UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Sintesi di nuove benzensolfonammidi secondarie decorate con un
nucleo tetraidroindazolico o tetraidrochinazolico come potenziali
inibitori di anidrasi carbonica
Candidato:
Chiara Biagini
Relatori:
Dott.ssa Silvia Salerno
Prof.ssa Sabrina Taliani
3
INDICE
Parte generale ... 4
1.Introduzione ...5
1.2 α CAs ... 8
1.3 Struttura della cavità di legame di α-CA ... 10
2. Meccanismo catalitico di CAs ... 12
2.1 Ruolo del residuo His 64 come navetta protonica ... 14
3. Isoenzimi CAs come target terapeutico: Attivatori e Inibitori ... 17
3.1 Attivatori di CA (CAA) ... 18
4.Meccanismi di inibizione di CAs ... 22
4.1 Zinc Binders ... 22
4.2 CAIs ancorati allo ione idrossido/molecola di acqua coordinato allo ione Zn (II) ... 26
4.3 Inibizione di CA mediante l’occlusione dell’entrata del sito attivo ... 28
4.4 CAIs che si legano fuori dal sito attivo ... 31
5. Utilizzo clinico degli inibitori di CA ... 35
5.1 Inibitori di Anidrasi Carbonica indicati in oftalmologia per il trattamento del glaucoma ... 37
5.2 Inibitori di Anidrasi Carbonica come diuretici ... 44
5.3 Inibitori di Anidrasi Carbonica usati come potenziai farmaci anti-osteoporotici ...48
5.5 Inibitori di Anidrasi Carbonica come potenziali farmaci anti-obesità .... 50
6. Fisiopatologia delle Anidrasi Carboniche nelle cellule tumorali ... 56
6.1 Inibitori dell’Anidrasi Carbonica come potenziali farmaci anti-tumorali 62 6.2 Inibitori dell'anidrasi IX carbonica: solfonammidi fluorescenti come agenti terapeutici e diagnostici ... 69
Introduzione alla parte sperimentale ... 71
Parte sperimentale ... 96
4
Parte generale
5
1.Introduzione
Gli enzimi anidrasi carbonica (CAs) sono metalloenzimi, nello specifico zinco-enzimi, che catalizzano in modo efficiente la conversione reversibile del biossido di carbonio in bicarbonato, rilasciando un protone, secondo la seguente reazione:
CO
2+ H
2O ↔ HCO
3-+ H
+Dalla scoperta dell'enzima negli eritrociti bovini nel 1933, gli isoenzimi sono stati trovati praticamente in tutti i tessuti e tipi di cellule dei mammiferi. Le anidrasi carboniche (CAs) sono anche abbondanti nelle piante e nelle alghe verdi unicellulari, dove sono essenziali per la fissazione fotosintetica della CO2. Questi enzimi sono essenzialmente importanti per il sistema biologico e svolgono numerose importanti funzioni fisiologiche e patofisiologiche. Queste includono respirazione, equilibrio acido-base, riassorbimento osseo, calcificazione, diverse vie biosintetiche e una varietà di processi che coinvolgono trasferimento di ioni, gas e fluidi. Inoltre, recenti evidenze suggeriscono il coinvolgimento nella crescita cellulare, con implicazioni per l'oncogenesi e il cancro[1].
Le CAs comprendono sei distinte famiglie genetiche di diversa evoluzione: α-CAs: presenti nell’uomo e in tutti i vertebrati, nei batteri, nelle alghe e
nel citoplasma delle piante verdi.
β-CAs: si ritrovano principalmente nei batteri, ma anche nelle alghe e nei cloroplasti delle mono- e di-cotiledoni, in molti funghi e in alcuni archeobatteri.
γ-CAs: si ritrovano negli archeobatteri, ciano batteri ed altri tipi di batteri. δ-CAs e ζ-CAs: sembrano essere presenti solo nelle diatomee marine. η-CAs: rappresentate solo nei protozoi.
Nell'uomo sono state identificate fino ad oggi quattordici diverse isoforme di CA appartenenti alla famiglia α-CA. Queste sono numerate da I a XIV (con due diversi isoenzimi -V, -VA e -VB) e sono note per essere coinvolte in molti processi
6 fisiologici. E’ stata riportata di recente un’ulteriore isoforma di CA, la XV, abbondante nei roditori e in altri vertebrati superiori, ma non espressa negli
umani o in altri primati. Gli isoenzimi dell’anidrasi carbonica mostrano vari pattern di espressione
tissutale e diverse proprietà cinetiche ed inibitorie; infatti, così come con le loro attività catalitiche, tutti gli isoenzimi differiscono anche nella loro affinità per gli inibitori di CA.
Nella seguente Tabella (Tabella 1) è riportata la loro relativa attività di idratazione della CO2 e la loro affinità per un inibitore della CA, l’acetazolamide. Non sono stati pubblicati dati relativi all’affinità dell’isoenzima CA-XV per l’inibitore e tutti i vari risultati si riferiscono agli isoenzimi umani se non diversamente specificato[2,3].
Tabella 1. Isoenzimi α-Ca cataliticamente attivi nei vertebrati superiori[2]
Isoenzima
Attività CA
Affinità perAcetazolamide
CAI
Moderata
Moderata
CAII
Alta
Alta
CAIII
Bassa
Bassa
CAIV
Alta
Alta
CAVA
Moderata
Alta
CAVB
Alta
Alta
CAVI
Moderata
Alta
CAVII
Alta
Alta
CAIX
Alta
Alta
CAXII
Moderata
Alta
CAXIII
Moderata (topo)
Alta (topo)
CAXIV
Moderata
Alta
7
Dal punto di vista della loro distribuzione tissutale e localizzazione subcellulare i vari isoenzimi si differenziano in citosolici, mitocondriali, legati alla membrana
e secreti nella saliva (figura 1):
CA-IV e CA-XV sono ancorate alla membrana plasmatica attraverso un legame glicosilfosfatidilinositolo. CA-XV non è espressa nei tessuti umani.
CA-IX, CA-XII e CA-XIV sono enzimi transmembrana i cui siti catalitici si trovano all'esterno della cellula.
La CA-VA e la CA-VB sono enzimi mitocondriali.
La CA-VI viene secreta nel latte e nella saliva.
I restanti isoenzimi, CA-I, CA-II, CA-III, CA-VII e CA-XIII sono espressi nel citosol. [3]
8 Sono state individuate inoltre tre forme acatalitiche presenti nel citosol, denominate CA-related proteins (CARP), ovvero proteine legate all’anidrasi carbonica : CARP VIII, CARP X e CARP XI. Tali isoenzimi non sono però dotati di attività catalitica non essendo presenti i residui di istidina necessari a legare lo ione zinco.
Per mutagenesi sito-diretta è possibile modificare queste proteine e trasformarle in enzimi con attività simil-CA che sono probabilmente inibiti dalle solfonammidi; attualmente non sono disponibili studi su questo argomento. [4] Gli isoenzimi cataliticamente attivi di CA presenti negli organismi svolgono diverse importanti funzioni fisiologiche, e la loro presenza in così tanti tessuti e in isoforme diverse rappresenta uno stimolo alla progettazione di inibitori con applicazioni biomediche. In particolare, gli inibitori CA sono utilizzati clinicamente come farmaci antiglaucoma: alcuni altri composti sono stati sviluppati come agenti antitumorali/strumenti diagnostici per tumori, agenti antiobesità, anticonvulsivanti e antimicrobici.
