ALTERAZIONI DEL TRASPORTATORE DELLA SEROTONINA IN PIASTRINE E LINFOCITI DI PAZIENTI CON DISTURBI PSICOTICI

INDICE

SUMMARY...2

1. INTRODUZIONE...4

1.1 BIOCHIMICADELLASEROTONINA... 8

1.2 ANATOMIADELSISTEMASEROTONINERGICO ...12

1.3 FISIOLOGIADELSISTEMASEROTONINERGICO ...18

1.4 RECETTORISEROTONINERGICI ...25

1.5 SISTEMADITRASPORTODELLASEROTONINA ...35

1.6 SEROTONINAEPSICOSI...43

1.7 DISTURBIPSICOTICI ...48

2. SCOPO DELLA RICERCA ...55

3. MATERIALI E METODI ...555

3.1 SOGGETTI ...56

3.2 SEPARAZIONEERACCOLTADELLEPIASTRINE...59

3.3 PREPARAZIONEDELLEMEMBRANEPIASTRINICHE ...61

3.4 SEPARAZIONEERACCOLTADEILINFOCITI ...61

3.5 PREPARAZIONEDELLEMEMBRANELINFOCITARIE... 565

3.6 DETERMINAZIONEDELLACONCENTRAZIONEPROTEICA ...66

3.7 METODICADIBINDING ...69

3.8 ANALISISCATCHARD:DETERMINAZIONEDELLABMAX EDELLAKD...72

3.9 ANALISISCHATCHARDDELLA3_{H-PARINMEMBRANEPIASTRINICHE ...76}

3.10 ANALISISCHATCHARDDELLA3H-PARINMEMBRANELINFOCITARIE ..78

3.11 ANALISISTATISTICAEDELABORAZIONEDATI ...79

3.12 STUDIODELSERTMEDIANTEL'UPTAKEDELLA3H-5-HT ...80

3.13 MISURAZIONEQUANTITATIVADELLEPIASTRINE ...82

3.14 MISURAZIONEQUANTITATIVADEILINFOCITI ...83

3.15 UPTAKEDELLA3H-5-HT ...84

3.16 ANALISIDEIDATI ...86

4. RISULTATI ...87

4.1 RISULTATI:BINDINGPIASTRINICODELLA3H-PAR ...87

4.2 RISULTATI:UPTAKEPIASTRINICODELLA3_{H-5-HT ...90}

4.3 RISULTATI:BINDINGLINFOCITARIODELLA3H-PAR ... 903

4.4 RISULTATI:UPTAKELINFOCITARIODELLA3H-5-HT...96

5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI ...99

Summary

Given the controversial data on the role of the serotonin (5-HT) transporter in psychosis, our study aimed to investigate this structure by means of the measurements of the reuptake kinetics and of the protein density, in both platelets and lymphocytes of patients with different psychotic disorders.

Twenty-five patients suffering from bipolar 1 disorders with mood incongruent psychotic features (14), mixed states (7) and schizophrenia (4), according to DSM-IV criteria, were included in the study and compared with a matched group of healthy control subjects. The severity of the symptoms was assessed by means of the Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS). Platelet and lymphocyte membranes were prepared according to standardized protocols, as were carried out 3H-5HT re-uptake and 3H-paroxetine (3H-Par) binding.

As far as platelet markers were concerned, Bmax values were lower, to a statistically significant degree, in patients than in control subjects (853±140 vs 1368±172, respectively, p=0.016), with no change in the Kd values (0.10±0.05 vs 0.09±0.03). The Vmax values (pmol/109 plt/min, mean+SD) too, were statistically lower

in patients than in control subjects (52±18 vs 133±15, respectively, p=0.03) while the Km values were 161±62 in patients and 211±67 in control subjects.

The same results were obtained in lymphocytes, namely the Bmax (313±131 vs 600±50, p=0.008) and Vmax (7400±310 vs 9400±350, p=0.016) values were statistically lower in patients than in the control subjects, with no change in the Kd or Km (0.08±0.02 vs 0.12±0.03 and 195±49 vs 180±67, respectively).

No correlation was observed between biological markers and either the psychopathological scale total score or single items.

The results of this study showed a decreased density of the 3H-Par binding sites coupled with a reduced velocity of 3H-5-HT reuptake in both platelets and lymphocytes of psychotic patients, as compared with healthy control subjects.

These findings would suggest a general abnormality of the 5-HT system in psychotic patients.

1. INTRODUZIONE

Lo sviluppo e l’introduzione nella pratica clinica dei cosidetti antipsicotici atipici, caratterizzati da un’azione farmacologica determinata dall’antagonismo, oltre che a livello dei recettori dopaminergici ed altri, anche a livello dei recettori serotoninergici, ha rinnovato l’interesse nel valutare il possibile coinvolgimento della serotonina (5-HT) nella fisiopatologia dei sintomi psicotici. Da un certo punto di vista ciò potrebbe essere visto come un ritorno al passato dato che la 5-HT era il neurotrasmettitore che sembrava maggiormente coinvolto nella fisiopatologia della schizofrenia (Wolley et al. , 1956); in seguito, l’evidenza che il principale meccanismo con cui agivano gli antipsicotici classici era il bloccaggio dei recettori dopaminergici, fece sì che l’ipotesi serotoninergica fosse temporaneamente abbandonata. Il punto di vista attuale sulla fisiopatologia dei disturbi psicotici è più complesso e si pensa che la complessità dei quadri clinici possa essere il risultato di un’alterazione di differenti sistemi neurotrasmettitoriali.

La 5-HT è presente per il 90% nel tratto gastrointestinale, mentre l'1-2% é sintetizzato nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) dove

funziona da neurotrasmettitore. Anche le piastrine ematiche sono ricche di 5-HT: esse sono incapaci di sintetizzarla, perciò la captano dal sangue attraverso un sistema di trasporto attivo, ad alta affinità, soprattutto durante il passaggio nei capillari intestinali, la accumulano in granuli e la liberano durante l'aggregazione. Inoltre, é stata scoperta la presenza di 5-HT nei linfociti dove si pensa che abbia un ruolo in alcune funzioni del sistema immunitario (Faraj e coll. 1993).

La molteplicità dei processi psicobiologici in cui è verosimilmente coinvolta la 5-HT, ha portato ad innumerevoli studi volti ad individuarne il ruolo nella fisiopatologia di vari disturbi psichiatrici. In particolare, negli ultimi anni si é sviluppato un settore di ricerca incentrato sulla caratterizzazione del trasportatore della 5-HT (SERT), la cui attività é particolarmente critica nella regolazione della concentrazione intrasinaptica di 5-HT, nel tentativo di progettare terapie sempre più mirate e specifiche per le patologie psichiatriche che comportano un’alterazione del sistema serotoninergico. Il SERT rappresenta il bersaglio primario dell'azione farmacologica degli antidepressivi triciclici e degli inibitori selettivi del re-uptake della 5-HT. E' stato perciò ipotizzato che alterazioni a questo livello possano essere implicate nella

fisiopatologia di molti disturbi psichiatrici, in particolar modo dei disturbi d'ansia e dell'umore. Il SERT appartiene a una larga famiglia di trasportatori Na+/Cl- dipendenti che includono i trasportatori di noradrenalina, dopamina, GABA, glicina, ecc. E’ una proteina di trasporto composta da 630 aminoacidi, organizzati in 12 domini transmembrana con l’estremità amino- e carbossi- terminali rivolti verso l’ambiente intracellulare. La sua funzione è quella di controllare la concentrazione sinaptica di 5-HT attraverso un meccanismo di ricaptazione (re-uptake). Numerosi studi hanno evidenziato la presenza del SERT sulle piastrine ematiche e tale proteina è risultata sovrapponibile a quella cerebrale, come dimostrato dal clonaggio e dalla sequenziazione delle due strutture, che sono quindi identiche. Pertanto, lo studio del SERT piastrinico di soggetti sani e di pazienti affetti da varie patologie psichiatriche è stato per molti anni uno dei metodi periferici più usati per valutare il possibile coinvolgimento del sistema serotoninergico in queste patologie. Inoltre, la dimostrazione della presenza del SERT nei linfociti (Faraj e coll., 1994; Marazziti e coll., 1998) ha fornito un ulteriore strumento per la valutazione della funzionalità del sistema serotoninergico, infatti, essendo i linfociti cellule nucleate, oltre a poter studiare la distribuzione e funzionalità del SERT, sarà

possibile effettuare studi di biologia molecolare, come, ad esempio, la valutazione dell'RNAm, per capire se eventuali modificazioni di parametri biologici del SERT possano essere attribuite ad alterazioni della trascrizione della proteina.

