Valutazione dell'efficacia di una macchina da perfusione normotermica per la preservazione degli organi nel trapianto epatico.

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SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN

PATOLOGIA CLINICA

VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA DI UNA MACCHINA DA

PERFUSIONE NORMOTERMICA PER LA PRESERVAZIONE

DEGLI ORGANI NEL TRAPIANTO EPATICO

Presidente

Chiar.mo Prof. Aldo Paolicchi

Candidato

Dott. Alessio Chiarugi

Relatori

Prof.ssa Daniela Campani

Dott. Paolo Strada

Prof. Aldo Paolicchi

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INDICE

INTRODUZIONE 5

 Il trapianto di fegato 5

 Tipologie di trapianto di fegato 6

 Tipologie di donazione 7

 La mancanza di donatori 7

 Il prelievo dell’organo e la conservazione statica ipotermica

 Problematiche correlate alla conservazione statica ipotermica e

all’uso degli extended criteria donors 11

 Patogenesi e fattori di rischio delle stenosi non anastomotiche

delle vie biliari 12

 La conservazione con macchine da perfusione

15

SCOPO DELLO STUDIO 18

 Razionale dello studio 18

 Obiettivi dello studio 19

MATERIALI E METODI 22

 La LiverAssist® 22

 Set Monouso

 Soluzioni per la perfusione e additivi

22

 Criteri di arruolamento

 Fase operativa

 Allocazione e randomizzazione

 Esecuzione del prelievo

 Descrizione della procedura di prelievo

 Conservazione con macchina LiverAssist

10 22 23 26 26 26 26 28

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3

 Il trapianto epatico

 Anatomia Patologica

 Fase post-trapianto

 Immunosoppressione post-trapianto

 Profilassi Anti Toxoplasma e CMV

 Controlli clinici, ematochimici, radiologici post-trapianto

 Fase post-dimissione RISULTATI DISCUSSIONE ICONOGRAFIA BIBLIOGRAFIA 29 30 33 33 33 34 35 37 44 47 52

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INTRODUZIONE

Il trapianto di fegato

Il trapianto di fegato rappresenta il trattamento di elezione per pazienti affetti da epatopatie croniche terminali. Differentemente dall’insufficienza terminale di altri organi, non esistono dispositivi artificiali capaci di supportare un paziente con insufficienza epatica per un lungo periodo di tempo.

Il primo trapianto di fegato umano della storia venne eseguito nel 1963 dal chirurgo Thomas E. Starzl a Denver (U.S.A.), ben cinque anni prima che Christiaan Barnard eseguisse il primo trapianto di cuore umano al mondo. Il suo paziente fu un bambino di tre anni chiamato Bennie Solis affetto da atresia delle vie biliari che però morì durante l’intervento per emorragia. Starzl tentò di nuovo nel maggio dello stesso anno con un uomo affetto da epatocarcinoma. L’operazione sembrò inizialmente essere un successo ma il paziente morì tre settimane dopo per le medesime complicanze. Tuttavia, nonostante il secondo paziente fosse sopravvissuto per poco tempo, l’operazione di Starzl rappresentò una vera e propria pietra miliare per la chirurgia. Il primo intervento che ebbe successo, sebbene a breve termine, avvenne nel 1967. Inoltre, Starzl è stato anche un pioniere nel trapianto di rene; infatti il 27 marzo 1962 eseguì con successo il suo primo trapianto fra gemelli monozigoti. Gli interventi effettuati durante gli anni successivi non sono stati però coronati da particolari successi, principalmente per problemi legati sia alla tecnica sia all’insorgenza di fenomeni di rigetto. Nonostante il progredire delle tecniche chirurgiche il trapianto di fegato rimase nella fase sperimentale per tutti gli anni settanta, con circa il 25% dei pazienti che sopravvivevano almeno a un anno dall’intervento. L’uso della ciclosporina

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6 migliorò decisamente i risultati e negli anni ottanta il trapianto di fegato divenne un trattamento clinico standard sia per adulti sia per bambini. In Italia il primo trapianto epatico venne eseguito il 20 maggio del 1982 al Policlinico Umberto I di Roma dall’equipe diretta dal Prof. Raffaello Cortesini.

Dal primo tentativo del 1963 questa procedura si è trasformata da mero tentativo sperimentale per pazienti in gravissime condizioni, a terapia riconosciuta a livello mondiale per le epatopatie acute e croniche, con decine di migliaia di procedure eseguite ogni anno. Attualmente la sopravvivenza post trapianto epatico in Italia si attesta attorno al 90% al primo anno e al 70% a cinque anni.

Tipologie di trapianto di fegato

Il trapianto di fegato viene attualmente eseguito con diverse varianti tecniche. Normalmente viene applicata la tecnica del trapianto ortotopico in cui è rimosso il fegato nativo ed il graft viene posizionato nella stessa sede. Esiste la possibilità di rimuovere parte del fegato nativo e posizionare il graft in sede adiacente per supportare una insufficienza acuta che si presume possa risolversi con il recupero funzionale del fegato nativo (auxiliary liver transplantation).

Nei primi anni della storia del trapianto epatico si utilizzavano solamente grafts provenienti da donatori cadaveri ma, con la crescita della domanda di organi dovuta al consolidamento della procedura, si sono iniziate ad utilizzare anche parti di fegato provenienti da donatori viventi. La donazione da vivente è stata ampiamente criticata per il tasso di mortalità del donatore, che si aggira attorno allo 0,2% ed il tasso di morbidità del ricevente estremamente maggiore rispetto alla donazione di organo intero da cadavere [1] e non viene pertanto utilizzata routinariamente nei paesi europei. Nei paesi orientali, per motivi sociali e religiosi,

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7 la donazione da cadavere non è molto diffusa e quindi la donazione da vivente si è consolidata come pratica routinaria.

Altro tipo di tecnica utilizzata per far fronte sia alla maggiore richiesta di organi sia alla necessità di disporre di grafts di minori dimensioni per il trapianto pediatrico è quella della bipartizione epatica; questa tecnica prevede la divisione del graft in due porzioni (split transplant) delle quali la minore si utilizza su riceventi pediatrici o adulti di piccole dimensioni e la maggiore su riceventi adulti.

Tipologie di donazione

Attualmente esistono varie tipologie di donazione. La donazione da cadevere è di gran lunga la prevalente in Italia e prevede l’utilizzo di due differenti tipi di donatori:

 Donatori a cuore battente (heart-beating donors, HBD)

 Donatori a cuore non battente (non-heart-beating donors, NHBD).

La donazione a cuore battente (Donors after Brain Death) prevede l’utilizzo di donatori in stato di morte cerebrale accertata mediante modalità differenti da paese a paese (DBD). La donazione a cuore non battente (Donors after Cardiac Death) prevede l’utilizzo di donatori in stato di morte cerebrale a seguito di arresto cardiaco (DCD). La donazione da vivente avviene per lo più da parte di familiari del ricevente, ma può avvenire anche in forma di donazione samaritana da parte di individui che vogliono donare un organo senza avere rapporti diretti col ricevente.