1.2 α CAs
Le CAs sono enzimi ubiquitari, presenti nei procarioti e negli eucarioti, codificate da sei famiglie di geni distinte, evolutivamente non correlati. Le β- e δ-CAs sono catalizzatori efficienti per l'idratazione reversibile del biossido di carbonio a bicarbonato così come le α-CA, le quali possiedono un'alta versatilità, essendo in grado di catalizzare diversi altri processi idrolitici. Il loro meccanismo catalitico è compreso nel dettaglio: il sito attivo è costituito da uno ione Zn (II) coordinato a tre residui di istidina e ad una molecola di acqua/ione idrossido. Quest'ultima è la specie attiva che agisce come un potente nucleofilo. Anche per gli enzimi della classe β e δ il meccanismo catalitico comprendente lo ione zinco è analogo,
9 sebbene alcuni β-CA non abbiano la molecola di acqua direttamente coordinata allo ione metallico. I γ-CA sono probabilmente enzimi Fe (II), ma è stato dimostrato che risultano attivi anche con ioni Zn (II) o Co (II) legati, mentre la
classe ζ utilizza Cd (II) o Zn (II) per eseguire la catalisi della reazione fisiologica. [5] Oltre alla reazione fisiologica, l'idratazione reversibile della CO2 a bicarbonato
(reazione 1), le α-CAs catalizzano una varietà di altre reazioni, quali (figura 2): l'idratazione del cianato dell'acido carbammico o della cianammide nell'urea
(reazioni 2 e 3);
l'idratazione aldeidica a gem-dioli (reazione 4);
l'idrolisi degli esteri di acidi carbossilici o solfonici (reazioni 5, 6);
altri processi idrolitici meno studiati, tra cui quelli descritti nelle equazioni 7-9 nella figura 2.
Figura 2. Reazioni catalizzate da isoenzimi α-CAs.[4].
Non è ancora chiaro se le altre reazioni catalizzate da α-CA rispetto all'idratazione di CO2 abbiano un significato fisiologico.[4] La struttura cristallina a raggi X è stata finora determinata per sei α-CA (isoenzimi CA I-VA, CA-XII e CA-XIV) e per i rappresentanti delle Famiglie β- e ɣ-CA.[5]
10
1.3 Struttura della cavità di legame di α-CA
La cavità di α-CA è uno spazio complesso che circonda lo ione catalitico Zn (II)
ed è stata al centro di molte ricerche negli ultimi tre decenni. La cavità del sito attivo può essere descritta come di forma conica con 15 Å di
diametro all’imboccatura che poi si assottiglia nel centro dell'enzima. La cavità di legame comprende tre regioni funzionali (figura 3):
Lo ione metallico Zn(II), il quale si trova all'apice del cono vicino al centro della proteina, coordinato in una disposizione tetraedrica distorta ad uno ione idrossido o una molecola d'acqua e tre residui di istidina, His94, His96 e His119.
Su un lato dello zinco, all’interno del sito attivo, si trova una serie di amminoacidi idrofobici (ovvero Val-121, Val-143, Leu-198, Thr-199-CH3, Val-207 e Trp-209).
Dall’altro lato dello zinco che si porta fuori dal sito attivo verso il solvente di massa, la superficie è rivestita da amminoacidi idrofili.
Gli studi di dinamica molecolare hanno dimostrato che la regione idrofobica del sito attivo sequestra il substrato CO2 e orienta l'atomo di carbonio per l'attacco nucleofilo da parte dell'idrossido legato allo zinco.
E’ stato visto mediante cristallografia a raggi X che la parete idrofilica del sito attivo risulta essere implicata nella creazione di una rete di legami ad idrogeno. Si ipotizza che questa rete sia necessaria per consentire il trasferimento di un protone dall'acqua legata allo zinco al solvente attraverso il residuo, identificato sperimentalmente, di His-64. Presi insieme, questi due ambienti del sito attivo molto diversi consentono il ciclo catalitico continuo e rapido della CO2 a bicarbonato.[7]
11
Figura 3. Struttura di CA-II umana in cui sono riportate le porzioni idrofiliche (in
rosa) e le porzioni idrofobiche (la superficie verde) del sito attivo. Il sito attivo con lo ione Zn è in colore viola.[7]
12
2. Meccanismo catalitico di CAs
Le CAs sono fra i più efficaci catalizzatori conosciuti in natura.
Il substrato sul quale agiscono è la molecola di CO2, idratandola secondo la
reazione:
CO
2+ H
2O ↔ HCO
3-+ H
+Lo ione metallico, che è lo Zn (II) in tutte le α-CAs investigate fino ad ora è
essenziale per la catalisi. Dati cristallografici a raggi X hanno mostrato che lo ione metallico si trova alla
base di una depressione anfifilica a forma di cono profonda 15 Å del sito attivo. La molecola di acqua/ione idrossido legata allo zinco è impegnata in interazioni di legame ad idrogeno con la porzione idrossilica di Thr199, che a sua volta è collegata alla porzione carbossilato di Glu 106 (figura 4). Queste interazioni migliorano la nucleofilicità della molecola d'acqua legata allo zinco ed orientano il substrato in una posizione favorevole per l'attacco nucleofilo.[5]
Figura 4. Coordinazione dello ione Zn (II) nel sito attivo di CA-II, con i tre residui di
istidina (His94, His96 e His119) e i residui di Thr199 e Glu106[6].
Studi di cinetica hanno proposto l’esistenza di due gruppi coinvolti nel meccanismo della catalisi. La forma attiva dell'enzima è quella basica (ZnOH),
13 con l’idrossido legato allo ione Zn (II): questa rappresenta il gruppo catalitico che controlla l'interconversione tra CO2 e HCO3- (figura 5A). L'altro gruppo trasporta un protone tra il sito catalitico ed il mezzo di reazione. Questo è stato proposto essere His-64, che sporge dal bordo del sito attivo alla superficie dell’enzima. I risultati cinetici suggeriscono anche che l'interconversione CO2 / HCO3- e il trasferimento del protone avvengano come due reazioni separate che possono essere schematicamente rappresentate dalle seguenti reazioni[6]:
Nella prima reazione (1) si ha un attacco nucleofilo nei confronti della CO2 con
formazione di ione bicarbonato; la forma enzimatica basica (ZnOH) agisce come un forte nucleofilo che attacca la molecola di CO2 legata in una tasca idrofobica
posta nelle sue vicinanze (figura 5B) portando alla formazione di bicarbonato coordinato allo ione Zn (II) (figura 5C).
Lo ione bicarbonato viene quindi spiazzato da una molecola d'acqua e liberato in soluzione, portando alla forma acida dell'enzima (ZnH2O), con la molecola di
acqua coordinata allo Zn (II), che rappresenta la forma cataliticamente inattiva (figura 5D).
Nel secondo step (2), al fine di rigenerare la forma basica, avviene una reazione di trasferimento del protone dal sito attivo all'ambiente, che può essere assistita da residui del sito attivo (come His64 lo shuttle del protone negli isoenzimi I, -II, -IV, -V-II, -IX e XII-XIV) o dai tamponi presenti nel mezzo.[5]
(1)
(2)
14
Figura 5. Rappresentazione schematica del meccanismo catalitico per
l'idratazione di CO2 mediata dallo zinco. La tasca idrofobica per il legame del / dei substrato / i è mostrato schematicamente allo step B. [5]
2.1 Ruolo del residuo His 64 come navetta protonica
La fase limitante la velocità della reazione è rappresentata dal secondo stadio della catalisi, cioè il trasferimento del protone, che rigenera le specie di idrossido di zinco dell'enzima. I risultati di una serie di esperimenti hanno confermato che l'anello imidazolico
15 di His64 agisce come navetta del protone in CA-II grazie alla sua conformazione che si estende nella cavità del sito attivo.
La catena laterale di His64 si trova a circa 7,5 Å dallo zinco e risulta quindi troppo distante dalla molecola di acqua legata allo ione Zn per rimuovere direttamente il protone. Il trasferimento protonico avviene grazie ad una rete di legame ad idrogeno, attraverso l’intervento di due molecole di acqua che collegano la molecola di acqua legata allo Zn con il gruppo imidazolico della catena laterale del residuo di His 64. Oltre al legame ad idrogeno che impegna il gruppo imidazolico, il meccanismo di estrusione dei protoni dalla cavità enzimatica interna al mezzo esterno è facilitato dal fatto che la catena laterale di His 64 in CA II è in equilibrio tra due conformazioni opposte (figura 6). L’His64 accetta un protone in un orientamento verso l'interno che punta verso il sito attivo e lo trasferisce al mezzo esterno passando alla conformazione verso l'esterno e puntando lontano dal sito attivo durante la seconda fase della reazione di catalisi. Quindi la conformazione interna di His64 è pronta ad accettare il protone in arrivo dalla rete di legami ad idrogeno, mentre la conformazione esterna è pronta a rilasciare il protone nel solvente.