Vista la mancanza di dati relativi alla funzionalità del SERT nelle psicosi, con la nostra ricerca ci siamo proposti di esplorarne la presenza e valutarne la funzionalità in piastrine e linfociti di soggetti affetti da disturbi psicotici, rispetto ad un gruppo di soggetti sani di controllo.

1.1 BIOCHIMICA DELLA SEROTONINA

Tutte le cellule che contengono la 5-HT, con eccezione delle piastrine, la sintetizzano nel proprio citoplasma a partire da un aminoacido precursore: il triptofano (un aminoacido idrofobico aromatico contenente un gruppo indolico costituito da un anello benzenico condensato con uno pirrolico). La triptofano-idrossilasi, enzima che determina la velocità di formazione della 5-HT, non è saturata dal suo substrato, perciò la somministrazione di triptofano è in grado di aumentare i livelli di 5-HT. L’aminoacido L-triptofano è fornito dalla dieta ed è trasportato all’interno delle cellule dal trasportatore degli aminoacidi neutri (tirosina, fenilalanina, leucina). Poiché esiste competizione tra gli aminoacidi neutri per il trasportatore, la biodisponibilità di L-triptofano è legata alla dieta. L’ingestione di carboidrati influenza la conversione del triptofano in 5-HT: infatti, questi stimolano la produzione di insulina che facilita il passaggio della maggior parte degli aminoacidi nei tessuti periferici. Dal momento che i livelli ematici di triptofano non sono influenzati dall’insulina, i carboidrati fanno aumentare la sua percentuale nel sangue rispetto agli altri aminoacidi.

L’assunzione di notevoli quantità di proteine, pur incrementando la concentrazione plasmatica di triptofano, non ne incrementa quella cerebrale perché il triptofano compete con gli altri aminoacidi per il trasporto intracerebrale.

La sintesi di 5-HT inizia con l’idrossilazione enzimatica del precursore e formazione di idrossi-triptofano (5-OH triptofano) da parte della triptofano-idrossilasi. Questo è l’enzima limitante del sistema perché non é saturato a concentrazioni di triptofano fisiologiche e la sua attività è modulata positivamente dalla stimolazione dei neuroni serotoninergici. Il 5-OH triptofano è quindi decarbossilato a 5-idrossitriptamina (5-HT) da una decarbossilasi degli amminoacidi aromatici. La triptofano-idrossilasi e la sintesi di 5-HT possono essere bloccate in modo duraturo dalla p-clorofenilalanina, farmaco di esclusivo interesse sperimentale. In genere i farmaci che interferiscono con la sintesi di 5-HT sono utili nella manipolazione dei modelli sperimentali, ma di scarso interesse clinico.

La via catabolica principale della 5-HT prevede la sua ossidazione a 5-idrossi-3-indolacetaldeide per opera di monoammino-ossidasi (MAO) di tipo A, localizzate in parte sui mitocondri all’interno delle terminazioni nervose. L’aldeide è immediatamente trasformata in

acido 5-idrossi-3-indolacetico (5-HIAA) da parte di aldeidi-deidrogenasi. L’accumulo di 5-HIAA nel liquido cefalorachidiano è indice del turnover della 5-HT. Circa 1/3 dei metaboliti urinari della 5-HT derivano dalla trasformazione del neurotrasmettitore in O-solfato per opera di una solfotransferasi. La 5-HT è anche il precursore della melatonina (N-acetil-serotonina), che viene sintetizzata nella ghiandola pineale per azione dell’enzima N-acetilasi, e svolge un ruolo importante nella regolazione del ciclo luce-buio e probabilmente nell’armonizzazione dei ritmi endogeni con la diversa luminosità ambientale (Fig.1)

1.2 ANATOMIA DEL SISTEMA SEROTONINERGICO

I corpi dei neuroni serotoninergici sono localizzati sulla linea mediana del tronco cerebrale a livello di bulbo, ponte e mesencefalo, dove si trovano particolarmente concentrati nei nuclei del rafe, e si distinguono in due gruppi principali (Baumgartner e Lachenmayer, 1985) (Fig.2; Fig.3):

1) Gruppo ponto-mesencefalico o rostrale

Tale gruppo comprende i nuclei dorsali del rafe, il mediano e il pontino e dà origine alle maggiori proiezioni ascendenti che sono il fascicolo retroflesso, il tratto tegmentale e il fascicolo dorsale o di Schultz. I fasci ascendenti si distinguono, inoltre, a seconda del nucleo di appartenenza in fascio dorsale e mediale e, attraverso di essi, si portano a quasi tutte le aree cerebrali: la neocortex, l’ippocampo, l’amigdala, l’ipotalamo, il corpo striato, la sostanza nera e il locus coeruleus. La funzione del gruppo rostrale è ancora sconosciuta, ma si suppone che riguardi l’integrazione neuroendocrina, il comportamento aggressivo, sessuale ed alimentare, il ritmo sonno-veglia, le emozioni ed il pensiero.

2) Gruppo bulbare-caudale

Questo secondo gruppo è costituito dai nuclei del rafe oscuro, rafe magno, rafe ventrale, rafe pallido e nucleo reticolare paragigantocellulare laterale da cui originano fasci discendenti che raggiungono il midollo spinale, soprattutto le corna posteriori. La funzione prevalente del gruppo caudale è il controllo retro-attivo locale dei messaggi propriocettivi, in particolare il controllo prevalentemente inibitorio dei messaggi nocicettivi ed eccitatori dei muscoli estensori. Vi sono poi fibre che vanno al cervelletto tramite i brachia conjuctiva. Neuroni serotoninergici sono stati trovati anche a livello ipotalamico nel nucleo dorso-mediale. I neuroni serotoninergici sono del tipo reticolare, ricchissimi di arborizzazioni dendritiche tipiche di un sistema atto a ricevere segnali multipli e a modulare bersagli e circuiti eterogenei. Le sinapsi sono in genere di tipo dendro-dendritico, suggestive di una funzione più modulatoria che eccitatoria o inibitoria del sistema serotoninergico.

Sono stati definiti almeno tre gruppi di peptidi, sostanza P, fattore di rilascio dell’ormone tireotropo (TRH) ed encefaline che coesistono nei neuroni serotoninergici e che funzionano da co-trasmettitori e/o co-modulatori a livello sinaptico, confermando la natura modulatoria di tale sistema. Come già sottolineato, evidenze

sperimentali supportano l’esistenza di più sottogruppi anatomici e funzionali di neuroni serotoninergici (Murphy, 1991).

Recenti studi di neuroanatomia e di neurofisiologia hanno dimostrato che i neuroni del nucleo dorsale del rafe e del nucleo mediano sono organizzati selettivamente nell’innervazione di diverse regioni cerebrali, benché in alcune aree l’innervazione proveniente dai due nuclei si sovrapponga. Gli assoni provenienti dai nuclei dorsali del rafe (fascio dorsale) si proiettano alla corteccia, allo striato, al globo pallido e all’amigdala con mediazione dei recettori serotoninergici di tipo 2, 1C e 3. Si pensa che questo sistema sia implicato nella regolazione dell’ansia anticipatoria. Gli assoni provenienti da questi nuclei sono molto sottili, con piccole varicosità ed altamente vulnerabili all’azione della para-cloroanfetamina. I neuroni provenienti dai nuclei mediani del rafe (fascio mediale) si proiettano prevalentemente all’ippocampo, all’area preottica mediale, al nucleo soprachiasmatico e al bulbo olfattorio e agiscono principalmente tramite recettori di tipo 1A. Questi neuroni hanno un grosso diametro, presentano una sviluppata varicosità e un’elevata resistenza ai composti di origine anfetaminica. Si pensa ad un coinvolgimento di questi tipi di neuroni nei fenomeni di tolleranza, adattamento a stimoli avversi e

anche nella depressione (Deakin, 1991). Il sistema serotoninergico é strettamente connesso sia anatomicamente sia funzionalmente con altri sistemi neurotrasmettitoriali, in particolare con il noradrenergico, il dopaminergico ed il GABAergico.