La mancanza di donatori

Negli ultimi decenni il trapianto epatico è stato vittima del proprio successo. Sempre più riceventi sono candidati al trapianto, ma il numero di donatori è

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8 rimasto pressoché stabile. Questo fenomeno ha portato ad un aumento della mortalità in lista di attesa, che è estremamente variabile da paese a paese. In Italia, ad esempio, il tasso di donazione è particolarmente vario tra le Regioni, con tassi dagli 8 donatori per milione di popolazione (pmp) fino ai 42 donatori pmp che superano di gran lunga le medie europee. A tal scopo sono stati fatti molti tentativi per aumentare il numero di donatori. Tra questi i più diffusi sono:

 L’utilizzo di donatori NHBD

 L’utilizzo di donatori viventi

 L’utilizzo di donatori marginali o extended criteria donors (ECD)

Quest’ultima classe comprende donatori che sono considerati non ottimali per varie ragioni tra cui:

 Donatori con iposodiemia

 Donatori anziani

 Donatori con infezioni

 Donatori con neoplasie con specifica istologia

 Donatori con instabilità emodinamica

Tutte queste categorie sono state utilizzate sempre più diffusamente fino a dimostrare la loro sicurezza in termini di risultati di sopravvivenza nel medio e lungo periodo.

In particolare l’innalzamento dell’età di donazione è un fenomeno quantitativamente rilevante in Italia. Negli ultimi anni, infatti, il numero di donatori giovani deceduti per trauma cranico si è drasticamente ridotto. D’altra parte il progressivo invecchiamento della popolazione ha comportato un aumento delle morti per malattia cerebrovascolare, che rappresentano attualmente la principale causa di morte nei donatori di organi del nostro paese. La maggior parte dei centri

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9 italiani utilizza al momento questi donatori come fonte principale di grafts epatici per trapianto poiché, a differenza di quanto osservato in altre tipologie di trapianto (cuore, polmone), si sono dimostrati sicuri. Nello specifico, la U.O. Chirurgia Epatica e dei Trapianti di Fegato (Direttore: Prof. Franco Filipponi) della Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana vanta una casistica superiore a 150 donatori ultraottantenni e oltre 300 donatori ultrasettantenni utilizzati con successo [2]. I risultati ottenuti hanno dimostrato che i grafts anziani presentano risultati sovrapponibili a quelli di età inferiore.

Per ciò che concerne la valutazione di un eventuale donatore, essa ha luogo presso il Centro Trapianti di Pisa sulla base delle informazioni clinico-anamnestiche, ovvero sulla base della storia clinica, degli esami ematici, virologici, e dell’ecografia epatica. L’allocazione dell’organo avviene tenendo in considerazione i seguenti criteri:

 Compatibilità AB0

 Classe antropometrica

 La patologia di base

 Gravità del quadro clinico (calcolato con score MELD)

 Tempo di permanenza in lista di attesa

Il MELD (Mayo End Stage Liver Disease) è un particolare sistema a punteggio che è stato proposto dalla Mayo Clinic di Rochester, Minnesota (USA) per valutare la sopravvivenza dei pazienti con conclamata insufficienza epatica terminale. Tale calcolo si basa sulla determinazione dei valori di bilirubina, INR e creatinina. Tutti questi valori di laboratorio sono facilmente reperibili dagli esami ematici che i pazienti affetti da patologia epatica eseguono di routine. Tanto più alto è il punteggio ottenuto, tanto più gravi sono le condizioni cliniche del paziente.

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10 La formula originaria del calcolo era la seguente: 3.8*loge(bilirubina [mg/dL]) + 11.2*loge(INR) + 9.6*loge(creatinina [mg/dL]) + 6.4*(eziologia: 0 se colestatica o alcolica, 1 negli altri casi).

Successivamente la formula venne modificata, con la rimozione della variabile “eziologia” e l’inserimento della necessità di eseguire sedute di dialisi. Il MELD è stato approvato dall’UNOS (l’organizzazione che sovrintende alla distribuzione degli organi negli Stati Uniti) per definire le priorità dei pazienti inseriti nella lista di attesa per il trapianto epatico; inoltre si è rivelato essere particolarmente migliore di un altro sistema di calcolo, ancora oggi utilizzato, ovvero il Child-Turcotte-Pugh, ragion per cui il MELD costituisce la formula a punteggio più comunemente utilizzata nella pratica clinica routinaria.

L’ulteriore valutazione del fegato avviene al momento del prelievo (aspetto macroscopico ed eventuale esecuzione di una biopsia) e della chirurgia di banco (preparazione e isolamento delle strutture vascolari e asportazione dei tessuti superflui attorno al graft). Solo a quel punto un organo può definitivamente essere ritenuto trapiantabile.

Il prelievo dell’organo e la conservazione statica ipotermica

Di norma il prelievo è eseguito da un’equipe del Centro titolare dell’allocazione dell’organo e composta da chirurghi con esperienza trapiantologica che viene inviata presso l’Ospedale sede della donazione. In tale sede è realizzata un’accurata valutazione dell’aspetto macroscopico dell’organo eseguendo, se necessario, anche una biopsia. Il prelievo prevede una fase a caldo, durante la quale si isolano le principali strutture dell’organo e lo si prepara per la perfusione, e una fase a freddo. Quest’ultima avviene dopo il clampaggio aortico e comporta la perfusione del

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11 fegato con soluzioni di conservazione apposite a temperatura di 0 - 4 °C e l’ulteriore raffreddamento in ghiaccio. Completata la perfusione, si preleva l’organo e lo si ripone all’interno di sacchetti sterili contenenti liquido di conservazione che saranno poi posizionati in un frigorifero portatile contenente ghiaccio. Tale tipo di conservazione è detta statica ipotermica. Le soluzioni utilizzate possono essere di vario tipo, ma la loro funzione è essenzialmente quella di prevenire l’edema cellulare e la necrosi determinate dal passaggio repentino di liquidi e ioni attraverso le membrane cellulari.

Problematiche correlate alla conservazione statica ipotermica e

all’uso degli extended criteria donors

Sebbene la preservazione fredda rallenti il metabolismo di 1,5 - 2 volte per ogni riduzione di 10°C di temperatura, ancora a 1°C si registrano considerevoli attività metaboliche. Questo determina l’accumulo di metaboliti che agiscono come substrati nel successivo momento della riperfusione con sangue ossigenato; tale fenomeno è alla base del così detto danno da ischemia riperfusione.

Durante la conservazione statica ipotermica, nonostante la minimizzazione del metabolismo, si produce comunque un danno d’organo. E’ ben noto, infatti, che una preservazione eccessivamente prolungata in liquido di conservazione ha un effetto deleterio sulla funzionalità del graft con una chiara correlazione tra tempo d’ischemia fredda e disfunzione dell’organo post trapianto. La percentuale di primary non function (PNF) o disfunzione primaria d’organo (ovvero l’assenza di ripresa funzionale del graft dopo il trapianto in assenza di identificabili cause chirurgiche/infettive) è riportata in letteratura al 5,8 %, sebbene reports di singoli centri mostrino un’ampia variabilità di incidenza. Nonostante una forte

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12 correlazione sia stata dimostrata tra danno da preservazione e il successivo rigetto acuto [1] questo non è stato confermato in studi successivi [3]. Le lesioni ischemiche delle vie biliari (ITBL) sono definite come stenosi non anastomotiche (NAS) in assenza di problematiche vascolari. La loro eziologia non è stata ancora definita con certezza anche se è certa una correlazione con il danno da ischemia riperfusione (Figura 1A-B). La loro incidenza varia in letteratura tra il 5% ed il 15%. La diagnosi: la presenza di ITBL può essere ipotizzata in caso di episodi di colangiti e/o alterazioni degli indici di colestasi e viene confermata da esami strumentali quali colangiografia o colangio-RM.