E’ stato inoltre dimostrato che la sostituzione di His64 in CA-II con un residuo di Ala (H64A), che non può trasferire protoni, causa una diminuzione di circa 20 volte nella velocità del trasferimento protonico nello stadio di catalisi. [8]
16
Figura 6. Percorso di trasferimento protonico. Vengono mostrate la geometria e le
interazioni degli amminoacidi del sito attivo e la disposizione dei solventi di CA- II. I grandi cerchi neri, quelli neri piccoli e aperti bianchi rappresentano rispettivamente gli atomi di zinco, ossigeno e idrogeno. Le conformazioni interne ed esterne di His64 sono raffigurate come pentagoni aperti, e i siti singolarmente protonati sono etichettati. I passaggi proposti per il percorso del protone sono contrassegnati da frecce rosse. Ulteriori legami idrogeno stabilizzanti sono indicati con linee tratteggiate rosse. Le istidine di coordinazione dello zinco e le tasca idrofobica di CO2 sono mostrate come linee curve blu e verdi aperte rispettivamente.[8]
17
3. Isoenzimi CAs come target terapeutico:
Attivatori e Inibitori
Gli enzimi CAs sono importanti bersagli terapeutici ed alcuni suoi inibitori sono
attualmente utilizzati in clinica come farmaci. Le α-CAs sono i rappresentanti più importanti delle varie isoforme enzimatiche e
ogni isoenzima di mammifero cataliticamente attivo presenta una distribuzione tissutale diversa e rappresenta un potenziale target per una determinata patologia. Di conseguenza, la modulazione dell'attività di questi enzimi, mediante inibitori o attivatori, offre opportunità per il trattamento o la prevenzione di una varietà di malattie (tabella 2). La maggior parte dei trattamenti terapeutici fa uso di inibitori di CA (CAI), tuttavia di recente si sono iniziati a considerare anche gli attivatori di CA (CAA) per diverse applicazioni farmacologiche.[9]
Tabella 2. Distribuzione tissutale e funzione di isoenzimi CA di mammifero
cataliticamente attivi. [9]
Potenziali
isoenzimi target Patologia CAI in uso/studio
CAII,CA IV, CA XII Glaucoma
CAIs sistemici (AZA, DCP), CAIs topici (dorzolamide,
brinzolamide), CAIs aromatici/eterociclici
CAIV, CA XIV Epilessia AZA, metazolamide, TPM
CAII, CAIV, CAVI, CAVII, CAXIV
Disordini
neurologici/neuromuscolari AZA, TPM
CAII Osteoporosi AZA
CAIX, CA XII, CAV Cancro Indisulam, CAIs
aromatici/eterociclici
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3.1 Attivatori di CA (CAA)
E’ stato visto che gli CAA, emersi più recentemente, hanno la proprietà di legarsi all'ingresso della cavità del sito attivo, in una regione diversa dai siti di legame dell'inibitore o del substrato. Questi composti sono in grado di facilitare la fase determinante la velocità del ciclo catalitico, ovvero la rigenerazione della specie cataliticamente attiva dell'enzima, con lo ione idrossido coordinato allo ione zinco. Pertanto, l'attivatore di CA (A in Equazione (1) ) interferisce direttamente nella fase di trasferimento del protone nella catalisi, facilitando il processo intramolecolare mediante la formazione di un complesso transitorio attivatore- enzima.
Le reazioni intramolecolari sono più veloci di quelle intermolecolari, e quindi si produce un conseguente aumento della velocità catalitica.
Nel cervello, la CA si trova negli oligodendrociti e nelle cellule gliali, ma si trova a più alte concentrazioni nei neuroni sensoriali, dove è importante nell'elaborazione del segnale, nella trasformazione sinaptica a lungo termine e nel controllo dell'attenzione e della memoria.
Studi recenti come quello condotto da Sun et al (2002), indicano che l'attivazione di questo enzima fornisce un meccanismo rapido ed efficiente per aumentare le concentrazioni di bicarbonato in strutture neurali legate alla memoria. La regolazione del flusso di bicarbonato nei canali dei recettori sinaptici consente a CA di funzionare come un gate che regola il trasferimento dei segnali attraverso la rete neurale (figura 7).[15] Un decremento dei livelli di espressione di CA è stato osservato nel cervello dei ratti più anziani rispetto agli
19 esemplari giovani, ed è stato anche associato con una ridotta resistenza alla disidratazione, alterazione del controllo coroideale dell'omeostasi cerebrale e
ridotta produzione di liquido cerebrospinale. Pertanto, l'attivazione delle CA presenti nel cervello rappresenta un approccio
promettente e piuttosto inesplorato per aumentare l'attività cerebrale, in particolare la memoria e l'apprendimento, con potenziali benefici significativi in soggetti anziani o in pazienti affetti dal morbo di Alzheimer e altre forme di demenza. È stato dimostrato che una moltitudine di composti fisiologicamente rilevanti come le ammine biogene (istamina, serotonina, catecolammine), amminoacidi, oligopeptidi o piccole proteine, tra gli altri, agiscono come CAA
efficienti per molti dei 15 isoenzimi umani attualmente conosciuti. In definitiva, l'attivazione di alcuni membri della famiglia α-CA potrebbe
costituire un possibile approccio terapeutico per il miglioramento dell'efficacia sinaptica, e questo può rappresentare una strategia concettualmente nuovo per il trattamento della malattia di Alzheimer, l'invecchiamento e altre condizioni che richiedono il recupero dell'apprendimento spaziale e della memoria.[12]
Figura 7. Alterazione del segnale GABAergico ad opera dei CAAs e meccanismo
correlato all’interno dei neuroni piramidali dell’ippocampo coinvolti nel consolidamento della memoria spaziale.
20
3.2 Inibitori di CAs
Le CAs sono inibite da due classi di composti: gli anioni complessanti i metalli e le solfonammidi. È noto da tempo che gli anioni complessanti il metallo agiscono da inibitori di metallo-enzimi e di più α-CAs (come CA-I e -II prevalentemente) con anioni come cianuro, cianato, azide o idrogeno solforato. Tuttavia, molti isoenzimi con importanti ruoli fisiologici non sono stati ancora studiati per quanto riguarda la loro interazione con questa classe di inibitori. Le solfonammidi e i loro isosteri (sulfammati/solfammidi), che costituiscono la principale classe di CAI, si legano in forma deprotonata, con l'atomo di azoto della frazione solfonammidica coordinata allo ione metallico Zn (II). Gli anioni possono legarsi allo ione metallico o nella geometria tetraedrica o come addotti trigonadipiramidali, come ad esempio l'addotto tiocianato mostrato nella figura 8.
Figura 8
.
Meccanismo di inibizione di CA ad opera di solfonammidi (A) e anioni (B).Nell'ultimo decennio sono state descritte nuove classi di inibitori CA (CAI) con meccanismi di inibizione enzimatica che differiscono considerevolmente dagli inibitori classici di tipo sulfammidico o anionico. Sono noti cinque diversi meccanismi di inibizione della CA:
21
Gli zinc binders, i quali si coordinano allo ione Zn (II) catalitico nel sito
attivo dell'enzima, con il metallo in geometrie tetraedriche o trigonali bipiramidali. Le solfonammidi e i loro isosteri, la maggior parte degli anioni, i ditiocarbammati e i loro isosteri, i carbossilati e gli idrossammati si legano in questo modo;
Inibitori che si ancorano alla molecola di zinco coordinata allo molecola di acqua/ione idrossido, ovvero i fenoli, i carbossilati, le
poliammine, le 2-tiossocumarine, le sulfocumarine;
Inibitori che occludono l'ingresso nella cavità del sito attivo. Questo
sito di legame coincide con quello in cui si legano gli attivatori di CA. Appartengono a questa classe di inibitori le cumarine e i loro isosteri.
Composti che si legano fuori dalla cavità del sito attivo, tra questi è
emerso un derivato di acido carbossilico che inibisce CA con questo meccanismo.