GRUPPO PONTOMESENCEFALICO O ROSTRALE

-Nuclei dorsali del rafe -Nuclei mediani -Nucleo pontino ▼ Proiezioni ascendenti -Fascicolo retroflesso -Tratto tegmentale -Fascicolo dorsale ▼ Aree cerebrali -Neocortex -Ippocampo -Amigdala -Striato -Sostanza nera -Locus coeruleus ▼ Controllo -Integrazione neuro-endocrina -Comportamento aggressivo, sessuale, alimentare -Ritmo sonno-veglia -Emozioni, pensiero, apprendimento

Fig.2 Vie serotoninergiche

GRUPPO BULBARE-CAUDALE

-Nuclei del rafe oscuro -Nuclei del rafe magno -Nuclei del rafe ventrale -Nuclei del rafe pallido -Nucleo reticolare paragigantocellulare

▼

Proiezioni discendenti ▼

Corna posteriori del midollo spinale

▼

Controllo

-Messaggi propiocettivi

-Inibitorio messaggi nocicettivi ed eccitatori

NUCLEI PONTO-MESENCEFALICI DEL RAFE

Rafe dorsale Rafe mediano Nucleo del ponte

NUCLEI BULBARI DEL RAFE Rafe oscuro Rafe pallido

Nucleo ventricolare ventrale

ANATOMIA DEL SISTEMA

SEROTONINERGICO

1.3 FISIOLOGIA DEL SISTEMA SEROTONINERGICO

Il sistema serotoninergico regola numerose funzioni e comportamenti a livello sia periferico che centrale (fig.4), in particolare:

1. Controllo delle attività motorie del tratto gastrointestinale

Gli enzimi deputati alla sintesi della 5-HT si trovano sia nelle cellule enterocromaffini che in alcuni neuroni dei plessi mioenterici. I recettori serotoninergici sono presenti sulle cellule muscolari lisce (soprattutto recettori del tipo 5-HT_{4, abbondanti nella muscolaris} mucosae esofagea) e sulle cellule nervose; su queste la 5-HT può sia inibire il rilascio di acetilcolina attivando recettori presinaptici localizzati sulle terminazioni delle fibre pregangliari dei gangli intramurali (inibizione della peristalsi), sia aumentare l’attività e il rilascio di neurotrasmettitori da terminali intramurali. Questo tipo di effetto è essenziale per la corretta progressione dell’onda peristaltica.

2. Controllo della pressione arteriosa

Gli effetti della 5-HT sul sistema cardio-circolatorio sono molteplici. La prima risposta che si osserva a seguito di infusione endovenosa di 5-HT è una bradicardia transitoria; essa è dovuta ad un riflesso

che determina un ipertono vagale (riflesso di Bezold-Jarish) generato dalla stimolazione dei recettori 5-HT3 localizzati sulle fibre

sensoriali presenti nel tessuto cardiaco. La bradicardia è seguita da tachicardia e aumento della forza di contrazione conseguenti, oltre che all’instaurarsi di fenomeni riflessi compensatori, ad attivazione dei recettori 5-HT4 presenti sulle cellule cardiache. Gli effetti sul

tono vagale sono complessi e legati a meccanismi quali:

a) attivazione di recettori 5-HT_1A localizzati sui neuroni dei nuclei vasomotori che mediano ipotensione;

b) inibizione del rilascio di noradrenalina dai terminali ortosimpatici; c) attivazione della produzione di monossido di azoto (NO) da parte delle cellule endoteliali (probabilmente attraverso l’attivazione di recettori 5-HT₂).

Nel distretto coronarico la 5-HT induce costrizione dei vasi di grosso e medio calibro e dilatazione delle piccole arterie. Recettori di tipo 5-HT₂ localizzati a livello ipotalamico sono coinvolti nella stimolazione del rilascio di renina indotta da 5-HT.

3. Promozione dell’aggregazione delle piastrine e della stimolazione della muscolatura vasale

Le piastrine mancano degli enzimi deputati alla sintesi della 5-HT, ma posseggono un trasportatore capace di captare il

neurotrasmettitore presente nel sangue. Le piastrine esprimono in prevalenza recettori di tipo 5-HT_2A che riducono notevolmente la soglia di attivazione dell’aggregazione piastrinica favorendo l’emostasi.

4. Controllo della secrezione dell’ormone della crescita, della prolattina e degli ormoni steroidei

Variazioni dei livelli plasmatici di questi ormoni sono talvolta utilizzati come indici dell’efficacia terapeutica di farmaci serotoninergici o in test di stimolo per indagini biologiche.

5. Regolazione della temperatura corporea

Nel ratto, la stimolazione di recettori 5-HT_1A provoca un abbassamento della temperatura, mentre l’opposto si verifica per la stimolazione di 5-HT_2A.

6. Controllo dei centri analgesici cerebrali

L’incremento di 5-HT produce analgesia, attraverso una probabile interazione col sistema degli oppioidi endogeni (Roberts, 1984). 7. Controllo del comportamento alimentare

L’iniezione di neurotossine nei ventricoli cerebrali causa una compromissione del sistema 5-HT con conseguente iperfagia e aumento di peso, mentre un aumento di 5-HT è associata a iporessia. Sembra che un aumento della quantità di questo

neurotrasmettitore intervenga nel ridurre l’ingestione di carboidrati, mentre una carenza ne determini una maggiore ingestione per aumentare la quantità di triptofano in circolazione e favorire la sintesi di 5-HT stessa. E’ stato dimostrato di recente che ratti senza recettori 5-HT2C diventavano obesi e presentavano comportamenti bulimici, ad ulteriore dimostrazione del ruolo della 5-HT sul controllo del comportamento alimentare.

8. Diminuzione dell’intervallo tra sonno e comparsa del R.E.M (rapid eye movement) e diminuzione del R.E.M. totale

Questi fenomeni sono stati interpretati come l’espressione di un’inibizione della trasmissione serotoninergica. L’atonia muscolare che caratterizza il sonno R.E.M. sembra dovuta all’arresto dell’attività elettrica dei neuroni del rafe (Jacobs e Fornal, 1993). In generale si ipotizza che un’aumentata attività di questo neurotrasmettitore sia importante per l’insorgenza del sonno, mentre il mantenimento di quest’ultimo è compatibile con una sua ridotta attività.

9. Effetto inibitorio sul rilascio di ormoni gonadici e sul comportamento sessuale attraverso l’azione sull’asse ipotalamo-ipofisario

E’ stato ipotizzato che l’iperattività noradrenergica del locus coeruleus sia coinvolta nell’eziopatologia del disturbo da attacco di panico.

11. Controllo inibitorio sui neuroni mesolimbici dopaminergici coinvolti in disturbi d’ansia e in alcuni disturbi psicotici

12. Controllo dei ritmi circadiani endocrini ipotalamici, probabilmente mediato dai recettori 5-HT7 (Lovenberg e coll., 1993)

I nuclei del rafe mesencefalico sono probabilmente la sede di un pace-maker centrale che ritma la frequenza e l’ampiezza dei profili circadiani di CRF, ACTH, LH, TRF e LRF. Nell’ipotalamo si verifica la convergenza e l’integrazione tra i ritmi endogeni e gli stimoli esogeni, soprattutto di quelli provenienti dalla retina. Il sistema serotoninergico sembra avere un ruolo nell’armonizzazione sonno-veglia con i ritmi endocrini.

13. Armonizzazione di alcuni ritmi endogeni con il ciclo luce-buio tramite la melatonina di cui la 5-HT è precursore

L’eziopatogenesi di alcune forme stagionali di patologia affettiva sembrano essere collegate alle variazioni di questo ormone.

14. Influenza su vari aspetti del comportamento attraverso integrazione e modulazione degli stimoli sensoriali

Alterazioni del sistema serotoninergico potrebbero creare una vulnerabilità che predisporrebbe a un disturbo nel controllo degli impulsi (Schildkrant, 1965; Einchelman,1979; Marazziti e coll, 1998).

15. Coinvolgimento nei processi di apprendimento e plasticità sinaptica che avvengono soprattutto a livello ippocampale

SISTEMA SEROTONINERGICO

COINVOLTO

NELLA REGOLAZIONE DI

Motilità gastrointestinale

Frequenza e forza di contrazione Aggregazione piastrinica Ciclo sonno-veglia Comportamento sessuale Sensibilità dolorifica Apprendimento e memoria Ritmi circadiani Controllo secrezione GH, Prolattina, Ormoni steroidei

DUPLICE EFFETTO SU

(opposte azioni dei recettori)

Alimentazione

Temperatura corporea

1.4 RECETTORI SEROTONINERGICI

Dalla prima dimostrazione dell’esistenza di almeno due tipi di recettori serotoninergici (Gaddum e Picarelli, 1957), si è giunti oggi alla identificazione molecolare e/o farmacologica di numerosi tipi e sottotipi recettoriali per la 5-HT (Fig.5). La classificazione dei recettori serotoninergici è basata sull’affinità farmacologica verso vari ligandi agonisti e antagonisti. Con l’avvento della biologia molecolare si sono potuti clonare e sequenziare molti recettori serotoninergici, dedurre la loro conformazione proteica e a quali sistemi di trasduzione sono collegati. La classificazione più completa dei recettori serotoninergici è stata effettuata tenendo presente le loro caratteristiche farmacologiche, strutturali (sequenza aminoacidica) e trasduzionali (Bloom e coll., 1995).

