Sviluppo e validazione di un metodo basato su microcampionamento e UHPLC-MS/MS per il monitoraggio terapeutico del Cannabidiolo.

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Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN CHIMICA ANALITICA

Sviluppo e validazione di un metodo basato su

microcampionamento e UHPLC-MS/MS per il

monitoraggio terapeutico del Cannabidiolo

Relatore interno: Dott. Tommaso Lomonaco Relatore esterno: Dott.ssa Giuliana Cangemi Controrelatore: Prof.ssa Maria Perla Colombini

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Indice

RIASSUNTO ... 4

CAPITOLO 1 ... 5

I

... 5

1.1

L

... 6

1.2

I

C

... 8

1.3

F

... 9

CAPITOLO 2 ... 12

S

’

... 12

2.1

C

... 12

2.2

M

(TDM-

T

D

M

) ... 14

2.3

M

TDM ... 16

2.4

C

(HPLC) ... 18

2.5

S

... 19

2.6

LC-MS/MS ... 20

2.7

M

THC

CBD

... 23

2.9

M

:

... 27

2.10

M

-

... 29

2.11

M

:

V

A

M

-S

(VAMS) ... 32

2.12

S

... 33

CAPITOLO 3 ... 35

M

M

... 35

3.1

R

... 35

3.2

P

... 35

3.3

P

... 36

3

3.5

S

UHPLC-MS/MS

THC

CBD

CAMPIONATO MEDIANTE

VAMS. ... 37

CAPITOLO 4 ... 42

R

... 42

4.1

O

UHPLC-MS/MS ... 42

4.2

P

... 51

4.3

V

EMA

(E

M

A

) ... 54

4.4

C

... 66

CAPITOLO 5 ... 72

C

... 72

CAPITOLO 6 ... 73

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Riassunto

Negli ultimi anni, l’analisi dei principi attivi della cannabis per il monitoraggio terapeutico del farmaco (TDM) è divenuta sempre più attraente alla luce della possibilità di creare una terapia specifica per ciascun paziente. I metodi analitici impiegati per il monitoraggio terapeutico dei farmaci devono garantire elevata specificità, accuratezza e riproducibilità al fine di misurare una vasta gamma di analiti in diverse matrici complesse anche in presenza di interferenti, il tutto in tempistiche d’analisi accettabili. Recentemente, la determinazione quantitativa dei cannabinoidi avviene mediante l’uso di metodi analitici basati sull’analisi di cromatografia ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (UHPLC-MS/MS), strumentazione che garantisce specificità, precisione e accuratezza nel risultato finale. Tale procedura d’analisi è considerata come metodo “gold standard” per la determinazione di tali analiti.

Il TDM presenta numerosi vantaggi, pur portando con sé una serie di punti sfavorevoli. In primo luogo la necessità di sottoporre periodicamente il paziente ad un trattamento invasivo: il prelievo ematico. Ponendo poi particolare attenzione ai pazienti pediatrici, questa procedura può addirittura risultare per certi versi “traumatica”, per tale ragione potrebbe essere utile la valutazione dell’uso di un micro-campionamento non invasivo.

Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare e validare un metodo UHPLC-MS/MS, seguendo le linee guida dell’European Medicines Agency, che permetta di determinare quantitativamente i principi attivi della cannabis, Δ9-Tetraidrocannabinolo (THC) e Cannabibiolo (CBD) su, sangue intero campionato mediante dispositivi Volumetric Absorptive

MicroSampling (VAMS).

Il presente lavoro di tesi è stato svolto grazie alla collaborazione con l’Istituto Giannina Gaslini, che è il centro di riferimento per la regione Liguria riguardo il trattamento di pazienti pediatrici mediante Cannabis terapeutica. Questi ultimi presentano spesso condizioni cliniche complesse, quali epilessie farmacoresistenti.

La possibilità dunque di poter effettuare un campionamento non invasivo, che sia inoltre di facile applicazione, può sicuramente garantire migliori condizioni di tollerabilità terapeutica nel paziente pediatrico.

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Capitolo 1

Introduzione

La cannabis, anche nota come canapa, è una pianta erbacea originaria dell’Asia centrale, appartenente alla famiglia delle Cannabinacee. Sin dal IX secolo a.C. tale arbusto veniva utilizzato per la produzione di fibre tessili e pertanto cominciò ad essere coltivato in Asia e Medio Oriente, fino ad espandersi in Europa. Dal periodo delle Repubbliche marinare fino all'avvento delle navi a carbone, l’Italia è stata, con Bologna e Ferrara, uno dei distretti più importanti per la coltivazione della Cannabis sativa, per poi diventare il primo fornitore della fibra di canapa in favore della Marina Reale Britannica. Con il passare degli anni si iniziarono a scoprire e studiare i diversi effetti stupefacenti della pianta sull’organismo umano, e per arginarne l’uso improprio, vennero introdotte leggi che ne contrastassero anche l’applicabilità industriale. Ad oggi, il numero di sostanze note contenute nelle infiorescenze femminili della Cannabis è in continuo aumento e riguardo alcune di queste, non è ancora conosciuto l’effetto; ciò che risulta essere ben noto sono gli effetti psicotropi sul sistema nervoso da parte dei fitocannabinoidi. Una delle principali molecole attive appartenente a quest’ultima classe, è il Δ9-tetraidrocannabinolo, anche definito come THC o Δ9-THC. Sono oggetto di studi anche il cannabidiolo e il cannabinolo, denominati rispettivamente CBD e CBN. La concentrazione di tali composti varia moltissimo da una specie all'altra di Cannabis, dipendendo oltre che dal tipo di coltura, anche dalle condizioni del suolo, dalla presenza di contaminanti e da molti altri fattori ambientali come temperatura e umidità.

L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha definito come psicoattive tutte quelle sostanze che, una volta assunte, sono in grado di modificare l’equilibrio psicofisico di un individuo, il suo umore e le sue attività mentali. Queste sostanze, oltre ad essere presenti sul mercato illegale come mezzo da “sballo”, vengono utilizzate a scopo curativo nell’ambito medico-farmacologico. A questo proposito, per l’effetto che generano sul sistema nervoso, i medicinali ad azione stupefacente o psicotropa vengono impiegati nella terapia del dolore ed il loro uso è attualmente regolato dalla legge n. 12 del 8 febbraio 2001, e dalla successiva legge n.38 del 15 marzo 2010(A)_.

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1.1 Legislazione italiana in materia di sostanze stupefacenti

In ambito internazionale, la prima regolamentazione sull’uso delle sostanze stupefacenti si ottenne con la Conferenza Internazionale dell’Aja (23 gennaio 1912), dove venne emanata la prima “Convenzione Internazionale dell’oppio” che entrò in vigore in Italia nel 1922, con la limitazione che fu però ad esclusiva regolamentazione dell’oppio e suoi derivati.

La prima legge promossa dallo stato italiano in tema di stupefacenti fu la n. 396 del 18 febbraio 1923, con la quale veniva inoltre regolamentato anche il commercio autorizzato di alcune sostanze. Successivamente, con l’entrata in vigore del Codice penale nel 1931, le sostanze stupefacenti assunsero un’autonomia concettuale e di disciplina; venne quindi introdotto il reato di spaccio e di abuso di sostanze psicotrope. In seguito, con la legge n. 1041 del 22 ottobre 1954, l’intera materia fu sottoposta a revisione, senza operare distinzione a livello penale tra venditore e consumatore. Con la legge del 1975 l’uso non terapeutico veniva valutato in termini di “modica dose” per differenziare il semplice consumo dallo spaccio. Alcune carenze della legge 685/75 portarono alla promulgazione della legge n. 162 del 26 giugno 1990, armonizzata con altri decreti in materia di stupefacenti nel Testo Unico del 1990, D.P.R. n. 309 del 9 ottobre 1990 “Testo unico delle leggi in materia di disciplina degli stupefacenti e sostanze psicotrope, prevenzione, cura e riabilitazione dei relativi stati di tossicodipendenza”. In quest’ultimo documento tutti gli stupefacenti e le sostanze psicotrope vennero iscritti in cinque tabelle, periodicamente aggiornate ogni qualvolta si presenti la necessità di inserire una nuova sostanza, di variarne la collocazione o di provvedere ad una eventuale cancellazione(B).