Patogenesi e fattori di rischio delle stenosi non anastomotiche delle

vie biliari

I principali fattori di rischio coinvolti nelle lesioni ischemiche delle vie biliari sono [7, 8]:

 Danno da ischemia riperfusione

 Tossicità dei sali biliari

 L’attività immuno–mediata

Tre studi indipendenti, aventi come obiettivo la valutazione del dotto biliare comune di fegati destinati alla donazione, hanno rivelato che nell’86% - 88% dei casi l’epitelio duttale risultava essere significativamente danneggiato al termine della conservazione statica ipotermica [9-11]. Tali studi hanno dimostrato che i dotti biliari della maggior parte dei fegati donati hanno subito danni durante la conservazione a freddo e che una piccola percentuale di essi abbiano addirittura sviluppato lesioni ischemiche alle vie biliari a seguito del trapianto; tutto ciò suggerisce la possibile perdita della capacità rigenerativa dell’epitelio duttale e che

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13 tale deficit possa rappresentare una causa molto importante almeno nelle fasi iniziali del danno biliare [11]. A tal riguardo le ghiandole peribiliari (PBG) sono state identificate come un importante sito di cellule progenitrici dell’epitelio biliare [12-16].

In uno studio condotto da op den Dries et al. [17] su 128 fegati trapiantati, è stata dimostrata una forte correlazione tra il danno a carico delle ghiandole peribiliari (PBG), al plesso vascolare peribiliare (PVP), e lo sviluppo tardivo di NAS nei riceventi. Le PBG sono strutture ghiandolari presenti in gran numero nelle pareti dei dotti biliari intra ed extraepatici e tali dotti costituiscono i siti più comuni per la formazione di stenosi [18].

Le ghiandole peribiliari sono connesse al lume superficiale con piccoli canali attraverso i quali le cellule dell’epitelio biliare di nuova costituzione possono migrare e contribuire al ripristino dello strato cellulare dei dotti biliari. Le cellule progenitrici si trovano principalmente proprio nelle ghiandole peribiliari e sono localizzate negli strati più profondi della parete duttale, adiacenti allo strato fibromuscolare [14-15].

Lo studio condotto da op den Dries suggerisce che il distacco e/o la perdita di cellule epiteliali delle ghiandole peribiliari, durante la conservazione statica ipotermica, costituisce il principale rischio di sviluppo di NAS a trapianto avvenuto. I marcatori specifici delle cellule staminali/progenitrici sono stati identificati principalmente a livello delle ghiandole situate più in profondità della parete duttale, mentre le cellule mature si trovano più facilmente nelle ghiandole situate vicino all’epitelio superficiale [14-16]. Sebbene la maggior parte delle biopsie duttali prelevate prima del trapianto abbiano rilevato un’importante perdita dell’epitelio biliare a livello del lume, tale dato non è correlato con lo sviluppo di NAS dopo il trapianto. Il danno a carico delle PBG e del PVP e il processo di

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14 necrosi dello stroma murale costituiscono le uniche evidenze istologiche significativamente associate con l’insorgere di NAS post operatorie. Questi dati suggeriscono che una ridotta capacità rigenerativa delle cellule progenitrici biliari nelle PBG, associata a un’insufficiente apporto sanguigno, rappresenta il fattore determinante per il meccanismo che sottintende la patogenesi di stenosi biliari post trapianto (Figura 2). Altro interessante dato di tale studio è stata la comparazione del danno biliare tra i graft provenienti da DCD e DBD. Sorprendentemente, non sono state rilevate molte differenze nello sviluppo del danno biliare in entrambi i gruppi, fatta eccezione però di una significativa percentuale di fegati con danno a livello del PVP nel gruppo dei DCD. Più precisamente l’incidenza di NAS post trapianto nei graft DCD è due volte più alta rispetto ai graft DBD. Tale fenomeno può essere causato dal disfacimento del microcircolo con conseguente riduzione dell’apporto di ossigeno nei dotti biliari di questi fegati. In aggiunta alla presunta mancanza di ossigeno, l’epitelio duttale è direttamente esposto agli acidi citotossici della bile durante la conservazione statica ipotermica, in quanto i meccanismi endogeni di difesa falliscono a causa del ridotto metabolismo per via delle basse temperature [7]. Studi precedenti hanno dimostrato che la tossicità dei sali biliari può contribuire al danno duttale e alla conseguente formazione di NAS [19,20]. Il plesso vascolare peribiliare ha un ruolo essenziale per la vitalità del dotto biliare in quanto provvede al necessario apporto sanguigno e di ossigeno. Il flusso ematico attraverso il PVP è supportato principalmente dall’arteria epatica e l’eventuale trombosi di tale vaso sanguigno, subito dopo il trapianto, porta in genere alla necrosi dei dotti biliari [21-23]. Queste recenti scoperte suggeriscono che il PVP ricopre un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dell’epitelio biliare e di conseguenza nella patogenesi di NAS. L’esame istologico dei dotti biliari con vari gradi di lesione dell’epitelio costituente, le ghiandole peribiliari e il plesso

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15 vascolare sono rappresentati nella Figura 3(A-B).

E’ ovvio che la tecnica statica ipotermica per la conservazione dei fegati destinati al trapianto non provvede ad un’adeguata protezione dei dotti biliari. Infatti l’alta percentuale di lesioni del tipo NAS suggerisce che la combinazione della ischemia calda e successivamente fredda potrebbe risultare particolarmente rischiosa. Il solo modo per ridurre l’ischemia fredda, al fine di preservare al meglio le PBG e il PVP, è il ricorso a macchine da perfusione. Infatti, è ormai globalmente condiviso il principio che mantenere organi da donatori anziani in un ambiente fisiologico, minimizzando i tempi di ischemia fredda, possa ridurre le complicanze post-trapianto e favorire una più rapida ripresa dell’organo. In particolare, la minimizzazione del danno da ischemia-riperfusione dovrebbe comportare una riduzione dell’incidenza delle complicanze biliari, un ridotto rischio di non funzione o disfunzione dell’organo e un miglior outcome del paziente trapiantato.

La conservazione con macchine da perfusione

Una macchina per perfusione e/o preservazione degli organi consiste in un dispositivo dotato di una pompa che garantisce un ricircolo controllato di sangue o soluzione di preservazione attraverso un organo. La perfusione continua permette una migliore penetrazione del perfusato, un equilibrio tra comparto vascolare, cellulare ed extracellulare, l’apporto di ossigeno e nutrienti (se il dispositivo è accoppiato ad un ossigenatore), la rimozione di metaboliti tossici [21]. La macchina permette, inoltre, un monitoraggio in tempo reale della performance funzionale e biochimica dell’organo [22].

I differenti tipi di macchina utilizzati differiscono per le temperature di conservazione e si dividono in:

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 ipotermiche (HMP) a 4°C

 subnormotermiche (SNMP) tra 20°C e 25°C

 normotermiche (NMP) a 37°C

Altre differenze riguardano il regime di flusso e di pressione (pulsatile Vs non pulsatile), il numero di vasi perfusi (arteria epatica e/o vena porta) e l’eventuale ossigenazione del perfusato.

La HMP, abbassando il metabolismo, protegge l’organo dai danni da ischemia riperfusione [23]. Guarrera et al. sono stati i primi ad osservare l’impatto di questa metodica sull’uomo riportando una riduzione dei markers biochimici di danno epatico, minori complicanze biliari e degenza ridotta. L’aggiunta di ossigeno alle soluzioni di conservazione (hypothermic oxygenated perfusion HOPE) in modelli animali ha mostrato ulteriori miglioramenti [24,25].

La macchina SNMP abbassa il fabbisogno metabolico del fegato mantenendo comunque una attività sufficiente per migliorare la funzione del graft [26]. In un modello animale è stato riscontrato un effetto benefico con abbassamento del picco delle transaminasi, mentre un aumento dei livelli di bilirubina ha suggerito una inadeguata prevenzione del danno da ischemia riperfusione a livello biliare.