Si distinguono diverse famiglie di recettori per la 5-HT: (Fig.5). • 5-HT₁ (7 sottotipi: 5-HT1A, 5-HT_1B, 5-HT_1D, 5-HT_1E,5-HT_1F, 5-HT_1P, 5-HT_1S); • 5-HT₂ (3 sottotipi: 5-HT2A, 5-HT_2B, 5-HT_2C); • 5-HT₃; • 5-HT₄; • 5-HT _{(2 sottotipi: 5-HT} , 5-HT );

• 5-HT6;

• 5-HT₇

A seconda delle modalità di trasduzione del segnale, sono state distinte due super-famiglie di recettori:

1) quelli legati alle proteine G (metabotropici) comprendente i recettori 5-HT_{1, 5-HT2}, 5-HT₄, 5-HT₆, 5-HT₇. Tali componenti sono costituiti da una singola catena polipeptidica che attraversa sette volte la membrana plasmatica, presentano cioè sette domini aminoacidici idrofobici transmembrana ad α-elica (ciascuno contenente da 20 a 28 aminoacidi), un dominio amino-terminale extracellulare contenente siti di glicosilazione e un dominio carbossi-terminale intracellulare che spesso contiene siti di fosforilazione. Quest’ultimo sembra coinvolto, insieme ad una sequenza intramembranosa, nella regolazione della proteina G accoppiata. Nella regione intracellulare sembrano presenti sequenze di consenso per la proteina chinasi C (PKC), questo suggerisce un suo ruolo nella regolazione delle funzioni recettoriali (Fargin e Gozlan, 1991). I domini transmembrana sono collegati da tre “loops” intracellulari e tre “loops” extracellulari. Si suppone che i domini transmembrana siano importanti per i meccanismi di binding con i leganti e per l’interazione con le proteine G. Il

confronto con le sequenze di altri recettori della stessa super-famiglia mostra che il grado maggiore di conservazione si ha a livello dei territori idrofobici. Il dominio III contiene un residuo di aspartico, che è presente in tutti i recettori per le amine cationiche e si ritiene che interagisca con il gruppo aminico del neurotrasmettitore. Per il legame con la 5-HT sono importanti anche le due serine presenti nei territori idrofobici IV e V e una fenilalanina del territorio VI.

La famiglia 5-HT₁ comprende recettori associati a una proteina G inibitrice (Gi) con azione inibitoria sulla produzione di AMP ciclico (cAMP) (Weiss e coll., 1986). Evidenze sperimentali ottenute tramite prove di binding hanno dimostrato che una buona parte di questi recettori ha un’alta affinità (Kd nM) per la 5-HT (Bennet e Snyder, 1976). Il sottotipo più conosciuto di questa famiglia è il 5-HT_1A (De Vivo e Maayani, 1985; Bockaert e coll., 1987; Dumuis, 1988), che é stato caratterizzato in maniera specifica con radioligandi selettivi come la 8-idrossi 2 (di-n-propilamino) tetralina triziata ([3H]-8-OH-DPAT) un potente agonista (Gozlan e coll., 1983). Studi di biologia molecolare hanno dimostrato che il recettore 5-HT_1A presenta un più alto grado di omologia con il

recettore β2-adrenergico rispetto al sottotipo recettoriale 5-HT₂ (Nardi e coll., 1993).

Le regioni con il maggior numero di recettori 5-HT_1A sono i nuclei del rafe dorsale e mediano, la corteccia frontale e il sistema limbico (ippocampo, setto, amigdala), dove si pensa che questi recettori siano implicati nel controllo dell’ansia e dell’umore. Sono legati ad un canale K+ per mezzo di una proteina G sensibile alla tossina della pertosse (Andrade e Chaput 1990; Innis e Aghajanian 1987; Newberry 1992). La loro attivazione determina una iperpolarizzazione dovuta ad un aumento di conduttanza al K+, con conseguente inibizione dell’eccitabilità neuronale. I recettori 5-HT_1A presenti sul corpo e sui dendriti dei neuroni del rafe sono autorecettori la cui attivazione causa la riduzione della frequenza di scarica dei nuclei del rafe e quindi una generale depressione del sistema serotoninergico. Il sottotipo 5-HT_1B, marcato con RU-24969, sembra essere specie-specifico, dato che è presente nel cervello del ratto, ma non in quello dell’uomo. I recettori 5-HT_1C sono localizzati nel tronco encefalico e nell’ipotalamo (Conn e coll., 1986) e per le loro caratteristiche biochimiche e farmacologiche sono entrati a far parte dei recettori 5-HT₂ (Saudou e Hen, 1994)

con la denominazione di 5-HT_{2C. I 5-HT1D} sono distribuiti in tutte le aree corticali, nella substantia nigra e nel nucleo caudato (Heuring e Peroutka, 1987); le loro caratteristiche più importanti sono la localizzazione presinaptica e l’effetto inibitorio sul rilascio di neurotrasmettitori classici e peptidici. Si ritiene che l’efficacia terapeutica di agonisti 5-HT_1D, utilizzati nella terapia dell’emicrania, sia dovuta all’attivazione di questo recettore presente nei vasi meningei, in questo modo la liberazione di sostanze vasodilatatorie come il monossido di azoto (NO), considerato da alcuni esperti l’evento responsabile dell’insorgenza degli attacchi di emicrania, risulterebbe inibita.

Recentemente sono stati evidenziati nuovi sottotipi 5-HT₁ nell’encefalo umano e di ratto: 5-HT_1E, 5-HT_1F (Leonhardt e coll., 1989; Lovemberg e coll., 1993), 5-HT_{1P e 5-HT1S} (Bloom e coll., 1995).

La famiglia dei recettori 5-HT₂ è formata da tre sottotipi recettoriali 5-HT_2A, 5-HT_2B, 5-HT_{2C (già detto 5-HT1C}). I recettori 5-HT₂, tramite una proteina G, promuovono l’idrolisi del fosfatidil-inositolo 4-5 difosfato per mezzo di un enzima, la fosfolipasi C. Questa famiglia di recettori viene marcata di preferenza con antagonisti selettivi

quali spiperone e ketanserina (Segawa e coll., 1979). Le aree cerebrali più ricche di recettori 5-HT_{2 sono la corteccia cerebrale e il} nucleo caudato. Benché questo genere di recettori abbia un’affinità molto ridotta per la 5-HT (1/100) rispetto ai recettori 5-HT₁, evidenze sperimentali li vedono coinvolti in molte risposte serotoninergiche. A differenza dei 5-HT_{1A, pare che i recettori} 5-HT_2A siano post-sinaptici: infatti se si realizza una lesione a livello dei nuclei del rafe non si altera il loro numero (Blackshear e coll., 1981). I recettori 5-HT_2A sono presenti anche nei nuclei vasomotori bulbari e la loro inibizione sarebbe responsabile dell’effetto anti-ipertensivo della ketanserina e altri farmaci della stessa classe. Le famiglie 5-HT₄, 5-HT_{6 (Ruat e coll.,1993) e 5-HT7 comprendono} recettori in grado di interagire con le proteine Gs (G stimolatoria) che incrementano l’attività dell’adenilato-ciclasi promuovendo un aumento della quantità di AMP ciclico.

Per quanto riguarda il recettore 5-HT₄, non é ancora chiara quale sia la sua rilevanza fisiopatologica. In periferia sembra che esso sia coinvolto nella regolazione dell’attività peristaltica e della forza di contrazione delle fibre cardiache, invece, nel SNC a livello ippocampale e del collicolo, il recettore 5-HT₄ stimola

l’adenilato-ciclasi e induce una inibizione dei i canali al K+, tramite una proteina-chinasi A. Questo determina un aumento della depolarizzazione nella fibra nervosa, promuovendo una maggiore entrata di calcio favorendo così un maggior rilascio di neurotrasmettitore. Lo stesso fenomeno si osserva in Aplysia (mollusco gasteropodo marino) ed è alla base di alcuni fenomeni identificati e studiati in questo che viene considerato un modello sperimentale di plasticità sinaptica (Brunelli e coll., 1976; Bailey e Chen, 1983).

Dei recettori 5-HT₅ sono sconosciuti gli effettori, sappiamo soltanto che non regolano l’attività nè dell’adenilato-ciclasi, nè quella della fosfolipasi C e che il sottotipo 5-HT5A è localizzato con altissima

densità nelle cellule del Purkinje del cervelletto. Si ritiene che possano essere coinvolti nell’attività esplorativa e giocare un ruolo nella fisiopatologia dell’autismo (Marazziti e coll., 2000).

