Rivalutazione biofenotipica di pazienti con adenocarcinoma del colon retto metastatico in ripresa di malattia

UNIVERSITA’ DI PISA

Facoltà di Medicina e Chirurgia

Corso di Studi Patologia Clinica

Tesi di Specializzazione

“ Rivalutazione biofenotipica di pazienti

con adenocarcinoma del colon retto

metastatico in ripresa di malattia ”

Relatori:

Prof.re Paolocchi Aldo

Dott.re Cavazzana Andrea

Candidata:

Solfanelli Linda

Lentamente muore – Martha Medeiros

“Lentamente muore chi diventa schiavo dell’abitudine, ripetendo ogni giorno gli stessi percorsi, chi non cambia la marcia, chi non rischia e cambia colore dei vestiti, chi non parla a chi non conosce. Muore lentamente chi fa della televisione il suo guru. Muore lentamente chi evita una passione, chi preferisce il nero su bianco e i puntini sulle “i” piuttosto che un insieme di emozioni, proprio quelle che fanno brillare gli occhi, quelle che fanno di uno sbadiglio un sorriso, quelle che fanno battere il cuore davanti all’errore e ai sentimenti. Lentamente muore chi non capovolge il tavolo quando è infelice sul lavoro, chi non rischia la certezza per l’incertezza per inseguire un sogno, chi non si permette almeno una volta nella vita, di fuggire ai consigli sensati. Lentamente muore chi non viaggia, chi non legge, chi non ascolta musica, chi non trova grazia in se stesso. Muore lentamente chi distrugge l’amor proprio, chi non si lascia aiutare chi passa i giorni a lamentarsi della propria sfortuna o della pioggia incessante. Lentamente muore chi abbandona un progetto prima di iniziarlo, chi non fa domande sugli argomenti che non conosce o non risponde quando gli chiedono qualcosa che conosce.

Evitiamo la morte a piccole dosi, ricordando sempre che essere vivo richiede uno sforzo di gran lunga maggiore del semplice fatto di respirare. Soltanto l’ardente pazienza porterà al raggiungimento di una splendida felicità.”

A me stessa, a mia sorella e ai miei genitori

INDICE

2.1 Accenni alla patogenesi della malattia 11

Cap. 3 Instabilità cromosomica

3.1 Pathway Wnt 14

3.2 Alterazioni genetiche 17

3.3 Pathaway RAS 21

3.4 Sistema p53 26

3.5 Ruolo di Src e STAT 27

Cap. 4. Instabilità microsatellitare (MSI)

4.1 Pathway MSI 30

Cap. 5.Metilazione aberrante del DNA

5.1 Metilazione isole CpG (CIMP) 34

5.2 micro RNA coinvolti nello sviluppo del CRC 36

Cap. 6 Screening

6.1 Prevenzione e Screening 38

Cap 7. Presentazione clinica e modalità di diffusione

7.1 “Cenni” di anatomia patologica 40

7.2 Stadiazione e prognosi 44

Cap.8 Trattamento della malattia localizzata

8.1 Tumore del colon-chemioterapia adiuvante 49

8.2 Tumore del retto extraperitoneale-terapia neoadiuvante 51

8.3 Terapia adiuvante 53

8.4 Trattamento della malattia metastatica 55

8.5 I farmaci citotossici 56

8.6 I farmaci biologici 60

8.7 Farmaci antiangiogenetici bevacizumab, aflibercept e ramucirumab 60

Cap. 9 Scopo della tesi 68 Cap. 10 Parte sperimentale

10.1 Materiali e metodi 69

10.2 BenchMarkXT (Roche) 69

10.3 Estrazione DNA 71

10.4 analisi di mutazione 71

Cap. 11 risultati

11.1 Distribuzione della popolazione 78

11.2 Distribuzione percentuale delle mutazioni esaminate 84 11.3 Percentuale di mutazione nei 291 casi analizzati KRAS vs BRAF 88 11.4 Analisi instabilità microsatellitare (MSI) nei pazienti in ripresa di

malattia 92

Cap.12 Conclusioni 94

1

RIASSUNTO

L’adenocarcinoma del colon retto è la terza forma tumorale per frequenza e la seconda causa di morte per neoplasia nei paesi occidentali. Esso rappresenta il terzo tumore maligno per incidenza e mortalità, dopo quello della mammella nella donna, della prostata nell’uomo e del polmone per entrambi i sessi. È un tipico tumore dell’età adulta con picco di massima incidenza tra la sesta e la settima decade.

Il trattamento dell’adenocarcinoma del colon retto metastatico si è rapidamente evoluto in questo ultimo decennio. L’introduzione di farmaci e combinazioni diverse tra le possibili opzioni di trattamento in prima linea dei pazienti affetti, da una parte ha ampliato il ventaglio delle possibili scelte, e dall’altro reso sempre più necessario personalizzare la strategia di terapia in base alle caratteristiche di ogni singolo paziente. Il rapido evolversi delle strategie terapeutiche e l’avvento di farmaci biologici obbliga una conoscenza sempre più approfondita non solo morfologica ma molecolare del tumore. Infatti è noto come mutazioni nelle vie delle MAP chinasi pur essendo eventi precoci della tumorogenesi dell’adenocarcinoma del colon retto rivestano un ruolo di primaria importanza nel determinare prognosi e scelte terapeutiche nel singolo paziente.

Il presente studio è rivolto a caratterizzare il profilo biomolecolare di una serie continua di adenocarcinomi del colon retto osservati in una singola istituzione nel periodo 2008-2012.

291 casi precedentemente analizzati per profilo mutazionale dei geni KRAS e BRAF furono eleggibili per lo studio. Di questi 136(46%) wild-type e 155 (54%) mutati. Dei 155 mutati 43% (125/291) (80 M e 45 F) presentano mutazione KRAS più precisamente KRAS codone 12 33% (95/291), KRAS codone 13 5% (15/291), KRAS codone 61 2% (6/291), KRAS codone 146 3% (9/291) e 10% (30/291) (8 M e 22 F) mutati BRAF codone 600.

Il profilo mutazionale del totale della popolazione presa in esame (291 casi) è stato correlato ai parametri anatomo-clinici quali età,sede, sesso e grading istologico.