La macchina NMP sembra essere la più promettente in quanto permette di mantenere l’organo in condizioni del tutto simili al corpo umano con temperature fisiologiche ed apporto di nutrienti ed ossigeno. Inoltre permette, mediante computer, un monitoraggio continuo di parametri come pH, transaminasi, produzione di bile [27]. Altro vantaggio della macchina è la duplice perfusione arteriosa e portale in modalità fisiologiche; la perfusione arteriosa è infatti a pressione regolabile e può essere continua o pulsatile, mentre la portale può essere a caduta (autoregolata), oppure regolata sulla base dei valori di flusso o di

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17 pressione al fine di evitare il danneggiamento del microcircolo venoso.

Attualmente sono in produzione 3 macchine delle quali solamente due sono state sperimentate sull’uomo:

 la LiverAssist® della ditta Organ-Assist® (modello non trasportabile)

 la Metra® della ditta ORGANOX® (modello trasportabile)

La macchina Metra® non possiede ancora il marchio CE e viene attualmente utilizzata in cinque centri Europei all’interno di un trial clinico (Birmingham, Londra, Bruxelles, Barcellona, Essen) ed in due centri canadesi con autorizzazione rilasciata dalle locali autorità sanitarie (Edmonton e Toronto). La macchina LiverAssist® possiede il marchio CE e viene utilizzata in alcuni centri Europei (Groningen, Cambridge ed altri).

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SCOPO DELLO STUDIO

Razionale dello studio

Questo studio è stato disegnato dopo diverse pubblicazioni di trapianti epatici eseguiti con l’ausilio di macchine da perfusione. In Toscana la mediana di età dei donatori nell’anno 2014 è 71 anni, ed è estremamente elevata se comparata ad altre regioni italiane (mediana area Nord Italian Transplant: 59 anni) oppure ad altri paesi come gli USA (39 anni). La sicurezza dell’utilizzo di questi organi è già stata ampiamente dimostrata in molti lavori scientifici come già descritto. Nonostante ciò, l’utilizzo di questi donatori è ancora correlato con una maggior incidenza di complicanze biliari, in particolare stenosi biliari non anastomotiche (ischemic type biliary lesion, ITBL) e recidiva di HCV. Le complicanze biliari raggiungono, in questi donatori, una percentuale del 14% circa, contro il 3% circa dei donatori sotto i 60 anni. Per questo motivo le complicanze biliari costituiscono il tallone d’Achille dell’utilizzo dei donatori anziani, poiché obbligano i riceventi con questa complicanza a sottoporsi a ripetuti trattamenti, anche invasivi, con elevati costi annuali e una scarsa qualità della vita. Le complicanze biliari sono principalmente imputate a un danno da ischemia-riperfusione. E’ nostra convinzione che mantenere organi da donatori anziani in un ambiente fisiologico minimizzando i tempi di ischemia fredda, tramite l’utilizzo delle macchine da perfusione normotermiche, possa ridurre le complicanze post-trapianto e favorire una più rapida ripresa dell’organo. In particolare, la minimizzazione del danno da ischemia-riperfusione dovrebbe comportare una riduzione dell’incidenza delle complicanze biliari, un ridotto rischio di non funzione o disfunzione dell’organo e un miglior outcome del paziente trapiantato.

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Obiettivi dello studio

Lo studio, approvato dal P.O. Segreteria Amministrativa del Comitato di Bioetica della Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana (AOUP) nella seduta del 11/02/2016 (Prot. N. 10185), che prevede ventiquattro mesi di reclutamento e 6 mesi di osservazione per paziente, è condotto presso la Divisione di Chirurgia Epatica e del Trapianto di Fegato della AOUP in collaborazione con:

 U.O. Immunoematologia AOUP

 U.O. Anatomia Patologica AOUP

 Dipartimento di ricerca traslazionale e delle nuove tecnologie in Medicina e Chirurgia, Laboratorio di Patologia Clinica, AOUP

 U.O. Anestesia e Rianimazione del Trapianto di Fegato AOUP

L’obiettivo è quello di confrontare 6 pazienti sottoposti a trapianto tramite graft preservato mediante procedura standard di conservazione statica ipotermica in ghiaccio (braccio A) con 6 pazienti sottoposti a trapianto tramite graft preservato mediante macchina LiverAssist® (braccio B).

Primary endpoint, ovvero valutare l’efficacia dell’utilizzo della macchina

LiverAssist® nel trapianto epatico con donatori di età maggiore o uguale a 70 anni attraverso:

 Incidenza di Primary non Function PNF

 Sopravvivenza del paziente e del graft a 90 giorni

 Incidenza di lesioni ischemiche delle vie biliari a 180 giorni (lesioni sospettate clinicamente e confermate con colangiografia o colangio-RM)

Secondary endpoint, ovvero eseguire la valutazione del danno da

ischemia-riperfusione del graft attraverso:

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 Picco di GOT, GPT, bilirubina, GGT nei primi sette giorni post-trapianto

 Analisi biochimica della bile mediante dosaggio di sali biliari, bilirubina, GGT, Na+

 Lesioni delle vie biliari a 180 giorni (lesioni sospettate clinicamente e confermate con colangiografia o colangio-RM)

Il numero di pazienti (12 totale e ripartiti 6 per braccio) non è stato formulato su base statistica, trattandosi di uno studio pilota. Esso corrisponde al 30% del volume annuale di trapianto. Si ritiene però che sia un numero sufficiente per raggiungere i seguenti obiettivi:

 Valutare l’efficacia della tecnologia

 Fornire dati che ci permettano di indirizzare futuri studi sulla base delle specifiche caratteristiche della popolazione donativa toscana che non conosce eguali (età elevata) nei restanti paesi europei o nord americani e che difficilmente otterrano risposte da studi condotti in centri con caratteristiche dissimili dal nostro (es. Nord Europei e Nord Americani).

Si ritiene che questo numero costituisca un ragionevole compromesso tra la necessità di ottenere dati scientifici preliminari e ottimizzare i costi nei limiti dei finanziamenti accordati dalla Organizzazione Toscana Trapianti (OTT).

La randomizzazione è stata effettuata mediante sistema a buste sigillate indicanti il braccio di allocazione. La sequenza delle allocazioni è stata generata mediante sistema informatico. In accordo con le variabili e i loro livelli di distribuzione, le descrizioni statistiche verranno riportate come mediane, interquartile (IQR) e frequenze. Nella comparazione tra braccio A e braccio B, useremo lo Student’s t test per comparare variabili continue con normale distribuzione ed il test di Mann-Whitney U per le variabili continue con distribuzione non parametrica. Il test esatto

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21 di Fisher e quello di Kruskal-Wallis verranno usati per comparare variabili dicotomiche. La sopravvivenza del graft e del paziente saranno calcolate usando il metodo di Kaplan-Meier in tutta la popolazione e stratificate in accordo con lo sviluppo di complicanze. Le curve di sopravvivenza saranno comparate con il test log rank tra i vari gruppi. Un valore di p<0.05 sarà considerato statisticamente significativo. Tutte le elaborazioni statistiche verranno eseguite con PASW 20.0 software (Chicago IL, USA).

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MATERIALI E METODI

La LiverAssist

®

La macchina LiverAssist® per perfusione normotermica (Figura 4) comprende una unità con pompa centrifuga per la perfusione pulsatile a pressione controllata dell’arteria epatica e una unità per la perfusione continua a pressione controllata della vena porta, un ossigenatore, un concentratore di ossigeno, un riscaldatore, un reservoir, delle sonde di flusso, dei sensori di pressione per la misurazione dei flussi e delle pressioni vascolari.