In sintesi, le argomentazioni delle tabelle sono le seguenti:

● Tabella I: sono comprese le sostanze, indipendentemente dalla distinzione tra stupefacenti e sostanze psicotrope, con potere tossicomanigeno ed oggetto di abuso;

● Tabella II: sono inserite le sostanze che hanno attività farmacologica e pertanto sono usate in terapia (farmaci). La tabella II è suddivisa in cinque sezioni indicate con le lettere A, B, C, D ed E dove sono distribuiti i farmaci in relazione al decrescere del loro potenziale di abuso;

● Tabella III: contiene i Barbiturici;

● Tabella IV: raggruppa le sostanze di impiego terapeutico; per le quali sono state accertati concreti pericoli di induzione di dipendenza, di intensità minori rispetto a quella delle sostanze elencate nelle prime due tabelle;

7 ● Tabella V: preparazioni contenenti le sostanze elencate nelle tabelle sopracitate che per le

modalità di impiego e dosi non comportano rischi d’abuso;

Una significativa modifica al D.P.R. 309/90 fu in seguito apportata con la legge n. 49 del 21 febbraio 2006. Successivamente, con il decreto redatto dal Ministero della Salute del 20 gennaio 2013, viene aggiornata la tabella II, sezione B in cui vengono inseriti “i medicinali di origine vegetale a base di Cannabis (sostanze e preparazioni vegetali, inclusi estratti e tinture)”. Negli ultimi anni si sono susseguiti diversi aggiornamenti del D.P.R. 309/90 per le diverse tabelle; l’ultimo riguarda la tabella IV con il Decreto del 12 luglio 2018 (A)_.

È importante valutare l’aspetto delle normative vigenti per quanto riguarda la vendita di tali sostanze. I medicinali si possono classificare in due gruppi; medicinali prodotti dall’industria, regolamentati con la normativa D.L. 219/06, e medicinali allestiti in farmacia (preparazioni magistrali galeniche), disciplinati dal Testo Unico delle Leggi Sanitarie (TULS) e dal Regio Decreto (R.D.) del 30/09/1938. In seguito, con il Decreto del 9/11/2015, si stabilisce la necessità di effettuare la titolazione dei principi attivi per ciascuna preparazione magistrale a base di Cannabis medicinale.

Fino ad oggi, per la realizzazione delle preparazioni magistrali con prodotti vegetali a base di cannabis, venivano importati in Italia solo i prodotti commercializzati dall’Office of Medicinal cannabis (organismo olandese per la cannabis) del Ministero olandese della Salute, welfare e sport, secondo la procedura per l’importazione prevista dal DM 11/2/97.

Nel 2016, il nostro Paese ha avviato una produzione nazionale di cannabis per uso medico presso lo Stabilimento chimico farmaceutico militare di Firenze (SCFM), grazie alla collaborazione tra il Ministero della salute e il Ministero della difesa, in modo da garantire l’accesso a tali terapie a costi adeguati e in modo sicuro.

Si tratta del prodotto Cannabis FM-2 (contenente THC 5% - 8% e CBD 7,5% - 12%), prima sostanza attiva a base di cannabis prodotta in conformità alle direttive europee in materia di medicinali (EU - GMP) su processo produttivo depositato e controllato, in una officina farmaceutica autorizzata dall’AIFA e la cui distribuzione è autorizzata dall’Organismo statale per la cannabis presso il Ministero della salute. Dal luglio 2018 è disponibile anche la varietà Cannabis FM-1, contenente THC 13,0-20,0% e CBD<1%.

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1.2 I Cannabinoidi

La cannabis contiene molte sostanze che nell'insieme rappresentano il fitocomplesso della pianta. Quest’ultimo risulta essere costituito da oltre 700 sostanze tra cui cannabinoidi, terpeni, flavonoidi, alcaloidi e clorofille. Come anticipato in precedenza solo i cannobinoidi sono responsabili dell’effetto psicotropo sull’organismo umano. Sono oltre settanta le molecole appartenenti a tale classe e molte delle quali ancora poco studiate. Di tutte queste il THC può esserne definito come il capostipite.

Nel 1964 presso l’Istituto Weizann, il biologo e chimico Raphael Mechoulan, insieme a Yechiel Gaoni e Habib Edery, ha isolato per la prima volta la molecola del THC (Fig. 1, a). Questo traguardo ha portato ad una svolta nell’ambito medico, portando ad un sensibile incremento riguardo lo studio sulle possibili applicazioni della molecola e sulla sua farmacocinetica.

La seconda sostanza più abbondante nella Cannabis è il CDB (Fig. 1, b), che a differenza del THC non è psicoattiva; ma possiede effetti sedativi, ipnotici, anticonvulsivanti, antidistonici, antiossidanti e antinfiammatori.

Figura 1: Struttura molecolare del Δ9-Tetraidrocannabinolo (A) e del Cannabidiolo (B)

Nel momento in cui un soggetto fa uso di cannabis, la presenza contemporanea del THC e CBD, genera sull’organismo il così detto “effetto entourage”, ovvero la presenza dell’una esalta le qualità positive dell’altra e viceversa.

Il THC, assieme al CBD viene classificato tra i tarpenofenoli C21, privi di atomi di azoto e ad elevata lipofilicità. Queste molecole non sono presenti nella pianta come tali, ma sotto forma di acidi denominati rispettivamente acido tetra-idrocannabinoilico (THC-A) e acido cannabidiolico (CBD-A).

9 Queste forme acide non sono farmacologicamente attive, quindi per poter apprezzare effetti psicoattivi sul sistema nervoso è necessario sottoporle ad una reazione di decarbossilazione.

L’attivazione per decarbossilazione (Fig. 2) consiste nel sottoporre la Cannabis ad elevate temperature (T >100°C), in modo tale che il gruppo carbossilico presente nella forma inattiva del cannabinoide venga eliminato sotto forma di anidride carbonica, generando così la sua corrispondente forma attivata.

Figura 2: Reazione di decarbossilizzazione dell’acido tetra-idrocannabinoilico (THC-A) e dell’acido cannabidiolico (CBD-A)

1.3 Farmacodinamica e modalità di assunzione

Per poter spiegare la farmacocinetica di tali sostanze all’interno del nostro organismo bisogna effettuare un’introduzione al sistema endocannabinoide (ECS); presente nel corpo umano e nella maggior parte delle specie animali. Tale sistema raggruppa i recettori (CB1 e CB2) e tutte quelle sostanze endogene come l’Anandamide e 2-arachidonoglicerolo (2-AG) definite come endocannabinoidi. Il sistema endocannabinoide è presente in ogni tessuto dell’organismo, svolgendo compiti differenti seppur con il medesimo obiettivo: l’omeostasi. L’omeostasi altro non è che l’attitudine propria degli organismi viventi, siano essi cellule, individui singoli o comunità, a mantenere in stato di equilibrio le proprie caratteristiche al variare delle condizioni esterne: essendo il vivente un sistema aperto, il mantenimento delle condizioni interne è effettuato da meccanismi automatici (dispositivi omeostatici) che regolano il flusso continuo di materiali ed energia attraverso il sistema stesso. Nello specifico tale sistema agisce sulla regolazione di una grande varietà di processi sia fisiologici che cognitivi come l’appetito, la sensazione di dolore o l’umore.

10 I recettori dell’ECS sono presenti in tutto il corpo, incorporati nelle membrane cellulari con distribuzione diverse; il CB1, scoperto nel 1990, è altamente localizzato nel sistema nervoso centrale e periferico mentre il CB2, scoperto nel 1993, è distribuito principalmente nel sistema immunitario. Il THC è un agonista parziale di entrambi i recettori ed è il responsabile degli effetti psicoattivi della cannabis per la sua azione sul recettore CB1; inoltre il THC agisce anche su altri recettori non CB e su altri target quali cationici ed enzimi con potenziali effetti antidolorifici, antiemetici e stimolanti per l’appetito. Il CBD manca di psicoattività poiché sembra non legarsi né ai recettori CB1 né ai recettori CB2 in concentrazione apprezzabili, ma influenza l’attività di altri target quali canali ionici recettori ed enzimi con un potenziale effetto antinfiammatorio, analgesico, ansiolitico ed antiepilettico. Il THC e il CBD quando vengono assunte entrano in relazione con il sistema endocannabinoide del nostro corpo legandosi ai recettori CB1 e CB2, sostituendosi ai legandi endogeni prodotti naturalmente dall’organismo (Fig 3).

Figura 3: Rappresentazione semplificata del recettore CB1 posto sui neuroni e relativa interazione con il THC.