Composti per cui non è noto il meccanismo di inibizione, tra cuile
solfonammidi secondarie/terziarie di cui imatinib/nilotinib sono gli esempi più studiati.[13]
22
4.Meccanismi di inibizione di CAs
4.1 Zinc Binders
Gli CAIs classici sono rappresentati dalle solfonammidi primarie, con almeno 25 composti (figura 9) in uso clinico da decenni o in sviluppo clinico nell'ultimo periodo. a: R2=R3=H, R6=Cl, Idroclorotiazide b:R2=R3=H, R6=CF3, Idroflumetiazide c:R2=H, R3=PhCH2, R6=CF3 Bendroflumetiazide d:R2=H, R3=CHCl2, R6=Cl, Triclorometiazide e: R2=Me, R3=CH2SCH2F3, R6=Cl, Politiazide
23
Figura 9. Solfonammidi e sulfammati CAIs: acetazolamide 1, metazolamide 2,
etossizolamide 3, sultiame 4, diclorofenamide 5, dorzolamide 6, brinzolamide 7, topiramato 9, zonisamide 10, sulpiride 11, celecoxib 14, saccarina 16, clorotiazide / diuretici ad alta concentrazione dei tipi 19-25, compresa l’idroclorotioazide 19a ampiamente prescritta, furosemide 24, bumetianide 25, composti in uso clinico per molti anni come diuretici, agenti antiglaucoma e antiepilettici.[5]
I composti 1-25 possono essere considerati come CAI di prima/seconda generazione. Gli effetti collaterali di molti di questi CAI (tra cui acidosi metabolica, calcoli renali, e così via) sono dovuti alla potente inibizione di tutte le isoforme CA di mammifero e non solo del target. Infatti, tra le numerose isoforme di mammifero studiate fino ad oggi, si ritiene generalmente che CAII, -IV e -XII siano il target per gli agenti anti-glaucoma; CA-VA e -VB per agenti antiobesità, CA-IX e -XII per agenti antitumorali/strumenti diagnostici per l'imaging di tumori ipossici, mentre non è affatto chiaro quali isoforme siano target delle solfonammidi/sulfammati antiepilettici, anche se sono state ipotizzate essere CA-VII e -XIV. (Tabella 2)
Gli inibitori di nuova generazione sono stati progettati in modo tale da agire come inibitori isoforma-selettivi e, come tali, poter produrre minori effetti collaterali rispetto ai CAI classici come 1-25. Inoltre, solfonammidi e sulfammati inibiscono fortemente le CAs appartenenti alla maggior parte delle famiglie, non
24 solo alla classe enzimatica α, e questo può essere sfruttato in futuro per ottenere antinfettivi con un nuovo meccanismo di azione.
Il meccanismo generale di inibizione degli zinc binders, comprendenti solfonammidi, sulfammati e solfammidi (che sono isosteri delle solfonammidi), è mostrato in figura 10. Gli zinc binders si legano in forma deprotonata, come
anioni, allo ione Zn (II) nel sito attivo in una geometria tetraedrica. Il legame di questa classe di inibitori avviene mediante lo “zinc binding group”
(ZBG), corrispondente al gruppo SO2NH, il quale interagisce direttamente con lo ione metallico. Inoltre, lo ZBG interagisce anche con altri due residui conservati in tutte le α-CA, fungendo da "gate keepers", ovvero con la Thr199 e il Glu 106. La Thr199 interagisce attraverso l’idrogeno del suo gruppo OH con la molecola di acqua/ione idrossido coordinato allo zinco nell’enzima non inibito e con lo ZBG negli addotti enzima/inibitore, mentre il Glu106 interagisce con l’idrogeno della Thr199 attraverso il suo gruppo carbossilato.
Figura 10. Meccanismo generale di inibizione degli zinc binders. Lo ZBG è
coordinato allo ione metallico e partecipa a forti interazioni con i residui di Thr199 e Glu106. Lo scaffold può occupare sia la metà idrofila o idrofobica (o entrambe) del sito attivo, mentre le code generalmente sono orientate verso l'uscita della cavità in cui si trovano i residui amminoacidici più variabili tra le diverse isoforme dei mammiferi.[13]
25 Lo scopo principale della ricerca negli ultimi anni è stato quindi quello di ottenere CAIs isoforma-selettivi. Questo non è tuttavia un compito facile, considerando che le 12 isoforme cataliticamente attive presenti nei primati,
hanno un'architettura di sito attivo abbastanza simile tra loro. In realtà, tutte le isoforme umane hanno i tre residui di His conservati (His94, 96
e 119), come metà del sito attivo principalmente rivestito con residui idrofobici e quello opposto con residui idrofili. Tuttavia, ci sono anche importanti differenze nei residui di amminoacidi principalmente nella parte centrale e verso l'uscita della cavità del sito attivo. La maggior parte degli inibitori menzionati sopra,
1-25, non ha contatti estesi con tali amminoacidi poiché i loro scaffold sono
piuttosto compatti e si legano in profondità all'interno della cavità del sito attivo che è piuttosto simile in tutte le isoforme di mammifero.
Sulla base di queste considerazioni, tra i numerosi approcci elaborati allo scopo di ottenere CAIs isoforma-selettivi, uno dei più riusciti è stato quello definito come "the tail approach": consiste nell'aggiungere una "coda" agli scaffold di solfonammidi aromatiche/eterocicliche che possiedono delle funzioni di tipo amminico, imminico o idrossilico, in modo da ottenere una molecola allungata con una porzione in grado di interagire con i residui amminoacidici situati al centro e alla estremità della cavità del sito attivo, come mostrato in Figura 10 per un generale zinc-binders. Scegliendo “code” di natura chimica diversa, diventa inoltre anche possibile modulare le proprietà fisico-chimiche di tali CAI,
26
4.2 CAIs ancorati allo ione idrossido/molecola di acqua
coordinato allo ione Zn (II)
Il primo composto per il quale è stato descritto questo nuovo meccanismo di inibizione della CA, è il fenolo (26), mentre il secondo composto è rappresentato dalla spermina (27) (figura 11). Il fenolo è ancorato ad un anione idrossido coordinato con lo Zn (II) metallico da un legame idrogeno che coinvolge l'atomo H dell'inibitore e lo ione idrossido. Inoltre, un secondo legame idrogeno coinvolge il residuo “gate keeper” di Thr199 con il suo gruppo NH (figura12).
26 27
Figura 11.
Fenolo (26), Spermina (27)
Figura 12. Il primo composto che inibisce CAs ancorando lo ione idrossido
27 Composti che inibiscono CA in questo modo, mediante l’ancoraggio alla molecola di acqua/ione idrossido coordinata allo ione zinco, sono caratterizzati dalla presenza di un “anchoring group” (AG) che è attaccato ad uno scaffold che potrebbe incorporare code che possono interagire con le due metà del sito attivo, così come per gli zinc-binders. La principale differenza tra questi CAI e gli zinc-binders consiste nel fatto che in questo caso l’inibitore non è in contatto diretto con lo ione metallico, come si evince dalla figura 13. Tra gli AG si ritrovano una varietà di funzionalità chimiche che includono unità fenoliche OH, ammine primarie, COOH, COOMe e SO3H. Gli scaffolds di questi composti possono essere di tipo aromatico, alifatico, eterociclico o zuccherino, e molti di essi mostrano un'efficace attività inibitoria nei confronti di CA appartenenti alle Classi α e β.
Figura 13. Meccanismo generale dei composti che si ancorano alla molecola di
acqua/ione idrossido coordinata con Zn (II). Il gruppo di ancoraggio (AG) può essere del tipo OH (fenolo), amminico (poliammina), estere (COOR), sulfonato (sulfocoumarina) o semplicemente un semplice atomo di zolfo (tioxocumarina).[13]
28
Più recentemente si è osservato che un derivato 2-tiossocoumarinico, si legava ancorandosi alla molecola d'acqua coordinata allo zinco. Nel caso della 2-tiossocumarina (composto 28 in figura 14), l'atomo di zolfo esociclico dell'inibitore forma un legame ad idrogeno con lo ione idrossido/molecola di acqua coordinata allo zinco, mentre lo scaffold organico rende le interazioni favorevoli con le molecole d'acqua e i residui di amminoacidi dal sito attivo. Pertanto, questo meccanismo di inibizione della CA sembra essere molto più generale, come inizialmente considerato quando sono stati scoperti come inibitori i fenoli. Va anche notato che le CA appartenenti ad altre famiglie genetiche rispetto agli α e ai β non erano ancora state studiate per questo tipo di meccanismo di inibizione alternativo.[13]
28
Figura 14. 2-Tiossocumarina (28)[13]
4.3 Inibizione di CA mediante l’occlusione dell’entrata del
sito attivo
Questi inibitori si legano ancora più lontano dallo ione metallico rispetto agli zinc-binders o ai composti che si ancorano alla molecola d'acqua coordinata allo zinco. Essi si vanno fondamentalmente a legare all'ingresso della cavità del sito
attivo, che rappresenta la regione più variabile tra le varie isoforme. I composti che agiscono con questo meccanismo di inibizione possiedono uno
29 “sticky group” (SG) attaccato ad uno scaffold che può essere aromatico, eterociclico o alifatico, come mostrato in figura 15. Possono anche incorporare una coda, che può estendersi dal sito attivo, poiché, come detto sopra, questi composti si legano in una regione piuttosto esterna della cavità.