Il gruppo wild-type costituito da 79 M e 57 F con età media 70 anni, ha gradin G2 per 23% (68/291), il 13% (37/291) localizza a destra e il 32% (94/291) a sinistra. Il gruppo mutati 88 M e 67 F con età media 72 anni. Di questi 30% (89/291) hanno grading G3, 27% (79/291) localizza a destra e 21% (61/291) a sinistra. Tra i due gruppi si ha la

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stessa incidenza della malattia per entrambi i sessi, si osserva però, che nei wild-type abbiamo prevalente localizzazione del tumore a sinistra mentre nei mutati è a destra e in quest’ultimi per la sola mutazione BRAF codone 600 si evidenzia una maggiore frequenza nelle femmine rispetto agli uomini.

Ristrengendo le osservazioni, sopra descritte, separatamente ai soli casi mutati 54% (155/291) e al 46% (136/291) wild-type si rafforza il valore dei risultati ottenuti evidenziando in modo più netto la correlazione percentuale tra l’analisi mutazionale e le caratteristiche anatomo-cliche,età, sede, sesso e grading istologico.

Allo scopo di approfondire la tipizzazione molecolare alla luce delle nuove linee guida del trattamento dell’adenocarcinoma del colon retto 20 casi furono selezionati per essere sottoposti ad un’analisi più approfondita con inclusione di codoni non precedentemente esaminati del gene KRAS, BRAF e dello stato mutazionale geni NRAS, PIK3CA. Quanto descritto è stato studiato attraverso l’utilizzo della spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) sul sistema strumentale “MassARRAY® system” (Sequenom, Inc.-California), associata alla tecnologia Single Base Extension kit “Myriapod® Colon status”.

I 20 casi furono selezionati in base alla stato mutazionale di entrambi i geni KRAS, BRAF 10 mutati e 10 non mutati.

La nuova analisi mutazionale ha dimostrato la presenza di mutazioni non richieste dalla precedente tipizzazione in 6 casi di cui 2 mutazioni NRAS e 4 mutazioni PIK3CA.

Mentre le mutazioni NRAS risultavano mutamente esclusive con mutazione KRAS e BRAF le mutazioni nel gene PIK3CA si sommavano esclusivamente alle mutazioni KRAS. La frequenza di tale associazione, nonostante il piccolo campione esaminato, appare riflettere la frequenza attesa di tale evento mutazionale in serie di maggiori dimensioni.

Il nuovo approccio che vede l’utilizzo di sistemi automatici e di kit diagnostici, comprendenti un panello mutazionale specifico più ampio, si è dimostrato essere uno strumento più snello ed efficiente nella tipizzazione dei profili molecolari dei singoli pazienti.

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ABBREVIAZIONI USATE

BMI Body Mass Index

BRAF Oncogene omologo al gene del sarcoma virale murino B CAPP2 Colorectal Adenocarcinoma Prevention Program

CI Intervallo di Confidenza CIN Instabilità Cromosomica CRC Carcinoma Colon Retto

CRCm Carcinoma Colon Retto Metastatico CRCs Carcinoma Col on Retto Sporadico

EGFR Recettore del Fattore di Crescita dell’ Epidermide FANS Farmaci Antiinfiammatori Non Steroidei

FAP Poliposi Adenomatosa Familiare

HNPCC Sindrome del Carcinoma Colon Rettale Non aAsociato a Poliposi

HR Hazard Ratio

HRAS Harvey RAS

KRAS Kirsten RAS

LHO Loss of Heterozygosis

LS Sindrome di Lynch

MAPK Mitogen activated protein kinase MMR Mismatch Repair

MSI Microsatellite Instability

MT Mutati

NESs Segnali di Uscita dal Nucleo NLSs Segnali di Localizzazione Nucleari

NRAS Neuroblastoma RAS

PFS Progression Free Survival PIK3CA Fosfatidilinositolo-3-chinasi

RAS Abbreviazione di Rat sarcoma del ratto, che riflette il modo in cui sono stati scoperti i primi membri della famiglia proteica

RR Rischio Relativo

SMAD Small mother against decapentaplegic

STAT Signal transducer and activator of transcription

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1.

INTRODUZIONE

1.1 Epidemiologia

Il carcinoma del colon retto (CRC) rappresenta come frequenza la terza neoplasia nell’uomo (746.000 casi per anno) e la seconda nella donna (614.000 casi per anno).[1] 1.4 milioni di nuovi casi e 694.000 decessi stimati nel 2012 in tutto il mondo.[2].

Il tasso d’incidenza più alto nei paesi più sviluppati (737.000 casi per anno) e più basso in quelli meno sviluppati (624.000 casi per anno). [1]

I tassi di incidenza più alti si registrano in Australia, Nuova Zelanda, Europa e Nord America mentre i più bassi in Africa, Asia centrale e del Sud e America centrale e del Sud.[3] Questa variabilità geografica è da attribuire ad alimentazione ed esposizioni ambientali differenti che si aggiungono ad una determinata suscettibilità genetica. Anche un basso status socio-economico è associato ad un aumentato rischio per lo sviluppo di CRC: si stima un aumento di rischio di insorgenza di CRC di circa un 30% nel quintile di status socio-economico più basso rispetto al quintile più alto.[4] Si pensa che comportamenti potenzialmente modificabili come l’inattività fisica, il fumo, l’alimentazione scorretta e l’obesità contribuiscano da un terzo a metà nella disparità socio-economica del rischio di sviluppo di CRC.[5,6] Altri fattori, in particolare uno scarso accesso alle indagini di screening per il CRC, contribuiscono alla variabilità del rischio di incidenza nelle varie classi socio-economiche.[7]

Negli Stati Uniti nel 2017 si prevede di avere 135.430 individui con CRC e 50.260 morti dalla malattia. Anche se la maggioranza dei nuovi casi (58%) si verificano nelle persone di 65 anni o più vecchi, il 45% degli uomini e il 39% delle donne sono più giovani di 65 anni di età alla diagnosi. Tra le donne, il 27% dei casi e il 40% delle morti si verificano ad 80 anni o più, comparate con il 1’8% e il 27% rispettivamente degli uomini.[8]

