UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica/Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutica
TESI DI LAUREA:
Espressione ed attività funzionale di PAR
1in una linea cellulare di mesotelioma
pleurico maligno
Candidata:
Cristina Bibiana Vasco
Relatore Correlatore
Prof.ssa Maria Rosa Mazzoni Prof. Antonio Lucacchini
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SOMMARIO ... 4
INTRODUZIONE La famiglia dei recettori attivati dalle proteasi ... 6
Attivazione e segnalazione di PAR1...7
PAR1 attiva percorsi di segnalazione mediati dalle proteine G ... 8
Sistemi di segnalazione mediati dalle β-arrestine ... 9
Le cascate di segnalazione stimolate dai PARs mediante la transattivazione recettoriale ... 9
Regolazione della segnalazione di PAR1... 10
PAR contribuiscono ai meccanismi di controllo fisiologici...11
Il PAR1 nel cancro ... 13
Mesotelioma pleurico maligno (MPM) ... 15
Patogenesi del MPM ... 15
Trattamento del MPM ... 16
Obiettivo del presente studio ... 18
MATERIALI E METODI Materiali ... 19
Colture cellulari ... 20
Analisi Western blot... 20
Real-time-RT-PCR ... 21
Saggio di proliferazione cellulare ... 21
Misurazione del [Ca2+] intracellulare... 22
Misurazione del cAMP intracellulare ... 22
Test di attivazione di RhoA... 23
Saggio analisi dei dati ... 23
RISULTATI... 24
PAR1 è sovra-espresso nelle cellule NCI-H28 ... 24
Agonisti per PAR1 stimolano la proliferazione cellulare di Met-5A e di NCI-H28 ... 25
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DISCUSSIONE ... 30 CONCLUSIONI... 32 BIBLIOGRAFIA... 33
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SOMMARIO
I recettori attivati da proteasi (PARs) sono una famiglia di recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) che mediano importanti risposte fisiopatologiche quali l'emostasi, la trombosi, l’infiammazione, lo sviluppo embrionale e la patogenesi di alcune neoplasie maligne. E 'stato riportato che il sottotipo PAR1 è coinvolto nella progressione neoplastica, nell’invasione e nelle metastasi ed esiste una correlazione tra il livello di espressione di PAR1 ed il fenotipo maligno. In realtà, PAR1 è sovra-espresso in numerose neoplasie di origine epiteliale quali il melanoma, l’adenocarcinoma del colon, il carcinoma prostatico e l’adenocarcinoma mammario invasivo (Tellez et al, 2003;. Darmoul et al, 2003;. Chay et al., 2002; Even-Ram et al., 1998). Tuttavia, il contributo di PAR1 alla patogenesi ed alla progressione neoplastica non è completamente consolidata per tutte le neoplasie e l’acquisizione di ulteriori conoscenze sul suo coinvolgimento è fondamentale per considerare il recettore come un potenziale bersaglio di nuovi interventi terapeutici. Sulla base di queste conoscenze, abbiamo deciso di indagare l'espressione PAR1 e le sue modalità di segnalazione in linee cellulari di mesotelioma pleurico maligno (MPM). Il MPM colpisce la pleura ed è spesso causato da esposizione all'asbesto. Questa neoplasia viene diagnosticata in una fase avanzata ed è caratterizzate da una prognosi infausta. Inoltre, l'incidenza del mesotelioma pleurico maligno(MPM) si prevede in aumento nei prossimi 10-20 anni a causa della diffusa esposizione all'asbesto negli ultimi decenni.
Pertanto nel mio lavoro di tesi ho valutato:
• Il livello di espressione di PAR1 in linee cellulari di mesotelioma pleurico maligno (MPM) ed in cellule mesoteliali non trasformate.
• La capacità di PAR1 di indurre la proliferazione cellulare della linea di MPM che sovra-esprime il recettore (NCI-H28) e delle cellule mesoteliali non trasformate.
• L’integrità delle vie di segnalazione intracellulare attivate da PAR1 nelle cellule NCI-H28 rispetto alle cellule mesoteliali di controllo.
Queste indagini hanno evidenziato che la linea cellulare NCI-H28 è l’unica tra le linee cellulari di MPM testate che sovra-esprime il recettore PAR1 ed inoltra mostra un profilo proliferativo indotto dall’attivazione di PAR1 anomalo rispetto a quello riscontrato nelle cellule mesoteliali di controllo. Queste differenze ci hanno indotto ha studiare le vie di segnalazione intracellulare attivate da PAR1 nelle cellule NCI-H28 e nelle cellule mesoteliali di controllo. Queste indagini hanno evidenziato che nelle cellule NCI-H28 la segnalazione attraverso le proteine Gq che induce l’aumento della
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concentrazione del calcio intracellulare è visibilmente compromessa, mentre l’attivazione della proteina RhoA attraverso le proteine G12/13 è ridotta. Al contrario, la via di segnalazione mediata dalle proteine Gi che portano ad una riduzione dei livelli intracellulari di cAMP non risulta significativamente compromessa. Pertanto, a fronte di un aumento dell’espressione di PAR1, nelle cellule NCI-H28 si è potuta riscontrare una visibile alterazione di alcune vie di segnalazione intracellulare. Al momento, non è chiaro il meccanismo che induce questa alterazione della segnalazione di PAR1, ma potrebbe essere implicato un disaccoppiamento selettivo tra il recettore e certe classi di proteine G.
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INTRODUZIONE
La famiglia dei recettori attivati da proteasi
I recettori attivati da proteasi-(PARs) sono una famiglia di recettori a sette eliche transmembrana accoppiati a proteine G-proteina (GPCRs) che mediano importanti risposte importanti fisiopatologiche com l'emostasi, la trombosi, l’infiammazione, lo sviluppo embrionale e la patogenesi di alcue neoplasie maligne. Nel genoma dei mammiferi ci sono quattro geni codificanti per altrettanti recettori: PAR1, noto anche come il recettore della trombina, PAR2, PAR3 e PAR4. Anche se i membri della famiglia PAR condividono le caratteristiche strutturali di base di tutti i GPCRs, i PAR mostrano un meccanismo di attivazione insolito (Figura 1). Infatti, i PARs sono attivati e segnalano in risposta a basse concentrazioni di alcune serina proteasi extracellulare che causano l’irreversibile degradazione proteolitica di un legame peptidico nell’estremità amminoterminale.
Figura 1. Schema che illustra l’organizzazione dei sette domini transmembrana. (Neumann et al., 2014). E’ mostrata
l’organizzazione di PAR1 con l'estremità N-terminale extracellulare, le sette eliche transmembrana e l’estremità C-terminale intracellulare .
Il PAR1 è il prototipo di questa famiglia di recettori che trasmette le risposte cellulari principalmente per la trombina (Vu et al., 1991), così come PAR3 e PAR4. PAR1 può essere anche scisso ed attivato da proteasi con attività anticoagulante, come la proteina C attivata (APC): la plasmina, il fattore Xa (FXa), il fattore VIIa (FVIIa), la callicreina, la tripsina, la matriptase, la triptasi e le metalloproteasi (MMP), come MMP-1 e MMP-13 (Kuliopulos et al, 1999; Koukos et al, 2011; Adams et al, 2011; Austin et al, 2013). Diversamente, PAR2 è attivato da serino proteasi come la tripsina, la triptasi e le proteasi della coagulazione a monte della trombina, FVIIa e FXa (Nystedt et al, 1995, Ishihara et al,
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1997; Xu et al., 1998). I PARs vengono attivati quando l’N-terminale è proteoliticamente scrisso da proteasi extracellulari con la conseguente formazione di un nuovo N-terminale che funge da legando recettoriale, causando un’attivazione irreversibile del recettore, portando così agli eventi di segnalazione cellulare a valle che evocano varie risposte cellulari (Vu et al., 1991, Soh et al., 2010). Una volta attivati, i PARs subiscono cambiamenti conformazionali che facilitano l'accoppiamento con le proteine G. A sua volta, le proteine G attivate innescano una cascata di eventi a valle, che portano a diversi esiti cellulari come la segnalazione del calcio, l'impegno delle integrine, l’adesione cellulare e la migrazione, la trascrizione genica e la mitogenesi.
Attivazione e segnalazione di PAR1
I meccanismi di attivazione di PAR1 sono stati ampiamente studiati. Le proteasi tagliano siti di riconoscimento specifici nella regione N-terminale extracellulare di PAR1 così da esporre un motivo noto come il ligando endogeno. Il ligando, così esposto, interagisce poi con il secondo loop extracellulare del recettore per avviare il reclutamento al dominio intracellulare delle proteine G o di altre molecole di segnalazione (Ramachandran et al, 2008;. Adams et al, 2011) (Figura 2, parte a). Inoltre, peptidi sintetici (PAR1-AP) che imitano i primi sei amminoacidi del neoformato N-terminale possono attivare PARs indipendentemente dalle proteasi e dalla digestione del recettore (Scarborough et al, 1992;. Chen et al, 1994;. Lerner et al ., 1996) (Figura 2, parte B). Una volta attivato PAR1 subisce un cambiamento conformazionale così che viene facilitato l'accoppiamento con le proteine G eterotrimeriche. PAR1 si accoppia a Gαq, Gαi e Gα12/13 ed induce l'attivazione delle MAP chinasi, la mobilitazion del Ca2+ intracellulare, l'attivazione di RhoA e la regolazione di altri effettori così da promuovere le diverse risposte cellulari. PAR1 presenta anche profili di segnalazione distinti in risposta a diversi meccanismi di attivazione, cioè proteasi o PAR1-AP, un evento conosciuto come selettività funzionale (Figura 2).
