguata risposta immunitaria, possono replicarsi attivamente ed invadere gli alveoli e successivamente i vasi ematici, da cui possono diffondersi ad altri organi ed apparati.
I conidi inalati attraverso le vie respiratorie trovano nei macrofagi alveolari la prima linea di difesa ma sono soprattutto i granulociti neutrofili le cellule dominanti nella risposta immunitaria difensiva nei confronti delle ife fungine. In seguito all’esposizione polmonare, nei pazienti immunodepressi, i conidi iniziano ad ingrandirsi, a germinare e a trasformarsi in ife.
Una caratteristica peculiare di Aspergillus spp. è l'elevata capacità di provocare una necrosi ed un'infiammazione tissutale, potendo quindi causare la rottura di vasi ematici anche di grosse dimensioni. Inoltre, molte specie di Aspergillus sono in grado di produrre metaboliti potenzialmente tossici, come aflatossine, ocratossine e gliotossine, che contribuirebbero ad aumentare lo stato immunosoppressivo (mediante inibizione della fagocitosi ed aumento dell'apoptosi) e a facilitare il processo invasivo. Nei soggetti immunodepressi pertanto si può
6 sviluppare un’infezione invasiva che interessa primariamente il polmone, con possibile disseminazione anche al sistema nervoso centrale nel 30% dei casi [25, 26].
Nei soggetti immunocompetenti invece, il sistema immunitario è in grado di controllare l’occasionale colonizzazione da parte di Aspergillus, grazie ai macrofagi alveolari che riconoscono componenti della parete cellulare fungina mediante recettori quali toll-like, lectina-legante il mannosio e dectin-1. In seguito al riconoscimento, vengono rilasciate le citochine che inducono il reclutamento dei neutrofili e che costituiscono la principale linea di difesa contro l’aspergillo [15, 27, 28]. È pertanto lo stato immunitario del paziente, insieme alle caratteristiche del parenchima polmonare, a condizionare lo sviluppo dello stato di malattia a livello di quest’organo [15].
7 Figura 2. Patogenesi dell’Aspergillosi: A) Inalazione dei conidi (2.5-3 μm) e loro localizzazione intra-alveolare. B) Agglutinazione dei conidi mediata da surfattanti SP-A / SP-D e conseguente fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari polmonari. C) Interazione dei conidi con fibrinogeno mediante recettore. D) Conidi producono proteasi (serina-proteasi) che rompono le tight-junctions con conseguente migrazione intra-epiteliale verso la membrana basale. E) Ancoraggio conidiale alla membrana basale mediante interazione con recettori per laminina, fibronectina e collagene. F) Conidi producono elastasi e fosfolipasi che rompono la membrana basale promuovendo la transmigrazione nel parenchima polmonare. G) Trasformazione dei conidi in ife (produzione di gliotossine a funzione antifagocitaria) con tropismo per i vasi sanguigni con angioinvasione che porta ad alterato flusso sanguigno causando necrosi ischemica.
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2.4 Epidemiologia
L’AI è una malattia che è sempre stata associata a pazienti con un ridotto numero di neutrofili, un’osservazione fatta nei primi anni ’70 [29], insieme alla scoperta che i neutrofili sono in grado di uccidere le ife di Aspergillus in vitro [30]. Quindi, l’AI è una malattia che si presenta principalmente in pazienti con deficit di neutrofili che può essere causato sia dalla chemioterapia mieloablativa utilizzata per le malattie ematologiche sia dal condizionamento che avviene nei pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali [31, 32].
L’incidenza di AI nei pazienti ematologici può variare dall’ 1.7% [33] al 30% [34]. Questa variazione di incidenza può essere influenzata da fattori intrinseci come una predisposizione genetica all’aspergillosi, ma anche dall’utilizzo di profilassi antifungina e dal modo in cui viene eseguita la diagnosi.
In una recente analisi multicentrica prospettica su 960 pazienti immunodepressi, la maggior parte delle aspergillosi (76%) è stata riscontrata in pazienti con malattie ematologiche o trapiantati di cellule staminali [35], mentre nei pazienti trapiantati di organo solido la frequenza di AI era risultata minore. In questa analisi il tasso di sopravvivenza è risultato del 64.4%. La sopravvivenza è risultata migliore nei pazienti trapiantati di organo solido, (77,9%) seguiti da pazienti sottoposti a trapianto autologo di cellule staminali [35], mentre il tasso di mortalità più alto è stato riscontrato in pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali (59,7%) seguito da pazienti ematologici e neutropenici (59.6%), e pazienti con tumore solido (60.5%).
I più importanti fattori di rischio per sviluppare AI nei pazienti trapiantati di cellule staminali includono: la malattia di base, la prolungata neutropenia, l’utilizzo e la durata di corticosteroidi o di immunosoppressori, il regime di condizionamento utilizzato per il trapianto e la presenza di graft versus host disease (GVHD)[36].
Pazienti sottoposti a trapianto allogenico hanno un’incidenza di sviluppare un’infezione fungina più elevata (tra il 5.8 e 8.1%) rispetto ai pazienti sottoposti a trapianto autologo (1.2%); in entrambi i casi, Aspergillus spp. risulta essere l’agente eziologico più comune[37].
Un altro grande studio epidemiologico ha mostrato un’incidenza cumulativa IFI dell’8.8% a un anno dal trapianto in 1858 pazienti allo-HSCT, nei quali più dell’80% delle IFI erano causate da Aspergillus spp [38].
9 Nei pazienti trapiantati di organo solido l’incidenza di sviluppare un’infezione fungina può variare dall’ 1 al 15%; questa variazione dipende dal tipo di organo trapiantato e dal grado e dalla durata dell’immunosoppressione. Infatti l’incidenza di AI varia dall’ 1 al 9% per i pazienti sottoposti a trapianto di fegato, dallo 0.7 al 4% per i pazienti trapiantati di rene, dal 4 al 23.3% per pazienti trapiantati di polmone e dall’1 al 14% per pazienti trapiantati di cuore [39]. Inoltre sono stati riportati casi di AI anche in pazienti con bronco-pneumopatia cronica ostruttiva (COPD)[40], pazienti ricoverati nei reparti di terapia intensiva [41, 42], pazienti con influenza da virus H1N1 [43] e pazienti chirurgici [44]. Casi di AI sono stati riportati anche in pazienti con HIV/AIDS, nonostante in questa popolazione vi sia un basso rischio di contrarre la malattia [45].
3. DIAGNOSI
La diagnosi di AI rimane a tutt’oggi difficile sia perché le manifestazioni cliniche non sono specifiche, sia perché i quadri radiologici possono essere suggestivi ma non sono patognomonici, sia infine perché le colture del tratto respiratorio spesso mancano di sensibilità. Inoltre la dimostrazione di ife invasive è particolarmente complessa in un paziente che per la sua malattia ematologica si presenta piastrinopenico e spesso in gravi condizioni cliniche.
Questa mancanza di strumenti diagnostici sottolinea l’importanza dello sviluppo e della valutazione di nuove metodiche diagnostiche non-colturali, come la rilevazione di antigeni fungini nel siero e in altri fluidi biologici o saggi diagnostici di biologia molecolare, che possano facilitare la diagnosi di aspergillosi, ovviando ad eventuali rischiose procedure invasive.