Indipendentemente dell’uso medico o ricreazionale, le proprietà farmacocinetiche della cannabis variano in funzione della dose assunta e della modalità di assunzione. Ad esempio, la Cannabis utilizzata a scopo voluttuario viene assunta sotto forma di fumo, oppure vaporizzata o ingerita. Per quanto riguarda l’uso medico, le preparazioni magistrali di Cannabis possono essere assunte sotto forma di decotto e olio, oppure eventualmente inalate attraverso vaporizzatori specifici.

11 Il tempo che intercorre fra il momento dell’assunzione e quello della manifestazione dei primi effetti fisici e psichici varia in base alla metodica di somministrazione. Infatti, quando la Cannabis viene inalata, è possibile iniziare ad apprezzarne i sintomi decorsi i primi 15 minuti; se invece viene ingerita gli effetti sono ritardati, primi sintomi tra 30 e 90 minuti, con picchi massimi anche dopo 3-4 ore dall’assunzione.

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Capitolo 2

Stato dell’arte

La Cannabis, oltre al suo impiego per scopi meramente ludici, viene utilizzata come farmaco in pazienti affetti da gravi malattie, quali epilessie farmaco resistenti, sindrome di Parkinson, malattie infiammatorie intestinali (IBD) e sclerosi multipla. Grazie al suo meccanismo di azione, le applicazioni della Cannabis sono molteplici. In letteratura sono varie le ricerche in cui viene descritta l’applicazione della cannabis terapeutica, ma è possibile imbattersi anche in articoli che riportano l’uso del Nabiolone e del Dronabinol, derivati sintetici del THC. Entrambe le forme sono state approvate, nel 1985, dalla Food and Drug Administration (FDA) per la diminuzione di vomito e nausea in pazienti sottoposti a chemioterapia. Nel 1992 il Dronabinol è stato anche approvato per la gestione dell’anoressia in pazienti con HIV/AIDS e come antiemetico e stimolante dell’appetito in pazienti pediatrici affetti da cancro1_{. Tra gli anni ’70}

e ’80 gli antiemetici più in uso nelle chemioterapie erano la proclorperazina, la metoclopramide, l’aloperidolo e la clorpromazina, ma durante questo stesso periodo, vari studi hanno valutato gli effetti antiemetici e l’efficacia del Nabiolone e del Dronabinol2_{. In letteratura oltre agli studi}

elencati in precedenza, sono presenti anche elaborati che valutano l’efficienza dell’uso terapeutico della Cannabis sativa in pazienti affetti da cancro3. Nel 2019 Ofrir et al4 riporta l’esperienza di un gruppo di 50 pazienti pediatrici tra bambini e adolescenti a cui viene somministrata cannabis terapeutica al fine di attenuare gli effetti della terapia antitumorale, come parte integrante della cura. La cannabis è stata fornita sotto forma di estratto di olio da somministrare per via orale e/o sotto forma di fumo da vaporizzare.

La cannabis è stata generalmente ben tollerata nella maggior parte dei pazienti e circa l’80% dei casi ha segnalato effetti positivi. Solo un gruppo ristretto di soggetti (10%) ha riportato una tossicità e ha mostrato reazioni avverse quali bruciore alla gola e attacchi d’ansia, quest’ultimo effetto riscontrato solo nei pazienti che hanno scelto la vaporizzazione del prodotto.

Il restante 10% non ha riscontrato effetti positivi, descrivendo quindi una situazione inalterata da quando ha iniziato l’assunzione della cannabis.

13 Altre ricerche più recenti riportano che l’uso della cannabis, nello specifico olio di CBD, migliora le condizioni di vita dei pazienti affetti da malattie infiammatorie intestinali (IBD), come il morbo di Chron e la colite ulcerosa 5,6.

L’ambito clinico in cui la cannabis terapeutica viene ampiamente utilizzata riguarda le malattie muscolari, neurodegenerative e neurologiche come sindrome di Parkinson 7–9, sclerosi multipla7 ed epilessia10. In tutti gli studi citati le popolazioni di pazienti interessate dichiarano di avere potuto apprezzare miglioramenti significativi sulla qualità della vita, segnalando una percezione dei livelli di disabilità inferiore.

Agli inizi, l’utilizzo della Cannabis in ambito medico era limitato alla terapia del dolore ma con il passare degli anni, grazie a diversi studi e trial clinici, l’impiego di tale sostanze si è ampliato, anche se la sua prescrizione (Bedrocan, Bediol), o quella di farmaci con medesimi principi attivi (ad esempio Sativex, Epidiolex), viene ancora valutata dai clinici come ultima possibilità, a causa degli effetti indesiderati non ancora del tutto approfonditi dalla comunità scientifica.

Molti sono i gruppi di ricerca che si sono occupati del trattamento di pazienti pediatrici affetti da epilessia farmaco resistenti.

Le epilessie infantili di questo tipo sono caratterizzate da convulsioni frequenti, ritardi nello sviluppo neurologico e una qualità di vita compromessa. Alcuni studi hanno dimostrato che circa l’84% dei pazienti pediatrici trattati con Cannabis ha riportato una riduzione della frequenza delle crisi; nello specifico l’11% ha riferito una completa libertà convulsiva, il 42% ha riportato una riduzione maggiore dell’80% delle crisi e solo il 32% ha riscontrato una riduzione del 25-60%10.

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2.2 Monitoraggio terapeutico dei farmaci (TDM- Therapeutic Drug Monitoring)

Il primo ad introdurre il concetto di monitoraggio terapeutico (TDM) fu il fisico svizzero Paracelsus, appartenuto al periodo Rinascimentale. Quest’ultimo capì che vi era una relazione diretta tra l’effetto fisiologico desiderato e la dose di farmaco somministrata.

Il concetto di TDM è stato, nel corso degli anni, profondamente rivisitato, passando dalla semplice misura della concentrazione dei farmaci nei fluidi biologici (“therapeutic drug measuring”), proposta nei primi anni Sessanta sulla spinta dello sviluppo delle tecniche analitiche, a strumento di controllo terapeutico (“therapeutic drug monitoring”), fino ad ausilio per il clinico nella gestione individualizzata della terapia (“therapeutic drug management”). Con il passare degli anni le indagini scientifiche hanno stabilito indici terapeutici, o “safe windows”, relativi a molti farmaci, in grado di mettere in relazione la quantità necessaria a produrre l’effetto desiderato con quella invece tossica per l’organismo. Si è passati quindi da un approccio prevalentemente orientato al risultato laboratoristico ad una visione incentrata sul paziente. Se un medicinale presenta dunque un range terapeutico ampio, viene generalmente considerato sicuro e non richiede monitoraggio, contrariamente un range ridotto induce la necessità di applicazioni procedurali utili a prevenire la possibile tossicità del farmaco.

Quello che bisogna valutare per il TDM è la curva tempo-concentrazione, che è caratterizzata da tre parametri:

● Concentrazione massima: rappresenta la concentrazione massima del farmaco nel plasma dopo la somministrazione di una dose.

● Tempo di concentrazione massima: che indica il tempo impiegato all’organismo a raggiungere la concentrazione massima.

● Area sotto la curva (AUC): quantità totale di farmaco che raggiunge la circolazione generale

Il TDM risulta indispensabile nelle terapie in cui sono necessarie dosi ripetute del farmaco; questo permette di mantenere la concentrazione di quest’ultimo al di sopra della concentrazione minima efficace.

15 Il grafico (Fig. 4) evidenzia come i livelli ematici massimi corrispondenti alle singole dosi sia in crescita. Questo si verifica quando ogni dose successiva si somma al livello ematico residuo della somministrazione precedente.

Figura 4: Rappresentazione grafica della concentrazione del farmaco in funzione del tempo quando si ha una somministrazione ripetuta della dose.

Con questa procedura si arriva ad un plateau definito come “Steady State”. Questo plateau va mantenuto all’interno del range terapeutico (Fig. 5).

Figura 5: Rappresentazione della dose ripetuta di un farmaco quando la concentrazione arriva nella fase dello “Steady State”.

16 È presupposto delle metodologie sviluppate calcolare accuratamente la concentrazione del farmaco, queste ultime devono essere precise, accurate, specifiche e riproducibili; le tecniche che rispecchiano queste caratteristiche sono quelle cromatografiche. Un altro importante vantaggio di queste metodiche è che permettono di misurare differenti farmaci e loro metaboliti contemporaneamente attraverso un singolo test. Molte tecniche cromatografiche richiedono il pretrattamento del campione e alcune anche la derivatizzazione, al fine di modificarne la volatilità. Le più comuni tecniche cromatografiche sono la gas-cromatografia (GC) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), quest’ultima, accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), riduce nettamente i tempi di analisi.