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Figura 2: PAR1 ha un meccanismo di attivazione insolito (Ramachandran et al 2012) (A) La figura illustra l'attivazione e la segnalazione di PAR1 in risposta all’irreversibile taglio proteolitico. Le proteasi si legano e tagliano l'N-terminale di PAR1, esponendo un nuovo N-l'N-terminale che funziona come un legando endogeno che si lega al recettore intramolecolare mente per innescare la segnalazione trans membrana; (B) Attivazione di PAR1 mediante l’applicazione esogena di PAR1-AP in assenza di smascheramento proteolitico del legando endogeno; (C) esempio di agonismo funzionale, nel quale avviene un taglio proteolitico a valle del sito di taglio che attiva il recettore così che viene rimosso il legando endogeno ed il recettore non è disponibile per l’attivazione da parte di proteasi. Tale proccessamento di PAR1 può, oltre a disarmare alcune vie di segnalazione, contemporaneamente attivare altre vie di segnalazione. Il recettore disarmato può talvolta essere trattenuto sulla superficie cellulare ed essere disponibile per l'attivazione da parte di peptidi sintetici. PAR1 viene disaccoppiato dalla segnalazione mediata dalle proteine G da una rapida fosforilazione e dal legame all’arrestina.
PAR1 attiva percorsi di segnalazione mediati dalle proteine G
Come altri GPCRs, PAR1 segnala tramite una varietà di proteine G, tra cui Gq Gi e G12/13(Russo et al., 2009). I GPCRs agiscono fattori di scambio del nucleotide guanilico attivati da ligandi, stimolando lo scambio del GDP per il GTP nella subunità Gα degli oligomeri eterotrimerici della proteina G. Questo scambio permette il “rilascio” della subunità Gα dalla suo stretto legame con la subunità dimerica Gβγ. Ognuna delle due subunità, Gα-GTP e Gβγ, può autonomamente essere in grado di interagire con effettori a valle nella via di segnalazione (Oldham et al., 2008). I primi studi dimostrarono che l'attivazione di PAR1 inibisce l'accumulo di cAMP mediante Gi e stimola l’idrolisi mediata dalla fosfolipasi C (PLCβ) del phosphotidylinosotol 4,5-bisfosfato (PIP2), con generazione di inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG ) (Voss et al., 2007). La mobilizzazione del calcio è indotta tramite la proteina Gq (Voss et al., 2007) ed è importante per la funzione di numerosi
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enzimi chiave di segnalazione, tra cui la proteina chinasi C (PKC), la fosfolipasi A2, e la calpaina (Hung et al., 1992). In contrasto con queste vie di segnalazione divergenti di Gi e Gq, la concomitante segnalazione di Gq e Gi in risposta all'attivazione di PAR1 sembra stimolare le chinasi 1/2 (ERK1/2) attivate da segnali extracellulari(Gao et al., 2010). PAR1 è anche accoppiato alle proteine G12/13 che portano all'attivazione di RhoA e induzione di modificazioni del citoscheletro (McCoy et al, 2010;. McCoy et al 2012)..
I sistemi di segnalazione mediati dalla β-arrestina
I PARs attivati interagiscono anche con varie proteine adattatore che facilitano la trasduzione del segnale indipendentemente dall’accoppiamento alle proteine G eterotrimericche. I megliori effettori caratterizzati dei GPCRs indipendenti dalle proteine G sono le β-arrestine, che sono considerate proteine adattatrici multifunzionali (Lefkowitz and Shenoy, 2005). Come un importante proteina di raccordo, la β-arrestina è essenziale per mediare più passaggi della segnalazione di PAR1, come l’attivazione di Akt e di ERK1/2 (Goel and Baldassare, 2002).
Le cascate di segnalazione stimolate dai PARs mediante la “transattivazione” recettoriale
Un certo numero di studi hanno dimostrato che i PARs possono formare omodimeri od eterodimeri che funzionano come un complesso. Una volta dimerizzati i PARs potrebbero adottare conformazioni uniche ed attivare diverse vie di segnalazione rispetto al monomero (Lin et al., 2013). La transattivazione dei recettori PARs è un fenomeno ben noto e ciascuno dei quattro PARs può formare eterodimeri. PAR3 è stato considerato come co-fattore per altri PARs. PAR3 può modulare l'attività di PAR1 potenziando la sua risposta alla trombina, aumentando così la permeabilità della barriera endoteliale senza alterare le risposte del Ca2+. Altri esempi di dimerizzazione recettoriale sono è i dimeri PAR1-PAR4 (Leger et al., 2006) e PAR1-PAR2 (Kaneider et al., 2007) che potrebbero avere importanti implicazioni, rispettivamente per il trattamento della trombosi arteriosa e della sepsi. Quando si forma il dimero PAR1-PAR2, il ligando endogeno esposto dalla trombina può trans-attivare PAR2 e così attivare la segnalazione PAR2 dipendente da Gαi/Rac, mentre la segnalazione di Gαq e Gα 12/13 mediata da PAR1 si spenge (Kaneider et al., 2007). I PARs possono agire come co-fattori o possono dimerizzare sia costituittivamente che in maniera ligando dependente. La formazione di dimeri può giocare un ruolo nell’organizzazione dei recettori sulla superficie cellulare, e può modulare allostericamente l'attivazione di entrambi i monomeri o agire come un complesso che
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genera risultati di segnalazione unici.
Regolazione della segnalazione di PAR1
Analogamente ad una serie di altri GPCRs, PAR1 mostra due modalità di traffico che sono importanti per la regolazione della segnalazione. La prima modalità riguarda il riciclaggio costitutivo dei PAR1 non digeriti tra la superficie cellulare e un compartimento intracellulare, che porta ad una rapida risensibilizzazione indipendentemente dalla sintesi de novo del recettore (Paing et al., 2006). Al contrario, il PAR1 attivato è rapidamente desensibilizzato e disaccoppiato dalla segnalazione della proteina G a seguito di fosforilazione e al legame alla β-arrestina (Figura 3) (Paing et al., 2002)
Figura 3: Il traffico intracellulare dei PARs (De Munnik et al, 2015) Dopo la sua attivazione, PAR1 viene rapidamente fosforilato a livello dell’estremità C-terminale da diverse chinasi per i GPCRs (GRKs), tra cui GRK3 e GRK5 (passaggio 1 e 2). La segnalazione di PAR1 è desensibilizzata a seguito della sua interazione con la β-arrestina 1 (passaggio 3). L’arrestina interagirsce con la clatrina e con il complesso 2 della proteina adattatrice della clatrina (AP-2) che portano all’internalizzazione del recettore (passaggio 4). I recettori internalizzati possono attivare la segnalazione dipendente dalla β-arrestina (passaggio 5). I PARs internalizzati vengono successivamente indirizzati verso gli endosomi per il riciclo (passaggio 6) o verso i lisosomi per la degradazione (passaggio 7).
Dopo l'attivazione di PAR1, il recettore è fosforilato su residui di serina e treonina all'interno della coda citoplasmatica da parecchie chinasi per i GPCRs (GRKs), comprese GRK3 e GRK5 (Ishii et al, 1994;. Tiruppathi et al., 2000) (passaggio 2 della Figura 3). Le GRKs mediano la fosforilazione dei
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PAR1 attivati, aumentando l’affinità del recettore per la β-arrestina 1 che quindi impedisce l'ulteriore accoppiamento tra recettore e proteine G e la conseguente segnalazione. L'interazione di PAR1 con la β-arrestina 1 è indipendente dallo stato di fosforilazione del recettore e non è essenziale per l’internalizzazione e la down-regolazione del recettore stesso (Paing et al., 2002) (passaggio 3 della Figura 3). L’arrestina interagisce con la clatrina e con il complesso 2 della proteina adattatore della clatrina (AP-2) che porta all’internalizzazione del recettore (passaggio 4 della Figura 3). Infatti, l’internalizzazione di PAR1 dipende dalla clatrina e dalla dinamina, dato che AP-2 si lega direttamente a un motivo di tirosine nella coda citoplasmatica di PAR1 ed è essenziale per l’internalizzazione costitutiva ed il recupero cellulare dopo l’esposizione alla trombina (Paing et al., 2006). Le invaginazioni rivestite di clatrina presenti a livello della membrana plasmatica sono responsabili del processo di internalizzazione della maggior parte dei GPCRs. La maggior parte dei GPCRs attivati e fosforilati sono riconosciuti dalle β-arrestine, che facilitano l'internalizzazione del recettore attraverso le invaginazioni rivestite di clatrina (passaggio 5 della Figura 3). Dopo endocitosi, PAR1 viene reinserito nella membrana da "vescicole di reciclaggio" (di passaggio 6 della Figura 3) o diretto dagli endosomi ai lisosomi dove viene degradato, un processo noto come
down-regulation (passaggio 7 della Figura 3).