Figura 15. Meccanismo generale dei composti che inibiscono le CA occludendo
l'ingresso al sito attivo. SG rappresenta uno sticky group, di tipo fenolico, acido carbossilico o ammidico. Lo scaffold si lega all'ingresso della cavità del sito attivo, occludendolo, e può anche essere presente una coda, che interagirà con i residui sulla superficie della proteina.[13]
Questo meccanismo di inibizione è stato evidenziato per la prima volta per le cumarine, ma successivamente altri composti come il farmaco antiepilettico lacosamide, le cumarine sostituite, i lattoni a 5 e 6 membri e i tiolattoni o il chinolinone, hanno dimostrato una significativa proprietà inibitoria della CA e probabilmente condividono un meccanismo d'azione comune. L'aspetto più interessante di questo meccanismo di inibizione è il fatto che gli inibitori si legano in una regione del sito attivo che è la più variabile tra le varie isoforme, cioè l'ingresso della cavità. Questo ha conseguenze importanti per la progettazione dei CAI, poiché i composti che si legano in quella regione
30 dovrebbero in linea di principio interagire in modo diverso con le varie CA e quindi mostrare profili inibitori di tipo isoforma-selettivi. In effetti, questo è stato effettivamente il caso per una serie ampia di derivati cumarinici/tiocumarinici (composti 29-41 in figura 16), che hanno mostrato un alto livello di isoformaselettività nei confronti di isoforme come CAIX, XII, -XIII, -XIV, ecc.
29-34 35 36-39
40 41
Figura 16. Alcuni dei derivati cumarinici investigati 29-41 come CAI che hanno
mostrato un profilo di inibizione isoforma-selettivo contro varie isoforme CA umane.[13]
È anche interessante notare che, considerando le cumarine come leads, sono state sviluppate le sulfocoumarine (in cui la frazione CO del lattone è stata sostituita da un gruppo SO2). Sebbene i derivati cumarinici e le sulfocumarine abbiano un diverso meccanismo di inibizione, poiché le cumarine si legano in forma idrolizzata all'entrata della cavità, mentre le sulfocumarine si legano anche in forma idrolizzata ma
31 ancorandosi all'acqua coordinata con lo zinco, molte sulfocoumarine descritte finora hanno mostrato un grado molto elevato di selettività verso le isoforme trans-membrana associate al tumore, CA-IX e -XII, rispetto a quelle citosoliche CA-I e -II.[13]
4.4 CAIs che si legano fuori dal sito attivo
Questo meccanismo di inibizione, rappresentato schematicamente in figura 17, è stato l'ultimo ad essere scoperto ed è quindi abbastanza recente.
Figura 17. Meccanismo di inibizione di CA fuori dal sito attivo. (A)
Rappresentazione schematica del sito di legame dell'inibitore. (B) CA-II complessato con l'acido carbossilico 42.
Quando l'acido 2-benzilsolfonilbenzoico (composto 42 in figura 18) è stato co-cristallizzato con CA-II, la densità elettronica dell'inibitore non è stata osservata all'interno del sito attivo ma in una tasca di legame adiacente al sito attivo, dove altri inibitori non sono mai stati osservati prima. Pertanto, questo composto si lega molto lontano, al di fuori del sito attivo dell'enzima.
32
42
Figura 18. Struttura chimica di Acido 2-benzilsolfonil-benzoico.[13]
Uno studio cristallografico ha mostrato che il composto 42 blocca la navetta protonica dell'enzima, His64, nella sua conformazione esterna ”out”, interferendo così con la fase determinante la velocità dell'intero ciclo catalitico, che è in effetti il trasferimento di un protone dalla molecola d'acqua coordinata allo zinco all'ambiente, con la generazione delle specie attiva dell'enzima. Questo residuo amminoacidico (His64) ha un'elevata flessibilità con due principali conformazioni, un più vicina allo ione metallico ed una esterna, verso l'uscita della cavità del sito attivo. Accettando un protone dall'acqua coordinata con lo zinco, la frazione imidazolica di questo residuo diventa protonata (nella sua conformazione “in”) mentre quando è in quella “out”, lo stesso protone può essere trasferito all'ambiente. Interferire con questo processo può bloccare l'intero ciclo catalitico, e il composto 42 (come mostrato in figura 19), inibisce l'enzima, bloccando lo shuttle del protone[13].
33
Figura 19. Interazione del composto 42 con i residui amminoacidici di CA-II. La
molecola di inibitore si trova in una cavità situata sulla superficie della proteina, a circa 14 Å dallo ione Zn (II), e delimitata dai residui Gly6, Tyr7, Gly8, Asn11, His64, Phe231, Asn232 e Glu239[13].
4.5 CAIs con un meccanismo d’azione non ancora noto
I quattro meccanismi di inibizione discussi finora sono noti, in quanto sono stati accuratamente documentati mediante studi cinetici e cristallografici a raggi X. Tuttavia, nell'ultimo periodo sono state raccolte prove su altre classi di composti, che mostrano vari livelli di proprietà inibitorie di CA, ma per i quali non è noto il preciso meccanismo d'azione, dal momento che non sono ancora stati cristallizzati negli addotti con l'enzima. Questo è principalmente dovuto a problemi di solubilità per alcuni di questi derivati, ma va anche sottolineato che molte classi di CAI sono state investigate solo di recente.
La porzione solfonammidica secondaria è presente in una grande varietà di farmaci utilizzati in clinica, tra i quali i più noti esempi sono i derivati 43-60 (figura 20), tra cui la sulfadiazina 59 e sulfapiridina 60, molti dei quali mostrano un’affinità submicromolare per le isoforme fisiologicamente dominanti CAI e -II.
34
Figura 20. Solfonammidi secondarie e terziarie (43-60)[13].
I derivati studiati presentano un gruppo solfonammidico secondario (43-52, 59,
e 60) o terziario (53-58), e i sostituenti piuttosto ingombranti sul gruppo
solfonamidico. Lo spazio disponibile nel canale del sito attivo, nella sua parte inferiore, è piuttosto limitato e non riesce ad accogliere tali composti. Il meccanismo inibitorio di questi composti è ancora sconosciuto, ma è piuttosto probabile che i sostituenti ingombranti della porzione NHSO2X (X=NH o O) della
molecola compromettano il loro legame con lo ione metallico all'interno del sito attivo. È stato ipotizzato che analogamente alla lacosamide e alle cumarine idrolizzate, questi CAI possono legarsi all'ingresso del sito attivo, nel sito di legame cumarinico (discusso in precedenza), ma questa ipotesi non è stata ancora confermata da studi di cristallografia a raggi X.[13]
35
5. Utilizzo clinico degli inibitori di CA
Gli inibitori di CA (CAI) appartenenti alle classi delle solfonammidi o dei sulfammati sono in uso clinico da decenni come agenti antiglaucoma, diuretici, antiobesità o antiepilettici; più recentemente è stata proposta l'inibizione delle isoforme associate al tumore CA-IX / -XII come nuovo approccio per combattere tumori e metastasi. Inoltre, i CAI sono anche usati per il trattamento dell'ipertensione intracranica idiopatica e rappresentano una promessa come agenti antineuropatici del dolore o per la gestione dell'ischemia cerebrale e l'artrite , condizioni per le quali sono attualmente disponibili poche opzioni efficaci di trattamento. Recentemente, è stato dimostrato che il targeting di CAs appartenenti a varie famiglie di geni di organismi patogeni (come batteri, funghi, protozoi, nematodi) può produrre importanti effetti antiinfettivi. Anche se questo è un campo ancora non sviluppato, è probabilmente il più rilevante per le future applicazioni di CAI. Un altro aspetto significativo è legato alla sicurezza e al basso livello di tossicità associato all'inibizione della CA per la maggior parte dei farmaci finora studiati. Questo è probabilmente dovuto al fatto che la reazione 1 non catalizzata può fornire un livello sufficiente di interconversione CO2/bicarbonato per evitare effetti letali dei farmaci.[16] Tra i derivati 1-25 non ci sono composti che inibiscono selettivamente una specifica isoforma di CA con valori terapeutici (tabella 3). Tuttavia il loro profilo d’inibizione è molto variabile e possono essere utilizzati per la progettazione di farmaci di nuova generazione, di inibitori
isoforma-selettivi. I punti critici per la progettazione di nuovi CAIs come agenti terapeutici
riguardano:
l’elevato numero di isoforme negli umani (16 CAs, di cui 13 hanno attività catalitica),
36 la mancanza di selettività dell’isoenzima nei confronti degli inibitori solfonammidici/sulfammati attualmente disponibili. Si può infatti osservare che molti tra i derivati 1-25 inibiscono fortemente la maggior parte degli isoenzimi CA.