La diagnosi di AI viene quindi effettuata sia con mezzi diagnostici convenzionali, come esame radiologico, colturale e istologico, sia con mezzi diagnostici non-colturali, come la ricerca di antigeni fungini circolanti nel sangue.
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3.1 Le definizioni di Infezioni Fungine Invasive secondo l’ EORTC
Nel 2008, l’European Organization for Research and Treatement of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of allergy and Infectious Disease Mycoses Study Group (EORTC/MSG) ha stabilito tre differenti livelli di certezza diagnostica (infezione certa, probabile e possibile) sulla base dello stato di immunodepressione dell’ospite e di precisi criteri clinici e microbiologici (Tab. 3) [46].
Tabella 3: Criteri EORTC/MSG per la diagnosi di AI
Aspergillosi invasiva certa
Evidenza istologica e/o citologica e/o coltura del materiale sterile (escluso il sangue) positiva per Aspergillus
Aspergillosi invasiva probabile
Presenza di 1 criterio dell’ospite + 1 criterio clinico + 1 criterio microbiologico
Aspergillosi invasiva possibile
Presenza di 1 criterio dell’ospite + 1 criterio clinico
Criteri dell’ospite Storia recente di neutropenia (<0.5 x 109 neutrofili/L) per più di 10 giorni correlata temporalmente all’esordio della malattia fungina
Trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche
Uso prolungato di corticosteroidi alla dose minima equivalente di 0.3 mg/kg/die di prednisone per una durata > 3 settimane
Terapia con altri noti immunosoppressori dei linfociti T, come ciclosporina, inibitori di TNF alfa, anticorpi monoclonali specifici (come alemtuzumab) o analoghi nucleosidici durante i 90 giorni precedenti l’esordio della malattia
Immunodeficienza grave congenita (come malattia granulomatosa cronica o immunodeficienza combinata grave)
Criteri clinici di AI polmonare
Quadro clinico compatibile con infezione polmonare, in presenza di almeno una tra re seguenti lesioni alla TC:
Lesione consolidata, a margini netti con o senza il segno dell’alone
Segno della luna crescente
Cavitazione
Criteri microbiologici Esame microscopico diretto o colturale positivo per Aspergillus nel campione proveniente da un sito non sterile (bronco lavaggio, espettorato etc)
Risultato positivo della ricerca di galattomannano o (1,3)-beta-D-glucano nel siero
Risultato positivo della ricerca di galattomannano nel liquido di bronco lavaggio o liquido cefalorachidiano
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3.2 METODI DIAGNOSTICI NON-COLTURALI
Importanti progressi sono stati fatti nello sviluppo di marcatori fungini quali BDG e GM, che hanno il vantaggio di essere non-invasivi e hanno la capacita di diagnosticare le infezioni fungine invasive più rapidamente rispetto ai tradizionali approcci, e allo stesso tempo consentono di stabilire nuovi paradigmi per la prevenzione ed il precoce trattamento di IFI, soprattutto per i pazienti leucemici e pazienti trapiantati con cellule staminali ematopoietiche.
3.2.1 Il Galattomannano
Il GM è un polisaccaride presente nella parete cellulare di Aspergillus spp. La molecola è composta da unità di mannosio legate con legame 1-4 α o β-glicosidico. Ogni 4 o 5 unità di mannosio si trova una unità di galattosio legata con un legame 1-6.
Durante la fase iniziale di crescita fungina, il GM è incorporato nella parete fungina. In seguito a crescita apicale, le ife diventano più deboli e rilasciano GM [47].
Utilizzando un modello in vitro di alveoli umani, un gruppo di ricercatori è riuscito a dimostrare che i livelli di GM sono strettamente correlati alla dinamica dell’angioinvasione, supponendo che il GM non viene rilasciato in circolo fino a quando il fungo non invade il compartimento endoteliale[48].
Per la diagnosi di AI sono commercializzati due metodi basati sullo stesso anticorpo monoclonale (EB-A2), uno in agglutinazione al lattice (LA), “Pastorex Aspergillus” (BioRad, Marnes-La-Coquette, France) ed uno in ELISA, “Platelia Aspergillus” (BioRad, Marnes-La-Coquette, France), che è un’evoluzione della versione in LA, e ne ha abbassato la soglia di rilevamento del GM da 15 ng/ml ad 1 ng/ml.
Nei primi anni ’90, in cui era disponibile solo il test in LA, il “Pastorex Aspergillus“ ha trovato subito una larga diffusione e si è dimostrato molto specifico (90-100%) ma con una sensibilità alquanto variabile e tendenzialmente bassa (36-95%)[49, 50].
Dal 1997 è stato commercializzato il test ELISA “Platelia Aspergillus“, che fin dai primi studi di confronto con il metodo in LA si è dimostrato, come prevedibile, più sensibile del suo predecessore [51, 52]. Attualmente il metodo ELISA è quello più utilizzato per la ricerca del GM e
12 dopo molti anni di impiego pressoché esclusivo in Europa ed Asia, nel 2003 il test è stato approvato dalla Food and Drug Administration statunitense ed introdotto anche negli U.S.A. La ricerca del GM è impiegata principalmente nei pazienti emato-oncologici [53, 54], per i quali ne è stata studiata l’applicazione come criterio diagnostico e fattore decisionale per guidare l’approccio terapeutico (unitamente a valutazioni cliniche e strumentali) [55, 56]. Generalmente se ne raccomanda un uso seriato e continuativo, con una frequenza di raccolta di 2/3 campioni la settimana, per aumentare la probabilità di rilevare il GM circolante [49, 57].
Il test
Il test utilizza anticorpi monoclonali di ratto EBA-2 diretti contro l’antigene galattomannano di Aspergillus. Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati per rivestire i pozzetti della micropiastra, per legare l’antigene e per rilevare l’antigene legato alla micropiastra sensibilizzata (anticorpi monoclonali anti-GM legati con perossidasi). I campioni di siero sono trattati al calore in presenza di EDTA allo scopo di dissociare il complesso immune e precipitare le proteine del siero che potrebbero interferire con il test. In presenza dell’antigene galattomannano si forma un complesso anticorpo monoclonale – galattomannano – anticorpo monoclonale/perossidasi. In presenza di tale complesso legato al pozzetto, l’aggiunta della soluzione substrato determina la comparsa della caratteristica colorazione blu determinata dalla reazione del substrato con la perossidasi. La reazione enzimatica è arrestata dall’aggiunta di acido, che fa virare il colore da blu a giallo. Il risultato fornito dal test è un indice numerico, il GM Index (GMI) che è il rapporto tra la densità ottica a 450/620 nm del campione testato e quella del controllo cut-off fornito nel test che ha concentrazione 1 ng/ml di GM.
Oltre che sul siero la ricerca del GM è stato anche usata su lavaggio broncoalveolare, con risultati interessanti [58-60], sulle urine con performance meno promettenti [59, 61] e su liquor, grazie al quale il test sembra è risultato essere specifico per l’aspergillosi cerebrale [62, 63].