2) quelli costituiti da canali ionici (ionotropici) al quale apparterrebbe solo il tipo 5-HT₃. Questo recettore, simile a quello nicotinico per l’acetilcolina, è formato da cinque subunità (omopentamero) che determinano un canale idrofilico attraverso il quale passano gli ioni. Ogni subunità è formata da una catena

polipeptidica che attraversa quattro volte la membrana plasmatica in corrispondenza di altrettante regioni ricche di aminoacidi idrofobici (regioni chiamate M, M1-M4). Il canale idrofilico, attraverso cui scorrono gli ioni, è delimitato dalle regioni M2 di ciascuna subunità. La selettività della carica ionica che attraversa il canale è data dalla presenza di aminoacidi elettricamente carichi posti in modo da creare degli anelli all’interno del canale. Ha uguale permeabilità per il Na+ e il K+, ma lascia passare anche il Ca++, quindi non è molto selettivo rispetto ai cationi; la sua attivazione induce una rapida depolarizzazione (Zifa e Fillion, 1992). Questi recettori, inizialmente caratterizzati a livello periferico, sono stati trovati anche nel SNC dove sembrano avere un ruolo importante nella modulazione della liberazione di diversi neurotrasmettitori come ad esempio la dopamina (Kilpatrick e coll., 1987). I recettori pre-sinaptici 5-HT₃ li troviamo anche nell’area postrema e nel nucleo gelatinoso del tratto spinale del trigemino. Questi due centri appartengono ad un complesso di strutture localizzate intorno alle porzioni più caudali del IV ventricolo (dove la barriera emato-encefalica è incompleta), importanti nel controllo del vomito. Farmaci antagonisti del recettore 5-HT₃ sono utilizzati come

antiemetici nel vomito incoercibile conseguente al trattamento con farmaci antiblastici.

Fig.5 Recettori serotoninergici

Sottotipo recettoriale Sistema di trasduzione 5-HT1 (1A, 1B, 1D, 1E, 1F, 1P, 1S) 1A (canali al K+ via Gq);

1B (specie specifico); 1D (canali al K+ via Gq)

5-HT2 (2A, 2B, 2C) IP3 e DAG

5-HT3 Recettore ionotropico (Canale Cationico) 5-HT4 AMPc (via Gs) 5-HT5 (5A, 5B) ? 5-HT6 AMPc (via Gs) 5-HT7 AMPc (via Gs)

1.5 SISTEMA DI TRASPORTO DELLA SEROTONINA

Il neurotrasmettitore, una volta liberato nel vallo sinaptico (Fig. 6), oltre a combinarsi con i recettori specifici pre- o post-sinaptici, è sottoposto ad una serie di meccanismi che hanno la finalità di abbassarne la concentrazione, favorendo la dissociazione dai recettori e la cessazione dell'effetto intrasinaptico (Amara e Kuhar, 1993). Questi meccanismi sono principalmente:

• la degradazione enzimatica

• il recupero del neurotrasmettitore da parte della terminazione nervosa (Iversen, 1975)

• la ricaptazione del neurotrasmettitore da parte delle cellule gliali

• la diffusione extra-sinaptica.

Per quanto riguarda il sistema serotoninergico ha particolare importanza il secondo meccanismo, che viene comunemente chiamato "ricaptazione" o re-uptake e avviene per mezzo di trasportatori specifici localizzati sulla membrana del terminale nervoso presinaptico. Si tratta di un processo attivo che richiede energia, è saturabile, è sodio e temperatura dipendente e viene

inibito da farmaci specifici (Ross, 1982). Una volta che il neurotrasmettitore si trova nel citoplasma, può essere trasferito nelle vescicole sinaptiche ad opera del trasportatore vescicolare o venire metabolizzato.

Ricordiamo che i trasportatori di membrana e vescicolari, pur avendo una struttura terziaria simile, differiscono sia dal punto di vista molecolare che farmacologico. E' interessante notare come questo meccanismo consenta un notevole risparmio energetico rendendo, inoltre, la terminazione nervosa relativamente indipendente dal corpo cellulare anche durante periodi di intensa attività secretoria.

La super-famiglia dei trasportatori di membrana è composta almeno da due famiglie. La prima è rappresentata da trasportatori per gli aminoacidi eccitatori (aspartato, glutammato) e necessita per funzionare del co-trasporto di Na+ e del contro-trasporto di K+. La seconda è formata invece dai trasportatori per le catecolamine, 5-HT, GABA, glicina, taurina ed è dipendente da un cotrasporto di Na+ e Cl-. La direzione e la velocità del trasporto, per entrambi i tipi di trasportatore, dipendono dal gradiente di Na+; il trasporto può quindi rallentare o perfino invertirsi durante la depolarizzazione o a causa dell'inibizione della pompa Na+/K+ ATPasica che determina il

mantenimento del gradiente del Na+ tra interno ed esterno della cellula.

Vi sono alcune condizioni in cui i trasportatori lavorano in maniera inversa, estrudendo i neurotrasmettitori anziché ricaptarli, in particolare:

a) quando aumenta la concentrazione dei neurotrasmettitori nel citoplasma;

b) quando si verifica una diminuzione del gradiente di Na+;

c) quando nello spazio sinaptico è presente un'alta concentrazione di un substrato che può essere trasportato dallo stesso trasportatore.

In questo caso non solo possiamo assistere a fenomeni di contro-trasporto, ma possiamo avere anche spiazzamenti a livello vescicolare del neurotrasmettitore a favore della nuova sostanza. Molti trasportatori sono stati clonati, ma non si è ancora stabilita precisamente la loro struttura terziaria.

Essi sono caratterizzati da 8-12 domini transmembranari, domini extra ed intracellulari e da regioni ristrette e variabili che conferiscono specificità per il neurotrasmettitore; inoltre si rileva un'elevata omologia nelle catene transmembranarie 1-2 e 4-8, ciò

indica l'importanza di queste regioni nella funzione di trasporto (Amara e Kuhar, 1993).

Il trasportatore della 5-HT (SERT) è stato clonato e sequenziato nel cervello di ratto (Blakely e coll., 1991), nelle cellule di coriocarcinoma placentare (Ramamoorthy e coll., 1993 a), nel cervello umano (Lesch e coll., 1993 a) e nelle piastrine (Lesch e coll., 1993 b).

Esso è rappresentato da un polipeptide di 630 aminoacidi, con 12 sequenze trasmembrana e peso molecolare pari a 70 KDa. Il processo di re-uptake della 5-HT è strettamente legato alla presenza di ioni Na+ e Cl-.

Esistono delle tappe obbligate di legame sulla proteina "carrier". Il complesso molecolare di trasporto è paragonabile ad un canale ionico che lega prima il Na+, poi la 5-HT, infine il Cl-; il Na+ è importante nella fase di captazione dell'amina dall'ambiente extracellulare e il Cl- ha un ruolo essenziale nel trasferimento della 5-HT nell'ambiente intracellulare. Questi legami causano delle modificazioni steriche del trasportatore, che provocano la liberazione dei tre componenti all'interno della cellula. A questo punto il trasportatore libero lega uno ione K+, che permette la nuova esposizione del canale al mezzo extracellulare. Una volta che

si è distaccato il K+ il sistema è pronto ad effettuare un altro ciclo (Humphreys e coll., 1991; Kanner, 1987; Marcusson e Ross, 1990). Molti composti psicoattivi, come gli antidepressivi triciclici (TCA) e gli inibitori selettivi del re-uptake della 5-HT (SSRI) (Garattini e Samanin, 1988; Marsden, 1991) quali paroxetina, fluoxetina, sertralina, fluvoxamina, citalopram e escitalopram, riconoscono come bersaglio primario il sistema di trasporto della 5-HT bloccandolo e favorendo così un aumento delle concentrazioni intra-sinaptiche di 5-HT.

Esperimenti di binding effettuati con imipramina triziata (3H-IMI) hanno evidenziato l'eterogeneità di questi siti di legame collegati al meccanismo del re-uptake della 5-HT (Sette e coll., 1983). La 3 H-IMI si lega, infatti, ad almeno due siti presenti nelle membrane cerebrali: uno ad alta affinità ed uno a bassa affinità. Il primo, di natura proteica e Na+-dipendente, corrisponderebbe al sito di trasporto della 5-HT e ad esso si legherebbero TCA e SSRI; il secondo, non proteico, forse lipidico, Na+-indipendente, potrebbe essere localizzato nella componente lipidica che circonda il trasportatore (Reith e coll., 1984) e non sarebbe implicato nel trasporto della 5-HT.