Tabella 3. Dati di inibizione di alcuni dei composti solfonammidici/sulfammati
(1-16) usati in clinica nei confronti degli isoenzimi I-XIV di CA[5].
Isoenzima
K
i(nM) 1 2 3 5 6 7 9 10 16 hCAI 250 50 25 1200 50000 4500 250 56 18540 hCAII 12 14 8 38 9 3 10 35 5950 hCAIII 2.105 7.105 1.106 6.8.105 7.7.105 1.1.105 7.8.105 2.2.103 1.106 hCAIV 74 6200 93 15000 8500 3950 4900 8.590 7920 hCAVA 63 65 25 630 42 50 63 20 10060 hCAVB 54 62 19 21 33 30 30 6.033 7210 hCAVI 11 10 43 79 10 0.9 45 89 935 hCAVII 2.5 2.1 0.8 26 3.5 2.8 0.9 117 10 hCAIX 25 27 34 50 52 37 58 5.1 103 hCAXII 5.7 3.4 22 50 3.5 3.0 3.8 11.000 633 hCAXIII 17 19 50 23 18 10 47 430 12100 hCAXIV 41 43 2.5 345 27 24 1460 5.250 77337
5.1 Inibitori di Anidrasi Carbonica indicati in oftalmologia
per il trattamento del glaucoma
Il glaucoma è una malattia oculare cronica e degenerativa che causa danni irreversibili alla testa del nervo ottico e, di conseguenza, la progressiva perdita della funzione visiva ed eventuale cecità. Il metodo generale per il trattamento del glaucoma consiste nella terapia di riduzione della pressione intraoculare (IOP), attraverso approcci farmacologici, terapia laser o intervento chirurgico.[15,17] La IOP è regolata, in condizioni normali, da un fine bilanciamento tra la produzione di umor acqueo a livello dei corpi ciliari, e il suo drenaggio a livello dell’angolo iride/cornea. Normalmente dunque alla produzione di umore acqueo corrisponde un pari deflusso che avviene tramite il canale di Schlemm e piccoli canali collettori che lo convogliano verso il plesso venoso episclerale. Questo permette di mantenere costante la pressione intraoculare. Nel caso in cui il sistema di deflusso non funzioni correttamente, si ha un accumulo di umore acqueo che provoca un aumento della IOP e col tempo danni al nervo ottico (figura 21).
Le strategie terapeutiche per prevenire il glaucoma e la conseguente perdita della vista si basano sulla riduzione della IOP utilizzando farmaci ipotensivi ad azione topica o sistemica.[17] Sono attualmente disponibili in clinica diverse classi di farmaci:
stimolanti simpaticomimetici come adrenalina; agenti parasimpaticomimetici come la pilocarpina;
antagonisti del recettore della prostaglandina F (PGF) (FP), come latanoprost e travoprost, che sono usati da soli o in combinazione.
β-bloccanti come il timololo;
38 In generale, i farmaci delle prime tre classi aumentano il deflusso di umor acqueo, mentre i farmaci delle altre classi ne diminuiscono la produzione. Tutti questi farmaci hanno vari effetti collaterali indesiderati che possono portare alla cessazione della terapia.[19]
Figura 21. Nell’immagine è mostrato un eccessiva pressione intraoculare ed il sito
in cui il nervo ottico viene danneggiato dalla stessa.
La CA svolge un ruolo importante nell'occhio: è presente nelle lenti, nel corpo vitreo, nella cornea e nella retina. Studi sulla chimica e sulla dinamica dell'umor acqueo hanno dimostrato che il principale costituente di questa secrezione è il bicarbonato di sodio. All’interno del corpo ciliare l’isoenzima α-CA-II è il principale responsabile della secrezione di HCO3-, come conseguenza della
reazione di idratazione di CO2.
L’inibizione di CA diminuisce la produzione di bicarbonato, e di conseguenza abbassa la pressione intraoculare (IOP). Le isoforme associate alla membrana come la CA-IV, -IX e la -XII, sono considerate possibili bersagli delle solfonammidi antiglaucoma.
L’isoenzima bovino CA-IV si è dimostrato sensibile all’inibizione da parte di molte solfonammidi e sulfammati, con una Ki nel range del basso nanomolare.
La corrispondente isoforma umana, CA-IV, mostra però un diverso funzionamento nei confronti di qualche farmaco: l’acetazolamide (1), l’etossizolamide (3) e il sultiame (4) agiscono come potenti inibitori, mentre altri
39 agenti antiglaucoma, come la metazolamide (2), la diclorofenamide (5), la dorzolamide (6) e la brinzolamide (7), agiscono come deboli inibitori (Tabella 3); tutto questo suggerisce che è improbabile che la CA-IV sia coinvolta nella secrezione dell’umore acqueo, dato che viene inibita debolmente dalla maggior parte delle solfonammidi antiglaucoma.
Tuttavia, la CA-XII (ma non la CA-IX) ha recentemente mostrato di essere altamente espressa negli occhi di pazienti con glaucoma e probabilmente gioca un ruolo importante nell’aumento della IOP caratteristica del disturbo. Successivamente è stato dimostrato che la CA-XII viene altamente inibita da tutte le solfonammidi antiglaucoma usate clinicamente (Tabella 4) e dunque, questa è probabilmente l’isoforma di membrana coinvolta nel glaucoma, che viene bersagliata da questi agenti farmacologici.
I farmaci comunemente utilizzati come agenti antiglaucoma sono i CAI solfonammidici, tra cui acetazolamide e diclorofenamide ad azione sistemica, e dorzolamide e brinzolamide ad azione topica (rappresentati in figura 22). Il loro meccanismo d’azione si basa dunque sull’inibizione degli isoenzimi di CA presenti nel processo ciliare dell’occhio, cioè CA-II, -IV e -XII. Il farmaco maggiormente studiato è l'acetazolamide in commercio come Diamox®, che è stato frequentemente somministrato per anni a causa della sua efficiente riduzione della IOP, della tossicità notevolmente ridotta e delle proprietà farmacocinetiche ideali.
