Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale
FACOLTÀ DI SCIENZE
MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN FISICA
Relatore: Prof. Tullio Scopigno
Correlatore: Dott.ssa Abigail Nunn Candidato: Saltarelli Francesco
Introduzione
Attraverso degli script in ambiente Matlab andremo ad analizzare la disposizione di tali goccioline seguendo le fasi indicate:
1. Acquisizione
2. Processing
• Threshold e Watershed
• Identificazione delle gocce in 3D
3. Calcolo funzione di distribuzione radiale
• Problema PBC
• Test su simulazione LJ
•
Negli epatocit vi può essere un accumulo anomalo di lipidi sotto forma di goccioline:
• dovuto a patologie (steatosi
epatica, cancro)
• indotto esternamente (acido oleico,
entinostat)
Diffusione a singolo fotone da parte di una molecola:
• Elastica → Rayleigh • Anelastica → Raman
Diffusione a più fotoni:
• CARS (Coherent Anti-Stokes
Raman Scattering):
Nei lipidi si sfrutta la riga vibrazionale di stretching del legame a:
•
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisiteSchema microscopio invertto CARS
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisiteStack di immagini associato ad una cellula
(trattamento: acido oleico + entinostat)
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
Nella fase di processing otteniamo dallo stack di immagini acquisite al microscopio posizione e area di ogni goccia per ogni layer
Threshold: si fissano due soglie, i pixel con
un'intensità al loro interno rappresentano il segnale, gli altri lo sfondo nero
Watershed: divide le gocce rimaste unite
cercando il loro centro e dilatandolo finche’ incontra un’altra goccia o raggiunge il limite della goccia stessa a cui il centro appartiene
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
Algoritmo interno Fiji: si fissa
una soglia di threshold uguale per l’intero stack e poi si esegue il watershed
3D Iteratve Thresholding plugin: sceglie una soglia di
threshold diversa per ogni goccia seguendola sull’intero stack di immagini e tiene quella che massimizza il volume
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacità di distinguere le gocce e stimarne le dimensioni
Inseguimento di una goccia:
Dato un certo layer e su di esso una goccia si va a calcolare per ogni goccia sul layer seguente più interno la quantità:
Le gocce e sono identificate come la stessa su layer diversi se:
•
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identficazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisiteMappa delle gocce di lipidi in una cellula
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identficazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisiteLa funzione di distribuzione radiale in un sistema di particelle, descrive come varia la densità in funzione della distanza da una particella presa come riferimento
•
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite→ con distanza fra i
centri delle particelle
Nel caso di volume finito possiamo:
• tenere conto del volume
effettivo in cui cerchiamo vicini per le particelle al bordo;
• introdurre PBC (minimum
image convention)
Ciò non è applicabile al caso delle cellule dove il bordo non è ben definito FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
per particelle puntiformi uniformemente distribuite:
• con PBC → costante al valore 1
• senza PBC → decadimento anomalo, previsto
analiticamente tenendo presente l’area effettiva dove vengono cercati vicini per le particelle al bordo
•
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite � � ¿ ¿ � � ¿ ¿ � � ¿ ¿ � � ¿ ¿ cos− 1 ¿ 3 4 −¿ ¿ cos− 1 ¿ 1 −¿ ¿ ¿ 2� ⋅(��− 2� )⋅(1 − �1 )+(��− 2� )⋅(�� − 2�� )+¿+4⋅ ∬ � < � � < � �2+�2>�2 ❑ ¿ ����� 2� (� )= 1 ��⋅ �� ⋅¿Per particelle che evolvono in un certo volume potremo correggere la ottenuta senza PBC detta , calcolando la ossia la per particelle puntiformi disposte uniformemente nello stesso volume:
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
Nel caso delle cellule resta il problema di definire un’area effettiva, ossia una zona dove la distanza fra le gocce è paragonabile alle dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo l’immagine in rettangolini e stabilendo una densità di soglia
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
calcolata in 2D
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FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisitecalcolata in 3D
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisitecalcolata in 3D
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisiteFASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
FASI DELL’ANALISI: 1. Acquisizione 2. Processing • Threshold e Watershed • Identificazione delle gocce in 3D 3. Calcolo funzione di distribuzione radiale • Problema PBC • Test su simulazione LJ • Correzione / 4. Applicazione a immagini acquisite