Set monouso

Il set monouso contiene componenti che devono essere sostituiti ad ogni utilizzo quali tubi, linee per la perfusione, una vaschetta per la conservazione dell’organo, cannule per arteria, vena porta e vena cava, una cannula per la via biliare.

Soluzioni per la perfusione e additivi

Le soluzioni includono: un fluido primario per la perfusione costituito da globuli rossi concentrati (3U di emazie concentrate isogruppo) con addizione di plasma fresco e albumina umana per normalizzare l’ematocrito e l’osmolarità.

Prima della connessione al graft il fluido di perfusione è addizionato con:

 Cefazolina (antibiotico)

 Metronidazolo (antifungino)

 Nutrizione parenterale

 Soluzione fisiologica

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 Sodio bicarbonato per l’aggiustamento del pH

 Calcio gluconato per correggere il legame del calcio al citrato

 Insulina (per il controllo dei livelli glicemici del perfusato)

Il fluido primario per la perfusione è costituito da globuli rossi concentrati che verranno forniti dal Centro Trasfusionale della AOUP. I circuiti con le necessarie soluzioni saranno preparati durante il set up della macchina una volta terminate le procedure di preparazione dell’organo al banco e prima della connessione del fegato. Nella progettazione della macchina si è posta molta importanza a non modificare le procedure standard di prelievo dell’organo al fine di minimizzare i possibili errori tecnici. Da un punto di vista legislativo è importante notare che la macchina LiverAssist® è un sistema di preservazione degli organi e non implica alcuna connessione né con il donatore né con il ricevente in nessun momento. La macchina è basata sul principio che tutti i perfusati sono rimossi dall’organo prima dell’impianto sul ricevente mediante la perfusione con soluzione salina o albumina 5%.

Ciò è in accordo con le attuali procedure trapiantologiche effettuate dopo la preservazione statica ipotermica.

La macchina può essere utilizzata solo da personale sanitario previo specifico addestramento. La decisione dell’utilizzo dell’organo dopo la perfusione con LiverAssist® è responsabilità del chirurgo trapiantatore.

Criteri di arruolamento

I criteri di inclusione del ricevente sono:

a. Inserimento in lista di attesa per trapianto epatico presso la UO Chirurgia Epatica e del Trapianto di Fegato dell’AOUP

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24 b. Consenso informato firmato in presenza di un medico dopo aver ricevuto

informazioni esaustive e note informative sul dispositivo e sullo studio c. Età tra i 18 ed i 70 anni al momento del trapianto

d. Eleggibilità al trapianto epatico stabilita mediante valutazione come da linee guida in uso presso il nostro Centro e discussione collegiale del personale medico della Unità Operativa

e. Capacità e volontà di aderire al protocollo di studio stabilita dagli investigatori I criteri di esclusione del ricevente sono:

a. Mancata volontà o incapacità di fornire un consenso informato b. Età inferiore a 18 anni o superiore a 70

c. Presenza di malattia o disordine o situazione che, nell’opinione degli investigatori, potrebbe influenzare il risultato dello studio o la capacità del partecipante di aderire allo studio

d. Partecipazione in altri studi e/o protocolli che potrebbero alterare il risultato dello studio

e. Re-trapianto

f. Incompatibilità ABO g. Trapianto multiorgano

h. Trapianto per insufficienza epatica acuta o per trauma epatico i. MELD>24

j. Non idoneità (a giudizio dei medici della UO) per altra ragione, a prendere parte allo studio

I criteri di selezione del donatore sono:

a. Donatore segnalato dal CRAOT (Centro Regionale Allocazione Organi e Tessuti) con consenso alla donazione

(25)

25 c. Nessuna controindicazione assoluta secondo le indicazioni del Centro

Nazionale Trapianti (CNT)

d. Donatore di età maggiore o uguale a 70 anni e. Organo intero

f. Disponibilità della macchina LiverAssist® e del personale medico addestrato al suo utilizzo

g. Donatore in presidio ospedaliero distante non più di 4 ore di macchina dalla AOUP

I criteri di esclusione del ricevente dopo l’arruolamento sono: a. Ritiro del consenso da parte del paziente

b. Assenza di compliance da parte del paziente

Per quanto concerne l’arruolamento dei partecipanti allo studio, a tutti i pazienti che rientrano nei criteri sopraelencati ed inseriti in lista di attesa per trapianto epatico presso la U.O. verrà proposta la partecipazione allo studio durante il primo colloquio programmato nel periodo pre trapianto. Come detto il colloquio si terrà in occasione di un appuntamento previsto dalle normali procedure della struttura ospedaliera. Informazioni dettagliate riguardanti lo studio verranno fornite da un medico sia verbalmente che mediante foglietto illustrativo. Ai pazienti verrà dato adeguato periodo di tempo per decidere sul consenso all’arruolamento. In caso di richiesta di ulteriori informazioni e/o chiarimenti un medico sarà sempre disponibile anche dopo l’arruolamento per un colloquio con il paziente. I partecipanti allo studio verranno segnalati all’interno della lista di attesa per trapianto epatico della U.O.

(26)

26

Fase operativa

Allocazione e randomizzazione

Una volta ricevuta segnalazione di donatore di fegato potenzialmente idoneo, il graft è stato allocato a un paziente in lista di attesa secondo le consuete modalità della U.O. e indipendentemente dallo studio. In caso l’organo allocato sia di un donatore di età maggiore a 70 anni e il ricevente scelto sia stato arruolato nello studio, il Medico Coordinatore verificherà la disponibilità della macchina LiverAssist® e del personale medico addestrato al suo utilizzo. La randomizzazione è stata effettuata secondo la modalità precedentemente indicata.

Esecuzione del prelievo

L’équipe di prelievo è costituita da medici della U.O. Chirurgia Epatica e dei Trapianti di Fegato della AOUP. L’équipe viene trasportata con apposito vettore nella sede della donazione. Dopo verifica della documentazione si procede con il prelievo.

Descrizione della procedura di prelievo

Sterno-laparotomia mediana. Valutazione macroscopica di assenza di lesioni degli organi toracici ed addominali. Valutazione macroscopica del fegato. Biopsia epatica con tru-cut (14G) per la valutazione del graft. Identificazione dell’arteria epatica e di sue eventuali varianti anatomiche; identificazione e sezione del dotto epatico comune. Incisione e lavaggio della colecisti con soluzione salina e successiva colecistectomia. Isolamento della vena mesenterica inferiore (VMI) e dell’aorta sottorenale. In caso di idoneità del fegato al trapianto stabilita mediante valutazione macroscopica ed eventuale biopsia, si procede con eparinizzazione sistemica (300 UI/Kg). Cannulazione della vena mesenterica inferiore e dell’aorta.

(27)

27 Clampaggio aortico toracico, atriotomia dx ed inizio della perfusione ipotermica con contemporaneo raffreddamento mediante ghiaccio nel cavo addominale e toracico. Perfusione a caduta dalla VMI con 1 L di Ringer lattato a 0-4%C seguito da perfusione con 1 L di Celsior a 0-4°C. Perfusione a pressione (150 mmHg) dall’aorta con 1 L di Ringer lattato seguito da Celsior 90 ml/Kg. Lavaggio del dotto epatico comune con soluzione di preservazione dal margine distale in prossimità del duodeno con un catetere e prelievo del suo margine distale per biopsia. Epatectomia. Ritorno in sede. Durante il trasporto l’organo è conservato in ipotermia statica. Esecuzione della chirurgia di banco per preparazione dell’organo. Stoccaggio con metodica statica ipotermica o con macchina LiverAssist® a seconda della randomizzazione.