13 Figura 3: Rappresentazione schematica del test Platelia Aspergillus: Step 1: i pozzetti della piastra sono rivestiti da anticorpo monoclonale EB-A2. Step 2: campioni di siero o BAL sono aggiunti nei pozzetti. Step 3: Aggiunta dell’anticorpo monoclonale legato alla perossidasi. In presenza dell’antigene galattomannano si forma un complesso anticorpo monoclonale – galattomannano – anticorpo monoclonale/perossidasi. Step 4:aggiunta della soluzione substrato che determina la comparsa della caratteristica colorazione blu. Lo spettrofotometro viene utilizzato per calcolare l’indice di densità ottica dei campioni.
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Fattori critici nella ricerca del galattomannano
Fattori biologici ed epidemiologici
Ad influenzare i risultati dell’ELISA per GM concorrono molti fattori, fondamentalmente raggruppabili in due categorie: biologici ed epidemiologici [57]. Tra i primi ci sono il sito di infezione, la specie di Aspergillus coinvolta, la profilassi e/o terapia antifungina, le condizioni di base ed il grado di immunosoppressione, la funzionalità epatica e renale, la presenza in circolo di anticorpi anti-Aspergillus, le modalità di raccolta e conservazione dei campioni di siero da testare, le procedure seguite nel test.
I principali fattori epidemiologici sono invece la popolazione di pazienti, le strategie di raccolta dei campioni da analizzare, le definizioni di “paziente con infezione” e di “risultato positivo”, la prevalenza dell’infezione, i cut-off utilizzati per la positività del campione, e l’esperienza del laboratorio che effettua il test.
Falsi positivi
Possibili cause per falsi positivi sono da ricercarsi in reazioni aspecifiche dell’anticorpo monoclonale Eb-a2 con altri microorganismi, farmaci, ed altri fattori.
Per esempio sono state descritte false positività dovute all’ interazioni del test con alcune specie fungine non appartenenti al genere Aspergillus, come ad esempio Penicillium marneffei [64], Fusarium solani, F. verticillioides, F. proliferatum, e F. oxysporum [65-67], Alternaria [68], Blastoschizomyces capitatus (conosciuto come Geotrichum capitatum) [69], e funghi dimorfi come Histoplasma capsulatum e Blastomyces [70-72].
Nel caso della Fusariosi, il GM può risultare positivo prima della diagnosi culturale e istologica, permettendo così una diagnosi precoce e una tempestiva terapia antifungina [65, 66].
Alcuni autori hanno riportato una cross interazione del test anche in un paziente leucemico con batteriemia da Listeria monocytogenes in assenza di aspergillosi [73].
Dal 2003 ad oggi sono stati riportate false positività al test in pazienti trattati con piperacillina/tazobactam [74, 75]. Adesso la situazione è cambiata, poiché il farmaco di marca (Tazocin™) e alcune formulazioni disponibili in commercio non sono più responsabili di questa
15 interazione [76-78] per probabili modifiche che sono state effettuate nella preparazione del farmaco; tuttavia il problema persiste ancora per alcune formulazioni generiche [79].
Recenti indagini hanno descritto quantità di GM variabile nelle diverse specie di Aspergillus, ma non è ancora chiaro se questo abbia un impatto clinico [70, 80, 81]. Ad esempio, in pazienti ematologici, il GM ha mostrato una sensibilità maggiore per le infezioni dovute alle specie Aspergillus non-fumigatus rispetto alle infezioni dovute ad Aspergillus fumigatus (49% versus 13%; p<0.0001)[80].
Infine, risultati falsi positivi sono dovuti a fluidi contenenti prodotti del sangue, cibi contenenti GM o altre sostanze che interagiscono con l’anticorpo del test, in particolare nei neonati prematuri o in pazienti con graft-versus-host-disease (GVHD) [82-84].
Falsi negativi
Il fallimento del test nel rilevare GM in un paziente affetto da AI può essere dovuto ad un carico fungino limitato, ad uno scarso rilascio di GM da parte delle ife fungine in accrescimento (principalmente a causa della mancanza di micronutrienti e di uno squilibrio chimico-fisico nel sito di infezione, spesso area necrotica), al legame del GM a sostanze presenti nel sangue, alla limitata capacità delle ife di Aspergillus di invadere il circolo ematico (anche a seconda della specie di Aspergillus coinvolta), alla profilassi o trattamenti preemptive con farmaci antifungini, come ad esempio pazienti che ricevono posaconazolo o voriconazolo [85, 86], e a diversi pattern antigenici (alcuni non rilevabili dal test “Platelia Aspergillus”®) espressi dalle specie di Aspergillus [57].
3.2.2 PERFORMANCE DIAGNOSTICA DEL GM NEL SIERO PER L’ASPERGILLOSI
INVASIVA
Il GM è un importante strumento diagnostico che nel 2002 è stato incluso nei criteri dell’EORTC/MSG come criterio microbiologico per la diagnosi di AI probabile in pazienti immunodepressi. Nei pazienti neutropenici che hanno un’alta probabilità a-priori (> 5-10%) di sviluppare AI è raccomandato il monitoraggio dei livelli di GM nel siero ogni 3-4 giorni. Un esempio di quanto sia importante il monitoraggio di GM in questi pazienti è dimostrato dal fatto che il GM nel siero possa essere un marcatore precoce rispetto alla comparsa di segni clinici, segni radiologici e alla diagnosi colturale [87-89].
16 La maggior parte degli studi, inoltre, indicano come l’andamento dei livelli di GM nel siero in pazienti sottoposti a terapia antifungina sia predittivo della prognosi, e come la persistenza del GM, nonostante la terapia, sia un segno prognostico negativo tale da imporre una rivalutazione clinica [85].
La performance del GM nel siero è stata ampiamente studiata, soprattutto in popolazioni di pazienti ad alto rischio di sviluppare AI. Complessivamente, la performance del GM è risultata migliore in pazienti neutropenici utilizzando due campioni di siero consecutivi con un cut off di positività >= 0.5, e la sensibilità e specificità sono risultate rispettivamente del 95 e 98% [90]. La performance del GM nel siero è stata analizzata in 2 meta-analisi [91]. La performance del test è risultata migliore in pazienti neutropenici, come ad esempio pazienti ematologici (sensibilità 58% [intervallo di confidenza 95% CI: 52–64%]; specificità 95% [95% CI: 94–96%]), e pazienti trapiantati con cellule staminali emopoietiche (sensibilità 65% [95% CI: 60–78%]; specificità 65% [95% CI: 44– 83%]), rispetto a pazienti trapiantati di organo solido (sensibilità 41% [95% CI: 21–64%]; specificità 85% [95% CI: 80–89%](92). La specificità è però risultata minore in pazienti HSCT e in pazienti pediatrici, (rispettivamente 65 and 60%), suggerendo una maggior frequenza di risultati falsi positivi in queste popolazioni [91].
3.3.1 L’ (1-3)-ß-D-GLUCANO (BDG)
(1-3)-ß-D-glucano è un componente polisaccaridico specifico della parete fungina, si trova in tutti i funghi patogeni e saprofiti eccetto che in quelli appartenenti agli zigomiceti (Mucor e Rhizopus) e si trova solo in minor misura nella parete dei criptococchi [92]. I virus e i procarioti sono privi di BDG. Gli animali, così come gli uomini, non sintetizzano ß-glucano, nonostante una piccola quantità di BDG di origine esogena sia presente nel sangue umano.