Negli Stati Uniti, l'incidenza percentuale annuale standardizzata per CRC nel periodo 2009-2013, negli ultimi anni per i quali sono disponibili dati, era di 40,7 per 100.000 persone e il tasso di mortalità (2010-2014) è stato di 14.8 per 100.000 persone. I tassi di incidenza e di mortalità sono rispettivamente del 30% e del 40% negli uomini rispetto alle donne, anche se il rischio di vita è simile (4,6% vs 4,2%) perché le donne hanno un'aspettativa di vita più lunga. Inoltre, la disparità sessuale differisce per età. Ad

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esempio, l'incidenza non è significativamente diversa negli uomini e nelle donne di età inferiore ai 40 anni, ma è quasi il 50% più elevata negli uomini rispetto alle donne di età compresa tra 55 e 74 anni (131,5 vs 90,7 per 100.000). Le ragioni per i tassi più elevati negli uomini non sono completamente compresi, ma in certa misura riflettono probabilmente le differenze nelle esposizioni ai fattori di rischio e agli ormoni sessuali.[8]

In Europa è la seconda neoplasia in ordine di frequenza in entrambi i sessi con 241.600 casi e 63.600 decessi tra gli uomini e 205.200 casi e 43.700 decessi tra le donne registrati nel 2012 con un’incidenza di 43,5/100.000.[9]

Dal 1988 al 2010 l’aumento di incidenza di CRC nell’Europa Centrale e dell’Est è stato soprattutto a carico della popolazione anziana mentre un incremento nella popolazione giovanile è stato registrato nell’Europa occidentale.[10]

Nel 2012 in Italia sono stati registrati 31.102 nuovi casi e 11.035 decessi tra gli uomini e 23.633 nuovi casi e 8.582 decessi tra le donne. L’incidenza si attesta su 70,1/100.000/anno per gli uomini e 38,4/100.000/anno per le donne._.[11]

Sono stimate circa 52.000 nuove diagnosi di tumore del colon-retto nel 2016. Secondo i dati AIRTUM (Associazione Italina Registri Tumori), tra gli uomini si trova al terzo posto, preceduto da prostata e polmone (13% di tutti i nuovi tumori), tra le donne al secondo posto, preceduto dalla mammella, con il 13%. Nella classifica dei tumori più frequenti per gruppi di età il carcinoma del colon-retto occupa sempre posizioni elevate, variando nelle diverse età tra l’8% e il 14% negli uomini e tra il 4% e il 17% nelle donne. La diffusione dei fattori di rischio, l’anticipazione diagnostica e l’aumento dell’età media della popolazione sono alla base della progressiva crescita dell’incidenza di questo tumore negli anni passati. Il trend temporale per gli uomini è passato da un andamento in crescita fino alla metà degli anni Duemila (+2,2% nel periodo 1999-2007) ad una successiva riduzione (-6,8%/anno dopo il 2007), effetti associati con l’attivazione dei programmi di screening organizzati e dei round cosiddetti di prevalenza. L’andamento è simile nel sesso femminile: si osserva un incremento (+2,1%/anno nel periodo 1999-2006) e successivamente una riduzione(-3,6%/anno). I confronti geografici nazionali mostrano valori omogenei nel Centro-Nord e inferiori al Sud sia nei maschi (Sud -15% rispetto al Nord) sia nelle femmine (Sud -12%), anch’essi coerenti con la diversa presenza dei fattori precedentemente indicati.[12]

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Il carcinoma del colon-retto presenta una prognosi sostanzialmente favorevole. La sopravvivenza a 5 anni in Italia e pari a 60,8% per il colon e 58,3% per il retto, più elevata rispetto alla media europea (50,7% e 55,8% rispettivamente), ma simile al Nord Europa (59,0% e 59,5% rispettivamente). Nei Paesi del Sud Europa, tra cui l’Italia, presenta valori elevati tra i pazienti giovani, passando da 63,9% (colon) e 62,3% (retto) tra 15 e 44 anni a 50,3% (colon) e 44,1% (retto) tra gli anziani (75+). Le Regioni meridionali presentano indici di sopravvivenza inferiori di circa l’1-4% rispetto al Centro-Nord nei maschi e del 4-5% nelle femmine.[12]

A livello globale, la sopravvivenza a 5 anni del CRC oscilla tra il 28% e il 42% nei paesi in via di sviluppo, mentre supera il 60% negli Stati Uniti, Giappone e Svizzera. [13]

I fattori che contribuiscono alle variazioni nella sopravvivenza sono l’accessibilità allo screening, la possibilità di ricevere un trattamento di qualità e le eventuali comorbidità. [14]

Dalla metà degli anni ‘70 negli Stati Uniti la sopravvivenza relativa per tutti gli stadi è aumentata dal 50.6% al 65.4% per il carcinoma del colon e dal 48.1% al 67.7% per il carcinoma del retto. [15]. In particolare, nello stadio localizzato si è evidenziato il migliore incremento di sopravvivenza a 5 anni passando dal 55.2% al 73.0% per il colon e dal 45.2% al 69.2% per il retto grazie all’introduzione a partire dalla metà degli anni ’80 della chemioterapia adiuvante.[16]Anche nella malattia metastatica i progressi raggiunti con le tecniche di ablazione delle metastasi, le nuove terapie e le migliori indagini radiologiche negli ultimi venti anni hanno migliorato la sopravvivenza a 1 e 2 anni dalla diagnosi dal 35.9% al 52% e dal 16% al 33%.[17]

I tassi di sopravvivenza non presentano importanti variazioni in base al sesso. I pazienti di età inferiore a 65 anni hanno una sopravvivenza a 5 anni maggiore rispetto agli ultra sessantacinquenni (68.9% vs 62.0%). Questo vantaggio però è confinato ai tumori del colon distale e retto mentre la sopravvivenza per pazienti con tumori prossimali è la stessa per ciascun gruppo . [18]

Dal 1989 al 2011 in Europa considerando 34 stati la mortalità causata dal CRC è aumentata del 6,0% per gli uomini e diminuita del 14.7% per le donne.