2.3 Metodi analitici per il TDM

Diversi metodi analitici, possono venire impiegati per il TDM, a patto però che siano in grado di soddisfare criteri di sensibilità (LOD= Limit of Detection e LOQ= Limit of Quantification), specificità (minor numero possibile di falsi negativi) e che siano stati opportunamente validati in matrici biologiche.

Le tecniche fino ad oggi utilizzate sono classificabili in due gruppi:

● METODI IMMUNOMETRICI (Radio Immuno Assay -RIA-, Enzyme-Linked

Immunoassorbent Assay -ELISA-, Enzyme Multiplied Immunoassay Technique EMIT, Fluoro Immuno Assay -FIA)

● METODI CROMATOGRAFICI.

I metodi immunologici si basano sulla competizione per un determinato sito di legame specifico su un anticorpo tra l’analita nella matrice biologica e l’analita marcato aggiunto (tracciante), legato cioè ad un particolare radionuclide, molecola o enzima che ne consenta la misura in determinate condizioni11–13.

Tale competizione è regolata dalla legge di azione di massa per cui maggiore è la concentrazione dell’analita presente nel campione e minore è l’interazione dell’anticorpo con il tracciante libero.

In relazione alla fase in cui avviene la determinazione del legame antigene-anticorpo si suddividono in metodi in fase omogenea (EMIT) o in fase eterogenea (ELISA, RIA). Questi test non necessitano di un elevato grado di pretrattamento del campione, risultando quindi essere molto rapidi e relativamente di facile utilizzo.

17 Essendo basati sulla reazione antigene-anticorpo, la specificità di questi test può non essere rivolta alla singola sostanza ma piuttosto al gruppo di sostanze (specificità di gruppo). Anche per questo motivo sono possibili dei “falsi positivi”, i quali possono essere causati sia dalla presenza di sostanze lecite appartenenti alla stessa “famiglia” per cui è stato creato l’anticorpo, sia di sostanze con struttura chimica diversa ma comunque in grado di legare l’anticorpo. Inoltre, la reazione antigene-anticorpo può risentire di interferenti naturalmente presenti nella matrice (pH alterato, torbidità eccessiva ecc.) oppure intenzionalmente aggiunti (cloruro di sodio, collirio, aceto, acido cloridrico, ipoclorito di sodio), traducendosi di fatto nell’ottenimento di un campione falsamente negativo (“falso negativo”).

Le analisi che utilizzano metodi cromatografici hanno il vantaggio di separare i singoli analiti target riducendo la presenza di eventuali interferenti fornendo ai clinici risultati quantitativi accurati.

Le tecniche cromatografiche trovano un'ampia applicazione se accoppiate alla spettrometria di massa in modo da poter identificare in maniera inequivocabile gli analiti in base al loro tempo di ritenzione, allo ione molecolare e ai rispettivi frammenti ionici. Queste tecniche hanno il pregio di avere una sensibilità pari o superiore al valore di soglia dei test immunometrici In letteratura, sono riportati diversi metodi che prevedono l'utilizzo di GS-MS e LC-MS applicati nella tossicologia clinica, nella medicina legale e nei controlli antidoping.

Buone prospettive di maggiore praticabilità vengono dagli studi sull’uso della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). Rispetto alla GC-MS, l’HPLC-MS è molto più versatile dal momento che permette anche la determinazione di sostanze termolabili, non polari e non volatili come metaboliti, coniugati e peptidi, adattandosi meglio al campione biologico liquido, quale ad esempio saliva, plasma ed urina.

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2.4 Cromatografia ad alte prestazioni (HPLC)

L’HPLC è potenzialmente in grado di separare ciascun componente di una miscela complessa di analiti. Il principio su cui si basa è la diversa affinità che l’analita, iniettato in colonna, presenta con la fase stazionaria e la fase mobile.

Il campione, generalmente sottoposto ad un opportuno pretrattamento, viene iniettato in testa alla colonna, impaccata da materiale poroso con particelle di dimensione ridotta (3-10 µm) (fase stazionaria). Tramite una pompa HPLC viene generato un flusso costante di fase mobile in grado di far rimuovere il campione all’interno della colonna HPLC contrastando la contro-pressione generata dalla colonna stessa. In funzione delle interazioni tra l’analita e la fase stazionaria, i diversi componenti del campione vengono separati ed eluiti in tempi differenti (tempi di ritenzione) e infine vengono rivelati da un opportuno detector.

L’utilizzo di tale metodica porta con sé una serie di vantaggi quali: ● Tempi ridotti di analisi

● Utilizzo di piccole quantità di campione (volumi dell’ordine dei µL) ● Elevata risoluzione dei picchi cromatografici.

Lo sviluppo tecnologico su tale strumentazione ha portato alla nascita della cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC). Questa tecnica cromatografica è simile all’HPLC con la differenza che è possibile utilizzare particelle della fase stazionaria con diametri inferiori a 2 µm, portando un aumento dell’efficienza della separazione cromatografica. Questo vantaggio va però a scapito delle pressioni perché per poter superare l’impaccamento di tale colonne bisogna avere pompe in grado di operare a pressioni più elevate (pressioni dell’ordine dei 1000- 1200 bar)14–16.

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2.5 Spettrometria di massa

Lo spettrometro di massa è solo uno dei tanti analizzatori che possono essere accoppiati alla cromatografia; tra quelli ad oggi disponibili ricordiamo quello di assorbimento molecolare con DAD (diode array detection), il fluorimetro e il rivelatore elettrochimico. L’utilizzo della spettrometria di massa rispetto agli altri rivelatori permette di avere prestazioni molto più specifiche per l’identificazione di analiti ed ottenere una ottima sensibilità e specificità. La spettrometria di massa è una tecnica analitica attraverso la quale è possibile identificare composti presenti in una miscela complessa; mediante lo studio delle abbondanze degli ioni e dei loro valori del rapporto massa su carica (m/z).

Lo spettrometro di massa, composto da, sorgente ionica (ad esempio Electrospray Ionization

ESI e Atmospheric Presure Chemical Ionization APCI) e da un analizzatore (ad esempio

quadrupolo, a tempo di volo (ToF)17, trappola ionica e Orbitrap18) risulta essere ampiamente diffuso in ambito clinico19–22 e tossicologico13,16,20,23.

Questo lo si deve alla sua notevole versatilità, determinata dalla facilità con cui è possibile non solo un accoppiamento con altre tecniche separative, quali LC e GC, ma anche con altri analizzatori sia in configurazione ibrida che tandem. Ciò influisce considerevolmente sulla risoluzione, sull’accuratezza di massa, sul range analitico, ma soprattutto sul tipo di applicazioni analitiche attuabili.

Un esempio di analizzatore tandem, largamente utilizzato, è il triplo quadrupolo (QqQ); si tratta di una configurazione strumentale in cui sono disposti tre quadrupoli in serie.

Ogni quadrupolo ha un suo specifico compito:

- Q1: selezionare gli ioni d’interesse ottenuti dalla sorgente

- Q2: Cella di Collisione (CID), ovvero in cui avviene la frammentazione degli ioni selezionati nel primo quadrupolo (Q1)

- Q3: ha il compito di indirizzare e guidare gli ioni frammento al rilevatore.

Sono possibili varie modalità di scansione: modalità full-scan; Prouct Ion Scan; Precursor Ion Scan (PIS); Neutral Loss Scan (NL); Selective Reaction Monitoring (SRM) e Multi Reaction Monitoring (MRM). Quest'ultima, consiste nel raccogliere gli ioni formati in sorgente nel primo analizzatore e solo gli ioni (ioni precursori) con uno specifico rapporto m/z vengono isolati.

20 Essi, una volta selezionati, vengono fatti collidere nel secondo analizzatore con un gas di collisione (argon o azoto), producendo uno o più ioni prodotto. Quest’ultimi vengono raccolti nel Q3 e solo gli ioni prodotto che presentano il rapporto m/z prescelto vengono emessi, producendo uno spettro di massa SRM.

Diverse tecniche analitiche vengono utilizzate nei laboratori per determinare differenti analiti nei fluidi biologici; la scelta si basa sul tipo di analita, sulla sua concentrazione, sulla quantità di campione disponibile e sulla sua stabilità.

L’applicabilità delle tecniche analitiche, come la GC-MS/MS, LC-MS/MS e UHPLC-MS/MS, in campo forense, tossicologico e clinico risulta essere ampiamente riportato in letteratura.

La gascromatografia, accoppiata alla MS2, è una tecnica molto conosciuta e di facile applicabilità in campo forense, tossicologico e clinico18,24.