Recenti dati della letteratura indicano come il BDG sia rilasciato dalla parete fungina nella circolazione sistemica di pazienti con IFI provata o probabile. La sua presenza nel sangue può essere un marker sierologico di fungemia, aspergillosi, candidosi, fusariosi, trichosporonosi o infezioni causate da Pneumocystis jirovecii, Acremonium spp. o Saccharomyces spp [92-95].
17 Un fossile vivente come donatore di sangue
Il Limulus appartiene alla classe degli Xiphosura, detti granchi a ferro di cavallo che esistevano già nell’Era Paleozoica. Ai nostri giorni ne esistono quattro specie: uno sulla costa orientale del Nord America (Limulus polyphemus) e altre tre sulla costa orientale dell’Asia (Tachypleus gigas, Tachypleus tridentatus, Carcinoscorpius rotondicauda). Il sangue, che è formato da un solo tipo di cellula amebocita, viene estratto mediante una puntura intracardica da tutte le specie di Limulus ed in particolare dal Limulus polyphemus, ed è di colore blu perché contiene enocianina (Cu++Cu+). Dalla lisi degli amebociti può essere isolato un sistema molto semplice di coagulazione (LAL = Limulus Amebocita Lisato). Questo reagisce specificatamente con endotossine e glucani che costituiscono parti importanti della parete cellulare dei funghi (lieviti e muffe).
Figura 4. Limulus polyphemus
Dopo aver donato il sangue, questi animali vengono rimessi in mare. Questa reazione di coagulazione è stata descritta per la prima volta nel 1956 da Frederik Bang il quale, con Jack Levin, ha poi sviluppato il LAL test, che dal 1972 viene utilizzato per evidenziare endotossine (pirogeni) nei farmaci e nei presidi medico-chirurgici.
Successivamente, Morita e colleghi, studiando il lisato amebocitario di Tachypleus tridentatus (granchio a ferro di cavallo giapponese), dimostrarono che il BDG attiva la cascata coagulativa del test Limulus, mediante la separazione di un pro-enzima, che venne chiamato fattore G [96]. Obayashi e colleghi svilupparono poi un test cromogenico basato sulla ricombinazione di diverse
18 frazioni di lisato amebocitario e proposero l’utilizzo di frazioni ricombinate contenenti il fattore G come metodica per la ricerca non invasiva di infezioni fungine [97]. Obayashi e colleghi, utilizzando questo test, pubblicarono il primo studio multicentrico nel 1995 [97].
Un test simile fu sviluppato in America utilizzando la frazione di lisato amebocitario del Limulus polyphemus (il granchio americano) e fu approvato nel 2004 dal Food and Drug Administration (FDA) come supporto nella diagnostica di infezioni fungine. Attualmente sono disponibili 4 diversi Kit commerciali per la ricerca dell’(1,3)-ß-D-Glucano (Tabella 4).
Tabella 4. Comparazione dei 4 kits in commercio per il test (1,3)-ß-D-Glucano. Variabili Fungitec G- test
MK ß -Glucan test Wako B-G Star Fungitell Produttore Seikagaku Corporation
Wako Pure Chemical Maruha Corporation Assoc. of Cape Cod
Paese Giappone Giappone Giappone USA
Anno di approvaz 1995 1996 2001 2004
Metodo Cinetico Cromogenico Cinetico Turbidimetrico “Endpoint” Cromogenico
Cinetico Cromogenico
Campioni Siero o Plasma Siero o Plasma Siero o Plasma Siero
Pre-trattamento Alcalino Diluizione e temperatura Diluizione e temperatura Alcalino
Standard -ß Glucano
Pachyman Carboxymethyil- curdlan Lentinan Pachyman
Origine del Lisato Tachypleus tridentatus Limulus Polyphemus Tachypleus tridentatus Limulus Polyphemus Cut-off, pg/ml 20 11 11 60 o 80
Range della curva, pg/ml
3.9 – 500 6 – 600 1.2 – 120 31.25 – 500
Tempo di lettura, min
30 90 30 40
I 4 test forniscono valori incommutabili, a causa di diversi standard utilizzati e differenti specie di granchio utilizzati come risorsa di reagenti, i quali hanno una diversa reattività nei confronti del 1,3-ß--D-Glucano. Ogni test ha, quindi, un diverso valore di cut-off.
19
Il test
L’(1,3)-ß-D-Glucano (BDG), costituente della parete fungina, è normalmente prodotto e rilasciato dalle ife fungine nel torrente circolatorio e sottoposto a clearance da parte di cellule mononucleate, granulociti e linfociti. In seguito alla sua captazione da parte di specifici recettori di membrana (CR3, lactosil-ceramide, scavenger, Dectin-1) [98], il BDG viene internalizzato nel citoplasma dove sembra stimolare le proprietà fagocitarie aspecifiche della cellula. La concentrazione plasmatica di BDG è dunque inversamente proporzionale al numero di tali cellule presenti nell’ospite. Il BDG stimola, insieme ad alcune endotossine (Endotossina B), particolari zimogeni presenti nel Limulus. Uno dei test attualmente in commercio, il Fungitell (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA) è un saggio colorimetrico basato sulla cascata coagulativa del Limulus (LAL), resa selettiva per l’attività del BDG inibendo la via dell’endotossina B (che prevede l’attivazione del fattore C) mediante rimozione del substrato con alcali. Il BG attiva il fattore G (serina proteasi zimogeno) che a sua volta scinde la porzione p-nitroanilina del substrato peptidico sintetico (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA), liberando il cromoforo che assorbe a 450 nm (sviluppo di colore giallo). La densità ottica viene rilevata in lettore ottico termostatato ad intervalli di 15-30 secondi per 40 minuti a 37°C.
La sensibilità del metodo è 1 pg/ml.
Il test BDG viene eseguito in base al protocollo fornito dal produttore. Cinque µl di campione vengono pretrattati con 20 µl di un reagente alcalino (0.25 M KOH, 1.2 M KCL), e incubati per 10 minuti a 37° C. Successivamente, ad ogni pozzetto della piastra contenente il campione, vengono aggiunti 100 µl del reagente Fungitell (LAL liofilizzato); il reagente Fungitell, fornito dal kit, viene ricostituito aggiungendo 2.8 ml di acqua sterile e 2.8 ml di tampone di ricostituzione Pyrosol. La densità ottica viene rilevata in lettore ottico termostatato (BioTek Instruments, Inc) ad intervalli di 15-30 secondi per 40 minuti a 37°C.
La concentrazione di BDG in ogni campione viene calcolata automaticamente utilizzando una curva di calibrazione di una soluzione standard fornita dal kit, che ha un range di concentrazione che va da 31.25 pg/ml a 500 pg/ml. I campioni con livelli di BDG > 80 pg/ml vengono considerati positivi.
20 Figura 5. Rappresentazione schematica del test per la ricerca di (1-3)beta-D-glucano (BDG). (A) Il Limulus polyphemus è la risorsa del lisato amebocitario. (B) il sangue, che è formato da un solo tipo di cellula amebocita, viene estratto mediante una puntura intracardica dal Limulus polyphemus, ed è di colore blu perché contiene enocianina. Dopo aver donato il sangue, questi animali vengono rimessi in mare. Dalla lisi degli amebociti può essere isolato un sistema molto semplice di coagulazione (LAL = Limulus Amebocita Lisato). (C) il lisato viene purificato e liofilizzato e venduto per il poter eseguire il test per la ricerca di (1-3)beta-D-glucano. (D) Cascata coagulativa dell’amebocita del Limulus modificata. (E) il test per la ricerca di BDG viene eseguito su micropiastra.