I PARs contribuiscono a meccanismi di controllo fisiologici
Nel sistema cardiovascolare, i PARs sono espressi dalle cellule circolanti nonché dalle cellule endoteliali e muscolari lisce endoteliali dei vasi. Le piastrine sono cellule del circolo sanguigno che sono mediatori critici della coagulazione. La trombina scinde i PARs sulle piastrine causando l'aggregazione, la secrezione dei granuli, e l’induzione dell’attività pro-coagulante, che sono essenziali per l'emostasi (Kahn et al, 1999;. De Candia et al., 2001). Le proteasi possono segnalare alle cellule endoteliali e cellule muscolari lisce dei vasi così da controllare la resistenza ed il flusso di sangue, lo stravaso di proteine plasmatiche e di granulociti e l'angiogenesi. La trombina e gli agonisti selettivi per PAR1 (PAR1-APs) invariabilmente causano il rilassamento dei vasi sanguigni precontratti, tra cui i grandi vasi come, per esempio, l’arteria polmonare umana (Hamilton et al., 2001), l’arteria coronarica suina (Hamilton and Cocks, 2000) e l'aorta di ratto ( Magazine et al., 1996), ma anche vasi più piccoli, incluse le arterie intramiocardiche suine ed umane (Hamilton et al., 2002). C’è consenso in questi studi sul fatto che il rilassamento indotto da PAR1 è compromesso dalla rimozione dell'endotelio ed è quindi mediato dalla secrezione di un fattore da parte delle cellule endoteliali che rilassa la muscolatura liscia vascolare. Il rilassamento è spesso soppresso
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dall’inibizione della monossido d’azoto (NO) sintetasi ed è quindi mediato, in parte, dal rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali (Hamilton and Cocks, 2000;. Hamilton et al., 2002). Nel sistema nervoso, le proteasi attivatrici dei PARs neuronali possono derivare dalla circolazione, dalle cellule infiammatorie che sono residenti o reclutate nel tessuto nervoso, o da neuroni o da astrociti. Le proteasi della cascata della coagulazione potrebbero segnalare nel sistema nervoso durante i traumi e l’infiammazioni quando vi è elevata permeabilità vascolare. Tuttavia, queste proteasi sono anche espresse nel sistema nervoso, anche se a bassi livelli. I PARs sono espressi nel cervello, nel midollo spinale e nei gangli, dove sono stati rilevati sia nei neuroni che negli astrociti (Weinstein et al, 1995;. Junge et al., 2004). I PARs nelle cellule neuronali controllano l'eccitabilità, il rilascio di neurotrasmettitori, e la sopravvivenza attraverso la regolazione del [Ca2+] intracellulare (Ubl and Reiser, 1997;. Wang et al, 2002). In particolare, l'attivazione di PAR1 nei neuroni e negli astrociti modula la morfologia cellulare e l’estensione dei processi così come la sopravvivenza cellulare. L'attivazione di PAR1 può produrre effetti bimodali (Vaughan et al, 1995). Bassi livelli di attivazione di PAR1 nei neuroni e negli astrociti esercitano effetti protettivi contro stimoli nocivi, mentre alti livelli di attivazione di PAR1 compromettono la vitalità delle cellule neuronali (Donovan et al, 1997; Acharjee et al., 2011). Nel sistema gastrointestinale, sono espressi tutti i recettori PARs, sebbene molti studi si siano concentrati sul PAR2, che sembra essere di particolare importanza nell'intestino. L'attivazione di PAR1 e di PAR2 stimola la secrezione di Cl- da parte della mucosa intestinale (Buresi et al., 2002; Kong et al., 1997). Le implicazioni funzionali di questa regolazione sono duplici. Innanzitutto, la stimolazione della secrezione del Cl- aumenterebbe la secrezione di fluido, con conseguente diarrea che è il sintomatico dell’infiammazione intestinale. In secondo luogo, una maggiore secrezione durante l'infiammazione intestinale può servire da funzione protettiva, promuovendo l'escrezione delle tossine. Inoltre, nell’esofago la trombina potrebbe avere un duplice effetto, causando contrazione mediante PAR1 e rilassamento mediante PAR4. L'effetto dominante dipenderà dalla concentrazione di trombina; basse concentrazioni attivano preferenzialmente PAR1, mentre sono necessarie alte concentrazioni l’attivazione di PAR4 (Kawabata et al., 2000).
Nella pelle, le cellule dell'epidermide e del derma potrebbero essere regolate da proteasi della cascata della coagulazione. L'infiammazione della pelle è associata ad un afflusso di cellule infiammatorie che rilasciano proteasi che attivano PAR1 e PAR2. Diversi risultati suggeriscono che PAR1 potrebbe svolgere un ruolo nella guarigione delle ferite. L'attivazione di PAR1 stimola la proliferazione dei cheratinociti e dei fibroblasti, ed induce anche l’angiogenesi (Chen et al, 1994;. Algermissen et al., 2000). Nelle vie aeree, durante l'infiammazione ed i traumi, le proteasi potrebbero regolare le cellule polmonari mediante l’attivazione dei PARs. Queste proteasi possono derivare dalla cascata della
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coagulazione, dalle cellule infiammatorie o dalle cellule delle vie aeree. I PARs sono espressi da molti tipi di cellule nelle vie respiratorie. Vi è debole immunoreattività per PAR1 nelle cellule epiteliali ciliate e basali e nelle cellule muscolari lisce della trachea e dei bronchi di ratto (Chow et al, 2000;. Howell et al., 2002). Nel ratto e nell’uomo, immunoreattività per PAR2 è espressa dalle cellule epiteliali ciliate e non ciliate, soprattutto a livello della membrana apicale, così come dalle ghiandole, dalla muscolatura liscia bronchiale, e dalle cellule endoteliali e dalle cellule muscolari lisce vasali (Chow et al., 2000; Cocks and Moffatt, 2001). Vi sono prove che attivatori di PAR2 inducono sia broncodilatazione, che sarebbe protettiva, contro la broncocostrizione dannosa. La prima prova a favore di un ruolo protettivo è venuto dalla constatazione che l'attivazione di PAR2 induce rilassamento dei bronchi isolati di ratto e umani, pre-contratti con carbacolo (Cocks et al, 1999; Cocks and Moffatt, 2001). Gli attivatori di PAR2 stimolano anche la contrazione degli anelli bronchiali umani che è mediata in parte da una attivazione diretta di PAR2 sulle cellule muscolari lisce (Schmidlin et al., 2001).
PAR1 nel cancro:
PAR1 è implicato nella progressione delle neoplasie, ma la modalità con cui questo recettore contribuisce alla crescita delle cellule neoplastiche, all’invasione e alle metastasi non è molto conosciuta. Le proteasi sono state associate con la progressione delle neoplasie a causa della loro capacità di degradare le matrici extracellulari, facilitando l'invasione delle cellule neoplastiche e le metastasi (Mook et al., 2004). In particolare, è stato dimostrato che la trombina gioca un ruolo fondamentale nel comportamento delle neoplasie oltre al suo coinvolgimento nell’emostasi e nella coagulazione del sangue. Questa proteasi è alla base di vari effetti cellulari relative alla crescita neoplastica ed alle metastasi così come un potente attivatore dell'angiogenesi, che è essenziale per la crescita e lo sviluppo di tutti i tumori solidi. Una caratteristica comune nei pazienti affetti da neoplasie è l'elevato livello di formazione della trombina ad opera delle cellule tumorali. E’ stato dimostrato che numerosi tipi di cellule neoplastiche esprimono la proteina transmembrana fattore tissutale (TF), che, quando esposto al FVII in circolo, attiva FX, che porta alla generazione di trombina (Zacharski et al., 1995). Le azioni della trombina nelle neoplasie sono principalmente mediate dalla segnalazione di PAR1. Infatti, il microambiente delle neoplasie è pieno di trombina, che attiva i PARs espressi sulle cellule neoplastiche. PAR1 media la tumorogenesi della trombina dato che questo proteasi innesca il rilascio di fattori di crescita (Daniel et al., 1996), di chemochine e di proteine extracellulari (Papadimitriou et al., 1997) che promuovono la proliferazione e la migrazione delle cellule neoplastiche. I recettori PAR1 hanno anche la capacità di trasdurre segnali in
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risposta a MMP-1, che è prodotta dalle cellule stromali (Boire et al., 2005) e anche in risposta al FXa, che è responsabile per la conversione proteolitica della protrombina in trombina. E 'stato dimostrato che le cellule tumorali sono in grado di sintetizzare e secernere ectopicamente il FVII, indicando che proteasi del sistema della coagulazione possono essere generate nelle neoplasie indipendentemente dalla loro produzione epatica (Koizume et al., 2006). E’ noto che il fattore tissutale associato alle cellule neoplastiche contribuisce alla crescita delle neoplasie (Ruf et al, 2006; Palumbo et al, 2007). Keshava et al. (2013) hanno studiato l'influenza di TF, del recettore per la proteina C delle cellule endoteliali (EPCR) e di PAR1 sulla crescita del mesotelioma pleurico maligno (MPM). Hanno scoperto che la soppressione dell’espressione di TF o di PAR1 nelle cellule di MPM riduceva notevolmente la crescita neoplastica. Al contrario, la sovraespressione di TF nelle cellule di MPM meno aggressivi che esprimono EPCR e PAR1 in assenza di TF non aumentava la loro limitata tumorigenicità. L’espressione ectopica di EPCR nelle cellule di MPM aggressive riduceva il loro potenziale di crescita, mentrela soppressione di EPCR nelle cellule di MPM non aggressivi ingegnerizzate per sovra esprimere TF ne aumentava la tumorigenicità. Questi risultati hanno chiarito il meccanismo con cui TF promuove la crescita neoplastica attraverso PAR1, ed hanno mostrato come EPCR può ridurre la crescita di cellule neoplastiche che esprimono TF (Keshava et al., 2013).