A causa di questa eterogeneità sono stati ricercati degli spiazzanti più selettivi e la paroxetina triziata (3H-PAR) (Mellerup e coll., 1983; Habert e coll., 1985) è risultata la molecola più idonea. Tale composto ha, infatti, dimostrato un'affinità per il trasportatore 100 volte maggiore rispetto all' 3H-IMI e di possedere un solo sito di legame corrispondente a quello di re-uptake della 5-HT (Marcusson e coll., 1988).

Attraverso metodiche di binding (Laruelle e coll., 1988) e autoradiografiche (Duncan e coll., 1992) è stata valutata la distribuzione del trasportatore; la massima concentrazione è stata rinvenuta a livello della sostanza nera e del corpo striato, comunque notevoli quantità sono state rilevate anche nell'ipotalamo, nel sistema limbico (ippocampo, amigdala e giro cingolato) e corpo striato (putamen e caudato). La sostanza bianca e il cervelletto ne sono quasi sprovvisti.

Nel 1977, Stahl ha descritto le strette somiglianze tra il meccanismo del re-uptake piastrinico e quello cerebrale, studio che ha portato ad utilizzare le piastrine come modello periferico di terminali presinaptici serotoninergici (Stahl, 1977).

Le tecniche di biologia molecolare hanno successivamente permesso la clonazione del trasportatore piastrinico e di verificarne l'identità con quello cerebrale (Lesch e coll., 1993 b).

E’ stato evidenziato che il SERT, sia neuronale che piastrinico, presenta sei siti di fosforilazione: tre per la PKA, attivata dal cAMP, e tre per la PKC (Lesch e coll., 1993 a), attivata dal DAG.

In una linea cellulare di coriocarcinoma placentare umano, nel quale è presente il trasportatore per la 5-HT (Ramamoorthy e coll., 1993 b), è stato rilevato che la somministrazione della tossina colerica o di composti che determinavano, come questa, l'incremento dell'cAMP cellulare causano l'attivazione della PKA con il conseguente aumento del re-uptake della 5-HT (Cool e coll., 1991; Ramamoorthy e coll.,1993 a).

La somministrazione degli esteri del forbolo su una coltura di cellule endoteliali bovine causa invece l'attivazione della PKC e la conseguente riduzione del trasporto della 5-HT (Myers e coll.,1989).

Queste evidenze dimostrano che il sistema di re-uptake della 5-HT, è controllato da due sistemi opposti, quello dell'cAMP e quello del PIP2 tramite la regolazione di due chinasi la PKA, e la PKC.

Sinapsi serotoninergica

1.6 SEROTONINA E PSICOSI .

Già nella prima metà del XX secolo, erano state formulate le prime ipotesi relative alle basi biologiche di alcuni sintomi psicotici, ed era stato sottolineato il rapporto con il sistema serotoninergico, sulla base delle somiglianze strutturali fra la 5-HT e la dietilammide dell’acido lisergico (LSD), sostanza psicotomimetica che produce allucinazioni e deliri sovrapponibili a quelli presenti nelle psicosi funzionali, agendo sulla trasmissione serotoninergica (Shaw e Woolley, 1956). In seguito questa teoria fu soppiantata dall’ipotesi che alla base dei disturbi psicotici esistesse solo un’alterazione del sistema dopaminergico, sulla spinta della sintesi e introduzione nella pratica clinica dei cosiddetti antipsicotici classici (o tipici), neurolettici che bloccano i recettori dopaminergici. Nei decenni successivi, ricerche dirette all’individuazione di nuove molecole attive nel trattamento delle psicosi, hanno portato alla scoperta di nuovi composti detti neurolettici atipici, capaci di bloccare simultaneamente sia i recettori dopaminergici di tipo D2, che i recettori serotoninergici di tipo 5-HT2, e molti altri, dando di nuovo

rilievo all’ipotesi di un coinvolgimento del sistema serotoninergico nella fisiopatologia di alcuni disturbi psicotici. Tale ipotesi è stata

suffragata anche dalla misurazione di parametri serotoninergici nei pazienti; tuttavia si tratta di studi con risultati alquanto controversi. Ohuoha e coll (1993) e Breier (1995), studiando i recettori 5-HT su reperti autoptici di corteccia frontale di pazienti schizofrenici, hanno rilevato un aumento degli stessi, rispetto a campioni di controllo sani. La densità dei recettori 5-HT2A serotoninergici sembra essere

alterata in reperti autoptici cerebrali sia di pazienti schizofrenici che di pazienti suicidi ( Hashimoto e coll., 1993; Hrdina e coll., 1993; Joyce e coll., 1993). Dean e coll. (1999) non hanno rilevato variazioni nella densità dei recettori serotoninergici a livello della corteccia dorsolaterale prefrontale, mentre Piyarat e coll. (2000) hanno dimostrato un aumento dei recettori 5-HT2 nelle stesse aree

cerebrali in pazienti schizofrenici. Esistono quindi dati contrastanti, ma la discordanza può dipendere da svariati fattori, come ad esempio differenze metodologiche nella preparazione delle membrane cerebrali o esiguo numero di soggetti studiati o criteri di selezione dei pazienti molto eterogenei.

A tutt’oggi, la possibilità di avere a disposizione un marker periferico come il SERT piastrinico e linfocitario, identico a quello cerebrale, offre notevoli vantaggi, come la possibilità di studiare casistiche più ampie, la possibilità di prelievi ripetuti nel tempo, la

possibilità di definire eventuali correlazioni tra eventi biologici e caratteristiche psicopatologiche.

I primi esperimenti di binding sulle piastrine umane furono effettuati circa venti anni fa da Langer (1983), che utilizzò la 3 H-imipramina (3H-IMI) per marcare il SERT e riscontrò una diminuizione del numero dei suoi siti recettoriali nei pazienti affetti da depressione. Questi dati sono stati replicati successivamente in molte ricerche e rappresentano dei marker riproducibili nella biologia dei disturbi psichiatrici. Una diminuzione del numero di siti per la 3H-IMI è stata rilevata anche in piastrine ematiche di pazienti affetti da schizofrenia (Meltzer e coll., 1984), da disturbo ossessivo compulsivo (Weizmann e coll., 1986a), da anoressia nervosa (Weizmann e coll., 1986b), da disturbo da attacchi di panico (Marazziti e coll., 1988), e da bulimia (Cash e coll., 1984). L’importanza dello studio dei siti di legame piastrinici per la 3H-IMI è strettamente legata alle relazioni funzionali dei siti stessi con il re-uptake della 5-HT (Briley e coll. 1981; Paul e coll., 1981).

La struttura del sito di legame per la 3H-IMI appare piuttosto complessa, può trovarsi in due configurazioni dette a bassa e ad alta affinità (Conway e coll. 1985).

Il sito ad alta affinità consta di una porzione proteica e Na+ dipendente, corrispondente al sito di trasporto della 5-HT, e di una non proteica, Na+-indipendente, lipofila, la cui funzione è tuttora sconosciuta (Marcusson e coll. 1986).

Ultimamente, per marcare il SERT è stato usato un ligando molto più selettivo la 3H-paroxetina (3H-PAR) che si lega ad un singolo sito, per il quale ha un’affinità 100 volte maggiore rispetto alla 3 H-IMI (Marcusson e coll.,1988). Maguire e coll.(1993) hanno riportato dati su una significativa correlazione tra velocità massima della 14 C-5-HT e capacità massima di legame (Bmax) della 3H-PAR, in 30 soggetti sani.

La 3H-PAR è stata ampiamente utilizzata per studiare il SERT e in molti casi ha permesso di replicare e ampliare i dati già ottenuti con la 3H-IMI. Sono state riportate alterazioni del binding della 3 H-PAR in alcune patologie psichiatriche come nella depressione e nel disturbo ossessivo-compulsivo (Marazziti e coll., 1996). E ancora, è stato riscontrato un aumento significativo nella densità dei siti di legame della 3H-PAR in un gruppo di bambini affetti da autismo, rispetto ad un gruppo di bambini sani di controllo (Marazziti e coll., 2000).

E’ difficile valutare il significato di questi risultati; le modificazioni del SERT potrebbero rappresentare un segno aspecifico del coinvolgimento del sistema serotoninergico, forse correlato a tratti della personalità come l’aggressività, l’ansia e l’umore, o ad aspetti dimensionali presenti anche in situazioni fisiologiche, come l’innamoramento (Marazziti e coll., 1999).