21
I falsi positivi
Vi sono diverse circostanze cliniche in cui viene ritrovato BDG nel sangue di pazienti che non hanno alcuna evidenza di infezione fungina.
In particolare, risultati falsi positivi per la ricerca di BDG è stata associata alla somministrazione di immunoglobuline endovena [99], all’ emodialisi [100], all’utilizzo di garze chirurgiche contenenti cellulosa [101], a mucosite severa [102], a infezioni batterica da Enterococcus faecalis [103], infezioni da Nocardia spp [104], e interventi di chirurgia [105]. Recentemente sono stati descritte interazioni di batteriemie sulla performance del BDG [106-109], sebbene i nostri dati non confermino questa associazione come clinicamente rilevante [106]. Per ultimo, sono stati riscontrati elevati livelli di BDG in pazienti con leucemia acuta linfoblastica trattati con pegylated asparaginase [110].
Questa enorme quantità di risultati falsi positivi al test sottolinea la necessità di valutare i risultati del BDG in un contesto clinico, specialmente quando i livelli sono bassi (compresi tra 80 e 160 pg/ml) [111].
3.3.2 STUDI DI VALIDAZIONE E DI PERFORMANCE DIAGNOSTICA DEL BDG PER
L’ASPERGILLLOSI INVASIVA
Diversi studi hanno analizzato in questi ultimi anni la performance del BDG per la diagnosi di AI. La performance di BDG per la diagnosi di IC e IA è stata valutata in 3 meta-analisi pubblicate tra il 2011 e 2012 [112-114]. I risultati in termini di sensibilità e specificità sono molto simili: 77 e 85%[112], 76 e 85% [113], 80 e 82% [114]. Questi studi mostrano una buona accuratezza diagnostica del BDG sia per la diagnosi di AI che di candidemia.
Successivamente, un’altra meta-analisi pubblicata nel 2012, ha analizzato diversi studi che utilizzavano il BDG per la diagnosi di IFI in un gruppo di pazienti ematologici [115]. Lo studio ha mostrato una migliore performance diagnostica del BDG in seguito a due risultati positivi consecutivi, ottenendo una sensibilità di circa il 50,0% e una specificità del 98,9% [115].
In uno studio recente condotto in Francia da Sulahian, sono stati analizzati 312 pazienti: 105 casi di AI provata/probabile, 97 pazienti ematologici ad alto rischio per sviluppare IFI, 50 volontari sani e 60 pazienti con sepsi [116]. Il BDG ha mostrato in questo studio una sensibilità e specificità
22 rispettivamente del 78 e 83%, mentre il GM ha dimostrato di essere più specifico (97%). In particolare, in 69 pazienti in cui è stata diagnosticata l’AI attraverso esame microscopico e/o esame colturale, il BDG ha dimostrato una elevata sensibilità rispetto al GM (81% vs 49%). Infatti, il 46% di questi pazienti erano positivi sia per GM che per BDG, il 35% erano positivi per BDG e GM negativi, e il 16% è risultato negativo ad entrambi i test [116].
In un altro studio pubblicato da Metan, sono stati analizzati 84 pazienti riceventi trapianto autologo di cellule staminali che venivano testati 2 volte/settimana sia per GM che per BDG durante la fase di neutropenia [117]. In 3 pazienti in cui è stata diagnosticata un’infezione probabile da AI sulla base di lesioni polmonari e del risultato positivo per GM, solo 1 paziente su 3 è risultato positivo anche per BDG. Altri 13 pazienti senza infezioni fungina avevano almeno un campione positivo per BDG, e quindi sono stati considerati falsi positivi. Tutti gli altri pazienti senza infezione fungina sono risultati negativi sia per GM che per BDG. Quindi, la sensibilità, specificità, PPV e NPV del test è risultata rispettivamente del 27%, 94%, 6% e 94% [117]. Nonostante l’elevato valore predittivo negativo (> 90%), in una popolazione in cui vi è una bassa incidenza di AI (3.5%), la scarsa sensibilità (solo 1/3 casi è risultato positivo per BDG) non permette di escludere la diagnosi di AI in pazienti con risultato negativo per BDG. Inoltre, 3 su 5 pazienti in cui è stata diagnosticata un’infezione possibile da AI sono risultati positivi per BDG, ma la mancanza di dati clinici e di ulteriori procedure diagnostiche, non hanno permesso di concludere se avevano o no aspergillosi [117].
In un altro studio recente, i campioni di siero di 63 pazienti che sono stati testati per GM al primo sospetto clinico di AI, sono stati testati retrospettivamente per BDG [118]. In 27 pazienti con AI e 21 pazienti senza AI, i risultati del GM e del BGD sono risultati concordanti (entrambi positivi o entrambi negativi, rispettivamente). I rimanenti 15 pazienti, tutti in terapia con piperacillina/tazobactam (una ben nota causa di falsa positività [74, 75]), sono risultati positivi per GM, ma negativi per BDG. In base a questi risultati, quindi, secondo gli autori il BDG potrebbe essere utile nell’identificare risultati falsi positivi per GM [118].
Infine, uno studio prospettico condotto nel Regno Unito, ha risaltato l’importanza di un approccio multi-diagnostico, utilizzando GM, BDG, TAC e biopsia [119]. E’ stato valutato il ruolo di ogni singolo marcatore in 202 pazienti neutropenici. In questa popolazione, l’incidenza di IFI provata/probabile è risultata del 21%, e l’utilizzo di un singolo test diagnostico è risultato il seguente, 10.5% per il GM, 16.3% per BDG e 19.6% per GM e BDG insieme. Il confronto tra GM e
23 BDG per la diagnosi di AI non è stato riportato dagli autori, ma la sensibilità del GM e del BDG è risultata rispettivamente del 71% e 84% [119].
Concludendo, il rilascio del GM e del BDG nel sangue nei pazienti con AI, probabilmente non avviene nello stesso momento durante il corso dell’infezione, e questo potrebbe suggerire che l’utilizzo di entrambi i marcatori, GM e BDG, potrebbe portare ad un aumento della sensibilità [119].
24
4. LO STUDIO
OBIETTIVO DELLO STUDIO
L’obiettivo dello studio è valutare e confrontare la performance diagnostica di BDG e del GM per lo screening di AI in pazienti ematologici.
4.1 MATERIALI E METODI
Nello studio sono stati inclusi tutti i pazienti ematologici ricoverati dal 2011 al 2013 presso il reparto di Ematologia dell’Ospedale IRCCS San Martino – IST. I campioni dei pazienti sono stati testati 2 volte alla settimana per GM e BDG, e i risultati sono stati retrospettivamente analizzati per la diagnosi di IFI secondo i criteri dell’EORTC/MSG del 2008.
La data della diagnosi di AI è stata stabilita come la data o del primo GM positivo o di lesioni suggestive alla TAC seguite dalla documentazione microbiologica o il giorno della coltura positiva per Aspergillus.