2.6 LC-MS/MS

Dalle problematiche elencate in precedenza nasce la necessità di poter sfruttare la cromatografia liquida, la quale garantisce una buone selettività senza avere la necessità di una fase di derivatizzazione, presentando però problemi dovuti all'effetto matrice, che comporta un aumento o diminuzione della sensibilità, legato al tipo di interfacciamento (ESI/APCI), poichè la ionizzazione può risentire dell'eluente cromatografico e dei composti presenti nella matrice25,26.

Una sorgente di ionizzazione a pressione atmosferica notevolmente impiegata è l’elettrospray (ESI)27. Si tratta di una tecnica di ionizzazione soft, che non porta a frammentazione, ma alla formazione di ioni mono o multicarica per trasferimento di protone.

La carica degli ioni, positiva o negativa, dipende dal potenziale impostato e dai successivi meccanismi di protonazione/deprotonazione, portano alla formazione rispettivamente di ioni multicarica protonati ([M+H] +) o deprotonati ([M-H] -).

Un’altra sorgente di ionizzazione a pressione atmosferica, in uso in questo studio, è l’APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionizzation). Anch’essa rientra nelle tecniche di ionizzazione soft in cui lo spray, generato dal nebulizzatore, ed i gas di trasporto e di ausilio, vengono preriscaldati (350-500°C) per un breve periodo; in questo modo, i composti termolabili presenti nel campione non hanno il tempo di degradarsi.

21 La scelta della sorgente di ionizzazione è strettamente legata alla polarità degli analiti interessanti; il grafico mostrato in seguito riporta la polarità in funzione del peso molecolare dell’analita. Per molecole che hanno polarità medio-alta, e pesi molecolari in un range elevato è preferibile usare una sorgente di ionizzazione ESI, mentre per molecole che hanno un valore di polarità che va da basso fino ad alto, con pesi molecolari medio-bassi, è consigliabile usare una sorgente di ionizzazione come l’APCI.

Figura 6: Rappresentazione grafica delle caratteristiche ottimali delle molecole in relazione alle possibili sorgenti di ionizzazione.

Lo sviluppo di nuove tecnologie ha permesso di ottimizzare la LC-MS/MS, tecnica specifica e sensibile che permette di lavorare sia in modalità SRM (Selected Reaction Monitorin) che in MRM (Multiple Reaction Monitoring), consentendo quest'ultima di monitorare contemporaneamente più transizioni per ogni analita. Nonostante i molteplici vantaggi della LC-MS/MS elencati in precedenza, quest’ultima prevede il pretrattamento del campione in modo tale da eliminare interferenti dovuti principalmente alla matrice del campione.

22

2.6.1 Procedura di estrazione

Come accennato in precedenza, le analisi LC-MS/MS prevedo il pretrattamento del campione attraverso un procedimento di estrazione; parte più importante e complessa dell’analisi. I lavori presenti in letteratura riportano fasi di pretrattamento del campione altamente complesse, in cui nella maggior parte è presente la fase di precipitazione delle proteine del campione attraverso l’aggiunta di solventi organici come metanolo o acetonitrile. Quest’ultima viene applicata a causa del fatto che le matrici biologiche sono matrici complesse e bisogna quindi semplificarle cercando di allontanare i possibili interferenti, che potrebbero alterare il valore dell’analita.

Lo scopo fondamentale di tale procedimento è quello di trasferire gli analiti d’interesse facendoli passare dalla matrice in soluzione, permettendo così la successiva analisi.

L’obiettivo è quello di avere rese più alte possibili e lavorare in condizioni di temperatura e pH tali da non causare la degradazione degli analiti. Si utilizzano solventi diversi in funzione dell’analita d’interesse. Al fine di avere recuperi soddisfacenti, la precipitazione delle proteine viene, nella maggior parte dei casi, seguite da una fase di clean-up.

Le metodiche di estrazione in ambito clinico sono diverse, le più utilizzate sono l’estrazione liquido-liquido (LLE) ed estrazione in fase solida (SPE).

- Estrazione liquido-liquido (LLE): tecnica estrattiva che sfrutta la differente distribuzione di un analita tra due fasi liquide immiscibili in contatto tra loro;

- Estrazione in fase solida (SPE): tecnica estrattiva che sfrutta gli stessi principi della cromatografia liquida. Una cartuccia SPE è costituita da un involucro cilindrico, in genere di polietilene, in cui tra i due filtri è impaccata una certa quantità di fase adsorbente.

Le procedure di estrazione prevedono l’uso di solventi organici come Acetonitrile (ACN), Metanolo con l’aggiunta di soluzioni saline come solfato di zinco o solfato d’ammonio; l’utilizzo di questi solventi permette la precipitazione delle proteine e delle cellule presenti nella matrice35_.

Per quanto riguarda le procedure di estrazione con SPE in ambito clinico viene applicata come clean-up dell’estratto.

23 Anche per i VAMS, la procedura di estrazione prevede l’utilizzo di solventi organici come acetonitrile e metanolo e, in alcuni casi, questa fase viene preceduta da reidratazione del puntale.

2.7 Metodi analitici per la determinazione di THC e CBD presenti in letteratura

Come descritto nel paragrafo precedente, l’elevata sensibilità e specificità delle tecniche LC-MS/MS, nello specifico HPLC-MS/MS e UHPLC-LC-MS/MS, ha permesso loro di avere un’ampia applicabilità in ambito clinico, tossicologico e forense.

In letteratura è possibile trovare molteplici metodi analitici validati allo scopo di effettuare il TDM di farmaci come antibiotici, antiepilettici, immunosoppressori e anti- tumorali1,3,7,10,28,29, in cui la strumentazione in uso è LC-MS/MS.

Al contrario, i metodi utili a quantificare il THC e il CBD non sono molti e questo è dovuto al fatto che la cannabis non è largamente in uso e i gruppi di ricerca che si occupano di questo argomento sono limitati.

La matrice largamente impiegata è il plasma, ma sono stati validati anche metodi in cui vengono utilizzate matrici convenzionali come l’urina e non convenzionali come la saliva e la matrici cheratiniche 4,14,22,30–32 _{. Caratteristica che accomuna le differenti matrici analizzate in}

LC-MS/MS è quella di dover essere sottoposte al pretrattamento del campione.

Una matrice che non è largamente in uso in ambito clinico è il sangue intero perché risulta essere molto complessa e di difficile stoccaggio dato che non può essere congelato per evitare l’emolizzazione dei globuli rossi. Sono tuttavia presenti alcuni metodi validati in cui la matrice in uso è il sangue intero, ma questi ultimi prevedono un procedimento di estrazione lungo e articolato al fine di rendere la matrice libera da interferenti.

Scheidweiler et. al.33 nel loro lavoro descrivono un metodo per la quantificazione dei cannabinoidi (THC, CBD, CBN, CBG, THCV), i loro metaboliti liberi e il glucorinidi in campioni di sangue.

Al fine di determinare la concentrazione degli analiti di interesse, il campione (200 µL) viene prima sottoposto alla fase di precipitazione delle proteine con l’aggiunta di 500 µL di acetonitrile, sottoposto ad agitazione tramite vortex, ed in fine centrifugato a 15.000g per 5 min.

24 550 µL di surnatante vengono sottoposti alla procedura di clean-up tramite l’uso di pipette monouso (DPX) e successiva analisi in LC-MS/MS.

Il sistema DPX prevede un’estrazione solido-liquida molto lunga e complessa poiché richiede una serie di passaggi consecutivi per poter ottenere l’estratto della matrice. Le fasi previste sono 6: condizionamento, aspirazione del campione, miscelazione con flusso d’aria, scarico del campione, lavaggio ed eluizione.

In questo studio l’estrazione attraverso DPX viene preceduta da un’estrazione liquido-liquido tra matrice e acetonitrile e la quantità di campione richiesto è pari a 200 µL; quindi, la DPX viene applicata come clean-up dell’estratto. I valori del limite di quantificazione individuati per il metodo in esame sono di 0.5 ng/mL sia per il CBD che per il THC. Il range di calibrazione (0.5-100 µg/L), non è molto ampio e l’ULOQ (Upper Lower Limit of Quantification) è 100 ng/mL.

Per quanto riguarda le percentuali di recupero dell’estratto sono in media tra campioni di controllo qualità (QC) ad alta concentrazione e bassa concentrazione (1.5- 80 µg/L per il THC; 1.5-40 µg/L per il CBD) del 60 % e 70% rispettivamente per il THC e CBD.

