RIASSUNTO
Il tumore della mammella è la neoplasia più comune nelle donne. Circa l’80% dei carcinomi mammari è di tipo sporadico mentre il rimanente 20% è rappresentato dai casi familiari, dei quali circa il 20-40% è dovuto a mutazioni nei geni BRCA1 e
BRCA2.
BRCA1 è un gene oncosoppressore che codifica per una fosfoproteina nucleare
coinvolta in numerosi processi cellulari tra cui la riparazione del DNA, il controllo del ciclo cellulare e il mantenimento della stabilità genomica. E’ noto che BRCA1 interagisce con numerose proteine coinvolte nei processi di ricombinazione omologa e non omologa e nel mismatch repair.
BRCA1 è un gene altamente polimorfico con circa 1500 varianti uniche documentate.
Alcune mutazioni portano alla produzione di una proteina tronca e non funzionale, che può causare l’insorgenza del tumore della mammella e dell’ovaio. Inoltre sono state identificate molte mutazioni missenso, definite VUS (variants of unknown significance) di cui non è noto il significato patologico.
Recentemente nel nostro gruppo di ricerca è stato messo a punto un saggio funzionale che valuta la patogeneticità di alcune VUS di BRCA1 tramite l’analisi del loro effetto sulla ricombinazione omologa nel lievito Saccharomyces cerevisiae. I risultati di questo lavoro hanno dimostrato che l’espressione di BRCA1wt e delle VUS neutre non induce aumento di ricombinazione nel ceppo diploide di S. cerevisiae RS112, mentre l’espressione di varianti patogenetiche determina un significativo aumento della ricombinazione.
Lo studio all’interno del quale si inserisce questo progetto di tesi ha lo scopo di determinare quali tra i partner del gene BRCA1, noti o meno, coinvolti nei processi di ricombinazione omologa, non omologa e mismatch repair possono contribuire all’insorgenza e alla progressione del tumore alla mammella e dell’ovaio.
S. cerevisiae è un ottimo sistema modello per la determinazione del ruolo dei
pathways di riparazione del DNA nell’instabilità genomica indotta da BRCA1 poiché, anche se non possiede il gene omologo di BRCA1, conserva gli stessi pathways di riparazione presenti nell’uomo. In esperimenti precedenti sono state valutate le frequenze degli eventi di ricombinazione omologa, non omologa e mutazione genica
in un ceppo aploide (RSY6) wild type o difettivo nei pathways di riparazione che esprimeva la proteina BRCA1 umana wild type o con le VUS. E’ stato visto che l’espressione di BRCA1wt nel ceppo RSY6wt non ha effetto nè sulla ricombinazione omologa né sulla frequenza di mutazione genica. Invece nel ceppo RSY6msh2∆ (deleto per il gene MSH2), che ha un livello basale di ricombinazione pari al 50% rispetto al wt, l’espressione di BRCA1wt aumenta la ricombinazione di circa tre volte e fa raddoppiare la frequenza di mutazione genica. Questi dati suggeriscono che il gene MSH2 potrebbe avere un ruolo nell’instabilità genomica indotta da BRCA1. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di effettuare un’analisi mutazionale, dei riarrangiamenti e dell’espressione proteica di MSH2, in un gruppo di carcinomi della mammella e/o dell’ovaio di pazienti carrier delle VUS di BRCA1. L’ipotesi di partenza è che, se BRCA1 e MSH2 cooperano nel processo di trasformazione neoplastica del tumore mammario e ovarico, nei pazienti carrier delle VUS di BRCA1 avremmo dovuto identificare mutazioni in MSH2 e che tali mutazioni avrebbero potuto essere localizzate nei siti di interazione con BRCA1. L’analisi mutazionale è stata condotta tramite PCR e sequenziamento diretto. Da questo screening sono emerse una variante missenso, posizionata nell’esone 3 e due varianti sinonime nell’esone 11 di MSH2. L’analisi dei grandi riarrangiamenti è stata condotta tramite la tecnica MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) e sono stati individuati riarrangiamenti in 4/11 pazienti. Infine dall’analisi dell’espressione proteica tramite immunoistochimica è stata evidenziata un’alterazione dell’espressione di MSH2 in 4/11 pazienti.
Il secondo obiettivo di questa tesi è stato quello di valutare mutazioni e grandi riarrangiamenti germinali del gene MSH2 in pazienti con storia familiare di tumore della mammella e/o dell’ovaio e storia personale di tumore mammario e del colon-retto e/o dell’endometrio e/o altri tumori, risultati wild type per i geni BRCA1 e
BRCA2. Questi pazienti hanno un fenotipo simile a quello della sindrome di Lynch di
tipo II, che talvolta comprende anche carcinomi mammari. Sono state selezionati 11 pazienti sulla base dell’analisi dell’albero genealogico ed è stata condotta l’analisi mutazionale dell’intera sequenza codificante e delle giunzioni introni-esoni del gene
MSH2 e l’analisi dei grandi riarrangiamenti tramite MLPA. Dall’analisi mutazionale è
stata identificata un’unica mutazione non senso in MSH2 che porta alla produzione di una proteina tronca. L’analisi dei riarrangiamenti non ha evidenziato amplificazioni o delezioni in nessuno dei pazienti.