Durante il prelievo vengono registrati i seguenti dati:

 sede di prelievo e orario inizio

 valutazione macroscopica del fegato

 orario clampaggio aortico

 orario prelievo fegato

 orario termine prelievo

 tipo di perfusione (soluzione e via di infusione)

 quantità di eparina somministrata

 eventuali anomalie arteriose

 tempo di preparazione su banco

 perfusione su banco

Il graft è inserito in una busta sterile poi perfuso con 1 litro di soluzione Celsior. La prima busta è inserita dentro un’altra sterile contenente ghiaccio. La prima e la seconda busta sono poi inserite all’interno di ulteriori due buste sterili. Il tutto è

(28)

28 inserito all’interno di un contenitore metallico e poi in un frigo trasportabile contenente ghiaccio. Una volta giunta presso la sede di trapianto (AOUP) l’equipe di prelievo esegue la fase di chirurgia di banco con preparazione dell’organo. In caso l’organo sia stato allocato nel braccio di controllo verrà stoccato come abitualmente avviene in sacchetti contenenti liquido di conservazione e ghiaccio e riposto in frigo fino al momento dell’impianto sul ricevente. In caso l’organo sia allocato al braccio di utilizzo della macchina si procederà come al punto seguente.

Conservazione con macchina LiverAssist

 Viene eseguito set-up della macchina da personale appositamente addestrato

 Viene aperto il set monouso e connesso alla macchina

 Una volta montato il set vengono preparate la soluzione di perfusione e gli additivi

 La macchina viene accesa ed il perfusato comincia a circolare. Il riscaldatore comincia a scaldare il perfusato

 Il fegato è posto nell’apposita bacinella e connesso alle linee evitando l’introduzione di aria

 I clamp vengono rimossi e la perfusione iniziata

 Si procede al riscaldamento dell’organo fino a 37°C

 La macchina permane in Sala Operatoria fino al momento dell’impianto e viene costantemente controllata da uno dei Chirurghi prelevatori. Durante questo periodo tutti i parametri (vedi dopo) vengono costantemente valutati dalla Equipe di prelievo e discussi con il Chirurgo trapiantatore

 Quando il chirurgo trapiantatore è pronto per l’impianto la perfusione è interrotta ed i clamps sulle linee vascolari chiusi.

(29)

29

 Il fegato è disconnesso dalla macchina e perfuso con soluzione salina fredda; le cannule vengono rimosse

 Il fegato viene consegnato al chirurgo trapiantatore per l’impianto

 Tutti i componenti monouso vengono gettati negli appositi contenitori per smaltimento dei rifiuti ospedalieri

 Dopo pulizia, la macchina è riposta all’interno del Coordinamento Trapianti di Fegato

Durante il trasporto e la conservazione dell'organo vengono monitorati i seguenti dati:

a. tempo trascorso dal graft nella macchina b. lattati

c. emogasanalisi d. pressione e. flussi

f. consumo di glucosio

g. produzione di bile e sua valutazione biochimica h. transaminasi

i. peso del graft dopo perfusione

Il trapianto epatico

Il trapianto viene eseguito, in entrambi i gruppi, con tecnica standard che prevede la asportazione della vena cava retroepatica ed il by-pass veno-venoso come usualmente avviene presso la U.O. Chirurgia Epatica e dei Trapianti di Fegato della AOUP. Dopo la riperfusione viene eseguita la biopsia del tratto distale della via biliare principale. Un tubo a T viene inserito nella via biliare al momento della

(30)

30 anastomosi, tranne che nei casi ove sia impossibile per motivi di dimensione della via biliare. Prima della chiusura dell’addome viene eseguita biopsia epatica con tru-cut 14G. Durante il trapianto vengono registrati i seguenti dati: orario inizio trapianto, orario fine trapianto, inizio fase anepatica, orario fegato fuori dal ghiaccio (o dalla LiverAssist®), rivascolarizzazione portale, rivascolarizzazione arteriosa, tempo di ischemia fredda (CIT), tempo di perfusione nella LiverAssist®, tempo di impianto, tempo tra riperfusione portale e declampaggio dell’arteria, unità di GRC usate, unità di PFC usate, unità di piastrine usate.

Anatomia Patologica

Come accennato sopra, durante le procedure di prelievo e trapianto vengono eseguite, sui pazienti del braccio sperimentale, le seguenti biopsie epatiche:

 Durante il prelievo (pre-perfusione)

 Prima dell’impianto nel ricevente (al termine della conservazione nella LiverAssist)

 Dopo la riperfusione sul ricevente prima della chiusura dell’addome

Sui pazienti del gruppo di controllo invece, come da protocollo, vengono eseguite le seguenti biopsie epatiche:

 Dopo la riperfusione sul ricevente prima della chiusura dell’addome

Sempre durante le procedure di prelievo e trapianto vengono eseguite sui pazienti del braccio sperimentale le seguenti biopsie della via biliare principale (tratto più distale):

(31)

31

 Dopo la riperfusione prima di eseguire l’anastomosi biliare nel ricevente

Sui pazienti del gruppo di controllo invece, come da protocollo, saranno eseguite le seguenti biopsie della via biliare principale (tratto più distale):

 Dopo la riperfusione prima di eseguire l’anastomosi biliare nel ricevente

In entrambi i gruppi le biopsie sono state valutate dalla U.O. Anatomia Patologica della AOUP con le seguenti modalità:

 Campionamento

 Processazione e inclusione in paraffina

 Colorazioni con ematossilina eosina

 Colorazioni istochimiche

 Colorazioni immunoistochimiche

Le colorazioni istochimiche previste sulle biopsie epatiche includono l’utilizzo del PAS, PAS-D e Tricromica di Masson. Per quanto riguarda la colorazione istochimica delle biopsie biliari è stata eseguita la Tricromica di Masson, mentre per l’immunoistochimica il CD 31.

I parametri istologici valutati per le biopsie epatiche sono stati:

 Fibrosi

 Necrosi

 Steatosi Macrovescicolare e Microvescicolare (M e m)

 Infiammazione portale

 Ispessimento vascolare

 contenuto in glicogeno valutato con la colorazione PAS

E’ stato inoltre effettuato il dosaggio biochimico della concentrazione di glicogeno nelle biopsie epatiche, presso il Laboratorio di Patologia Clinica (Prof. Aldo

(32)

32 Paolicchi), tramite il Glycogen Assay Kit, n. catalogo MAK016, della azienda Sigma-Aldrich.

Per quanto riguarda i parametri istologici per le biopsie biliari sono:



Danno dell’epitelio biliare superficiale



Necrosi della parete



Danno dell’endotelio e della parete vascolare



Trombosi luminale



Sanguinamento intramurale



Danno delle ghiandole superficiali



Danno delle ghiandole profonde



Infiammazione

In special modo per le biopsie biliari, come già evidenziato, i marcatori specifici delle cellule staminali/progenitrici sono stati identificati principalmente a livello delle ghiandole situate più in profondità della parete duttale, mentre le cellule mature si trovano più facilmente nelle ghiandole situate vicino all’epitelio superficiale. Dato che la maggior parte delle biopsie duttali prelevate prima del trapianto hanno rilevato un’importante perdita dell’epitelio biliare a livello del lume, il danno alle ghiandole biliari superficiali e alle ghiandole biliari profonde è stato valutato tramite un punteggio separato. Tale punteggio prevede (Figura 5):