Nel lavoro pubblicato da Hubbard et. al.34, viene riportato lo sviluppo e la validazione di un metodo LC-MS/MS al fine di determinare quantitativamente i cannabinoidi in sangue intero e la parte condensata dell’espirato. I cannabinoidi determinati sono i medesimi di Scheidweiler et. al33. Esaminando esclusivamente la matrice sangue intero, la loro procedura di estrazione risulta essere anch’essa complessa e articolata perché prevede una prima precipitazione delle proteine con 500 µL di acetonitrile freddo con lo 0.1% di acido formico (FA). Successivamente, al surnatante vengono aggiunti 1.1 mL di acqua ed in seguito caricati su una cartuccia SPE per estrazione solido-liquida. Per la fase di eluizione degli analiti, dalla fase stazionaria della cartuccia, vengono prima aggiunti 100 µL di soluzione 90:10 acetonitrile: isopropanolo e di seguito con 100 µL di soluzione 50:50 acetonitrile: metanolo con 2% di acido formico.

Anche in questo lavoro, come nell’articolo di Scheidweiler et. al.33, la fase di precipitazione delle proteine viene seguita da una fase di clean-up che allunga ulteriormente la fase di pretrattamento del campione.

25 A differenza del precedente articolo, l’estratto ottenuto dopo il clean-up viene successivamente portato a secco sotto flusso d’azoto e ricostituito con 200 µL di acetonitrile con 0.1% FA, infine iniettato in LC-MS/MS. La procedura ha mostrato un LOQ di 0.5 ng/mL sia per THC che per CBD34.

Nei due lavori descritti in precedenza vengono riportate procedure di clean-up dell’estratto attraverso metodiche differenti, l’SPE e con l’utilizzo delle DPX, in entrambi i casi tali procedure allungano ulteriormente la fase di pretrattamento del campione.

Il lavoro di Jagerdeo et. al. descrive un metodo di analisi LC-MS/MS con il sistema di Estrazione in Fase Solida (SPE) on-line, ovvero direttamente collegata alla strumentazione, al fine di determinare la concentrazione dei cannabinoidi in sangue intero.

L’innovazione del sistema risiede nel fatto che la procedura di clean-up dell’estratto ottenuto viene effettuato direttamente dalla strumentazione, senza la necessità di un operatore che svolga tale compito, riducendone quindi eventuali errori che potrebbero inficiare i risultati finali dell’analisi. La caratteristica prerogativa di tale sistema è quella di avere un sistema di pompe opportuno ovvero due pompe ad alta pressione (HPD) per il sistema SPE e altrettante per il sistema di cromatografia al fine di garantire il giusto gradiente per la separazione degli analiti.

Nonostante il complesso assetto del sistema di analisi, dovuto principalmente alla necessità di due sistemi di pompaggio ad alto vuoto, Jegerdeo descrive una procedura di pretrattamento del campione molto semplificata rispetto ai lavori citati in precedenza.

Il campione di sangue (1 mL) viene inizialmente sottoposto a precipitazione delle proteine attraverso l’aggiunta di 2 mL di acetonitrile, centrifugato per 15 min a 4000 rpm. Del surnatante ottenuto se ne prelevano 200 µL che vengono sottoposti ad una diluizione con l’aggiunta di 50 µL di ACN e centrifugato nuovamente. In seguito al surnatante viene aggiunto 1 mL di acetato di sodio (0.1 M, pH 7), il tutto viene centrifugato per 5 minuti a 4000 rpm; la soluzione ottenuta viene successivamente sottoposta alla procedura di SPE on-line che prevede la fase di condizionamento della cartuccia con ACN seguita dalla fase di equilibratura del sistema con AC N + 0.1% FA. Dopo la preparazione della cartuccia, avviene l’iniezione del campione (fase di carico) seguita dalla fase di pulizia della cartuccia con ACN+0.1% FA. A questo punto allontanati i possibili interferenti gli analiti vengono eluiti con ACN e trasferiti alla colonna cromatografica al fine di essere separati e rilevati allo spettrometro di massa.

26 La procedura ha mostrato un LOQ per il THC di 1.8 ng/mL, mentre per il CBD il livello risulta essere di 2.8 ng/mL; valori nettamente superiori ai due precedenti articoli.

Nel lavoro di Schwope et. al., la procedura di pretrattamento prevede che 500 µL di campione vengano posti in una provetta conica di polipropilene da 10 mL ed aggiunti 25 µL di MeOH. Durate la fase di agitazione con vortex vengono aggiunti goccia a goccia 1.5 mL di ACN ghiacciato. Una volta agitata, la soluzione viene posta in centrifuga per 5 minuti a 4.000g a 4°C. Al surnatante ottenuto vengono aggiunti 4.5 mL di acqua deionizzata con 0.2% di NH4OH; la soluzione ottenuta viene poi sottoposta ad agitazione tramite vortex, seguita dalla fase di estrazione con SPE.

Le condizioni di separazione con SPE prevedono l’uso di 2 mL di MeOH e 2mL di H2O deionizzata per il condizionamento della colonna, seguita dalla fase di carico dell’estratto ottenuto precedentemente. Successivamente la colonna viene lavata con 2 mL di una soluzione 79:20:1 di H2O: ACN:CH3COOH al fine di allontanare possibili interferenti; infine la fase di

eluizione viene eseguita attraverso 1.5 ml di ACN con 1% di CH3COOH.

Finita la fase di clean-up la soluzione ottenuta viene portata a secco sotto flusso d’azoto a 42°C e ricostituita con 150 µL di soluzione 70:30 delle fasi mobili A (10 mM acetato d’ammonio in acqua) e B (ACN +15% MeOH). Questo metodo ha permesso di avere un LOQ per CBD e THC di 1 ng/mL.

Anche nel lavoro di Sorensen et.al. viene descritto un metodo per la determinazione dei cannabinoidi attraverso analisi LC-MS/MS con la fase di clean-up del campione attraverso SPE.

La procedura prevede l’utilizzo di 100 µL di campione più l’aggiunta in sequenza di 10 µL di acido ascorbico, 50 µl di MeOH, 50 µL di H2O e 50 µL di ACN con 1% FA. Ad ogni aggiunta

la soluzione veniva agitata per 30 secondi; infine vengono aggiunti ulteriori 350 µL di ACN con 1% FA e agitati per 1 min 1.650 rpm. Successivamente, 350 µL di soluzione viene sottoposta a clean-up con SPE. La caratteristica peculiare di queste cartucce SPE è quella di avere una fase stazionaria con proprietà di acido di Lewis che permettono di rimuovere in modo efficiente i possibili PLs come lisofosfatidilcolina e lisofosfatidiletanolamina presenti nel campione. La cartuccia è stata precedentemente lavata con 500 µL di MeOH ed essiccata per 10 minuti; successivamente è stata caricata la soluzione estratta preparata precedentemente. Come ultimo passaggio sono stati prelevati 150 µL del filtrato ed aggiunti 10 µL di una soluzione acquosa al 10% di FA e posti in vial.

27 Questo metodo d’analisi ha permesso di avere un valore di LOQ per THC e CBD pari a 0.2 ng/mL, il valore più basso tra tutti i lavori citati in precedenza.

Per i primi due lavori sopra descritti viene riportata una procedura di pretrattamento del campione lunga ed elaborata in cui manipolazione del campione da parte dell’operatore è elevata e questo potrebbe comportare un incremento dell’errore nella procedura di preparazione del campione, inficiando il valore finale della concentrazione. Inoltre, fatto che accomuna tutti gli articoli citati, i volumi di campione necessario per la fase di estrazione sono importanti e questo potrebbe risultare problematico quando si tratta campioni proveniente da pazienti pediatrici.

2.9 Matrici biologiche: sangue intero e plasma

Le matrici biologiche più utilizzate in ambito di clinico sono urina, sangue intero e plasma (Fig. 7 a,b,c). Ad oggi stanno assumendo una notevole importanza anche matrici alternative quali saliva e, più raramente, capelli, che sono indice di monitoraggio retrospettivo, più utile per il controllo nel campo delle sostanze d’abuso, che non per l’individuazione di una terapia.

28 Figura 7, b: Immagine rappresentativa delle componenti principali nella matrice urina.

Figura 7, c: Immagine rappresentativa delle componenti principali nella matrice cheratinica.