E’ stata evidenziata una correlazione tra il livello di espressione di PAR1 e il fenotipo maligno. Infatti, è stato dimostrato che PAR1 è sovraespresso in molti tumori epiteliali come il melanoma aggressivo, il cancro del colon, il cancro della prostata e il tumore al seno invasivo (Even-Ram et al, 1998;. Chay et al, 2002;. Tellez et al., 2003; Darmoul et al, 2003). Inoltre, la sovraespressione mirata del PAR1 umano nella ghiandola mammaria di topo attiva la via di Wnt e della β-catenina, che è cruciale per la progressione neoplastica in alcuni tipi di neoplasie maligne (Yin et al., 2006). Cisowski et al., (2011) hanno dimostrato una sovraespressione di PAR1 in linee cellulari di adenocarcinoma polmonare (A549, HOP62, H1299, HOP92, H226, H522, H23, e EKVX) ed hanno identificato PAR1 come un potenziale bersaglio terapeutico dell’adenocarcinoma polmonare utilizzando peptidi sintetici in grado di attraversare la membrana cellulare ("pepducine"), con sequenze corrispondenti a quelle della prima (i1) e terza (i3) ansa intracellulare di PAR1. I loro studi hanno dimostrato che le pepducine basate sulle anse i1 ed i3 di PAR1 possono bloccare diverse vie di segnalazione implicate nella migrazione delle cellule di adenocarcinoma polmonare. Per chiarire il ruolo di PAR1 nella sopravvivenza e nel processo metastatico, sono stati condotti altri studi su linee cellulari di adenocarcinoma mammario (Yang et al., 2009a).
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Mesotelioma Pleurico Umano
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore aggressivo derivante dalle cellule mesoteliali che rivestono la pleura del polmone (Ismail Khan et al., 2006). Dal punto di vista anatomo patologico, il MPM è diviso in tre principali sottotipi istologici:
1) Epiteliode 2) Sarcomatoide
3) Bifasico con cellule sia epiteliodi che sarcomatoidi (Husain et al., 2009).
Il tipo epitelioide è il sottotipo più comune tra i pazienti affetti da mesotelioma pleurico (<50%) (Pinto et al., 2013). Il mesotelioma è una neoplasia insidiosa a causa del suo lungo periodo di latenza, in alcuni casi fino a 40 anni dopo l'esposizione all'amianto. I sintomi più comuni sono relativamente non specifici, come la mancanza del respiro ed il dolore, la stanchezza, la tosse e la sudorazione. Pertanto, nei pazienti con MPM la patologia viene di solito diagnosticata in uno stadio avanzato. Inoltre, gli strumenti diagnostici radiologici ed i biomarcatori sierici non sono efficaci per una diagnosi precoce. Questa neoplasia è resistente alla chemioterapia ed alla radioterapia con un tempo medio di sopravvivenza dei pazienti con MPM di meno di 12 mesi (Robinson et al., 2005). L'incidenza del MPM è in aumento in quasi tutto il mondo, e si prevede che continui ad aumentare nei prossimi 10-20 anni a causa della diffusa esposizione all’amianto negli ultimi decenni (Robinson et al., 2005).
Patogenesi del MPM
L'esposizione a fibre di amianto nell'aria è la causa principale per lo sviluppo del MPM (Rascoe et al., 2012). Le fibre di amianto sono un gruppo di minerali fibrosi di magnesio silicato idrato. L'amianto è tipicamente utilizzato per la costruzione delle navi, del cemento e dei pannelli dei controsoffitti e delle piscine. Le fibre di amianto inalate sono intrappolati nei polmoni, dove iniziano una risposta infiammatoria. In particolare, le fibre vengono fagocitate nelle cellule mesoteliali ed avviano una cascata di eventi oncogenici (Heintz et al., 2010). A causa dell’esposizione occupazionale, il MPM è più comune negli uomini rispetto alle donne (rapporto 5: 1) (Nasreen et al 2012). Anche se l'esposizione all'amianto ha un ruolo fondamentale nel promuovere eventi sia cellulari che molecolari che portano allo sviluppo del MPM, altri fattori come la genetica, le alterazioni epigenetiche ed il virus SV-40 contribuiscono alla sua patogenesi (Rascoe et al., 2012).
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Diversi fattori di crescita ed i loro recettori sono stati implicati nell’oncogenesi, nella progressione e nella resistenza alla terapia del MPM (Rascoe et al., 2012). Per esempio, i recettori tirosin chinasici (RTK), spesso attivati nelle cellule maligne, portano ad una costitutiva up-regulation della vie della fosfoinositide-3 chinasi (PI3K)/Akt e delle proteine chinasi attivate da mitogeni (MAPK), implicate nella proliferazione e nella sopravvivenza cellulare ( Brevet. et al., 2011). L’attivazione del sistema di segnalazione bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) che è una via a valle PI3K/Akt contribuisce alla patogenesi di molti tipi di neoplasie. In pazienti con MPM è stato dimostrato che un'alterazione della via di segnalazione PI3K/Akt/ mTOR si associa ad una sopravvivenza abbreviata (Varghese et al., 2011). La chemochina CXCL12 ed il suo recettore CXCR4, che appartiene alla grande famiglia dei GPCRs, sono stati ritrovati altamente espressi in linee cellulari di mesotelioma pleurico maligno(MPM) e nei tessuti neoplastici (Li et al., 2011). CXCL12 è anche un fattore di attivazione funzionale di percorsi a valle di Akt, suggerendo che possono essere coinvolti nella progressione neoplastica e nella sopravvivenza dei pazienti con MPM (Li et al., 2011). Come accennato in precedenza, una più recente ricerca collega il TF ed i livelli di PAR1 alla tumorigenicità del MPM (Keshava et al., 2013).
Trattamento del Mesotelioma Pleurico Maligno
Il trattamento del MPM può essere classificato in procedure radicali come la chirurgia ed in misure palliative che riguardano la rimozione dei versamenti pleurici e la prevenzione delle loro recidive con lo scopo di alleviare i sintomi come la dispnea ed il dolore toracico. Le tre procedure chirurgiche più utilizzate sono:
1) Pleurodesi,
2) Pleurectomia/decorticazione (P/D),
3) Pneumonectomia extrapleurica (PPE), che è stata utilizzato come procedura standard per molti anni.
Sia la P/D che la PPE sono procedure cito-riduttive il cui scopo è il controllo locale del MPM. Il PPE consiste in una escissione radicale di un intero polmone, della pleura viscerale e parietale, del pericardio e del diaframma con ricostruzione, mentre il P/D permette la rimozione della pleura viscerale, parietale e pericardica; è tecnicamente meno impegnativo del PPE, e quindi può essere eseguito nella maggior parte delle strutture chirurgiche.
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Secondo la Fondazione Mesotelioma e Chirurgia Radicale, uno studio controllato multicentrico randomizzato (Treasure et al., 2011) ha mostrato che i pazienti con MPM trattati con P/D hanno da un risultato uguale a migliore rispetto a quelli trattati con EPP il che ha sollevato la questione se l'esecuzione del P/D in associazione con la chemioterapia preoperatoria possa avere migliori risultati con una mortalità operatoria inferiore del PPE e la chemioterapia perioperatoria (Flores et al., 2008). Tuttavia, il ruolo della chirurgia nella gestione del MPM è ancora dibattuto (Flores et al., 2008). Flores et al. (2007) hanno osservato una sopravvivenza globale di soli 10 mesi nei pazienti che non sono stati sottoposti a qualsiasi intervento chirurgico e di 14-15 mesi in coloro che sono stati sottoposti a resezione chirurgica.