0 qualora non vi siano segni di lesione



< 50 qualora la lesione è inferiore al 50 %



> 50 qualora la lesione è superiore al 50%

(33)

33

Fase post-trapianto

Immunosoppressione post-trapianto

 Anti-IL2R (Basiliximab 20mg) in giornata post-operatoria 0 e 4

 Micofenolato Mofetile (MMF) 500 mg per os due volte al giorno

 Tacrolimus 0,1-0,2 mg per Kg per os due volte al giorno variando il dosaggio fino al raggiungimento di un valore di tacrolemia di 6-10 ng/ml dalla 5° giornata

 Steroidi:

1. Giornata 0: Metilprednisolone: 10 mg per Kg (min. 500 mg/max 1000 mg) 2. Giornata 1: Metilprednisolone: 500 mg 3. Giornata 2: Metilprednisolone: 250 mg 4. Giornata 3: Metilprednisolone: 125 mg 5. Giornata 4: Metilprednisolone: 60 mg 6. Giornata 5: Metilprednisolone: 30 mg 7. Giornata 6-15: Prednisone: 25 mg 8. Giornata 15-30: Prednisone: 20 mg 9. Giornata 30-45: Prednisone: 15 mg 10. Giornata 45-60: Prednisone: 10 mg 11. Giornata 60-75: Prednisone: 5 mg

12. Giornata 75-90: Prednisone: 5 mg a giorni alterni

Profilassi Anti-Toxoplasma e CMV

Tutti i riceventi con mismatch D+/R- riceveranno profilassi anti-toxoplasmosi e CMV rispettivamente con:

(34)

34

 Valganciclovir 450 mg b.i.d. per os per 3 mesi

Controlli clinici, ematochimici, radiologici post trapianto

Dopo l’esecuzione del trapianto, il paziente verrà trasferito presso la U.O. Anestesia e Rianimazione nel Trapianto di Fegato ove rimarrà per un periodo di tempo variabile a seconda delle condizioni cliniche. Durante il ricovero il paziente verrà quotidianamente sottoposto a valutazione clinica. Il paziente eseguirà gli stessi controlli post-operatori dei pazienti sottoposti a trapianto epatico secondo procedura standard. Nessuno di questi accertamenti costringerà il paziente a visite aggiuntive rispetto a quelle normalmente previste per qualunque altro paziente sottoposto a trapianto. Rispetto alla comune pratica clinica i seguenti esami saranno aggiuntivi:

 Esami chimici sulla bile (prelevata tramite tubo di Kehr durante la routinaria pulizia dello stesso da effettuarsi almeno 2 volte/die)

 Esami di laboratorio sul ricevente nelle giornate postoperatorie: 0 (pre-trapianto), 0 (post-(pre-trapianto), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, e successivamente alla dimissione

 Emocromo con formula

 Test di funzionalità epatica (AST, ALT, Bil T/D, GGT, ALP, LDH)

 Elettroliti (Na, Ca, K, Cl, Mg)

 Creatininemia, BUN, glicemia

 Tacrolemia

 Sierologia (anti HBs se ricevente HBV+ o donatore anti HBc+; HCV-RNA quantitativo solo se paziente HCV+; HBV-DNA se ricevente HBV+ o

(35)

35 donatore anti HBc+; PCR-CMV; PCR-EBV): nelle giornate postoperatorie 7,30,60,90

 Analisi della bile

Per i propositi dello studio i seguenti esami saranno eseguiti su campioni di bile del ricevente nelle giornate postoperatorie 0,1,3,7,14,30:

 Sali biliari

 ɣGT (e sue sub-frazioni)

 Bilirubina

 Na+

Per quanto riguarda i controlli radiologici, come da standard clinici, un Doppler US sarà eseguito in giornata postoperatoria 2,7,30,90 e comunque ogni volta sia clinicamente indicato per controllare la pervietà dei vasi. Per la valutazione della via biliare verrà eseguita una colangiografia trans-Kehr in giornata postoperatoria 90 (prima della rimozione del tubo) o comunque ogni volta sia clinicamente indicato. Nel caso in cui si manifestino segni e/o sintomi di ITBL dopo la rimozione del Kehr il paziente verrà sottoposto ad una colangio-RM per la conferma diagnostica.

Fase post-dimissione

Tutti i pazienti saranno clinicamente seguiti per un periodo di sei mesi dopo il trapianto epatico per i propositi di questo studio. Dopo tale periodo tutti i pazienti continueranno a seguire il normale follow-up in uso presso l’U.O. Chirurgia Epatica e del Trapianto di Fegato dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana. I controlli clinici da effettuare sono:

(36)

36

 Esami ematochimici settimanali fino al terzo mese e quindicinali fino al sesto mese post trapianto

 Prelievo di bile dal Kehr in 14 e 30 giornata postoperatoria

 Prelievo per esami sierologici in giornata 30, 60, 90 dopo il trapianto

 Esecuzione di Doppler US in 30 e 90 giornata post-trapianto

 Esecuzione di colangiografia trans-Kehr in 90 giornata postoperatoria per la rimozione del Kehr stesso

Tutti i sopraelencati controlli potranno avere una frequenza maggiore in caso di necessità cliniche.

(37)

37

RISULTATI

I risultati del grading istologico a carico delle biopsie epatiche sia del braccio sperimentale sia del braccio di controllo sono elencati nelle Tabelle 1 e 2.

L. A. 43 aa

Biopsia Epatica Fibrosi % Necrosi % Steatosi % Infiammazione Portale

Ispessimento

vascolare PAS %

Banco 0 0 0 Lieve Lieve-Moderato 80

Post perfusione 0 5 0 Lieve Lieve-Moderato 80

Post trapianto 0 5 0 Lieve Lieve-Moderato < 5%

T. V. 46 aa

Biopsia Epatica Fibrosi Necrosi % Steatosi % Infiammazione

Portale

Ispessimento

Banco 0 0 0 Lieve Lieve 90

Post perfusione 0 < 1 0 Lieve Lieve 50

Post trapianto 0 < 5 0 Lieve Lieve 10

B. M. 60 aa

Portale

Ispessimento

Banco 0 0 > 50 m Lieve-Moderato Lieve-Moderato 90

Post perfusione 0 0 > 50 m; < 10 M Lieve-Moderato Lieve-Moderato 40

Post trapianto 0 0 > 50 m; < 10 M Lieve Lieve-Moderato 50

S. C. 44 aa

Portale

Ispessimento

Banco 0 0 30 m; 5 M 0 Assente 70

Post perfusione 0 0 40 m; 5 M Lieve Assente 70

Post trapianto 0 < 5 40 m; 5 M Lieve Assente < 5

DL. M. 61 aa

Portale

Ispessimento

Banco 0 0 70 m; 5 M Lieve Assente 30

Post perfusione 0 < 5 70 m; 5 M Lieve Assente 60

Post trapianto 0 < 10 70 m; 5 M Lieve Assente 15

G. S. 58 aa

Portale

Ispessimento

Banco 0 0 0 0 Lieve 50

Post perfusione 0 < 10 0 0 Lieve 70

Post trapianto 0 < 20 0 0 Lieve 30

(38)

38

P. P. 47 aa

Ispessimento

Banco 0 0 < 5 Lieve Lieve 90

Post trapianto 0 5 < 5 Lieve Lieve 90

M. F. 42 aa

Ispessimento

Banco 0 0 0 Lieve Lieve-Moderato 80

Post trapianto 0 15 0 Lieve Lieve-Moderato 30

L. G. 63 aa

Ispessimento

Banco 0 < 5 15 m; 0 M Assente Assente 80

Post trapianto 0 < 5 15 m; < 5 M Assente Assente 40

N. V. 54 aa

Biopsia Epatica Fibrosi % Necrosi % Steatosi % Infiammazione _Portale Ispessimento _vascolare PAS %

