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Approccio proteomico integrato allo studio dei domini PDZ

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Academic year: 2021

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Riassunto

La proteomica è una nuova disciplina, nata dall’esigenza di studiare in modo sistematico tutte le proteine prodotte nei vari organismi, di cui è in corso oppure è già stato completato il sequenziamento del genoma. In passato, allo scopo di visualizzare un’espressione proteica differenziale in condizioni o stati biologici diversi venivano utilizzati essenzialmente metodi di elettroforesi su gel bidimensionale.

Con l’emergere di nuove potenti tecnologie analitiche, come la spettrometria di massa, e con lo sviluppo di metodi bioinformatici per analizzare le sequenze genomiche e dedurre la composizione amminoacidica dei prodotti genici, la proteomica ha esteso il suo campo d’azione all’analisi della funzione dei prodotti genici (“genomica funzionale”), includendo studi d’identificazione, di localizzazione, di espressione e d’interazione tra le proteine.

In particolare, la creazione di una mappa d’interazioni proteina-proteina di una cellula potrà essere di gran valore per la comprensione della biologia della cellula stessa. Il riconoscimento e il legame tra le proteine è alla base della formazione di complessi multiproteici, fondamentali per molte attività della cellula come lo sviluppo, la trasduzione del segnale, l’adesione e la comunicazione con altre cellule. Un gran numero di interazioni sono mediate da famiglie di “domini” di legame proteici, che sono porzioni di proteine, ripiegate indipendentemente e autonomamente dal resto della molecola, comprendenti circa 40-200 aminoacidi. Sono domini non catalitici che legano specificamente e reversibilmente una regione più o meno estesa della molecola bersaglio, tramite una cavità specializzata per il riconoscimento.

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Riassunto II

Per questo lavoro di tesi, ho concentrato il mio studio su una particolare famiglia di domini di legame, che sono molto frequenti nelle proteine e partecipano alla formazione di svariati complessi multiproteici. I domini proteici “PDZ” sono stati descritti in origine come elementi strutturali conservati in tre proteine, PSD95 (componente di un complesso sotto la membrana post-sinaptica), DLG (un soppressore tumorale) e ZO-1 (presente nelle giunzioni strette), e successivamente sono stati individuati in molte proteine dei metazoi, soprattutto a livello delle membrane cellulari, dove svolgono un ruolo di “adattatori” o di “impalcature” alle quali le altre proteine sono associate.

Allo scopo di caratterizzare le modalità con cui i domini PDZ riconoscono e legano i loro bersagli, ho isolato le regioni codificanti per alcuni domini PDZ presenti in proteine di differenti organismi: uomo, topo e zebrafish. Ho utilizzato quindi un approccio proteomico integrato per studiare: 1) la specificità di riconoscimento dei vari domini, 2) le proteine bersaglio con cui possono interagire, 3) i componenti degli eventuali complessi multiproteici, di cui fanno parte. Ho quindi analizzato repertori di peptidi a sequenze casuali, esposti su capside fagico (“peptide phage-display”) oppure librerie fagiche di prodotti di cDNA (cDNA-phage display), identificando i peptidi che vengono legati preferenzialmente da ciascun PDZ. Inoltre partendo da estratti proteici ottenuti da cervello di topo, ho selezionato mediante cromatografia di affinità le proteine che rimangono associate ai PDZ in vitro e ho provato a confermare in vivo queste interazioni. Alcune delle proteine bersaglio sono state identificate mediante spettrometria di massa, nell’ambito di un progetto di collaborazione.

L’uso di approcci differenti ha permesso di capire i vantaggi e i limiti delle varie tecnologie, mettendo in evidenza la necessità di comparare e integrare i vari risultati,

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Riassunto III

allo scopo di avere un quadro completo di come questi domini modulano le attività delle proteine all’interno delle cellule.

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