Considerando i 27 stati dell’Unione Europea è diminuita del 13.0% negli uomini e 27.0% nelle donne mentre negli Stati Uniti del 39.8% e 38.8%. Riduzioni di più del 25% negli uomini e 30% nelle donne si sono verificati in Austria, Svizzera, Germania,

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Regno Unito, Belgio, Repubblica Ceca, Irlanda; per contro il tasso di mortalità è diminuito solo del 17% in Olanda e Svezia per entrambi i sessi. Nello stesso periodo si sono verificati cali piccoli o nulli nella maggior parte dell’Europa centrale. Sostanziali aumenti nella mortalità sono avvenuti in Croazia (64%), Macedonia (98.3%), Romania (102.0%) per entrambi i sessi e nella maggior parte dei paesi dell’Europa orientale per gli uomini. Nei paesi con la diminuzione della mortalità, le riduzioni sono state più importanti per le donne di tutte le età e gli uomini più giovani di 65 anni. [19] In Europa si osserva una notevole diversità nel tasso di mortalità: è diminuito sia per gli uomini che per le donne in un ampio numero di paesi ma persistono differenze tra i sessi e tra le varie regioni. Riduzioni maggiori sono state osservate in Europa occidentale e settentrionale come risultato di una riduzione nella prevalenza di fattori di rischio come fumo e alcol, maggiore consapevolezza della malattia e maggiore partecipazione allo screening. Le stesse cause sono alla base della differenza mortalità tra uomini e donne. [20-22]

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1.2 Fattori di rischio

La patogenesi del CRC è molto diversificata ed è influenzata da molteplici fattori alcuni dei quali sono legati alla dieta e allo stile di vita, mentre altri sono legati alla predisposizione genetica. Un altro fattore di rischio è la presenza di malattie infiammatorie intestinali (IBD) di lunga durata Colite di Crohn o ulcerosa. Diversi studi epidemiologici hanno confermato il coinvolgimento di numerosi fattori ambientali e alimentari, come il fumo di sigaretta, l’abuso dell’alcol, una dieta in alto contenuto di grassi e basso in fibre, obesità e stile di vita sedentario. L’attività fisica, terapia a lungo termine con aspirina a basso dosaggio hanno dimostrato avere possibili effetti preventivi.[23]

Esiste un’associazione ben documentata tra colite ulcerosa e rischio di sviluppare un CRC. I determinanti principali del rischio per quanto riguarda la colite ulcerosa sono l’estensione, la durata e l’attività della malattia. La pancolite conferisce un rischio aumentato di 5-15 volte rispetto alla popolazione generale, mentre una malattia confinata al colon sinistro è associata ad un aumento di tre volte del rischio relativo. Il rischio non sembra significativamente aumentato con proctite o proctosigmoidite.[24] Anche se i dati a riguardo sono meno consistenti, sembra che una pancolite causata dalla Malattia di Crohn sia associata ad un rischio di sviluppare un CRC paragonabile a quello della pancolite causata dalla colite ulcerosa. Una sorveglianza più stretta è quindi consigliabile quando sia coinvolta almeno un terzo della mucosa del colon.[25]

L’obesità causa un modesto ma significativo aumento del rischio di CRC soprattutto se l’aumento di peso insorge in giovane età (HR=1.23, 95% CI 1.14-1.34).[26]

Più di 50 studi osservazionali dimostrano che il regolare esercizio fisico riduce del 40% il rischio di CRC indipendentemente dal body mass index (BMI).[27]

Il livello di attività, intensità e frequenza e il mantenimento degli allenamenti nel tempo sembrano essere associati ad un importante riduzione del rischio. Studi di coorte e caso controllo hanno dimostrato un’associazione tra il grasso corporeo e il rischio di CRC. I risultati di una metanalisi, che comprende 23 studi di coorte e 8 studi caso controllo dimostra che l’obesità è un fattore di rischio diretto e indipendente del CRC.[28]

Una metanalisi di 14 studi stima che il rischio di carcinoma del colon tra i diabetici sia circa 38% più alto dei non diabetici (RR=1.38, 95% CI 1.26-1.51) e di carcinoma del retto di un 20% più alto (RR=1.20, 95% CI 1.09-1.31)[29]. Una possibile spiegazione che

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collega il diabete al CRC è l’iperinsulinemia: l’insulina è un fattore di crescita per la mucosa colica e per le cellule neoplastiche.[30]

I fattori alimentari che predispongono al CRC sono l’eccessivo introito calorico, un basso contenuto nella dieta di fibre vegetali non assorbibili, un alto contenuto relativo di carboidrati raffinati, l’assunzione di carni rosse e il ridotto introito di micronutrienti protettivi. È stato ipotizzato che una dieta con poche fibre porti ad una massa fecale ridotta, ad un aumento nel tempo del transito fecale e ad un’alterazione della flora batterica intestinale. Ciò comporta un aumento nelle feci di prodotti ossidativi tossici, che risultano della degradazione dei carboidrati da parte dei batteri, e un loro prolungato contatto con la mucosa colica. L’assunzione di elevate quantità di colesterolo proveniente da carni rosse, aumenta la sintesi degli acidi biliari, che a loro volta possono essere convertiti in sostanze cancerogene dai batteri intestinali. Le diete ricche di prodotti raffinati contengono, inoltre, ridotte quantità di vitamine A, C ed E che esercitano un ruolo benefico rimuovendo i radicali liberi dell’ossigeno. [31]

L’elevato e prolungato consumo di carne rossa lavorata è associato ad un aumento del rischio di incidenza per quanto riguarda il colon distale, ed in particolare la giunzione retto sigmoidea e il retto. Il rischio aumenta del 17% (95%CI 1.05-1.31) per 100g al giorno di carne rossa e del 18% per 50g al giorno di carne lavorata (salumi, carni salate, affumicate, ecc.). Al contrario l’abituale consumo di pesce e pollo è associata ad una lieve riduzione del rischio per il colon prossimale e distale, ma non per il retto.[31,32] Nel 2015 la World Health Organization’s International Agency for Research on Cancer ha inserito le carni lavorate nel gruppo 1 dei carcinogeni umani e la carne rossa nel gruppo 2°. [33]

Anche un consumo eccessivo di alcol è associato ad un incremento del rischio di carcinoma colico, così come una dieta povera in acido folico e vitamina B12. [33]

Una metanalisi di 27 studi di coorte e 34 studi caso controllo conclude che rispetto agli astemi c’è un significativo aumento del rischio di CRC nei bevitori moderati (2-3 drinks al giorno RR=1.21, 95% CI 1.13-1.28) e nei forti bevitori (più di 4 drinks al giorno RR=1.52, 95% CI 1.27-1.81).[34]