Banco nv nv nv nv nv nv

Post trapianto nv nv nv nv nv nv

Y. W. 39 aa

Ispessimento

Banco 0 < 5 < 5 m; > 5 M Lieve Assente 40

Post trapianto 0 10 < 5 m; > 5 M Lieve Assente 40

P. R. 58 aa

Ispessimento

Banco < 5 < 5 30 m; 15 M Lieve Assente 70

Post trapianto < 5 < 10 20 m; 15 M Lieve Assente 70

Tabella 2. Parametri istologici per le biopsie epatiche del braccio di controllo

Dal confronto tra i risultati delle biopsie epatiche del gruppo sperimentale e del gruppo di controllo si evince che per quanto concerne i parametri morfologici, ovvero fibrosi, necrosi, steatosi, infiammazione portale e ispessimento vascolare, i dati sono pressochè identici, la necrosi può presentarsi nel post trapianto e comunque sempre di modesta entità. Ai fini, dunque, del seguente studio essi non rappresentano dei parametri significativi. Considerazione a parte deve esser fatta

(39)

39 per il contenuto in glicogeno a livello degli epatociti, visualizzabile morfologicamente tramite la colorazione istochimica PAS. In tutti i casi studiati del gruppo sperimentale, eccezion fatta per uno, il trend del PAS è stato il medesimo ovvero con concentrazioni alte al banco (inizio del processo) e molto basse nel post trapianto (fine del processo sperimentale). Due esempi a dimostrazione di tale tesi sono riportati nelle Figure 6 e 7. Nei casi di controllo, invece, la concentrazione del glicogeno valutato con il PAS ha subito un minor decremento e in alcuni casi il glicogeno del post trapianto si è addirittura mantenuto ai medesimi livelli registrati nelle biopsie al banco. Questa decrescita molto importante del glicogeno nei casi sperimentali sottoposti a conservazione mediante macchina da perfusione è del tutto inaspettata soprattutto se confrontata coi controlli che, in rapporto, hanno avuto una diminuzione decisamente minore. In linea generale, dagli studi condotti sembra che nei casi sperimentali la concentrazione di glicogeno, alla fine del processo, sia nettamente inferiore rispetto ai controlli, dove il glicogeno si mantiene agli stessi livelli o mostra minore riduzione. Tali risultati morfologici vengono confermati dalle analisi biochimiche condotte sulle biopsie epatiche al fine di rilevare la concentrazione di glicogeno (grafico 1 e 2). Anche in questo caso, dopo la perfusione tramite macchina, si assiste ad una riduzione significativa del glicogeno di partenza mentre i casi controllo mostrano una diminuzione sensibilmente minore se confrontata coi casi sperimentali. Una considerazione in tal senso può essere azzardata col dire che il maggiore consumo di glicogeno da parte degli epatociti, nei fegati sottoposti a conservazione normotermica, potrebbe essere dovuta alla temperatura troppo elevata (37 C°) affine a quella corporea che evidentemente, in fase di trapianto, sottopone a uno stress elevato le cellule, aumentandone così il metabolismo e di conseguenza il consumo stesso di glicogeno.

(40)

40 Grafico 1. Concentrazioni di glicogeno nelle biopsie epatiche del gruppo sperimentale

(41)

41 I risultati del grading istologico per le biopsie biliari sia del braccio sperimentale sia del braccio di controllo sono elencati nelle Tabelle 3 e 4.

L. A. 43 aa

Biopsia Biliare Danno epit.

biliare % Necrosi % Danno vascolare % Trombosi luminale Sanguinamento intramurale Danno gh Superf % Danno gh Profonde % Infiam.

Banco 100 Focale 0 Assente Assente 100 90 0

Post perfusione 90 25-50 Focale Assente Assente 80 10 0

Post trapianto 100 25-50 Focale Assente Assente 90 0 0

T. V. 46 aa

Banco > 50 < 25 0 Assente Assente 0 0 0

Post perfusione < 50 < 25 0 Assente Assente 0 0 0

Post trapianto > 50 25-50 0 Assente Assente < 50 < 50 0

B. M. 60 aa

Banco > 50 < 25 0 Assente Assente < 50 < 50 0

Post perfusione > 50 25-50 > 50 Assente Assente > 50 > 50 0

Post trapianto > 50 > 50 < 50 Assente Assente > 50 < 50 0

S. C. 44 aa

Banco > 50 Assente 0 Assente Assente < 50 < 50 Lieve

Post perfusione > 50 < 25 0 Assente Assente > 50 < 50 Lieve

Post trapianto > 50 < 25 < 50 Assente < 50 < 50 < 50 Lieve

DL. M. 61 aa

Post perfusione > 50 < 50 0 Assente Assente > 50 < 50 Moderata

Post trapianto > 50 Assente 0 Assente < 50 > 50 < 50

Moderata-Grave

G. S. 58 aa

Post perfusione > 50 Assente 0 Assente Assente > 50 < 50 Lieve

Post trapianto > 50 Assente 0 Assente Assente < 50 < 50 Assente

(42)

42

P. P. 47 aa

biliare % Necrosi % Danno vascolare % Trombosi luminale Sanguinamento intramurale Danno gh Superf % Danno gh Profonde% Infiam. Banco > 50 < 25 0 0 0 25-50 < 50 0

Post trapianto > 50 < 25 < 50 0 < 50 > 50 < 50 Lieve

M. F. 42 aa

biliare % Necrosi % Danno vascolare % Trombosi luminale Sanguinamento intramurale Danno gh Superf % Danno gh Profonde% Infiam. Banco > 50 0 < 50 0 0 < 50 < 50 Assente

Post trapianto > 50 0 0 0 0 < 50 < 50 Assente

L. G. 63 aa

biliare % Necrosi % Danno vascolare % Trombosi luminale Sanguinamento intramurale Danno gh Superf % Danno gh Profonde% Infiam.

Banco > 50 < 25 assente assente assente < 50 < 50 Assente

Post trapianto > 50 < 25 assente assente assente < 50 < 50 Assente

N. V. 54 aa

Biopsia Biliare Danno epit. _{biliare %} Necrosi % _{vascolare %}Danno Trombosi _luminale Sanguinamento _intramurale Danno gh _{Superf %} _Profonde%Danno gh Infiam.

Banco > 50 assente assente assente assente < 50 < 50 Assente

Post trapianto > 50 < 25 < 50 assente < 50 < 50 < 50 Assente

Y. W. 39 aa

Banco > 50 assente assente assente assente < 50 < 50 Assente

Post trapianto > 50 assente assente assente assente < 50 < 50 Assente

P. R. 58 aa

Banco > 50 assente assente assente assente > 50 < 50 Lieve

Post trapianto > 50 assente assente assente < 50 < 50 < 50 Lieve

Tabella 4. Parametri istologici per le biopsie biliari del braccio di controllo

Dal confronto tra i risultati delle biopsie biliari del gruppo sperimentale e del gruppo di controllo si evince che i dati sono pressochè sovrapponibili. Ci siamo concentrati in particolare su tre parametri istologici di maggior interesse clinico, ovvero il danno dell’epitelio biliare superficiale e il danno a carico delle ghiandole superficiali e profonde; da tali risultati si deduce che in entrambi i gruppi, sperimentale e di controllo, il trend del danno dell’epitelio superficiale è il