1.7 DISTURBI PSICOTICI

Con il termine “psicosi” si fa riferimento ad una sindrome, ovvero un insieme di sintomi, che può associarsi a diversi disturbi psichiatrici. E’ una condizione in cui le capacità mentali di un soggetto, la risposta affettiva, la capacità di riconoscere la realtà, di comunicare e di vivere relazioni con gli altri sono compromesse. Nel D.S.M-IV i sintomi psicotici possono essere variamente inquadrati tra i disturbi dell’umore, come episodi affettivi con sintomi psicotici, nella schizofrenia e in un gruppo di condizioni dai confini arbitrari che comprende il disturbo schizoaffettivo, disturbo schizofreniforme, psicosi reattiva breve, disturbo delirante, disturbo psicotico indotto e disturbo psicotico non altrimenti specificato. I disturbi psicotici sono caratterizzati da sintomi psicotici. In alcuni casi la loro presenza è necessaria per porre diagnosi, ad esempio di schizofrenia o di disturbo schizofreniforme. In altri casi i sintomi psicotici sono presenti, ma non risultano indispensabili per la diagnosi come nel caso della mania e della depressione.

Classicamente i sintomi psicotici vengono distinti in positivi e negativi:

1) SINTOMI POSITIVI: -Deliri

-Allucinazioni

-Alterazioni del linguaggio e della comunicazione -Comportamenti disorganizzati -Alterazioni psicomotorie 2) SINTOMI NEGATIVI: -Appiattimento affettivo -Ritiro sociale -Passività

-Difficoltà di pensiero astratto -Mancanza di spontaneità -Pensiero stereotipato -Interessi ristretti -Alogia -Abulia -Anedonia -Disturbi dell’attenzione

Le psicosi, inoltre, sono caratterizzate da:

-alterazione della coscienza di malattia o “insight” -alterazioni cognitive

-alterazioni dell’umore

I sintomi negativi sono molto simili a quelli di una sindrome da “ipofrontalità”. E’ stata, infatti, ampiamente documentata una ipoattivazione del lobo prefrontale, anche se molto probabilmente, coesistono alterazioni funzionali ad altri livelli, come le strutture limbiche e il lobo temporale.

I sintomi positivi, invece, sono correlati ad una iperattività delle vie mesolimbiche, di tipo dopaminergico e probabilmente anche con altre strutture, come aree corticali o particolari popolazioni recettoriali come i 5-HT2.

Nel corso degli anni è stata raccolta una grande mole di dati riguardo al coinvolgimento della 5-HT nella fisiopatologia di numerosi sintomi psicotici, seguendo principalmente tre approcci basati su:

1) azione psicotomimetica di molecole con meccanismo d’azione serotonergico

2) alterazione del metabolismo serotoninergico in pazienti psicotici

3) azione di farmaci con meccanismo serotonergico nel ridurre sintomi psicotici spontanei o indotti.

La constatazione degli effetti psicotomimetici della dietilamide dell’ acido lisergico (LSD), descritti per la prima volta da Hoffmann nel 1954, ha dato inizio all’indagine sul ruolo della 5-HT nella genesi delle psicosi. La formulazione iniziale dell’ipotesi serotoninergica prevedeva un deficit neurotrasmettitoriale, partendo dalla considerazione che l’LSD agisce principalmente come antagonista serotoninergico (Gaddum, 1954), espletando questa azione indirettamente, tramite stimolazione degli autorecettori che presentano un’elevata densità a livello dei nuclei del rafe mediale. (Aghajanian e coll., 1968, 1995; Bowers, 1972). Negli anni successivi fu constatato che il bromo-LSD, dotato di sola attività antagonista, non dimostrava effetti psicotomimetici in volontari sani ed in contrasto fu dimostrata un’eccellente correlazione tra l’affinità per il recettore 5-HT2A di numerose molecole ed il loro effetto

allucinogeno nell’uomo (Glennon e coll., 1984). Questi dati portarono alla riformulazione della teoria iniziale, focalizzandosi viceversa su un possibile ipertono serotonergico. I principali

composti dotati di attività allucinogena nell’uomo sono compresi in tre classi: le feniletilamine (mescalina), le indolamine (LSD, psilocibina) e gli antagonisti NMDA (PCP, ketamina). Per quanto riguarda le prime due classi è stato da tempo evidenziato un meccanismo d’azione comune (Glennon e coll., 1984; Glennon, 1990), mentre il ruolo delle molecole ketamina-simili è rimasto a lungo poco chiaro fino a che non è stato evidenziato che i composti bloccanti NMDA aumentano i livelli cerebrali di 5-HT (Carlsson e coll., 1994; Lindefors e coll., 1997; Martin e coll., 1999; Aghajanian e Marek, 2000).

Alcuni lavori hanno evidenziato un aumento dei livelli liquorali del catabolita della 5-HT 5HIAA (Sedvall e Wode-Helgodt, 1980) o un incremento della concentrazione piastrinica ed ematica della 5-HT in pazienti schizofrenici (De Lisi, 1981; Muck-Seler, 1988), esistono, però, anche dati opposti (Gattaz e coll., 1982; Nyback e coll., 1983).

Gli studi di “challenge” con MCPP (m-clorofeniliperazina, agonista diretto dei recettori 5-HT) hanno dimostrato che l’infusione periferica di questo composto in pazienti schizofrenici produce esacerbazione di deliri ed allucinazioni ed una risposta ansiosa più intensa e protratta (Krystal e col., 1993; Owen e coll., 1993).

Inoltre, l’efficacia antipsicotica di molecole ad azione antagonista sui recettori 5-HT3, come l’ondansetron (Eichhorn e coll., 1996), o

sui recettori 5-HT2, come il ritanserin (Wiesel e coll., 1994)

suggerisce il ruolo potenziale di numerosi sottotipi recettoriali.

La più solida evidenza farmacologica del ruolo della 5-HT deriva tuttavia dall’impiego degli antipsicotici atipici. Le prime osservazioni sono legate alla clozapina (Stille e coll., 1971; Simpson e Varga, 1974), la cui farmacodinamica comprende un importante meccanismo d’azione a livello dei recettori 5-HT2 (Iqbal e Van

Praag, 1995): è stato così riscontrato come l’affinità per i recettori 5-HT2 sia da dieci a venti volte superiore rispetto all’affinità dei D2

(Meltzer e coll., 1989). Negli anni ’90 questo particolare profilo farmacodinamico è stato esplorato anche in vivo, valutando l’occupazione recettoriale con tecniche di brain imaging (Farde e coll., 1995, Nordström e coll., 1995, Kapur e coll., 1999). Questi studi hanno tutti confermato un elevato rapporto di occupazione 5-HT2/D2 per tutti gli antipsicotici atipici, pur non concordando sui

rapporti specifici per ciascun farmaco, probabilmente anche in relazione alla differenza delle specifiche tecniche utilizzate. L’azione sui sintomi negativi appare comunque in qualche modo correlata

alla componente di blocco serotoninergico, verosimilmente sui recettori 5-HT2A.

Un’interessante ipotesi di lavoro ha proposto due diversi meccanismi patogenetici: un generale incremento della funzione serotoninergica, implicato nella genesi dei sintomi positivi, e un deficit localizzato a livello prefrontale alla base dei sintomi negativi. In tal senso gli antipsicotici atipici agirebbero come modulatori espletando la loro efficacia su entrambe le dimensioni psicopatologiche (Breier, 1995).

Gli studi più recenti si sono focalizzati sui recettori serotoninergici clonati ultimamente, come i 5-HT6 e i 5-HT7 (Meltzer e coll., 2003).

Molti antipsicotici sia tipici che atipici, testati in vitro con colture cellulari transfettate con il gene che codifica nel ratto per i recettori 5-HT6 e 5HT7, possiedono affinità per questi recettori (Roth e coll.,

1994). Lo studio del polimorfismo per i geni codificanti questi recettori è stato effettuato confrontando soggetti sani, pazienti schizofrenici e pazienti bipolari con manifestazioni psicotiche (Shinkai e coll., 1999; Vogt e coll., 2000; Ohmori e coll., 2001) ma i dati emersi non sono conclusivi per quanto concerne un possibile coinvolgimento dei 5-HT6 e 5-HT7 nelle psicosi.

2. SCOPO DELLA RICERCA

Le strette somiglianze tra il meccanismo di re-uptake della 5-HT piastrinico e linfocitario, e quello cerebrale, hanno portato ad utilizzare le piastrine, e, più recentemente, i linfociti, come modello periferico di terminali presinaptici serotoninergici mediante lo studio del SERT (Stahl, 1977, Marazziti e coll., 1998; 2001).

Vista la mancanza di dati relativi alla funzionalità del SERT nelle psicosi, con la nostra ricerca ci siamo proposti di valutarne la distribuzione e la funzionalità in piastrine e linfociti di soggetti affetti da disturbi psicotici, rispetto ad un gruppo di soggetti sani di controllo. La valutazione del SERT è stata effettuata mediante il binding della 3H-PAR, e mediante l’uptake della 3H-5-HT.