Il fumo di sigaretta è associato con un aumento dell’incidenza e mortalità di CRC soprattutto per il carcinoma del retto. Una meta-analisi di 106 studi osservazionali ha concluso che il rischio di sviluppo di CRC tra i fumatori è aumentato rispetto ai non fumatori (RR=1.18, 95% CI 1.11-1.25) così come aumentata è la mortalità (RR=1.25, 95% CI 1.14-1.37).[35]

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Tra i fattori protettivi troviamo la vitamina D e l’introito di calcio che sembrano correlati a un ridotto sviluppo di tumori del colon distale e del retto.[36]

Molti studi epidemiologici suggeriscono inoltre che l’uso di aspirina e altri FANS eserciti un effetto protettivo nei confronti del carcinoma colico. Nel Nurses’ Health Study, le donne che avevano assunto 4-6 compresse di aspirina/die per 10 anni o più hanno mostrato una ridotta incidenza di carcinoma del colon. Un effetto protettivo dell’aspirina a 600 mg/die nella Sindrome di Lynch è emerso dal trial CAPP2.

Due studi hanno rivelato che l’aspirina riduce il rischio di recidiva degli adenomi in pazienti con precedenti carcinomi o adenomi colon rettali.[37] Il meccanismo di tale chemio-prevenzione non è stato ancora compreso, ma è probabilmente mediato dall’inibizione della ciclosssigenasi-2 (COX-2). Questo enzima è iper espresso nell’epitelio neoplastico e sembra regolare l’angiogenesi e l’apoptosi. Sulla base di questi dati la Food and Drug Amministration ha autorizzato negli Stati Uniti l’uso di inibitori di COX-2 nella chemio prevenzione dei carcinomi in pazienti affetti da FAP.[31]

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2.

PATOGENESI

2.1 Accenni alla patogenesi della malattia

La patogenesi del CRC varia in base ai cambiamenti genetici ed epigenetici. Questi cambiamenti seguono la sequenza di fasi multiple teorizzata da Fearon e Vogelstein. Tali alterazioni genetiche ed epigenetiche sono direttamente responsabili di un evento specifico all’interno della sequenza che porta al CRC, contribuendo “all’iniziazione” della trasformazione neoplastica dell’epitelio sano e/o determinando la “progressione” verso stadi più maligni della malattia. [38]

I differenti percorsi sono caratterizzati da modelli distintivi d’instabilità genetica, successive manifestazioni cliniche e comportamenti patologici caratteristici. [39]

La progressione tumorale dallo stato di adenoma a quello di carcinoma è accompagnata da alterazioni genetiche multiple ed è conosciuta come sequenza adenoma-carcinoma. [40]

Il CRC prende origine, in oltre il 90% dei casi, da un precursore focale, displastico e polipoide: l'adenoma o polipo adenomatoso. Si tratta di piccole escrescenze, di per sé benigne, dovute al proliferare delle cellule della mucosa intestinale. Non tutti i polipi tendono a degenerare e la probabilità di trasformazione neoplastica aumenta nei cosiddetti “adenomi ad alto rischio” che presentano, cioè, caratteristiche microscopiche specifiche (componente villosa, displasia grave) e dimensioni superiori a un centimetro. Si stima che circa il 25% degli adenomi ad alto rischio si trasformi in tumore maligno attraverso una serie di passaggi intermedi legati a mutazioni di carattere genetico. L’evento più precoce nella tumorigenesi del CRC è legato alla formazione dei polipi adenomatosi in seguito alla mutazione inattivante o alla perdita del gene APC (Adenomatous Polyposis Coli), riscontrata in circa l’80% dei casi di CRC. Esso codifica per una proteina citoplasmatica che promuove la degradazione della β-catenina, limitando in questo modo la trascrizione dei geni del ciclo cellulare controllati da Wnt. [41] Tale gene è un tumor suppressor ed è coinvolto in una varietà di processi cellulari oltre alla proliferazione cellulare, quali migrazione cellulare e adesione, è correlato al mantenimento della stabilità cromosomica, nonché dell’organizzazione del citoscheletro.

Circa l’80% dei casi di CRC sono di tipo sporadico (CRCs). Il rimanente 20% è considerato di tipo familiare o legato a sindromi genetiche, come la poliposi

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adenomatosa familiare (FAP), associata a mutazioni del gene Apc (adenomatous poliposis coli), e la Sindrome di Lynch (LS) o sindrome del carcinoma colon rettale non associata a poliposi (HNPCC), caratterizzato da mutazioni germinali dei geni mismatch repair (MMR), soprattutto hMSH2, hMSH6, hMLH1 e hPMS2. Queste due sindromi genetiche rappresentano rispettivamente, meno dell’1% ed il 2-3% di tutti i casi di CRC.[42]

Nella cancerogenesi del colon si distinguono tre principali percorsi di trasformazione.[42]

Per primo e maggiormente rappresentato quello dell’instabilità cromosomica (CIN) caratterizzato da loss of hetrozygosis (LHO) e grosse anomalie cromosomiche. Il secondo che coinvolge approssimativamente il 15% di CRC è dovuto alla degradazione del sistema di riparazione del DNA Mismatch Repair (MMR) e conseguente microsatellite instability (MSI); il sistema MMR è responsabile della produzione di proteine che riconoscono e dirigono la riparazione di disaccoppiamenti di singoli nucleotidi a sequenze di DNA microsatellite che scappano al sistema di correzione di bozze della DNA polimerasi. Negli ultimi anni è stato stabilito un terzo percorso coinvolto nella patogenesi del CRC che comprende più sistemi come la metilazione aberrante del DNA (CIMP) e più recentemente la scoperta dei microRNA (miRNA) che possono attivare e contribuire al processo di cancerogenesi. [42]

Lo studio della patogenesi molecolare del CRC, trattata in dettaglio più avanti, ha portato all’identificazione di vari disordini genetici trasmessi nella maggior parte dei casi in modalità autosomica dominante. La frequenza allelica per la FAP è di 1/10000 e di 1/350-1700 per la HNPCC.[43]

La FAP è caratterizzata dalla presenza in epoca giovanile di centinaia di polipi adenomatosi che in assenza di trattamento evolvono in carcinoma prima dei 30 anni di età. Lo standard terapeutico è rappresentato dalla colectomia profilattica ma i polipi si possono sviluppare anche nel tratto gastroenterico superiore e negli individui affetti vi è un aumentato rischio di altre neoplasie (stomaco, ampolla di Vater). Tale forma è provocata da mutazioni del gene Adenomatosus Polyposis Coli (APC) a trasmissione autosomica dominante.