Un altro approccio, quando i pazienti non sono buoni candidati per la chirurgia, è la chemioterapia. La terapia combinata con pemetrexed e cisplatino viene considerato come trattamento standard per i pazienti affetti da mesotelioma ed uno studio ha dimostrato un effetto benefico sulla sopravvivenza, con sopravvivenza mediana di 12,1 mesi rispetto a 9,3 mesi per i pazienti trattati con il solo cisplatino (Vogelzang et al., 2003). Allo stato attuale, i ricercatori si stanno concentrando su come ottenere nuovi farmaci mirati, con una migliore finestra di efficacia-tossicità ed effetti collaterali minimi. Un importante segno distintivo delle neoplasie maligne è la capacità delle cellule neoplastiche di sostenere la segnalazione proliferativa mediante l’aumento della produzione di fattori di crescita (Hanahan e Weinberg, 2011). Pertanto, numerosi anticorpi monoclonali sono stati sfruttati farmacologicamente per bloccare l’attivazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del recettore del fattore di crescita simil-insulinico (IGFR), come per esempio il cetuximab in pazienti con tumore non a piccole cellule del polmone (NSCLC) (Agarwal et al ., 2011; Pirker et al, 2012) ed il cixutumumab nei pazienti con MPM (Kalra et al, 2012). Altri anticorpi monoclonali sono in fase di sviluppo clinico. Ad esempio, amatuximab è un anticorpo monoclonale chimerico contro la mesotelina, una proteina presente nelle normali cellule mesoteliali e sovraespressa nel mesotelioma. E’ stato iniziato uno studio di fase II con amatuximab in combinazione con cisplatino e pemetrexed come prima linea di impostazione nei pazienti con MPM non resecabile (Hassan et al., 2014). Tremelimumab, un anticorpo monoclonale interamente umano specifico per l’antigene associato ai linfociti T umani citotossici (CTLA-4) che induce l'attivazione immunitaria, è in fase di sviluppo clinico per i pazienti con mesotelioma pleurico maligno (Calabrò et al., 2013).
I recenti progressi nel massiccio sequenziamento in parallelo di campioni di neoplasie sono stati utilizzati per comprendere il profilo genomico di mesotelioma. Le alterazioni genetiche, che sono considerate associate al MPM ed eventualmente guidano lo sviluppo e la progressione della neoplasia (Mossmann et al., 2013), possono fornire una sfida per sviluppare nuove terapie mirate per
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il trattamento farmacologico (Scagliotti et al., 2014). I ricercatori si stanno concentrando sullo sviluppo di nuovi inibitori della via di segnalazione PI3K/Akt/mTOR dal momento che è stato dimostrato che questo percorso di segnalazione è aberrantemente attivato nel MPM (Altomare et al., 2005). Attualmente, everolimus, un inibitore di mTOR, è nella fase II di sperimentazione clinica in pazienti con MPM (Ou et al., 2015).
Obiettivo del presente studio:
Numerose evidenze collegano l’espressione e l’attivazione aberrante dei GPCRs a diversi tipi di neoplasie umane (Dörsam et al, 2007; Lappano et al, 2011). Tra i GPCRs, è stato riportato che il sottotipo PAR1 è coinvolto nella progressione neoplastica, nell’invasione e nelle metastasi ed è anche implicato nella patogenesi di alcune neoplasie. Inoltre, è stato evidenziata una correlazione tra il livello di espressione di PAR1 ed il fenotipo maligno (Tellez et al, 2003;. Darmoul et al, 2003;. Chay et al., 2002;. Anche-Ram et al, 1998). PAR1 può essere considerato come un futuro potenziale bersaglio farmacologico e pertanto è molto importante ottenere maggiori informazioni sui suoi livelli di espressione e sulle sue modalità di segnalazione in un certo ambito patologico. Sulla base di queste conoscenze, gli obiettivi di questo studio sono stati quelli di indagare i livelli di espressione e le vie di segnalazione di PAR1 in linee cellulari di mesotelioma pleurico maligno ed in cellule mesoteliali non trasformate.
Abbiamo così trovato che il livello di espressione di PAR1 è nettamente maggiore nelle cellule di una linea cellulare di mesotelioma pleurico maligno (NCI-H28) rispetto ad una linea cellulare di mesotelio umano (Met-5A) ed a cellule mesoteliali primarie umane. Inoltre, i nostri risultati mettono in evidenza che le vie di segnalazione attivate da PAR1 nelle cellule NCI-H28 sono nettamente alterate rispetto a quelle delle cellule mesoteliali non trasformate.
E’ stato messo in evidenza negli ultimi anni, il ruolo di PAR1 nella progressione del MPM (Keshava et al., 2013) e le nostre osservazioni possono sicuramente contribuire a chiarire l’importanza del coinvolgimento di questo recettore in questa neoplasia.
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MATERIALI E METODI
Materiali
Penicillina, streptomicina, idrocortisone, cAMP, 4- (3-butoxy-4-metossibenzil)-2-imidazolidinone, cocktail di inibitori delle proteasi, isoproterenolo ed anticorpi secondari sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA). Le cellule endoteliali di microvascolatura umana 1 (HMEC-1) (Ades et al., 1992) è stato un generoso regalo del Dott. E.W. Ades (Centers for Disease Control, Atlanta, GA, USA), mentre le cellule NCI-H28 e Met-5A sono state acquistate da LGC Standards srl (Middlesex, Regno Unito). Le cellule REN di mesotelioma (Smythe et al, 1994;.. Pinton et al, 2010) sono state un generoso dono di L. Moro (Università del Piemonte Orientale '' A. Avogadro '', Italia), mentre le cellule di mesotelioma Mero-14 (Versnel et al. , 1989) ed Ist-Mes2 (Orengo et al., 1999). Sono state gentilmente donate dall'Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro (IST), Genova (Italia). Le cellule mesoteliali umane primarie ed il loro terreno di coltura (MSO-1) sono stati acquistati da Zen-Bio, Inc (Research Triangle Park, NC, USA). I mezzi per le colture cellulari (Medium 199, MCDB-131, RPMI-1640 e DMEM), il siero fetale bovino (FBS), la tripsina-EDTA, il fattore di crescita epidermico (EGF), la L-glutammina, l'insulina ricombinante umana, le membrane di nitrocellulosa, il Fluo-3 AM e l’acido pluronico sono stati acquistati da life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). Il kit WST-1 è stato acquistato da Roche Life Science (Basilea, Svizzera). Il kit per l’analisi dell’attivazione di RhoA è stato ottenuto da Cytoskeleton Inc. (Denver, CO, USA). L’antagonista di PAR1, SCH 79797, ed il PAR1-AP selettivo, TFLLR-NH2, erano prodotti di Tocris Bioscience (Bristol, UK). Il PAR1-AP non selettivo, SFLLRN-NH2, è stato sintetizzato nel laboratorio della Prof.ssa A.M. D'Ursi (Dipartimento di Farmacia dell'Università degli Studi di Salerno, Fisciano, Italia) utilizzando una strategia in fase solida convenzionale basata sulla chimica di protezione Fmoc/tBu come descritto in precedenza (D'Ursi et al., 2006). L’α-trombina umana (attività, ≥ 2.800 U/mg di proteina) era un prodotto della Calbiochem (Merck Biosciences, Billerica, MA, USA). Il kit RNeasy Mini ed il kit per PCR SYBR Green sono stati acquistati da Qiagen GmbH (Hilden, Germania). Il kit trascriptasi Rev era un prodotto di New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Un anticorpo policlonale anti-PAR1 è stato acquistato dalla Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA), mentre un anticorpo monoclonale anti-PAR1 era di Abnova (Taipei City, Taiwan). Altri agenti e reagenti provenivano da fonti commerciali standard ed erano della migliore qualità disponibile.
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Colture cellulari
Le cellule HMEC-1 sono state coltivate in terreno MCDB-131 con il supplemento di 5% FBS, 1% di penicillina/streptomicina (100 unità/ml, 100 µg/ml), idrocortisone (1 µg/ml), fattore di crescita epidermico (0,01 mg/ml) e L-glutamina (2 mM). Le cellule Met-5A sono state coltivate nel Medium 199 in presenza di 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina (100 unità/ ml, 100µg/ml), idrocortisone (400 nM), EGF (3,3 nM) ed insulina umana ricombinante (870 nM ). Le cellule mesoteliali primarie sono state coltivate nel mezzo MSO-1 (Medium 199 integrato con FBS, EGF, penicillina, streptomicina ed anfotericina-B secondo le istruzioni del produttore. Le cellule NCI-H28 e REN sono state coltivate nel terreno RPMI-1640 con il supplemento di 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina (100 unità/ml, 100 µ g/ ml). Le cellule Ist-Mes2 e Mero-14 sono state coltivate nel terreno DMEM contenente 4,5 g/ ml di glucosio e 3,97 mM L-glutammina con il supplemento del 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina (100 unità/ml, 100 µg/ml). Le cellule sono state normalmente propagate nei loro terreni di crescita, tranne che prima degli esperimenti sono state coltivate in RPMI-1640. Tutte le cellule sono state coltivate a 37°C ed in presenza del 5% CO2 in atmosfera umidificata.
Analisi Western blot
Le cellule primarie di mesotelialio umano sono state coltivate nel mezzo MSO-1 fino alla confluenza; le cellule Met-5A, NCI-H28, REN, Mero-14, e IstMes2 sono state coltivate in terreno RPMI completo fino alla loro confluenza. Le cellule sono state lavate con tampone fosfato salino (PBS) e lisate in tampone RIPA modificato (PBS, pH 7,4, 1% Igepal, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS e 10µl/ml di un cocktail di inibitori delle proteasi). Le cellule lisate sono stati centrifugate a 14.000 g a 4°C per 45 minuti; il surnatante è stato raccolto ed analizzato per la concentrazione proteica utilizzando il kit Bio-Rad DC (Bio-Rad, Hercules, CA). Trenta microgrammi di proteina per ciascuna linea cellulare sono stati caritati su di un gel di poliacrilamide al 12% e separati mediante SDS-PAGE; successivamente le bande proteiche sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa. La membrana è stata bloccata, lavate ed incubata con l’anticorpo primario. Il segnale è stato visualizzato utilizzando un sistema di rilevazione chemiluminescente (Western Lightning® Plus ECL). Le immagini sono state acquisite mediante lo strumento LAS4010 (GE Healthcare Life-Sciences, Pittsburgh, PA, USA). L'intensità delle bande immunoreattive è stata misurata mediante scansione densitometrica utilizzando Immagine Quant TL 1D, versione 7.0 (GE Healthcare LifeSciences, Pittsburgh, PA, USA). Le membrane di nitrocellulosa saggiate con l’anticorpo
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PAR1 sono state successivamente lavate dell’anticorpo e risaggiate con un anticorpo anti-β-actina.