3. MATERIALI E METODI

3.1 SOGGETTI

Sono stati inseriti nel nostro studio 25 pazienti (10 donne e 15 uomini, età media ± D.S. 28± 10 anni; Tab. 1) ricoverati nella Clinica Psichiatrica dell’Ospedale Santa Chiara dell’Università di Pisa.

Le diagnosi, secondo i criteri DSM IV-R erano:

• disturbo bipolare di tipo 1 con tratti psicotici incongruenti (14 pz)

• stato misto (7 pz) • schizofrenia (4 pz)

Nove di questi pazienti seguivano un trattamento farmacologico con:

• antipsicotici: aloperidolo,clorpromazina e olanzapina ( 4 pz) • sali di litio (1 pz)

• benzodiazepine (3 pz) • valproato (1 pz)

La gravità dei sintomi è stata valutata mediante la Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS, Overall, 1962) col punteggio totale (media ± D.S.) di 30 ± 4.

Inoltre, sono stati inseriti nel nostro studio 25 soggetti sani di controllo che non assumevano farmaci psicotropi, con anamnesi personale e familiare negativa per disturbi psichiatrici maggiori. Entrambi i gruppi di soggetti, pazienti e controlli, non presentavano nessun tipo di patologia fisica come dimostrato dagli esami clinici e di laboratorio.

Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio che è stato approvato dal comitato etico dell’Università di Pisa.

SESSO ETA’(media ± D.S)

SOGGETTI SANI 15M, 10F 25 ± 5

PAZIENTI 15M, 10F 28 ± 10

Tab.1

4 pazienti Aloperidolo,Clorpromazina,Olanzapina 1 pazienti Sali di Litio

3 pazienti Benzodiazepine

1 paziente Valproato

3.2 SEPARAZIONE E RACCOLTA DELLE PIASTRINE

A tutti i soggetti digiuni sono stati prelevati 30 ml di sangue venoso, tra le ore 8 e le ore 10 del mattino. Il sangue è stato raccolto in provette di plastica contenenti EDTA come anticoagulante ed è stato centrifugato a 200 x g per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando una centrifuga con rotore flottante. Da tale centrifugazione si è ottenuto il plasma ricco di piastrine (PRP) (fig. 7, A). Il PRP è stato prelevato, centrifugato a 2000 x g per 15 minuti; in questo modo abbiamo ottenuto il plasma completamente libero dalle piastrine, che sono rimaste nel pellet sul fondo della provetta.

Il pellet ottenuto è stato conservato a –80 °C fino al momento dell’utilizzo che comunque non è mai stato superiore alle 2 settimane.

1. Raccolta di 30 cc di sangue 2. Centrifugazione a 200 x g _{per 20 min.} Otteniam la separazione del plasma ricco di piastrine

(PRP) (A), dallerestanti componenti cellulari (B)

3. Prelievo del PRP 4. Centrifugazione a 2000 x g per 15 min. Otteniamo il “pellet” di piastrine

A

A

A

A

B

B

B

B

A

A

A

A

3.3 PREPARAZIONE DELLE MEMBRANE PIASTRINICHE

Il pellet di piastrine è stato sospeso con 8 ml di tampone T1 (Tris/HCl 5 mM, pH 7,4 ) contenente gli inibitori delle proteasi (Benzamidina 160 µg/ml; Bacitracina 200 µg/ml; Inibitori della tripsina 20 µg/ml) ed è stato vorticato, mantenendo la soluzione in ghiaccio, omogeneizzato con Ultraturrax e centrifugato a 48000 x g per 15 minuti a 4°C. Il precipitato (P1) ottenuto è stato sospeso con tampone T2 (Tris/HCl 50 mM, pH 7,4) contenente gli inibitori delle proteasi, omogeneizzato con Ultramax e centrifugato a 48000 x g per 15 minuti a 4°C. Scartato il sovranatante, il precipitato (P2) contenente le membrane piastriniche è stato sospeso con tampone T3 (Tris/HCl 50mM, KCl 5mM, NaCl 120mM, pH 7,4) omogeneizzato con Ultraturrax e nuovamente centrifugato a 48000 x g a 4 °C per 15 minuti. Subito dopo la preparazione, un’aliquota di membrane piastriniche è stata utilizzata per la determinazione della concentrazione proteica. Le membrane sono state congelate a -80°C e successivamente utilizzate per i saggi di binding radioattivo.

3.4 SEPARAZIONE E RACCOLTA DEI LINFOCITI

Una volta effettuata la separazione del PRP (vedi par. “separazione delle piastrine”), la restante parte (Fig. 7, B) è stata diluita 1:1 con Emagel . Dopo 40 min. gli eritrociti sono precipitati, mentre i linfociti e i granulociti sono rimasti in sospensione nel sovranatante (Fig. 8, C). Il sovranatante è stato prelevato, diluito 1:5 con soluzione fisiologica, aliquotato e stratificato su 3 ml di Lymphoprep. Dopo questo passaggio, i campioni sono stati centrifugati a 800 x g per 20 minuti a temperatura ambiente, utilizzando una centrifuga a rotore ad angolo mobile. Da tale centrifugazione è stato ottenuto un anello linfomonocitario all’interfaccia tra plasma (parte superiore) e Lymphoprep (parte inferiore). L’anello linfomonocitario è stato prelevato da ciascun campione, riunito e diluito con soluzione fisiologica fino a circa 10 ml. I campioni sono stati centrifugati a 1600 x g per 10 minuti, il sovranatante è stato rimosso ed i linfociti così ottenuti sono stati riuniti in un’unica provetta, sospesi in circa 10 ml di soluzione fisiologica e centrifugati a 400 x g per 5 minuti. Questa ultima operazione di lavaggio, è stata eseguita per due volte. Al termine

del secondo lavaggio, dopo rimozione del sovranatante, è stato ottenuto il pellet dei linfociti.

5. La restante parte (B) viene diluita con Emagel in rapporto 1 : 1

6. Dopo 40 min. gli eritrociti precipitano, mentre i linfociti e i granulociti rimangono in sospensione nel sovranatante (C) 7. Il sovranatante (C) viene raccolto e stratificato su 15 cc di Lymphoprep 8. Centrifugazione a 1000 x g per 30 min. Otteniamo un “anello” di linfociti ed un “pellet” di granulociti pellet di granulociti “anello” di linfociti

C

C

C

C

B

B

B

B

C

C

C

C

Separazione dei linfociti

3.5 PREPARAZIONE DELLE MEMBRANE LINFOCITARIE

I pellet di linfociti sono stati sospesi 1:10 in tampone ipotonico (T1) Tris-HCl 5mM a pH=7.4 contenente gli inibitori delle proteasi (Benzamidina 160 µg/ml; Bacitracina 200 µg/ml; Inibitori della tripsina 20 µg/ml).

La sospensione cellulare ottenuta, è stata omogeneizzata con Ultraturrax al fine di lisare le cellule.

Successivamente, dopo centrifugazione dell’omogenato a 48000 x g per 15 minuti, a 4ºC è stato eliminato il sovranatante, e le membrane cellulari ottenute sono state sospese in uno stesso volume di tampone (T2) Tris-HCl 50mM pH=7.4, addizionato di inibitori delle proteasi, e centrifugate nuovamente.

Infine eliminato il sovranatante le membrane cellulari sono state centrifugate in presenza del tampone T2 senza gli inibitori delle proteasi, nelle stesse condizioni. Subito dopo la preparazione, un’aliquota di membrane linfocitarie è stata utilizzata per la determinazione della concentrazione proteica.

Le membrane cellulari sono state congelate a -80°C e successivamente utilizzate per i saggi di binding radioattivo.

3.6 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA

Per la determinazione della concentrazione proteica nelle membrane è stato seguito il metodo colorimetrico di Lowry modificato da Peterson (1977): questo si basa sull’utilizzo del reattivo di Folin Ciocalteau’s che reagisce con i gruppi fenolici delle tiroxine contenute nelle proteine producendo, in presenza di ioni rameici, una colorazione blu/porpora la cui intensità è misurabile mediante uno spettrofotometro.

La determinazione della quantità proteica prevede l’uso delle seguenti soluzioni:

1) Folin A: carbonato di sodio 2% + idrossido di sodio 1% in acqua bidistillata;

2) Folin B: solfato rameico 0,5%+ sodio citrato 1% in acqua bidistillata;

3) Folin C: soluzione preparata al momento dell’uso unendo in rapporto 1:50 le soluzioni 1 e 2;

4) Folin Ciocalteau’s: diluizione 1:1 con acqua bidistillata della preparazione commerciale;