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La presenza di alcune anomalie non appartenenti al tratto gastroenterico determina le varianti della FAP. Nella Sindrome di Gardner si riscontrano tumori desmoidi, osteomi multipli e fibromi cutanei. La Sindrome di Turcot si caratterizza per la presenza di tumori cerebrali, mentre quella di Zanca per la presenza di esostosi cartilaginee.

La Sindrome di Lynch è più frequente della FAP e da sola è responsabile del 3% dei casi di CRC. L’età media dei pazienti alla diagnosi è di 44 anni (CI 41.0-46.3 anni) e il tumore si sviluppa nella maggior parte dei casi in sedeprossimale.[44] Questa sindrome si associa ad un aumentato rischio di sviluppareneoplasie anche in altre sedi, in ordine di frequenza l’endometrio, lo stomaco, leovaie, gli ureteri, il cervello, l’intestino tenue, le vie epatobiliari e la cute.

La Sindrome di Lynch si sospetta quando vengono rispettati i criteri di Amsterdam:[45] • diagnosi di CRC o di tumori extracolici associati alla LS prima dei 50 anni di

età;

• tre o più familiari, di cui almeno uno di primo grado, con diagnosi di tumore associato alla LS verificata istologicamente;

• tumori associati alla LS che coinvolgono almeno due generazioni; • esclusa diagnosi di FAP;

Per una diagnosi definitiva di LS è necessario il riscontro di una mutazione germinale nei geni del mismatch repair (MMR).

I pazienti con una storia personale o familiare di CRC o di polipi adenomatosi hanno un rischio aumentato di sviluppare un CRC.[46] Pazienti con storia personale di polipi adenomatosi maggiori di un centimetro, polipi con istologia villosa o tubulo-villosa, polipi con displasia di alto grado, hanno rischio aumentato di sviluppare CRC. Il rischio relativo in questi pazienti va da 3.5 a 6.5. La storia familiare è un importante fattore di rischio anche al di fuori delle sindromi precedentemente trattate ed è presente nel 20-30% dei pazienti che ricevono una diagnosi di CRC. Avere un unico parente di primo grado affetto da CRC raddoppia il rischio di sviluppare neoplasia rispetto alla popolazione generale. Il rischio aumenta ulteriormente se i parenti di primo grado sono più di uno o se la diagnosi è avvenuta a un’età minore di 60.[47]

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3.

INSTABILITA’ CROMOSOMICA

3.1 Pathway Wnt

È il percorso più caratterizzato, studiato del colon retto. Il processo tumorogenico coinvolge diversi punti di controllo regolatori del fuso mitotico e delle proteine che mutamente influenzano la stabilità cromosomica. In accordo con Fearon la via classica di CIN inizia con la mutazione del gene oncosoppressore adenomatose polyposis coli (Apc) che causa la sintesi della forma tronca della proteina. [55]

La classica sequenza adenoma-carcinoma è implicata nello sviluppo di circa l’80% dei CRC sporadici così come nei carcinomi derivati da FAP. Aneuploidia e perdita di eterozigosità (LHO) giocano il ruolo principale nei tumori CIN non solo nelle forme sporadiche (85%) ma anche nei caso di adenoma poliposico familiare associato a mutazioni della linea geminale del gene Apc.[55]

APC proteina di 310 KDa, in condizioni fisiologiche, presente sia nel citoplasma che nel nucleo delle cellule coliche ed extracoliche. È una shuttle-protein, ovvero una proteina in grado di muoversi tra il nucleo e il citoplasma, proprietà conferita dalla presenza di sequenze amminoacidiche che codificano per segnali di localizzazione nucleare (NLSs) e segnali di uscita dal nucleo (NESs). APC è il fulcro della via di segnalazione denominata Wingless/Wnt. APC si lega ai fasci di microtubuli, favorisce la migrazione cellulare e la sua funzione principale è modulare i livelli citoplasmatici di β-catenina, proteina in grado di migrare nel nucleo e attivare complessi proteici di trascrizione. Quest’ultima legando i recettori della caderina ai filamenti di actina del citoscheletro, svolge un’importante funzione di adesione cellulare ed è coinvolta nella via di segnalazione Wnt. L'attivazione o inibizione della via APC/β-catenina dipende principalmente dal legame di proteine Wnt (mediatori locali e morfogeni) con i recettori sulla membrana plasmatica appartenenti alla famiglia Frizzeled (proteine transmembrana a sette passaggi) che a un corecettore proteico che è correlato al recettore della lipoproteina a basa densità (LDL) ed è perciò chiamato proteina correlata al recettore delle LDL (LRP) [56]

Quando Wnt è presente la β-catenina si stacca dal complesso APC, trasloca nel nucleo e trascrive specifici geni che promuovono la proliferazione, se invece Wnt non è presente lo stesso complesso induce la degradazione di β-catenina da parte del proteasoma.

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Il gene oncosoppressore Apc è coinvolto in APC/β-catenina/Tcf. Dalla sua inattivazione dovuta alla mutazione sul cromosoma 5q risulta in aumento della via di segnalazione Wnt. La perdita di funzione di APC interferisce con fosforilazione della β-catenina che non viene ubiquitinata e quindi non viene eliminata dal proteosoma. [57]

L’accumulo citoplasmatico di β-catenina determina la sua traslocazione nel nucleo dove assume la funzione di fattore di trascrizione in interazione con LEF/TCF , spostando Groucho (corepressore) e va ad aumentare l’espressione di geni che promuovono la crescita cellulare. La β-catenina funziona come un coattivatore inducendo la trascrizione di geni bersaglio di Wnt quindi la via di segnalazione di Wnt innesca un cambiamento dalla repressione trascrizionale all’attivazine trascrizionale. [56]