Real-time RT-PCR
E’ stata utilizzata la reazione a catena della polimerasi (PCR) per verificare l'espressione del mRNA codificante PAR1 nelle cellule Met-5A e NCI-H28. L'RNA è stato isolato utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen) ed è stato saggiato per l'integrità mediante elettroforesi su gel. Sei µl di RNA totale per ogni campione sono stati retrotrascritti a cDNA utilizzando il kit specifico Rev Transcription (New England Biolabs). In seguito, 3 µl di cDNA sono stati amplificati in presenza di SYBR Green utilizzando pecifici primer oligonucleotidici per la sequenza di PAR1, come qui di seguito riportato:
• Forward primer: 5'-TGCTTCAGTCTGTGCGG-3 '
• Reverse primer: 5'-CTCCATCAATAAAAGCAGTCCTCT-3 '
La PCR è stata eseguita per 35 cicli con le seguenti condizioni: dopo l'attivazione iniziale di Taq a 94°C per 5 min, ogni ciclo consisteva di denaturazione a 95°C per 1 min, annealing a 50°C per 30 sec e estensione a 72°C per 1 min, con un allungamento finale a 72°C per 7 minuti .
L’espressione relativa di PAR1, con la β-actina come il gene di riferimento, è stato determinato utilizzando il MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Inc., Hercules , CA, USA). I dati sono presentati come rapporti di espressione normalizzati rispetto alla β-actina.
Saggio di proliferazione cellulare
La proliferazione cellulare è stata valutata utilizzando il WST-1 kit (Roche Life Science) seguendo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule Met-5A e NCI-H28 sono state piastrate alla densità di 3x103 cellule/pozzetto in piastre a 96 pozzetti e sono state incubate tutta la notte. Quindi le cellule sono state incubate nel mezzo di coltura privo di siero e di fattori di crescita per 12 ore, e stimolate con e senza agonisti per 72 ore. Dopo di che, 10 µl del reattivo WST-1 è stato aggiunto a ciascun pozzetto, agitato delicatamente per un minuto e le cellule sono state incubate per altre 2 ore a 37°C. Durante l'incubazione, le cellule vitali convertono il reagente WST-1 nel colorante formazano mediante l’azione della deidrogenasi mitocondriale. Dopo l’incubazione, il colorante formazano è stato quantificato misurando l'assorbanza di ogni campione contro il bianco alla lunghezza d’onda di 450 nm utilizzando il lettore di micro piastrra Wallac 1420 (PerkinElmer, Inc., Boston, MA, USA).
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Misurazione del [Ca2+] intracellulare
PAR1 provoca il rilascio del Ca2+ intracellulare mediante l’attivazione delle proteine Gq. L'aumento di [Ca2+] intracellulare è stato valutato misurando le variazioni di fluorescenza dopo la stimolazione con agonisti delle cellule trattate con Fluo-3 AM, utilizzando il lettore di micropiastre Wallac 1420 (PerkinElmer, Inc., Boston, MA, USA). Le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto (HMEC-1) o di 1,5 x 104 cellule/pozzetto (Met-5A e NCI-H28) in terreni di crescita completi. Dopo l'adesione, le cellule sono state incubate in mezzi di coltura previ di FBS e fattori di crescita ma contenenti albumina sierica bovina (BSA) per 3 ore a 37°C. Prima del saggio, le cellule sono state lavate due volte con il tampone di caricamento (20 mM Hepes, 0,83 mM Na2HPO4, 0,17 mM NaH2PO4, pH 7.4, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, e 1 mM MgSO4) contenente 25 mM mannosio, 1 ml/ml BSA e 2,5 mM probenecid e quindi incubate in 100 µl dello stesso tampone contenente 6 µM Fluo-3 AM/0,024% acido pluronico. Il Fluo-3 AM è una sonda fluorescente che può penetrare all'interno delle cellule e qui essere idrolizzata dalle esterasi intracellulari nella sua forma attiva. Il probenecid riduce, invece, ogni possibile fuoriuscita di Fluo-3 AM dalle cellule, poiché è un inibitore del trasportatore non specifico di anioni organici. Dopo 1 h a 37°C, le cellule sono state lavate due volte con il tampone di caricamento ed incubate in 100 µl dello stesso tampone per un’altra ora a 37°C per rimuovere l'eccesso di colorante. La fluorescenza è stata registrata in condizioni basali e ogni 3 secondi dopo l’aggiunta di trombina (10 nM) o di PAR1-AP (10 µM) per un tempo totale di 120 secondi.
Misurazione del cAMP intracellulare
L’attivazione di PAR1 provoca la riduzione dell'accumulo di cAMP mediante le proteine Gi. I livelli intracellulari di cAMP sono stati misurati utilizzando un metodo di legame competitivo ad una proteina. Le cellule Met-5A e NCI-H28 sono state seminate ad una densità di 4 x 104 cellule/pozzetto in piastre a 24 pozzetti. Dopo 24 h, le cellule sono state incubate per 15 min nel mezzo di coltura privo di FBS e fattori di crescita contenente 20 mM 4-(3-butossi-4-metossibenzil)-2-imidazolidinone e quindi esposte a diverse concentrazioni di trombina o di un PAR1-AP selettivo in presenza ed assenza di 100 nM SCH 79797 per 15 min. I dosaggi sono stati iniziaticon l'aggiunta di 1µM isoproterenolo. La reazione è stata bloccata mediante la rimozione del mezzo e l'aggiunta di 0,4 N HCl. Dopo 30 min, i lisati sono stati neutralizzati con 4 N KOH, e la sospensione centrifugati a 800 g per 5 min. Per misurare la produzione di cAMP, la proteina surrenalica bovina legante il cAMP è stata incubata con [3H]-cAMP (2 nM) e 50 µL di lisato cellulare o cAMP standard (0-16 pmol) a 0°C
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per 150 minuti in un volume totale di 300 µL . La radioattività legata è stata separata mediante filtrazione rapida attraverso filtri di fibra di vetro GF/C, e quindi i filtri sono stati lavati due volte con 4 ml di 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. La radioattività è stata misurata mediante spettrometria a scintillazione liquida.
Saggio di attivazione di RhoA
L’attivazione di Rho è stata misurata utilizzando un kit di rilevazione di Cytoskeleton. Le cellule Meri-5A e NCI-H28 sono state coltivate a confluenza ed icubate nel mezzo di coltura privo di siero per 18 ore. Successivamente, le cellule sono state stimolate con 10 nM trombina o con 10 µl PAR1 -AP selettivo per un tempo compreso tra 0 e 2 minuti. Le cellule sono state lavate con PBS e lisate con 500 µL di tampone di lisi contenente inibitori della proteasi a 0°C. I lisati sono stati centrifugati a 10000 g per 3 minuti a 4°C e quindi sono stati trasferiti in una piastra a 96 pozzetti del kit di RhoA GLISA®. L'assorbanza di ciascun campione è stata misurata alla lunghezza d’onda di 490 nm utilizzando il lettore Wallac 1420 (PerkinElmer, Inc., Boston, MA).
Analisi dei dati
L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il programma informatico GraphPad Prism versione 4.0 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). I valori rappresentano le medie ± S.E.M. di almeno tre esperimenti indipendenti. La significatività statistica delle differenze di valore è stata valutata mediante test ANOVA seguita dal test di confronto multiplo di Bonferroni.
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RISULTATI
I PARs sono coinvolti in diversi processi fisiopatologici, compresa la patogenesi di alcuni tumori maligni. In particolare, è stata riportata una correlazione tra il livello di espressione di PAR1 ed il fenotipo maligno. E 'stato dimostrato che PAR1 è sovra-espresso in numerose di neoplasie come il melanoma aggressivo, il cancro del colon, il cancro della prostata ed il tumore al seno invasivo (Tellez et al, 2003;. Darmoul et al, 2003;.. Chay et al, 2002; Even-Ram et al, 1998).
Perciò, abbiamo deciso di indagare l'espressione e le modalità di segnalazione di PAR1 nelle cellule mesoteliali ed in quelle di mesotelioma pleurico maligno per valutare il possibile ruolo di questo recettore nella proliferazione cellulare del mesotelioma. Per questo lavoro abbiamo utilizzato la linea cellulare di mesotelioma pleurico maligno, NCI-H28, che è caratterizzata da una delezione omozigote del gene della β-catenina (CTNNB1) e da una sotto-regolazione dell'espressione della trombomodulina mediante un meccanismo epigenetico (Shigemitsu et al, 2001;. Nocchi et al., 2011). L'espressione di trombomodulina, una proteina transmembrana glicosilata che si lega con alta affinità alla trombina inibendone l'attività enzimatica e accelerando l'attivazione della proteina C, è ridotta nel tessuto di MPM rispetto mesotelio normale (Nocchi et al., 2011). Inoltre, in vari tipi di neoplasie maligne, la mancata o ridotta espressione di trombomodulina è stata associata a prognosi infausta (Ogawa et al, 2000;. Liu et al., 2010).