Gestione clinica dei pazienti
I pazienti sono stati sottoposti a profilassi con fluconazolo (400 mg/giorno) per tutta la durata della neutropenia. L’iter diagnostico di pazienti neutropenici febbrili include emocolture, valutazione clinica, urinocolture e radiografie del torace. La terapia antibiotica empirica, che solitamente include piperacillina/tazobactam o meropenem, in associazione o non convancomicina, è stata iniziata seguendo le linee guida internazionali.
La TAC è stata effettuata solo in pazienti che presentavano febbre persistente per più di 72 ore dall’inizio della terapia empirica, o in presenza di segni e sintomi respiratori.
In pazienti che si presentavano in condizioni cliniche critiche, e quindi impossibilitati ad essere trasferiti all’unità operativa di radiologia, veniva eseguita la radiografia al torace invece della TAC. Le procedure diagnostiche in caso di segni e sintomi polmonari o in caso di polmonite documentata radiologicamente, includono: emocolture, ricerca di antigeni urinari per Legionella e Pneumococcus, PCR per virus respiratori e batteri (influenza, parainfluenza, adenovirus,
25 metapneumovirus, coronavirus, rhinovirus, bocavirus, enterovirus, RSVA, RSVB, chlamydia, haemophilus, mycoplasma, ebordetella).
In caso espettorato, sono state richieste: colture per batteri, funghi e micobatteri. Il lavaggio bronco alveolare (BAL) mediante broncoscopia è stato richiesto in pazienti che presentavano nuove lesioni polmonari e che risultavano negativi ai test microbiologici, se non controindicato dalle condizioni cliniche dei pazienti.
Definizioni
La diagnosi di infezione Fungina Invasiva (IFI) provata, probabile e possibile si basa criteri clinici, microbiologici, radiologici e istopatologici secondo le definizioni dell’EORTC/MSG [33]. Pazienti con criteri dell’ospite, criteri microbiologici, infiltrati polmonari e nessun’ altra diagnosi microbiologica alternativa di polmonite, sono stati considerati come casi di Aspergillosi probabile. Mentre, pazienti con criteri dell’ospite e criteri microbiologici, ma senza criteri clinici secondo le definizioni del 2008 dell’EORTC/MSG a causa della mancanza della TAC, rimangono inclassificati.
Raccolta e conservazione dei campioni
Il prelievo di sangue è stato effettuato 2 volte alla settimana per tutta la durata della neutropenia. I campioni di sangue sono stati raccolti in provette da siero “Vacutainer“ sterili; il siero è stato centrifugato a 3000g per 10 minuti, aliquotato e conservato a -20°C fino al momento dell’esecuzione del test. Tutti i campioni sono stati testati sia per GM che per BG.
Ricerca di Antigeni fungini:
Il Galattomannano
La ricerca di GM viene effettuata mediante il test Platelia Aspergillus (BioRad, Marnes-La-Coquette, France) secondo le procedure indicate dal produttore.
26 300 μl di siero vengono trattati al calore con una soluzione al 4% di EDTA allo scopo di dissociare i complessi immuni che possono essere presenti e precipitare le proteine del siero che potrebbero interferire con il test. Ad ogni pozzetto della piastra rivestito con anticorpo monoclonale, vengono aggiunti 50 μl di siero pretrattato e 50 μl di coniugato (anticorpo monoclonale legato alla perossidasi); la piastra viene incubata a 37°C per 90 minuti. In presenza dell’antigene galattomannano, si forma un complesso anticorpo monoclonale – galattomannano – anticorpo monoclonale/perossidasi.
La piastra viene quindi lavata con una soluzione di lavaggio per eliminare eventuale materiale non legato. Successivamente, vengono aggiunti 200 μl di soluzione substrato, che reagisce con i complessi eventualmente legati al pozzetto per formare una reazione di colore blu. La piastra viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. La reazione enzimatica viene arrestata con l’aggiunta di 100 μl di acido solforico che fa virare il colore della reazione da blu a giallo. La densità ottica dei campioni è determinata con uno spettrofotometro impostato ad una lunghezza d’onda di 450/620 nm.
In ogni piastra vengono inclusi controlli positivi e negativi che vengono forniti dal produttore del kit.
Il risultato dei campioni è calcolato mediante un indice numerico (GMI = densità ottica del campione/densità ottica del controllo contenente 1 μg di GM).
I campioni con indice GMI ≥ 0.5 sono considerati positivi.
L’ (1-3)-β-D-Glucano
Il BDG è stato misurato utilizzando il kit Fungitell (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA) come raccomandato dal produttore.
Cinque µl di campione sono stati pretrattati con 20 µl di un reagente alcalino (0.25 M KOH, 1.2 M KCL), e incubati per 10 minuti a 37° C. Successivamente, ad ogni pozzetto della piastra contenente il campione, vengono aggiunti 100 µl del reagente Fungitell (LAL liofilizzato); il reagente Fungitell, fornito dal kit, viene ricostituito aggiungendo 2.8 ml di acqua sterile e 2.8 ml di tampone di ricostituzione Pyrosol. La densità ottica viene rilevata in lettore ottico termostatato (BioTek Instruments, Inc) ad intervalli di 15-30 secondi per 40 minuti a 37°C.
27 La concentrazione di BDG in ogni campione viene calcolata automaticamente utilizzando una curva di calibrazione di una soluzione standard fornita dal kit, che ha un range di concentrazione che va da 31.25 pg/ml a 500 pg/ml. Tutti in campioni vengono testati in duplicato. I campioni con livelli di BG > 80 pg/ml vengono considerati positivi.
4.2 ANALISI STATISTICA
Pazienti con infezioni fungine diverse dall’AI sono state escluse in questa analisi, visto che lo scopo dello studio è quello di stabilire il valore aggiuntivo del BGD nei confronti del GM.
I pazienti analizzati sono stati cosi divisi in 2 gruppi: pazienti con AI provata/probabile e pazienti senza IFI.
Per valutare al meglio l’utilità dello screening dei campioni con questi antigeni fungini, sono state effettuate 2 distinte analisi: per paziente e per campione.
Analisi per paziente
È stata analizzata la performance del GM e del BDG nei pazienti con AI vs pazienti senza AI, calcolando la sensibilità, la specificità, il valore predittivo positivo (PPV) e il valore predittivo negativo (NPV). La sensibilità e la specificità sono state calcolate sia per un singolo risultato positivo che per due risultati positivi consecutivi. È stata inoltre analizzata la positività del BDG nei confronti del GM per vedere se il BDG precede la prima positività del GM.
Analisi per campione
È stata calcolata la specificità per singolo campione utilizzando un disegno di caso-controllo con corrispondenza multipla casuale per valutare una possibile variabilità intra-individuale (gruppi di risultati falsi positivi nello stesso paziente). È stato applicato un rapporto caso-controllo di 1-8. I risultati sono stati calcolati per valutare la performance mediana, migliore e peggiore.
In aggiunta, sono state confrontate le curve di sopravvivenza con l’utilizzo di log-rank non parametric test.
28
5. RISULTATI
Durante il periodo di studio, sono stati testati un totale di 1583 campioni di siero provenienti da 171 pazienti (70 donne e 101 uomini). La maggior parte dei pazienti era affetto da leucemia acuta mieloide, l’età mediana dei pazienti era di 52 anni (range 24-70 anni). Le caratteristiche dei pazienti sono descritte nella tabella 5.