Tra i geni attivati dalla β-catenina c’è c-Myc, che codifica un proteina (c-Myc) che è un potente stimolatore della crescita cellulare. Queste mutazioni del gene Apc inibiscono la capacità della proteina di legare di legare B-catenina, così che questa si accumula nel nucleo e stimola la trascrizione di c-Myc e altri geni bersaglio di Wnt, anche in assenza del segnale da parte di Wnt. La crescita e la proliferazione incontrollata che ne conseguono promuovono lo sviluppo del tumore.[56] L’attivazione di Wnt è già presente nel polipo adenomatoso, precursori di CRC e quindi evento iniziale della carcinogenesi. Questi adenomi del colon sono lesioni precursori dei carcinomi e questo era noto molto prima della conoscenza dei meccanismi molecolari (Fig.3.1).[57]

Con la spiegazione del modello molecolare di Vogelstein la trasformazione da adenomi a carcinomi è stata resa nota ed è diventato un approccio standard per affrontare la carcinogenesi molecolare. Pazienti con FAP con una mutazione germinale di APC sviluppano in età molto giovane centinaia di migliaia di polipi adenomatosi con un rischio del 100% di portare allo sviluppo di CRC.[57]

Lo sviluppo delle lesioni neoplastiche non è limitata al colon retto: neoplasie si sviluppano anche nel tratto intestinale superiore (stomaco, duodeno) e nel tessuto connettivo (desmoide tumori).

Nei casi di CRC sporadico dove di solito lo sviluppo del tumore è in età avanzata (principalmente settima decade) si verifica la mutazione somatica di APC ma non germinale. [57]

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Fig.3.1 Percorso canonico di Wnt. In assenza di Wnt β-catenina è fosforilata attraverso

GSK3β e CK1 nella multiproteina MDC che contiene axin, APC, GSK3b e CK1 ed è successivamente degradata dal proteosoma. Il legame di Wnt con il suo recettore Frizzled e i corecettori LRP5/6 crea un recettore complesso. Questo destabilizza MDC che non fosforila più la β-catenina il mediatore chiave del percorso. β-catenina non è più degradata dal proteosoma e si accumula nel citoplasma e migra nel nucleo, qui si forma un complesso di trascrizione con pygopus (pygo), Bcl-9 e TCF/LEF che non è più inibito dal corepressore groucho (grg) e si ha la trascrizione di geni bersaglio che stimolano la proliferazione, tra cui c-myc e CDK1. [57]

Questa fase è seguita da ulteriori mutazioni, tra queste svolgono un ruolo di fondamentale importanza le mutazioni attivanti RAS, proto-oncogene che codifica per una proteina di legame posta a valle dell’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). In situazioni fisiologiche il legame di EGFR al fattore EGF o al TGFα causa l’attivazione delle proprietà tirosin chinasiche del recettore di membrana, a cui segue l’attivazione della proteina citoplasmatica RAS, responsabile a sua volta della differenziazione e proliferazione cellulare. In presenza della mutazione di RAS la cellula è sottoposta ad uno stimolo proliferativo costante per l’attivazione costitutiva della cascata di segnale a valle di EGFR.[43] La progressione neoplastica è associata anche alla mutazione di altri oncosoppressori, come quelli che codificano per le proteine SMAD2 e SMAD4 (cromosoma 18q), attuatori della segnalazione di TGFβ; la perdita di questi geni può consentire la crescita cellulare incontrollata.[58] L’oncosoppressore p53 (cromosoma 17p) risulta mutato nel 70-80% dei tumori del colon; la perdita di funzione di questi

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oncosoppressori è spesso causata da delezioni cromosomiche o in alternativa possono essere silenziati dalla metilazione di una zona regolativa ricca di CpG (isola CpG), regione che comprende il promotore e il sito di inizio della trascrizione.[58]

3.2 Alterazioni genetiche

L’aggravarsi degli adenomi e la progressione verso la forma di carcinoma è legata all’acquisizione di mutazioni a livello dei geni KRAS, BRAF, NRAS, PIK3CA , PTEN, MET, TP53 e HER2 che si trovano a valle della via di segnalazione di EGFR.[48]

I ligandi di EGFR sono epiregulina (EREG) e afiregulina (AERG) sono comunemente espressi in CRC e un alto rapporto AREG/EREG è marker di beneficio alla terapia monoclonale in paziente RAS Wild-Type (WT) contrariamente a pazienti con basso rapporto. Tuttavia, pazienti con mRNA di EREG e AREG hanno aumentata sopravvivenza rispetto ai pazineti con bassa espressione nel tumore.[48]

La famiglia RAS è costituita da tre membri noti come HRAS, KRAS ed NRAS, localizzati su cromosomi differenti da proto-oncogeni e codificanti proteine G del peso di 21 KDa. La proteina KRAS è localizzata nella membrana cellulare ed è dotata di attività GTPasica [49]. Il legame extracellulare di specifici ligandi al recettore transmembrana come l’EGFR comporta l’attivazione di una cascata di eventi di trasduzione del segnale che mediano le risposte cellulari ai segnali di crescita.

Il 40-50% dei casi di CRCs presenta mutazioni puntiformi a carico del gene Ras. In una recente analisi, la prevalenza di mutazioni RAS nel cancro colon retto metastatico (CRCm) è del 55.9%, con mutazioni del gene KRAS esone 2 (42.6%) seguito da KRAS esone 3 (3.8%), KRAS esone 4 (6,2%), NRAS esone 2 (2.9%), NRAS codone 3 (4.2%) e NRAS esone 4 (0.3%). Mutazioni nei codoni G12D, G12V e G12C risultano più comuni per KRAS esone 2, codoni Q61H e Q61R per KRAS esone 3, codoni A146T e A146V per KRAS esone 4, codone G12D per NRAS esone 2, codone Q61K e Q61R per NRAS esone 3 e codone A146T per NRAS esone 4 [50]

La mutazione attivante KRAS svolge un ruolo fondamentale nella progressione tumorale di CRC, in quanto sembrerebbe essere associata all’acquisizione di un comportamento più invasivo da parte delle cellule tumorali, ed è seguita da delezioni

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del cromosoma 18q con la perdita di SMAD4, localizzato a valle di Transforming Growth Factor-ß (TGFß) e da mutazioni del gene Tp53 nel passaggio da adenoma avanzato a carcinoma. Il gene Tp53 è frequentemente deleto nelle forme tumorali ad alto rischio, che hanno una minor probabilità di sopravvivenza, ma tuttavia non è del tutto considerato un marcatore prognostico come KRAS poiché non è stato possibile correlare la sua perdita all’outcome dei pazienti nel trattamento farmacologico [51]

Mutazioni in KRAS sono associate con alto rischio di recidiva dopo la resezione di metastasi epatiche con intento curativo, una procedura eseguita in circa il 25% di pazienti con metastasi epatiche di CRC. Mutazioni KRAS sono associate con all’aumento del rischio di recidiva polmonare (HR 2.1, P=0.007) in pazienti con asportazione del tumore alla stadio II e III.