Il PAR1 è sovraespresso nelle cellule NCI-H28
Per valutare il livello espressione della proteina PAR1 nelle linee cellulari di mesotelioma maligno (NCI-H28, REN, Ist-Mes2 e Mero-14) e nelle cellule mesoteliali non trasformate, è stata eseguita l'analisi immunoblot seguita da quantificazione densitometrica. L’analisi immunoblot ha mostrato una banda di 48 kDa corrispondente a PAR1 nei lisati delle linee cellulari Met-5A, NCI-H28 e di altri tre mesotelioma pleurico maligno (Ist-Mes2, REN e Mero-14), mentre erano rilevabili due bande sottili negli immunoblot delle cellule mesoteliali primarie (Figura 4C). La comparsa di due bande non è stata una sorpresa dato che il PAR1 umano contiene più siti consenso per la glicosilazione e diversi studi hanno rivelato negli immnoblot bande proteiche comprese tra 40 e 100 kDa (Vouret-Craviari et al, 1995;. Soto e Trejo, 2010). Tuttavia, l'espressione della proteina PAR1 è inferiore nelle cellule mesoteliali primarie rispetto alle cellule Met-5A (Figura 4A e 4C). Nelle cellule NCI-H28, il livello di espressione della proteina è risultata significativamente aumentato rispetto sia alle cellule mesoteliali primarie che alle cellule Met-5A (Figura 4A e 4C). Nelle altre linee cellulari di
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mesotelioma pleurico maligno, i livelli della proteina PAR1 sono essenzialmente simile a quello presente nelle cellule Met-5A. Pertanto, l'aumento dell'espressione PAR1 è una caratteristica unica della linea cellulare NCI-H28. In seguito, abbiamo valutato, mediante real-time RT-PCR, il livello di espressione di mRNA codificante per PAR1 nelle cellule NCI-H28 e nelle Met-5A. Abbiamo osservato che nelle cellule NCI-H28, il livello di mRNA codificante per PAR1 è significativamente aumentato rispetto alle cellule Met-5A (Figura 4B). Nel complesso, si può ipotizzare che l'aumentata espressione di PAR1 nelle cellule NCI-H28 sia il risultato di una maggiore trascrizione genica, anche se possono essere coinvolti meccanismi che inducono una maggiore stabilità o del mRNA o della proteina PAR1 e del mRNA
Figura 4: Nelle cellule NCI-H28, il livello di espressine di PAR1 è risultato significativamente aumentato rispetto
alle cellule mesoteliali primarie ed alle cellule Met-5A. (A) Livelli di espressione relativa della proteina PAR1 determinati mediante l’analisi immunoblot seguita da quantificazione densitometrica. (B) Livelli di espressione relativa, determinati mediante real-time RT-PCR, del mRNA codificante per PAR1 nelle cellule Met-5A e nelle NCI-H28. I dati sono espressi come unità arbitrarie (variazione rispetto al controllo, le cellule Met-5A) dopo la normalizzazione con la β-actina e sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. * p ≤ 0,05; *** p ≤ 0,001 ottenuti mediante test ANOVA seguito dalla comparazione multipla di Bonferroni. (C) Un immunoblot rappresentativo.
Gli agonisti PAR1 stimolano la proliferazione delle cellule Met-5A e delle NCI-H28
In una fase successiva dello studio, abbiamo deciso di esaminare se nelle cellule NCI-H28 PAR1 è funzionalmente attivo valutando la proliferazione cellulare indotta da trombina o da PAR1-AP. Le cellule Met-5A e NCI-H28 sono state incubate in presenza di diverse concentrazioni di trombina o di
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PAR1-AP per 72 ore. Dopo stimolazione con trombina sia le cellule Met-5A che le NCI-H28 hanno mostrato un aumento significativo della proliferazione cellulare a 72 ore (Figura 5A). Tuttavia, il profilo della risposta proliferativa era piuttosto diverso nelle cellule NCI-H28 rispetto a quello delle cellule Met-5A. Nelle cellule Met-5A, la risposta proliferativa è massima ad 1 nM trombina con una progressiva diminuzione fino a 50 nM, mentre nelle cellule NCI-H28 è stata raggiunta la massima risposta a 50 nM (Figura 5A). Il PAR1-AP non selettivo, SFLLRN-NH2, è meno efficace della trombina nello stimolare la proliferazione delle cellule Met-5A e delle NCI-H28 (Figura 5B). Un aumento del 24-28% della proliferazione cellulare è stato raggiunto alle concentrazioni di 10 e 100 µM di SFLLRN-NH2 rispettivamente nelle cellule Met-5A e nelle NCI-H28 (Figura 5B). Il PAR1-AP selettivo, TFLLRNH2, è meno efficace nello stimolare la proliferazione cellulare rispetto a SFLLRN-NH2, ma una concentrazione di 100 µM causa un aumento del 20% della proliferazione delle cellule NCI-H28 (Figura 5C). Questi risultati evidenziano che i PAR1-AP non si comportano esattamente come la trombina nello stimolare la proliferazione cellulare.
Figura 5: Gli agonisti di PAR1 stimolano la proliferazione delle cellule Met-5A e delle NCI-H28. Le cellule Met-5A
e NCI-H28 sono state seminate alla densità di 3 x 10 3cellule/pozzetto, incubate in mezzo di coltura privo di FBS e fattori
di crescita per 18 ore e poi trattate con differenti concentrazioni di agonisti per 72 h. La proliferazione cellulare è stata misurata usando un saggio che valuta l’attività mitocondriale (WST- 1). (A) proliferazione cellulare indotta dalla trombina. (B) proliferazione cellulare indotta dal PAR1-AP non selettivo. (C) La proliferazione cellulare indotta dal PAR1-AP selettivo. I dati indicati sono la media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti condotti in triplicato. Sono indicate le differenze di proliferazione tra il controllo e le cellule trattate con agonisti che sono risultate significative (* p ≤ 0,05; p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001) ottenuti secondo il test ANOVA seguito dal test di comparazione multipla di Bonferroni. Ctrl 1 nM Thr 10 n M T hr 50 n M T hr Ctrl 1 nM Thr 10 n M T hr 50 n M T hr 50 100 150 Met-5A NCI-H28 A *** *** *** *** ** ** A b s o rb a n c e 4 5 0 n m (% C tr l) Ctrl 2 M S FLLR N-N H µ 1 2 M S FLLR N-N H µ 10 2 M S FLLR N-N H µ 100 Ctrl 2 M S FLLR N-N H µ 1 2 M S FLLR N-N H µ 10 2 M S FLLR N-N H µ 100 50 100 150 B *** *** ** * ns ns A b s o rb a n c e 4 5 0 n m (% C tr l) Ctrl 2 M T FLLR -NH µ 1 2 M T FLLR -NH µ 10 2 M T FLLR -NH µ 100 Ctrl 2 M T FLLR -NH µ 1 2 M T FLLR -NH µ 10 2 M T FLLR -NH µ 100 50 100 150 C * ns ns ns ns ns A b s o rb a n c e 4 5 0 n m (% C tr l)
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Alcune vie di segnalazione attivate da PAR1 sono disfunzionali nelle cellule NCI-H28
Poiché le cellule NCI-H28 iper esprimono il recettore PAR1, ma rispondono con la proliferazione solo a concentrazioni di agonisti più alte rispetto alle cellule di controllo, Met-5A, ci siamo chiesti se le vie di segnalazione attivate da PAR1 erano tutte egualmente attive in queste cellule del mesotelioma pleurico maligno(MPM). In primo luogo, abbiamo studiato la via di segnalazione Gq-mediata attivata da PAR1, analizzando la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare indotta dalla stimolazione delle cellule sia con trombina che con un PAR1-AP selettivo. Come indicato dall’aumento della fluorescenza, sia la trombina (10 nM) che il PAR1-AP (10 µM ) inducono un rapido e transitorio aumento del [Ca2+]i nelle cellule Met-5A e nelle HMEC-1 (Figura 6A e 6B) . Al contrario, la stimolazione con trombina o con PAR1-AP delle cellule NCI-H28 determina solo un ridotto incremento della [Ca2+] intracellulare (Figura 6A e 6B).
Figura 6: Via di segnalazione Gq-mediata indotta da agonisti PAR1 nelle cellule NCI-H28. (A) Mobilizzazione del
Ca2+ intracellulare indotta da trombina (10 nM) nelle cellule Met-5A, HMEC-1 e NCI-H28. (B) Mobilizzazione del Ca2+
intracellulare indotta da PAR1-AP (10 µM) nelle cellule Met-5A, HMEC-1 e NCI-H28. Le cellule sono state caricate con Fluo-3 AM e la fluorescenza è stato registrata prima della stimolazione con l’agonista (F0) e poi ogni 3 secondi dopo l’aggiunta di trombina o di PAR1-AP per un tempo totale di 120 secondi. I risultati sono riportati come fluorescenza relativa (RF = F/F0 dove F0 è la fluorescenza basale e F è la fluorescenza registrata dopo la stimolazione delle cellule con l'agonista). I dati indicati sono media ± SEM di almeno tre esperimenti indipendenti condotti in triplicato.