Infine sono state analizzate tramite i saggi in lievito descritti precedentemente tre nuove VUS di BRCA1 identificate nei pazienti con tumore familiare della mammella e/o dell’ovaio: la p.R1495M, dovuta ad una transversione G>T situata sull’ultima base dell’esone 14, già classificata come patogenetica, e le varianti p.S1140G e p.S1040N, entrambe posizionate nell’esone 11, classificate come neutre. Sono stati prodotti vettori di espressione contenenti le VUS tramite mutagenesi sito specifica del plasmide pYES2-BRCA1 che contiene il cDNA di BRCA1. Questi vettori sono stati poi espressi nei ceppi RS112, RSY6wt e RSY6msh2∆ e sono stati valutati gli eventi di ricombinazione intra ed intercromosomica e di mutazione genica.
Sulla base dei risultati ottenuti si può quindi concludere che il lievito S. cerevisiae è un buon sistema modello per l’individuazione di nuovi partner di BRCA1 che contribuiscono all’insorgenza e alla progressione del tumore familiare della mammella e/o dell’ovaio e che il gene MSH2 sembra avere un ruolo nello sviluppo di questa neoplasia.
ABSTRACT
Breast cancer is the most common neoplasia in women. About 80% of breast cancers are sporadic while the remaining 20% is represented by familial cases, of which 20-40% is due to mutations in BRCA1 and BRCA2 genes.
BRCA1 is a tumor suppressor gene that encodes for a nuclear phosphoprotein
involved in numerous cellular processes including DNA repair, cell cycle control and maintenance of genomic stability. BRCA1 interacts with several proteins involved in homologous and non homologous recombination and in mismatch repair.
BRCA1 is a highly polimorfic gene with approximately 1500 unique variants reported.
Some of these mutations lead to the production of a truncated and non functional protein which can cause the development of breast and ovarian cancer. In addition, many missense mutations, called VUS (variants of unknown significance), have been identified. These variants have no known pathological significance.
Recently our research group developed a functional assay that assesses the pathogenic role of some BRCA1 VUS by analysis of their effect on Saccharomyces
cerevisiae’s homologous recombination. The results of this work demonstrated that
the expression of BRCA1wt and neutral VUS does not induce a recombination increase in the diploid strain of S. cerevisiae RS112, whereas the expression of the pathogenetic variants determines a significant recombination increase.
The aim of the study in which is inserted this thesis project is to determine which of the known or less partner of BRCA1 gene involved in homologous and non homologous recombination and in mismatch repair may contribute to breast and ovarian cancer development and progression.
S. cerevisiae is an excellent model system to determine the role of the DNA repair
pathways on the genomic instability induced by BRCA1 because, even if, it lacks the homologous of BRCA1, preserves the same repair pathways present in humans. In previous experiments were evaluated the homologous and non homologous recombination and gene mutations frequency in a haploid strain (RSY6) wild type or defective in repair pathways. Each strain also expresses the human protein BRCA1, wild type or carrying the VUS. The expression of BRCA1wt in the RSY6wt strain has no effect on either the homologous recombination or gene mutation frequency.
Instead, in the strain RSY6msh2∆ (deleted for MSH2 gene) which has a basal level of recombination equal to 50% of the wild type one, the expression of BRCA1wt increases the recombination of three times and double the gene mutation frequency. These data suggests that the MSH2 gene might have a role in genomic instability induced by BRCA1.
The first goal of this thesis was to perform a mutational and rearrangements analysis and an evaluation of MSH2 protein expression in selected breast and/or ovarian tumors from BRCA1 VUS carriers. The initial assumption is that if BRCA1 and MSH2 cooperate in the neoplastic transformation of breast and ovarian cancer, in the
BRCA1 VUS carriers we should identify mutations in MSH2 and that these mutations
could be located at the sites of interaction with BRCA1. The mutational analysis was performed by PCR and direct sequencing. This screening revealed a missense variant in exon 3 and two synonymus variants in exon 11 of MSH2 gene. The rearrangements analysis was performed using the MLPA technique (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification). Rearrangements was detected in 4/11 patients. Finally the protein expression analysis by immunohistochemistry revealed alterations of MSH2 expression in 4/11 patients.
The second goal of this thesis was to evaluate germinal mutations and rearrangements of MSH2 gene in patients with familial history of breast and/or ovarian tumor and personal history of breast cancer in association with colorectal and/or endometrial cancer and/or other tumors. These individuals are wild type for
BRCA1 and BRCA2 genes and have a phenotype similar to patients affected by
Lynch syndrome type II, which sometimes show also breast cancer. 11 patients was selected on the basis of their pedigree. Mutational analysis of the entire coding sequence and intron-exon junctions of MSH2 gene was performed. In addiction was performed also rearrangements analysis by MLPA. Mutational analysis revealed a single nonsense mutation in MSH2 which lead to the production of a truncated protein. Rearrangemets analysis did not show amplifications or deletions in any of the patients.
Finally in this work were analyzed by the yeast assays described above three new
BRCA1 VUS identified in patients with familial breast and ovarian cancer. These VUS
are: p.R1495M due to a G>T transversion on the last base of exon 14, which has been already classified as pathogenic, and variants p.S1140G and p.S1040N, both located in exon 11 and previously classified as neutral. Expression vectors containing
BRCA1 VUS were produced by site-directed mutagenesis of pYES2-BRCA1 plasmid
which contains BRCA1 cDNA. These vectors were then expressed in RS112, RSY6wt and RSY6msh2∆ strains, and were evaluated intra and interchromosomic recombination events and genic mutation frequency.
On the basis of these results we may conclude that yeast S. cerevisiae is a good model system for the individuation of new BRCA1 partners which contribute to onset and progression of familial breast and ovarian cancer. We may also conclude that