Sono stati testati una media di 7 campioni per paziente (range 1 -55), mentre 28 pazienti avevano solo 1 prelievo disponibile. Sono stati quindi analizzati 183 episodi di chemioterapia, associati nella maggior parte dei casi a neutropenia. La durata mediana di screening del GM e BDG è risultata di 14 giorni (range; 4 - 133 giorni).
L’incidenza di IFI provata/probabile è risultata del 14% (24/171 pazienti): il 12.3% erano AI provata/probabile (21/171) e il 2.3 % erano candidemie (4/171).
Quattro pazienti sono stati esclusi dall’analisi: 3 erano affetti da candidemia (da notare che uno di loro aveva un risultato positivo per BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di candidemia), mentre 1 paziente era affetto sia da aspergillosi disseminata che da candidemia, con elevati livelli sia di GM che di BDG.
Quindi, nell’analisi finale sono stati inclusi 1549 campioni di siero provenienti da 167 pazienti, di cui 20 casi e 147 controlli. Solo in 19 casi e 120 controlli erano disponibili almeno due campioni consecutivi.
Inoltre, in 31 pazienti erano state eseguiti esami colturali: in 21 pazienti il materiale proveniva da espettorato, in 4 da BAL e in 6 da tampone nasale. Di questi, solo una coltura su espettorato è risultata positiva per Aspergillus spp. Sono stati inoltre eseguiti altri 40 tamponi nasali e 3 tamponi faringei; tutti questi tamponi sono risultati negativi per funghi.
29
Tabella 5: caratteristiche demografiche dei pazienti
Characteristic Findings
N° of patients 171
Sex male/female 101/70
Age, years (median) 52 years
Underlying disease
Acute myelogenousleukemia Acute lymphoblastic leukemia Non-Hodgkin lymphoma Myelodysplastic syndrome Multiple myeloma
Hodgkin disease Severe aplastic anemia
Chronic myeloprolipherative disease Chronic lymphoprolipherative disease
103 24 29 6 3 2 1 1 1 1 IFI Probable IA IC 21 4
Performance diagnostica di GM
In 33/167 (20%) pazienti il GM testato nel siero è risultato positivo (172 campioni, mediana 3 campioni/paziente, range 1-37) con un valore mediano di GM di 1.03 (range 0.5 – 12 GMI).
Nei 20 pazienti con AI, 1 paziente ha avuto la positività del GM su BAL (GMI 6.9), mentre nei restanti 19 pazienti, l’AI è stata diagnosticata con la positività del GM nel siero e la presenza di lesioni polmonari.
16 pazienti avevano lesioni polmonari tipiche secondo i criteri EORTC del 2008, 2 pazienti avevano lesioni atipiche (massiccio versamento pleurico e interstiziale), e nei restanti 2 pazienti la TAC non è stata eseguita a causa delle critiche condizioni dei pazienti, mentre l’esame radiologico dimostrava la presenza di nuove lesioni polmonari.
Negli altri 14 pazienti, il GM è stato considerato un risultato falso positivo. Sette pazienti avevano singole positività al GM, molte delle quali risultavano con bassi livelli (mediana 0.7, range 0.5-2.3), ed erano seguite da campioni negativi al GM, in assenza di terapia antifungina. In 1 paziente il GM
30 è risultato positivo con un valore di 0.644 proprio prima della morte, dovuta a sepsi da P. aeruginosa, in assenza di segni o sintomi polmonari (considerato non-classificabile a causa della presenza di criteri microbiologici ma la radiologia o la TAC non era stata eseguita). Gli altri 6 pazienti avevano più campioni consecutivi positivi per GM, tutti con bassi livelli di positività (< 1 GMI), in assenza di segni e sintomi suggestivi e i successivi campioni sono risultati negativi per GM in assenza di terapia antifungina.
Nei 20 pazienti con AI il valore mediano di GM è risultato di 1.2 GMI (range 0.5-12). Il valore 12 è il valore più alto considerato quando il risultato era superiore al valore massimo valutabile dallo spettrofotometro. Mentre nei 14 pazienti che avevano un risultato falso positivo per GM, il valore mediano di GM è risultato 0.7 (range 0.5 – 2.3). In ogni caso, i livelli del primo campione positivo per GM non differisce tra risultati vere e false positività (mediana 0.773, range 0.503-2.305 vs. 0.650, range 0.544-2.352, respectively, p=0.377).
Quindi, in questa popolazione, la performance del GM nel siero è risultata la seguente:
Tabella 6: Performance di GM Sensibilità,% (95%CI) Specificità,% (95%CI) PPV %(95%CI) NPV %(95%CI) Singola positività per GM 95% (73 - 99) 91% (86 - 94) 57% (50 – 64) 99% (96 - 99) 2 risultati positivi consecutivi per GM 94% (89 - 97) 96% (91 - 98) 72% (65 - 79) 99% (96 - 99)
Performance diagnostica di BDG
La performance di BDG per la diagnosi di AI in questa popolazione è stata calcolata sulla base della positività del BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di AI.
Tra i 20 pazienti con AI, 12 avevano almeno un campione positivo per BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di AI, incluso il paziente con GM positivo su BAL e negativo su siero.
31 Tra i 147 controlli, 32 avevano almeno un risultato positivo per BDG, che è stato considerato come falso positivo.
22 pazienti avevano un singolo risultato positivo per BDG, con bassi livelli di BDG (172 pg/ml; range 88-523), mentre i restanti 10 pazienti avevano più campioni positivi per BDG, con livelli mediani di 213 pg/ml (range 81 – 523).In 27/33 pazienti (di cui 20 con singole positività e 7 con multiple positività per BDG) i campioni successivi testati sono risultati negativi per BDG. tutti questi 27 pazienti sono sopravvissuti senza essere stati sottoposti a terapia antifungina.
Nei restanti 5 pazienti (2 con singola positività e 3 con multiple positività per BDG) la positività per BDG è stata rilevata nell’ultimo campione eseguito prima della morte, quindi l’IFI non può essere esclusa definitivamente a causa della mancanza di ulteriori indagini diagnostiche, e sono quindi stati considerati come inclassificabili per AI secondo i criteri dell’EORTC. Questi 5 pazienti avevano tra l’altro il GM negativo nel siero, e 2 avevano polmonite (1 aveva sepsi da P. aeruginosa).
Nei 20 pazienti con AI il valore mediano di BDG è risultato di 204 pg/ml (range 84 - > 523), nei 27 pazienti con risultato falso positivo per BDG, il valore mediano è risultato 164 pg/ml (range 81 - > 523), mentre nei restanti 5 pazienti non classificabili, il valore mediano di BDG è risultato di 239 pg/ml (range 123- > 523). In ogni caso, i livelli del primo campione positivo per BDG non differiscein caso di vera e falsa positività(mediana 159, range 84-523 vs. 178, range 81-523, respectively, p=0.782). Quindi, in questa popolazione, la performance del BDG nel siero entro 7 giorni dalla diagnosi di AI è risultata la seguente:
Tabella 7: Performance di BDG Sensibilità,% (95%CI) Specificità,% (95%CI) PPV %(95%CI) NPV %(95%CI) Singola positività per BDG 60% (52 - 67) 78% (71 - 84) 27% (20 - 34) 93% (88 - 96) 2 risultati positivi consecutivi per BDG 41% (33 - 49) 92% (86 - 95) 36% (29 - 44) 93% (88 - 96)
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Performance diagnostica combinata
La performance combinata per GM e BDG, considerando il risultato di BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di AI è risultata la seguente:
tabella 8: Performance combinata di GM e BDG Sensibilità,% (95%CI) Specificità,% (95%CI) PPV %(95%CI) NPV %(95%CI) Singola positività per GM o BDG 100% (97- 100) 72% (64 -78) 32% (25 - 40) 100% (97-100) Risultato positivo combinato per GM e BDG 40% (32 - 47) 98% (95 - 99) 80% (73 - 86) 92% (86 – 95)
Specificità di BDG per un singolo campione.