La scelta della matrice influenza la significatività del dato analitico dal momento che ogni matrice riflette una finestra temporale caratteristica, in grado di fornire informazioni sul tempo di assunzione; in ogni matrice biologica, inoltre, si possono trovare più o meno prodotti metabolici del composto biologico. Nello specifico, per il TDM è importante valutare la concentrazione del farmaco a livello ematico. Il plasma o il siero, nonostante la loro complessità biologica in quanto derivati ematici, sono le matrici biologiche ideali per il TDM, pur tenendo conto dello svantaggio nel metodo di raccolta del campione. Va anche tenuto conto che per alcuni farmaci il sito più importante d’azione è localizzato nei globuli rossi, questo implica l’utilizzo del sangue intero. In letteratura sono presenti diversi metodi analitici che prevedono l’utilizzo del plasma come matrice, questo è dovuto al fatto che si tratta di una matrice molto meno complessa e che prevede un procedimento di estrazione meno invasivo rispetto alla matrice sangue intero.

29 Con la matrice plasmatica è possibile effettuare lo stoccaggio di campioni per effettuare una banca dati, cosa impossibile per il sangue intero che necessita condizioni di mantenimento complesse, dato che non può essere sottoposto ad elevate temperature per non incorrere nell’emolisi della parte corpuscolata.

2.10 Micro-campionamento

Il prelievo ematico è da sempre utilizzato dai clinici per indagare lo stato di salute del paziente e rientra nelle tecniche di campionamento tradizionali. La procedura è invasiva, ma attraverso esami in laboratorio della matrice stessa è possibile avere un quadro completo sui vari aspetti clinici.

In funzione di ciò che si vuole monitorare nella matrice, il clinico decide il tipo di prelievo ematico sia questo venoso, arterioso o capillare.

● Il prelievo arterioso viene eseguito per poter effettuare l'emogas analisi, che permette di misurare i valori delle pressioni parziali dei gas arteriosi (O2 e CO2), e il del pH del

sangue.

● Il prelievo venoso viene utilizzato per diverse ragioni, dalla curva da carico della glicemia, al monitoraggio terapeutico (TDM).

● Il prelievo capillare è ampiamente in uso nei reparti di neonatologia per gli screening neonatali con lo scopo di identificare patologie precoci di cui sia noto il trattamento. Tale procedura può essere definita non invasiva perchè viene effettuata attraverso una micro-puntura sul dito o sul tallone nel caso dei neonanti.

Uno dei motivi più frequenti per cui i pazienti sono sottoposti ad un prelievo ematico è il monitoraggio terapeutico (TDM). Questo implica essere sottoposti periodicamente ad una procedura invasiva; disagio ampiamente accentuato quando si tratta di pazienti pediatrici. Negli ultimi anni si può riscontrare un aumento dell’interesse da parte della comunità scientifica, nei confronti del micro-samplinig per analisi quantitative di sangue. Uno dei primi dispositivi ad essere usati a tale scopo è stato il Dried Blood Spot (DBS); anche definito come dispositivo di prima generazione (Fig. 8).

30 Figura 8: Tipico campione di sangue raccolto con un Dried Blood Spot (DBS)

Nonostante questo metodo di campionamento sia datato, in letteratura, sono diversi gli articoli che descrivono metodi analitici in cui è previsto l’uso del DBS.

Mercolini et al.36 hanno validato un metodo per la determinazione simultanea del THC e dei sui metaboliti su DBS da sangue capillare, attraverso analisi in HPLC-MS/MS. La determinazione simultanea di questi analiti consente di valutare il tempo intercorso dall’assunzione della sostanza stupefacente ed è possibile distinguere tra un consumo routinario o avvenuto in tempi passati. Mercolini et al. mette in risalto anche il fatto che, il campionamento con DBS del sangue capillare, può essere utilizzato in supporto alle forze dell’ordine nel momento in cui eseguono controlli di routine su strada. Questo è possibile perché non si tratta di una procedura invasiva come il prelievo ematico e quindi non è richiesto personale sanitario specializzato; inoltre è stabile a temperatura ambiente e non richiede nessuna precauzione specifica per la conservazione.

Anche in ambito di tossicologia forense è possibile trovare articoli come quello di Odoardi et al.37 _{in cui è stato validato un metodo con analisi UHPLC-MS/MS per la determinazione di 17}

di droghe d’abuso attraverso campionamento con DBS. La caratteristica di tale ricerca è che il metodo è stato provato su 10 campioni di sangue ottenuti post-mortem allo scopo di identificare l’eventuale presenza di droghe illecite; 5 di questi campioni reali sono risultati positivi all’analisi, riscontrando quindi l’abuso di sostanze stupefacenti.

31 L’uso dei DBS presenta numerosi vantaggi rispetto ai metodi di campionamento convenzionali, pur presentando alcune criticità. Il campionamento con DBS non è una procedura complessa purché vengano rispettate alcune regole basilari ed essere effettuato con sangue periferico. È importante che la goccia di campione sia deposita al centro del cerchio di carta assorbente pretagliata, possibilmente utilizzando una quantità standard di campione (procedura difficile se il campione viene ottenuto da una goccia di sangue tramite puntura del dito) ed evitare di toccare il DBS direttamente con il sito della puntura o con il puntale della pipetta.

L’ematocrito (HCT) è il componente principale che influenza la formazione dello spot, l’omogeneità del campione, le dimensioni, il tempo di asciugatura, il recupero dell’analita nonché la robustezza e la riproducibilità dei test. A tale scopo è in corso l’applicazione di differenti strategie ad opera di gruppi di studio per ridurre al minimo l’impatto dell’HCT, come ad esempio l’uso di DBS pretagliato, applicazione di un volume noto direttamente sul DBS e correzione basata sulla concentrazione di potassio38,39_.

L’interesse da parte della comunità scientifica per questa branca della chimica clinica ha portato allo sviluppo, da parte di differenti aziende, di nuovi device come i Volumentric Adsorptive Micro-Sampling (VAMS- Neoteryx), Minivette POCT (Sarstedt), DS 10 (DBS System SA), Capitainer-B (Capiainer AB). La caratteristica che accomuna i dispositivi sopra elencati è il fatto di essere volumetrici, ovvero garantire che il volume di campione prelevato sia quantitativamente definito, riproducibile ed esente dall’errore dovuto ai diversi valori di ematocrito40–43. Caratteristica ancor più rilevante è che il paziente può effettuare in maniera semplice ed autonoma il campionamento e questo può accadere in un ambiente familiare, aspetto che garantisce un minore stress nel paziente pediatrico.

A quanto già esposto va inoltre aggiunta la possibilità di spedire e conservare i campioni a temperatura ambiente grazie all’elevata stabilità del campione una volta adsorbito nei dispositivi.

32 Figura 9: Dispositivi di micro-campionamento volumetrico: a) Capitainer-B (Capiainer AB), b) Minivette

POCT (Sarstedt), c) DS 10 (DBS System SA).

2.11 Micro campionamento: Volumetric Absorptive Micro-Samplinig (VAMS)

Una delle tecniche più promettenti di micro-campionamento è rappresentata dall’uso dei dispositivi volumetrici. Quest’ambito della chimica clinica è ancora nella sua fase di pieno sviluppo data la sua “giovane età”, sono quindi numericamente molto ridotti i gruppi di ricerca focalizzati su tale settore.

Sono svariati gli analiti oggetto delle ricerche che vedono l’utilizzo di VAMS (Fig. 10) allo scopo di determinazione quantitativa; ad esempio, nello studio di Barco et. al.28 viene validato un metodo per la determinazione quantitativa di antibiotici attraverso il campionamento con i VAMS e la successiva analisi con UHPLC-MS/MS. Qu et. al.44 utilizzano tali dispositivi per uno studio di TDM per idrossiclorochina, in pazienti affetti da artrite reumatoide. Sono stati effettuati anche studi per la quantificazione di steroidi su modello animale45. Una ricerca interessante da citare è quella di Mercolini et. al.46 in cui la matrice fatta adsorbire sui VAMS non è sangue intero, bensì urina, plasma e fluidi orali. Lo scopo di tale ricerca è quella di identificare quantitativamente gli analoghi dei catinoni, spesso in uso come stimolanti dagli atleti nelle competizioni sportive.

Nello studio oggetto della presente tesi è stato valutato l’uso dei VAMS per la quantificazione simultanea di THC e CBD in sangue di pazienti pediatrici attraverso analisi di cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

33 Nello specifico, i VAMS analizzati provengono sia da campionamento capillare che da campionamento da prelievo venoso; questo allo scopo di valutare se fossero presenti o meno differenze sostanziali nelle concentrazioni degli analiti dai due siti di campionamento e conseguentemente valutare la possibilità di effettuare solo il campionamento non invasivo per il monitoraggio di THC e CBD nei pazienti pediatrici.