40
Figura 22. La figura riporta CAIs di prima generazione: Acetazolamide,
Metazolamide, Etossizolamide, Diclorfenamide.[19]
Tuttavia, poiché le CA-II, -IV e -XII sono presenti anche in molti altri tessuti/organi, la somministrazione di solfonammidi sistemiche porta ad un’inibizione delle CA in organi diversi dal tessuto target che in questo caso è l’occhio e quindi ad effetti collaterali indesiderati. Tra gli effetti collaterali sistemici si hanno: affaticamento, aumento della diuresi, parestesie, gusto
metallico, acidosi metabolica. Per superare questo limite, Becker propose la somministrazione topica
dell'inibitore solfonammidico direttamente nell'occhio. Gli studi riguardanti composti quali, acetazolamide, metazolamide, etossizolamide e diclorfenamide ( CAI di prima generazione ) hanno però dato solo risultati negativi, portando alla conclusione che tali CAI solfonammidici sono efficaci come farmaci antiglaucoma solo attraverso la via sistemica. Nel 1983 il gruppo di Maren postulò che una solfonammide solubile in acqua, con proprietà lipofile relativamente bilanciate e potere di inibizione della CA abbastanza forte, sarebbe stata un'efficace farmaco topico per la riduzione della IOP.[17]
41 forte azione inibitoria, nel range del basso nano molare contro le isoforme di CA coinvolte nella secrezione di umore acqueo, come, CA-II, -IV e -XII;
solubilità in acqua nell'intervallo 1 - 2% per consentire la formulazione come collirio;
liposolubilità bilanciata (non troppo bassa) per poter attraversare la membrana cellulare all'interno dei tessuti oculari per arrivare alle CA del processo ciliare.[19] Dorzolamide e brinzolamide (in figura 23), sviluppati negli anni ‘90 come potenti inibitori di CA II / CA XII nel range del nano molare, possono essere somministrati per via topica, in quanto possiedono una buona solubilità in acqua e sono sufficientemente liposolubili per penetrare attraverso la cornea. Possono quindi essere somministrati direttamente
nell'occhio, come sali (a un pH di 5.5) o come basi libere. I due farmaci sono efficaci nel ridurre la IOP e producono minori effetti
collaterali rispetto ai farmaci somministrati per via sistemica. Gli effetti collaterali più comuni osservati includono bruciore, arrossamento dell'occhio, visione offuscata, prurito e sapore amaro.[17]
Figura 23. CAIs di seconda generazione: dorzolamide e brinzolamide.[19]
Tuttavia, anche se la dorzolamide e la brinzolamide rappresentano un progresso importante nella lotta contro il glaucoma con terapie basate sui CAI, le ricerche
42 proseguono per identificare nuovi tipi di inibitori efficaci per comministrazione topica.
Un approccio generale che è stato utilizzato per sviluppare CAI di tipo sulfammidico solubili in acqua ed efficaci è noto come “tail approach”.
Un esempio consiste nella derivatizzazione delle solfonammidi con residui contenenti gruppi donatori di ossido nitrico (composti 60-64 in figura 24). Questo approccio è stato recentemente applicato per studiare i derivati della dorzolamide che incorporano frazioni donatrici di NO. L'ossido nitrico (NO), un gas radicale prodotto dall'enzima ossido nitrico sintasi (NOS), è anche coinvolto nella vasodilatazione, nel deflusso dell'umore acqueo nell'occhio, nella modulazione locale del flusso sanguigno oculare e nella morte delle cellule del ganglio retinico mediante apoptosi. Sembrava quindi di interesse combinare questi due farmacofori, un CAI sulfonammidico, e una porzione capace di donare NO (sottoforma di estere nitrico), in una sola molecole, a costituire un farmaco ibrido. Così, negli ultimi anni sono state sviluppate un gran numero di solfonammidi con proprietà donatrici di NO.
Figura 24. Dorzolamide e suoi derivati donatori di NO[19].
Più recentemente, sono stati utilizzati diversi scaffold solfonammidici per preparare nuovi CAI che incorporano frazioni donatrici di NO. Tra questi è stata studiata la 4-carbossi-benzenesolfonammide dove la porzione carbossilica è
43
stata derivatizzata per introdurre gruppi donatori di NO (figura 25). I composti della serie 65 sono CAIs che incorporano varie unità di esteri nitrici
sullo scheletro della Dorzolamide. Alcuni di questi composti hanno mostrato un’elevata potenza ed efficacia NO-mediata, come provato dal loro effetto vaso-rilasciante sull’anello aortico dei conigli pre-contratto da metoxamina; inoltre, hanno dimostrato di poter abbassare fortemente la IOP in vivo nei conigli normotesi. [19
Figura 25. I frammenti a - f sono attaccati come esteri alla porzione COO di 65[19.]
Il composto 65a in particolare, è risultato due volte più efficace della dorzolamide nel ridurre la IOP. E’ stato effettuato uno studio farmacologico dettagliato di tale composto: una sua somministrazione cronica come collirio al 2% a conigli albini glaucomatosi ha determinato un'importante riduzione della IOP (del 45% -50%) già dopo la prima settimana di trattamento, con una diminuzione regolare durante il trattamento. Questa riduzione è risultata molto più alta di quella osservata quando la dorzolamide al 2% veniva somministrata nello stesso modello animale e con un programma di somministrazione identico.
Quindi, i farmaci ibridi che incorporano solfonammidi e frazioni donatrici di NO hanno mostrato una buona inibizione in vitro degli enzimi target ed una promettente efficacia in vivo in modelli animali di glaucoma. [19]
44
5.2 Inibitori di Anidrasi Carbonica come diuretici
Le CA sono molto abbondanti nei reni e molte isoforme hanno dimostrato di essere presenti in vari tessuti di questo organo. Degli isoenzimi di CA cataliticamente attivi, almeno quattro (CA-II, -IV, -XII e -XIV) sono presenti nelle cellule epiteliali dei tubuli renali. La CA II citosolica è ampiamente espressa nel rene dove svolge un ruolo chiave nelle funzioni renali. Sono stati riportati alti livelli di questo isoenzima nelle cellule del tubulo distale tardivo, del tubulo collettore e del condotto di raccolta.
Anche le isoforme associate alla membrana CA IV, IX, XII e XIV sono presenti in vari tessuti dei reni:
CA-IV sembra essere onnipresente in questo organo,
CA-XII è espressa nella membrana plasmatica basolaterale delle cellule epiteliali nel segmento ascendente di Henle e dei tubuli distali contorti, oltre che nelle principali cellule dei dotti collettori.
CA-XIV è altamente espressa in alcuni segmenti del nefrone nel roditore. CA-IX è altamente sovraespressa nei tumori renali
Nell’uomo, le isoforme CA presenti nei reni svolgono una funzione cruciale in almeno tre processi fisiologici: l'omeostasi dell'equilibrio acido-base, secernendo ed espellendo i protoni che si formano dalla reazione di idratazione di CO2 catalizzata da questi enzimi; i processi di riassorbimento del bicarbonato e di escrezione di NH3 sotto forma di ione NH4+.[20]
Queste importanti funzioni sono ben localizzate nei diversi segmenti del nefrone: il riassorbimento del bicarbonato avviene nel tubulo prossimale, mentre l'acidificazione urinaria e l’escrezione di NH4+ si verificano nel tubulo distale e nel condotto di raccolta.
La fisiologia renale è stata compresa nel dettaglio inibendo le CA presenti in questo organo per mezzo di CAI sulfamidici.
45 L'acetazolamide (figura 26), un inibitore potente contro la maggior parte delle isoforme CA dei mammiferi, è stato il primo diuretico non mercuriale ad essere usato clinicamente, a partire dal 1956.
N
N
S
SO
2NH
2H
N
H
3C
O
Figura 26. Acetazolamide (1)Dopo la somministrazione di un CAI, come l'acetazolamide, il volume urinario aumenta rapidamente e il suo pH normalmente acido (intorno a 6) diventa alcalino (circa 8,2).
Questi eventi sono dovuti all'inibizione dei vari isoenzimi CA nel tubulo prossimale, che porta all'inibizione della secrezione di H+ da parte di questo segmento del nefrone. L'inibizione degli enzimi sia citosolici (CA-II) che legati alla membrana (CA-IV, -XII e CA-XIV) sembra essere coinvolta negli effetti diuretici delle sulfonammidi. L'inibizione di tali CAs diminuisce la disponibilità di protoni per l’antiporto Na+/H+, che mantiene una bassa concentrazione di protoni nella cellula. Il sodio, non essendo riassorbito, permane nel lume del tubulo renale portandosi dietro l’acqua con conseguente aumento della diuresi. L’inibizione della CA comporta quindi un aumento del volume delle urine che diventano più alcaline; inoltre per uso prolungato si può avere un’eccessiva perdita di potassio (figura 27).
46
Figura 27. Cellula epiteliale del tubulo contorto prossimale renale e schema dei
processi mediati dalle varie isoforme di CA presenti in questo distretto.