Per verificare l'integrità funzionale del percorso di segnalazione mediato da Gi, abbiamo analizzato l’inibizione indotta da trombina o da PAR1-AP dell’accumolo di cAMP stimolato da isoproterenolo sia nelle cellule Met-5A che nelle NCI-H28. Nelle cellule Met-5A, la trombina ha un effetto bifasico sull’accumulo di cAMP. Infatti a concentrazioni tra 10 pM ed 1 nM, la trombina inibisce la produzione di cAMP stimolata da isoproterenolo in modo concentrazione dipendente raggiungendo il
0 25 50 75 100 125 0 1 2 3 HMEC-1 (Thr) Met-5A (Thr) NCI-H28 (Thr) A Time (sec) R e la ti v e F lu o re s c e n c e 0 25 50 75 100 125 0 1 2 3 4 5
Met-5A (PAR1-AP)
NCI-H28 (PAR1-AP) B Time (sec) R e la tiv e F lu o re s c e n c e
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50% di inibizione a 1 nM (Figura 7A). Tuttavia, a concentrazioni più elevate (da 1 nM a 100 nM) l’effetto inibitorio della trombina diminuisce progressivamente. Nelle cellule NCI-H28, la trombina inibisce l’accumulo di cAMP in modo concentrazione dipendente raggiungendo il 50% di inibizione e l'inibizione massimale (circa il 70%), rispettivamente, ad 1 nM e 100 nM (Figura 7A). Nelle cellule Met-5A la presenza di SCH 79797 riduce significativamente l'effetto inibitorio dato dalla trombina indicando, così, che PAR1 media tale inibizione. Nelle cellule NCI-H28, la presenza di SCH 79797 induce uno spostamento significativo verso l'alto della curva di inibizione e l'inibizione massimale a 100 nM è solo del 42% indicando che l'effetto inibitorio sull’accumulo di cAMP è parzialmente mediato da PAR1. Varie concentrazioni del PAR1-AP selettivo non provocano alcuna inibizione della produzione di cAMP stimolata da isoproterenolo sia nelle cellule Met-5A e nelle NCI-H28 (Figura 7B) dimostrando la selettività funzionale di questo agonista peptidico.
Figura 7: La segnalazione mediata da Gi indotta da agonisti PAR1 è alterata nelle cellule NCI-H28. (A) Inibizione della produzione di cAMP stimolata da isoproterenolo nelle cellule Met-5A e NCI-H28 a diverse concentrazioni di trombina in presenza ed assenza di 100 nM SCH 79797. (B) Varie concentrazioni del PAR1-AP selettivo non causano alcuna inibizione della produzione di cAMP stimolata da isoproterenolo. La produzione di cAMP è stata misurata usando
un saggio competitivo che prevede l’uso della proteina del surrene bovino che lega il cAMP e di [3H]cAMP. I dati
riportati sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato. Le differenze tra le cellule trattate con trombina e quelle trattate con trombina più SCH79797 sono risultate significative (** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001) come determinato mediante il test ANOVA seguito dall’analisi di comparazione multipla secondo Bonferroni.
Nella fase successiva, abbiamo analizzato la via di segnalazione mediata da G12/13 attivata da PAR1 misurando l’attivazione di RhoA dopo stimolazione delle cellule sia con trombina che con PAR1-AP. Nelle cellule Met-5A, 10 nM trombina induce un significativo aumento di 2,5 volte dell’attivazione di RhoA, mentre nelle cellule NCI-H28 l'aumento è stato solo di 1,2 volte (Figura 8A). Il PAR1-AP selettivo (10 µM ) è meno efficace della trombina nello stimolare attivazione di RhoA nelle cellule
-12 -11 -10 -9 -8 -7 0 25 50 75 100 Met-5A (Thr) NCI-H28 (Thr) Met-5A (Thr + SCH 79797) NCI-H28 (Thr + SCH 79797) A ** *** *** *** ** ** ** ** *** *** ** Log [Thrombin] (M) c A M P p ro d u c tio n (% C tr l) -8 -7 -6 -5 -4 -3 0 25 50 75 100
Met-5A (PAR1-AP)
NCI-H28 (PAR1-AP) B Log [PAR-AP] (M) c A M P p ro d u c tio n (% Ct rl )
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Met-5A, ma causa comunque un aumento significativo (Figura 8B). Analogamente alla trombina, il PAR1-AP induce solo un modesto aumento dell’attivazione di RhoA nelle cellule NCI-H28 (Figura 8B).
Figura 8: La segnalazione mediata da G12/13 indotta da agonisti PAR1 è alterata nelle cellule NCI-H28. (A) Livelli relativi di attivazione di RhoA in risposta alla trombina nelle cellule Met-5A e nelle NCI-H28. (B) Livelli relativi di attivazione di RhoA in risposta al PAR1-AP selettivo nelle cellule Met-5A e nelle NCI-H28. I dati riportati sono la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti eseguiti in triplicato. Le differenze di attivazione di RhoA tra il controllo (cellule Met-5A o NCI-H28 trattate con il veicolo) e le cellule trattate con agonisti sono risultate significative (*p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01; *** p ≤ 0,001) come determinato mediante il test ANOVA seguito dall’analisi di comparazione multipla secondo Bonferroni. Ctrl 10 n M T hr Ctrl 10 n M T hr 0 1 2 3 Met-5A NCI-H28 *** ** A R h o A A c tiv a tio n (f o ld in c re a s e o ve r C tr l) Ctrl 1-AP M P AR µ 10 Ctrl 1-AP M P AR µ 10 0 1 2 3 *** * B Rh o A A c tiv a tio n (f o ld in c re a s e o ve r Ct rl )
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DISCUSSIONE
Numerose evidenze collegano espressione e l’attivazione di GPCR aberranti a diversi tipi di neoplasie umane (Dörsam et al, 2007; Lappano et al, 2011). I recettori attivati da proteasi sono noti per essere implicati in diversi tipi di tumori maligni, in particolare il sottotipo PAR1 è sovra-espresso in molte neoplasie come il melanoma aggressivo, cancro del colon, cancro della prostata ed il tumore al seno invasivo (Tellez et al. 2003; Darmoul et al, 2003; Chay et al, 2002; Anche-Ram et al, 1998). E’ stato, inoltre, dimostrato che l'attività pro-coagulante mediata dall'azione delle proteasi del sistema della coagulazione quali la trombina può contribuire al fenotipo maligno sia direttamente, stimolando la proliferazione delle cellule tumorali, che indirettamente attraverso lo sviluppo di tromboembolie associate al tumore (Nierodzik e Karpatkin, 2006). In effetti, tra i malati di cancro quelli conmesotelioma pleurico maligno(MPM)sono molto sensibili alle complicanze tromboemboliche (Nguyen et al., 2008). Inoltre, Keshava et al., (2013) hanno dimostrato che linee cellulari di MPM, che esprimono il fattore tissutale e PAR1 generano grandi tumori nella cavità toracica del topo indicando così che l'attivazione di PAR1 promuove la crescita cellulare del MPM.
Sulla base di queste evidenze, abbiamo iniziato a studiare se esiste una correlazione tra l'espressione PAR1 e la proliferazione delle cellule utilizzando una linea cellulare di MPM (NCI-H28) e una linea di cellule mesoteliali pleuriche (Met-5A). Nella linea cellulare NCI-H28, la trombomodulina, una glicoproteina transmembrana che controlla la proteolisi mediata dalla trombina, è silenziata con un meccanismo epigenetico (Nocchi et al., 2011). All'inizio, abbiamo analizzato livelli di espressione PAR1, trovando come risultato che PAR1 è altamente sovraespresso nelle cellule NCI-H28, mentre le altre tre linee cellulari di MPM mostrano livelli di espressione simili o leggermente aumentati rispetto ad una linea di cellule mesoteliali (Met-5A) ed alle cellule mesoteliali primarie. Successivamente, abbiamo trovato che la risposta proliferativa delle cellule NCI-H28 a varie concentrazioni di trombina è molto diversa da quella ottenuta con la linea di cellule mesoteliali pleuriche. Nelle cellule NCI-H28, la proliferazione indotta dalla trombina aumenta in modo concentrazione dipendente. La risposta proliferativa delle cellule NCI-H28 aumenta al variare della concentrazione senza però raggiungere alcun stato stazionario di crescita come previsto quando le cellule perdono l'inibizione di contatto, una caratteristica tipica delle cellule tumorali. Nelle cellule Met-5A, al contrario, trombina induce l'effetto proliferativo massimale alla concentrazione di 1 nM e poi a concentrazioni più elevate l'effetto stimolatorio progressivamente diminuisce. Possiamo, altresì, speculare che la mancanza di trombomodulina possa essere alla base dell’alterata risposta proliferativa indotta dalla stimolazione con trombina delle cellule NCI-H28. Abbiamo anche valutato la risposta proliferativa di entrambe le linee cellulari alla stimolazione con un PAR1-AP selettivo od