Figura 10: Dispositivi VAMS in uso nel metodo oggetto della tesi

2.12 Scopo del lavoro

L’obiettivo del presente lavoro di tesi è di sviluppare e validare un metodo innovativo per quantificare THC e CBD su sangue capillare, campionato su dispositivi di micro-sampling volumetrici (VAMS), al fine di semplificare il trattamento del campione rispetto alle procedure presenti in letteratura.

La procedura di estrazione presentata è decisamente più rapida rispetto ai lavori presenti in letteratura, e prevede un volume ridotto di campione (50 µL) e l’aggiunta di 50 µL di solfato di zinco e 150 µL di acetonitrile. Dopo la centrifugazione il surnatante viene prelevato ed inserito direttamente nella vial per autocampionatore, pronto per essere analizzato. Nonostante la procedura di estrazione semplificata si è riusciti ad avere un LOQ per entrambi gli analiti di 0,41 ng/mL e percentuale di recupero di circa 81% per il sangue, mentre per i dispositivi VAMS la percentuale è di circa il 30%.

Questo aspetto, insieme all’uso di una pre-colonna che preconcentra il campione, ha permesso di ottenere risultati vantaggiosi ed innovativi rispetto alle metodiche presenti in letteratura.

34 L’elemento distintivo ed innovativo del metodo sviluppato nel presente lavoro di tesi è quello di aver ottenuto una buona correlazione tra le concentrazioni plasmatiche dei due analiti e le concentrazioni sia in sangue intero sia nei VAMS campionati da sangue capillare, nonché da sangue venoso; questo risultato avvalora ulteriormente la possibilità di utilizzare un micro-sampling con VAMS di sangue periferico su pazienti pediatrici in trattamento con cannabis terapeutica.

35

Capitolo 3

Materiali e Metodi

Δ9-THC (1.0 mg/mL) (T-005 Cerilliant), Δ9-THC-D3 (100 μg/L) (T-003 Cerilliant; usato come THC standard interno, IS), CBD (1.0 mg/L) (C-045 Cerilliant), CBD-D3 (100 μg/L) (C-084 Cerilliant; usato come CBD IS), sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Srl (Milano, Italia). I composti hanno purezza del 98% e sono sottoforma di soluzioni metanoliche. Acetonitrile, metanolo e acido formico (purezza 99.9%) con grado per HPLC sono stati acquistati da Merck (Darmstadt, Germania). L’acqua è stata purificata attraverso osmosi inversa e filtrazione attraverso sistema di purificazione Milli-Q (Millipore, MA, USA). Tale sistema ha garantito una conducibilità pari a 0.055 µS/cm a 25°C.

3.2 Preparazione delle miscele standard

Una soluzione madre di THC e CBD è stata preparata diluendo 75 µL di ciascun composto puro con metanolo fino ad un volume di 1.5 mL. Tale soluzione è stata preparata direttamente in vial da 1.5 mL con tappo a vite (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia) ed è stata conservata a -20 °C per 1 mese.

Una soluzione madre di standard interni di THC-D3 e CBD-D3 è stata preparata miscelando 12 µL di ciascun composto puro con l’aggiunta di metanolo fino al volume di 1.5 mL, direttamente in vial da 1,5 mL con tappo a vite (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia). La soluzione ottenuta è stata agitata con vortex per 5 s e conservata a -20 °C per 1 mese. Quest’ultima soluzione è stata diluita (1:5) con metanolo al fine di ottenere la soluzione di standard interni di lavoro contenenti gli standard interni ad una concentrazione di 100 ng/mL. La soluzione ottenuta è stata agitata con vortex per 5 s e conservata a -20°C per 1 mese.

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3.3 Preparazione delle soluzioni in matrice

Per la preparazione delle soluzioni in matrice sono state utilizzate lesoluzioni Standard descritte nel paragrafo 3.2.

Il campione composito di sangue è stato preparato mescolando un’aliquota (150 µL) di campioni di sangue prelevato da sei pazienti diversi. Il campione composito è stato conservato in una provetta falcon a temperatura di +4 °C per 7 giorni.

Al fine di preparare le soluzioni in matrice per la curva di calibrazione (800, 400, 200, 100, 40, 16, 6.4, 2.56, 1.02, 0.41 ng/mL) e i campioni di controllo qualità (QC) (0.41, 1.23, 400, 650 ng/mL) sono state utilizzate le soluzioni degli analiti descritte nel paragrafo precedente e preparate direttamente nelle eppendorf a cui sono stati aggiunti 10 µL di soluzione mix di standard interni.

Per il campionamento tramite dispositivi VAMS sono state preparate, direttamente nelle eppendorf, le soluzioni a concentrazione nota in matrice (range di calibrazione: 800, 400, 200, 100, 40, 16, 6.4, 2.56, 1.02, 0.41 ng/mL; QC: 0.41,1.23, 400, 650 ng/mL) ed aggiunti 10 µL della soluzione mix di standard interni; in seguito la soluzione è stata agitata con vortex per 5 sec. Dopo la preparazione delle soluzioni si è proceduto con il campionamento tramite VAMS inserendo il dispositivo nella eppendorf avendo l’accortezza di non inserire l’intero puntale nella matrice ma facendo toccare solo la sua superficie con la matrice. Quando l’intero puntale avrà assunto una colorazione totale di rosso, verrà posto a temperatura ambiente al fine di far asciugare la matrice. La fase di asciugatura è di circa 2 ore alla luce.

3.4 Strumentazione

Per il microsampiling sono stati utilizzati i dispositivi VAMS (30 µL) acquistati da Neoteryx (Torrance, Ca).

È stato utilizzato un sonicatore Soniprep 150 (MSE Ltd, Londra, UK) ed una microcentrifuga refrigerata con rotore modello 5010 R (Eppendorf, Milano, Italia).

L’analisi LC-MS/MS è stata eseguita attraverso un sistema Ultimate 3000 UHPLC fornito di autocampionatore refrigerato, con pompa quaternaria e compartimento di colonna termostatata, accoppiato ad un TSQ Quantiva™ Triplo Quadrupolo (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia).

37 La separazione cromatografica è stata ottenuta per mezzo di una pre-colonna TurboFlow HTLC C18-XL 0,5 x 50 mm (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia), seguita da colonna Acquity UPLC HSS T3 2,1 x 150 mm impaccata con particelle da 1,8 µm (Waters).

Sono state provate le seguenti colonne cromatografiche, la colonna Hypersil Gold aQ 50 x 2.1 mm impaccata con particelle di dimensioni di 5 µm (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia) e la Eclipse Plus C18 con particelle di diametro 1.8 µm (Agilent, Milano, Italia), al fine di ottimizzare la separazione cromatografica.

La caratteristica innovativa di sistema oggetto del lavoro di tesi, si basa sull’utilizzo della tecnologia Turboflow che unisce i principi di turbolenza, diffusione e chimica per eliminare rapidamente le interferenze dovute alla matrice durante l’acquisizione degli analiti d’interesse. Nello specifico la pre-colonna viene utilizza come clean-up dell’estratto, permettendo di effettuare una sorta di pre-concentrazione del campione.

3.5 Sviluppo di un metodo UHPLC-MS/MS per la quantificazione di THC e CBD su sangue intero e su sangue intero venoso e capillare campionato mediante VAMS.

Il primo punto della fase sperimentale è stato quello di sviluppare un metodo per l’identificazione del THC e del CBD tramite l’UHPLC-MS/MS attraverso l’utilizzo di soluzioni standard degli analiti elencati in precedenza.

Prima di tutto si sono identificate le transizioni migliori degli analiti collegando l’autocampionatore direttamente allo spettrometro di massa. È stata preparata, in un vial da autocampionatore, una soluzione di THC e CBD ad una concentrazione di 100 ng/mL e iniettata direttamente nello spettrometro di massa con sorgente di ionizzazione APCI; la modalità di acquisizione era in positivo. Le transizioni ioniche seguite per il THC e il CBD sono state monitorate prima operando in Multi Reaction Monitoring (MRM). Per tale metodica di acquisizione, il software automatizza la selezione dei migliori ioni precursore e ioni prodotto e l’ottimizzazione dei valori dell’energia di collisione al fine di massimizzare intensità degli ioni prodotto per ogni transizione ionica. Le transizioni ioniche del THC e del CBD scelte vengono riportate nella seguente tabella (Tab.1).