Usando l'acetazolamide come lead, negli anni '60-'70 sono stati sviluppati un grande numero di altri diuretici solfonammidici di successo, tra cui le benzotiadiazine 19 (idroclorotiazide 19a, idroflumetiazide 19b e simili), quinetazone (20), metolazone (21), clortalidone (22), indapamide (23),
furosemide (24) e bumetanide (25). [21] Questi farmaci 19-25 clinicamente utilizzati possiedono la frazione SO2NH2
primaria nella loro molecola, attraverso la quale legano lo ione Zn II presente all'interno del sito attivo CA (zinc-binders). Tuttavia, fino a poco tempo fa, le proprietà inibitorie di CA di questi farmaci sono state studiate solo per un isoenzima CA, cioè CA-II, che si riteneva responsabile di tutti gli effetti fisiologici dei farmaci sulfammidici. Solo recentemente, è stata investigata l'inibizione contro tutte le isoforme di CA dei mammiferi, offrendo risultati interessanti, che possono portare a importanti applicazioni polifarmacologiche.[20] I composti 19-25 sono inibitori molto più deboli dell’isoenzima CA-II rientrando
47 nell'intervallo micromolare. Infatti, solo la furosemide (24) è un buon inibitore di CA-II tra questi diuretici, con un Ki di 65 nM. Tuttavia, molti dei farmaci 19-25
inibiscono sensibilmente le CA scoperte dopo la loro introduzione nell'uso clinico (tabella 4); esempi di tali situazioni sono: metolazone (21) contro CAVII, XII e -XIII, clortalidone (22) contro CA-VB, -VII, -IX, -XII e --XIII, indapamide (23) contro CA-VII, -IX, -XII e -XIII, furosemide (24) contro CA -I, -II e -XIV e bumetanide (25) contro CA-IX e -XII. La bumetanide è un CAI specifico per il trattamento del tumore; mostra potenza paragonabile ad acetazolamide, ma differisce da quest’ultima in quanto acetazolamide è un CAI potente contro la maggior parte degli isoenzimi di mammifero. [21]
Tabella 4. Dati di inibizione di alcune delle solfonammidi clinicamente utilizzate (Acetazolamide 1 e 19a-25) contro gli isoenzimi CAII citosolico e CA-IV, -XI, -XII e XIV di membrana presenti a livello renale; Nt=Non testato, dati non disponibili.[20]
Ki (nM)
Isoenzima
1
19a
20
21
22
23
24
25
CAII
12 290 1260 2000 138 2520 65 6980CAIV
74 4225 Nt 750 917 890 499 700CAIX
25 367 Nt 320 23 36 420 25.8CAXII
5.7 355 Nt 5.4 4.5 10 261 21.1CAXIV
41 4105 Nt 5432 4130 4950 52 25048
5.3 Inibitori di Anidrasi Carbonica usati come potenziai
farmaci anti-osteoporotici
L’isoforma CA-II è molto abbondante nelle ossa ed è presente solo a livello degli osteoclasti a concentrazioni dello stesso ordine di grandezza di quelle presenti a
livello dei reni. Il ruolo di questo enzima è quello di fornire ioni idrogeno, provenienti
dall’idratazione della CO2, ad una pompa protonica ATP-dipendente, la quale li utilizza nella mobilitazione del calcio dalle ossa. Queste attività sono richieste per la dissoluzione della matrice inorganica, che precede la rimozione enzimatica della matrice organica dalle ossa (figura 28).
Figura 28. Reazione catalizzata da CA nel processo di degradazione della matrice ossea mediante HCl.
Si è pertanto pensato di utilizzare CAI solfonammidiche nel trattamento dell'osteoporosi, una condizione caratterizzata da un'eccessiva perdita di calcio
49 osseo. Per valutare il ruolo fisiologico delle CA di membrana negli osteoclasti, sono stati usati inibitori strutturalmente correlati al composto 66 (in figura 29), che non permeano la membrana.
Figura 29: PCS, molecola per la quale la membrana cellulare è impermeabile
utilizzata per gli studi sulle CA di membrana presenti negli osteoclasti.[22]
In una coltura di osteoclasti di ratti, che sono stati esposti ad una bassa concentrazione di inibitore, è stato osservato un aumentato numero di osteoclasti ed un’attività di riassorbimento osseo. Il trattamento con gli inibitori disturba anche l’acidificazione intracellulare degli osteoclasti. Gli isoenzimi di membrana CA-IV e CA-XIV sono espressi negli osteoclasti in vivo
e in vitro. Successivi esperimenti sugli inibitori hanno fornito nuove evidenze che
annullano l’ipotesi che la regolazione del pH intracellulare negli osteoclasti può coinvolgere il trasporto di metaboloni e che potrebbe essere possibile l’utilizzo di alcuni inibitori nella progettazione di nuove terapie anti-osteoporosi.[22]
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5.5 Inibitori di Anidrasi Carbonica come potenziali farmaci
anti-obesità
L'obesità è una malattia metabolica comune caratterizzata da un eccesso di tessuto adiposo. Nella società moderna la facile disponibilità di alimenti altamente energetici combinati con stili di vita sedentari sono considerati le
principali cause sociali di aumento incontrollato del peso corporeo.[24] Tra le α-CAs, le isoforme CA-VA e CA-VB sono espresse solo nei mitocondri.
Esiste anche una localizzazione tissutale specifica per CA-VA, che è presente solo nel fegato, mentre CA-VB è più ampiamente distribuito nell'organismo. È noto che CA-VA e CA-VB sono coinvolte in diversi processi metabolici, tra cui l'ureagenesi, la gluconeogenesi e la lipogenesi nei vertebrati (per esempio nei roditori) e negli invertebrati (per esempio nelle cavallette).[23]
L’approvvigionamento di bicarbonato (che rappresenta il substrato) in diversi processi biosintetici che coinvolgono la piruvato carbossilasi (PC), l’acetil-Co-A carbossilasi (ACC) e la carbamoil-fosfato sintetasi I e II, viene assicurato principalmente dalla reazione catalitica che coinvolge gli isoenzimi di CA (rappresentato schematicamente in figura 30). Il piruvato viene carbossilato ad ossalacetato in presenza di HCO3- e PC. Il
bicarbonato necessario per questo processo è generato sotto l'influenza catalitica degli isoenzimi mitocondriali CA-VA e/o CA-VB. L’acetil-coenzima (acetil-CoA) nel mitocondrio reagisce con l'ossalacetato, portando al citrato, il quale viene poi traslocato nel citoplasma mediante l’azione del trasportatore tricarbossilato. Nel citosol, il citrato viene scisso rigenerando ossalacetato e acetil-CoA. Quest’ultimo è utilizzato per la lipogenesi de novo. Il bicarbonato necessario in questa fase è fornito dalla conversione catalizzata da CA-II di CO2 in bicarbonato all’interno del citosol.[24]
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Figura 30. Biosintesi degli acidi grassi in cui prendono parte le CA-VA e -VB a livello
mitocondriale, e la CA-II citosolica: [23]
Il Topiramato (TPM) (in figura 31), farmaco antiepilettico, possiede potenti effetti anticonvulsivanti a causa di un meccanismo d'azione multifattoriale: il blocco dei canali al sodio e dei recettori AMPA/kainato (acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolo-propionico), la ritenzione di CO2 secondaria all’inibizione dei globuli rossi del sangue e degli isoenzimi CA del cervello, come l’aumento del sistema di trasmissione GABAA–ergico. Gli effetti collaterali di questo farmaco includono: cambiamenti di umore, perdita della memoria, parestesia e calcoli renali.
52 Figura 31. Topiramato (9)
L’osservazione clinica che i pazienti obesi trattati con il farmaco antiepilettico TPM presentavano una marcata riduzione del peso corporeo, ha costituito il punto di partenza per lo studio delle CA come bersagli per il trattamento dell'obesità, anche se non è stata fornita ancora alcuna spiegazione farmacologica di tale fenomeno. E’ stato così dimostrato che il TPM è un potente inibitore di diversi isoenzimi CA,
come la II, VA, VB, VI, VII, XII e XIII. In particolare è un CAI efficace per CA-II, VA e VB con valori di Ki rispettivamente
di 10, 63 e 30 nM. (Tabella 3)
Studi cristallografici del complesso di TPM (in figura 32) con CA-II hanno chiarito le interazioni molecolari che spiegano l’elevata affinità di questo composto per il sito attivo della CA. Successivamente sono stati condotti studi di dinamica molecolare sull’addotto TPM-CAII che hanno dimostrato una modalità di legame simile anche con l’isoenzima CA V.