La specificità del BDG nell’analisi per singolo campione che è stata calcolata eseguendo una valutazione caso-controllo in rapporto 1:8, è risultata la seguente:
Tabella 9: Specificità di BDG
Scenario: I falsi positivi sono una mediana di quanto ottenuto su 5000 campionamenti casuali dal gruppo dei controlli.
Specificità
Scenario mediano 95.63% (90.84% - 98.07%)
Scenario migliore 100% (97.08% - 100%)
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Positività del BDG rispetto al GM nei pazienti con AI
In 13/20 pazienti erano disponibili campioni di siero precedenti il giorno della diagnosi di AI (giorno 0). Il BDG è risultato negativo in 9 pazienti (45%) entro 7 giorni dalla diagnosi, mentre 4 pazienti (31%) sono risultati positivi per BDG, con valori mediani di BDG di 204.5 pg/ml (range 90 – 523 pg/ml); di cui 3 erano positivi 7 giorni prima della diagnosi.
Il tempo mediano trascorso tra la prima positività al GM e la prima positività al BDG è risultata di 3 giorni (range; -7 - +7 giorni). Il numero di positività per BDG aumenta dopo la prima positività al GM. Nella figura 6 è rappresentato il numero di pazienti che avevano un risultato positivo per BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di IA (giorno 0).
Figura 6: Numero di pazienti positivi per BDG entro 7 giorni dalla diagnosi di AI (giorno 0).
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Day -7 Day -3 Day 0 Day 3 Day 7
Days with respect to the day of the diagnosis of IA (day 0)
Negative, < 60 pg/ml
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Impatto della positività di GM e BDG sulla sopravvivenza
In questa popolazione di 171 pazienti neutropenici, la mortalità calcolata dall’inizio dello screening è risultata del 60.1% (51.6-68.7%), con un follow-up mediano di 160 giorni (range, 1-319 giorni). Nei pazienti con AI, la mortalità è risultata dell’ 81.6% (61-95.2%) con un follow-up mediano di 18 giorni (range, 1-35 giorni), mentre nei pazienti senza AI, la mortalità è risultata del 57.2% (48.1%-66.7%), con un follow-up mediano di 574 giorni (range, 319-830 giorni) (p<0.001) (figura 7); tuttavia quando si confrontano pazienti con AI e il risultato di BDG, il confronto tra la sopravvivenza è statisticamente significativo solo per pazienti senza AI vs pazienti con AI e risultato positivo di BDG (p < 0.001) (figura 8).
Figura 7: Survival curves in patients with IA and No IA. When comparing the overall survival in IA vs no IA patients a significant differences was found (p<0.001).
35 Figura 8: Significant difference (p<0.001) only comparing No IA vs IA-BDG+; No IA vs IA-BDG- not reached the statistical significance (p=0.08) while IA-BDG- vs IA-BDG+ were not significantly different (p=0.23).
La sopravvivenza è stata analizzata e confrontata anche per pazienti senza AI e risultati falsi positivi per GM e BDG. (figura 9). La mortalità è risultata del 64.8% (39.3-88.8%) per pazienti senza AI e risultati falsi positivi per GM, e 66.8% (49.3-83.3) per pazienti senza AI e risultati falsi positivi per BDG. In entrambi i casi la sopravvivenza è risultata più alta in pazienti senza AI (45%), ma è risultata statisticamente significativa solo quando si confrontano pazienti senza AI vs pazienti NO-AI e falsi positivi per BDG (p=0.003) (figura 9).
36 Figura 9: Survival curves in patients with IA and patients with false positive GM and BDG results. 9A) Significant differences comparing No IA vs IA (p<0.001) and NO IA vs No IA-BDG+ (p=0.003); not significant difference comparing No IA – BDG+ and IA (p=0.19). 9B) Significant difference (p<0.001) only comparing No IA vs IA; no significant differences comparing No IA-GM+ vs No IA (p=0.17) and IA vs No IA-GM+ (p=0.28).
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6. DISCUSSIONE
La diagnosi di AI rimane tutt’oggi difficile sia perché le manifestazioni cliniche non sono specifiche, sia perché i quadri radiologici possono essere suggestivi ma non sono patognomonici, sia infine perché le colture del tratto respiratorio spesso mancano di sensibilità. Inoltre, la dimostrazione di ife invasive è particolarmente complessa in un paziente che per la sua malattia ematologica si presenta piastrinopenico e spesso in gravi condizioni cliniche.
Per questi motivi la valutazione di nuove metodiche diagnostiche non-colturali che possano facilitare la diagnosi di aspergillosi, come la rilevazione di antigeni fungini nel siero e in altri fluidi biologici (GM e BDG) o saggi diagnostici di biologia molecolare, hanno ricevuto notevole interesse negli ultimi anni. [18, 57, 120].
Diversi studi hanno riportato una performance del GM e del BDG molto simile per la diagnosi di AI, nonostante l’ampia dispersione dei valori di sensibilità e specificità; in particolare, è stata riportata una sensibilità e specificità per il GM che variano rispettivamente dal 30 al 100% e dal 38 al 98% [91, 121], e una sensibilità e specificità per il BDG che variano rispettivamente dall’80 al 90% e dal 36 al 92% [122]. Pochi studi però, hanno confrontato direttamente i 2 test per la diagnosi di AI nella stessa popolazione di pazienti, spesso riportando risultati contrastanti. Due studi hanno favorito il BDG [80, 116], uno studio ha favorito il GM [120], mentre altri 3 studi non hanno mostrato differenze significative tra i due markers [92, 123, 124].
In questo studio abbiamo confrontato retrospettivamente la performance diagnostica di due test di laboratorio utilizzati per la diagnosi di AI, il GM e il BDG, in una popolazione ad alto rischio di sviluppare questa infezione.
Il GM ha mostrato una buona performance diagnostica per AI, in termini di sensibilità e specificità, che sono risultate rispettivamente del 95 e del 91%; infatti, in tutti i casi di AI tranne 1, il GM è risultato positivo nel siero con elevati valori.
Il BDG invece ha dimostrato una sensibilità ridotta rispetto al GM (60% vs 95%). Solo 12/20 casi di AI avevano almeno 1 campione positivo per BDG entro 7 giorni dal giorno della diagnosi. Tuttavia, quando sono stati considerati 2 campioni di siero consecutivi, si aveva una diminuzione della sensibilità del BDG (60% vs 41%), ma un aumento della specificità (78% vs 92%). Tuttora però non