Tra tutti i pazienti con CRCm, la presenza di mutazioni KRAS appare influenzare il modello di diffusione delle metastasi. Tie et al. hanno analizzato la frequenza di mutazione KRAS in metastasi epatiche, polmonari e celebrali. Loro hanno trovato che mutazioni in KRAS sono meno frequenti nelle metastasi epatiche (32.2%), più frequenti nel polmone (62.0%) e nel cervello (56.6%).[52]

NRAS è mutato approssimativamente nel 3% di CRCs. Le mutazioni in NRAS sono mutuamente esclusive con BRAF e KRAS in CRC e conferiscono resistenza all’attività dell’anticorpo anti-EGFR. Mutazioni in NRSA sono associate con un calo della sopravvivenza. L’attivazione NRAS si ritrova in tumori che si sviluppano da una precedente infiammazione. L’attivazione NRAS potrebbe sopprimere l’apoptosi in cellule CRC. Un recente studio suggerisce che in CRC, il segnale NRAS attraverso STAT3, un fattore di trascrizione normalmente richiesto IL-6 promuove la crescita e la sopravvivenza in una via citochina indipendente [52]

Le mutazioni del gene BRAF si ritrovano nel 8-10% di CRCs e nel 5-15% dei CRCm. Per il 95% questa mutazione consiste nella conversione di una valina a acido glutammico nel codone 600 (V600E) esone 15.

Mutazioni in BRAF sono associate allo sviluppo del tumore attraverso la via serrata e raramente attraverso la via classica adenoma-carcinoma.[52] In molti studi clinici è stato visto che le mutazioni nel gene BRAF sono un fattore prognostico negativo; mentre la sopravvivenza media per i CRCm ha superato i due anni per i CRCm mutati BRAF è inferiore ad un anno.[52]

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CRCs con mutazioni in BRAF sono associati prevalentemente al sesso femminile, età avanzata, localizzazione a destra , alto grado di istotipo mucinoso, MSI, metastasi peritoneali e linfonodali.[48] CRCm con mutazione in BRAF esibiscono un distinto pattern di diffusione delle metastasi. Questi tumori hanno metastasi che sono probabilmente meno presenti nel fegato ma hanno un aumento di incidenza peritoneale e linfonodale anche a distanza. Pazienti con BRAF mutato in CRCm sono meno sottoposti a metastasiectomia. Il meccanismo di aumento di linfonodi metastatici in pazienti BRAF mutati CRCm è sotto studio.[52]

Nei casi di CRC caratterizzati da MSI possono verificarsi delle alterazioni geniche differenti, ma dalle funzioni analoghe, rispetto a quelle descritte per i casi con instabilità cromosomica. In questi casi, le prime tappe della tumorogenesi coinvolgono alterazioni della cascata di segnali attivata da WNT. Tale alterazione è frequentemente seguita, nei casi con MSI, da mutazioni del gene BRAF (una chinasi a valle di KRAS) piuttosto che da mutazioni in KRAS. Le mutazioni di BRAF hanno un effetto biologico simile a quello determinato dalle mutazioni di KRAS, in quanto entrambe si verificano all’interno della stesso pathway cellulare e nella stessa fase di passaggio dall’adenoma al carcinoma; d’altra parte, le mutazioni del gene BRAF sono in genere riscontrate in tumori meno avanzati, a differenza delle mutazioni di KRAS [51,53] La presenza di mutazioni di microsatelliti a livello dei geni TGFBR2 (TGFβ Receptor 2), IGF2R (Insulin-like Growth Factor 2 Receptor) e BAX, determina l’attivazione di un meccanismo di progressione tumorale indipendente da Tp53. p53 è attivata quando ci sono danni al DNA ma anche quando oncogeni sono attivati in modo improprio e induce l’apoptosi.

Il gene PIK3CA codifica la isoforma p110α catalitica di fosfatidilinositolo 3-chinasi (PIK3) e risulta avere mutazioni nel 15-20 % di CRCs.[52] L’80% delle mutazioni sono state ritrovate in due hot spot dell’esone 9 e 20 [54]. Mutazioni di PIK3CA sono ritrovate nella transizione adenoma-carcinoma nella sequenza classica adenoma-carcinoma di sviluppo del CRC e di solito si verifica con mutazioni in KRAS o BRAF. Circa il 70% di CRCm presenta PIK3CA mutato quando KRAS è mutato. [52]

PTEN è un gene oncosoppressore coinvolto nel mantenimento dell’omeostasi del pecoroso PIK3CA/AKT (serina/treonina chinasi chiamata anche proteina chinasi B, o

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PKB). La perdita dell’espressione di PTEN, valutata attraverso immunoistochimica, è riportata nel 20-40% dei CRCs ed aumenta fosfatidilinositolo-3,4,5-tifosfato, il maggiore substrato di PTEN, questo induce una persistente attivazione dell’effettore PIK3CA. [48]

MET gene che codifica il recettore tirosin chinasico per la crescita degli epatociti (HGF) e ha un ruolo oncogenetico nei tumori solidi, dove è attivato attraverso l’amplificazione genica, over espressione , mutazioni attivanti o autocrine stimolazioni. MET e il suo ligando HGF sono coinvolti nella resistenza alla terapia. Si trova amplificato nell’1% e correla con la resistenza alla terapia anti-EGFR. [48]

Il gene HER2 amplificato e la proteina è sovra espressa in circa 3%-6% di pazienti con CRC. Mutazioni in HER2 determinano trasformazione oncogenetica di cellule epiteliali e determina resistenza ai famaci anti-EGFR.[48]

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3.3 Pathway RAS

Le mutazioni di KRAS si trovano in circa il 40-50% CRC e attivano costitutivamente la via di segnalazione MAPK (MAP-chinasi) (Fig.3.2). BRAF, a valle di KRAS nel percorso MAPK, è mutato in meno del 10% casi. Si verificano anche mutazioni nel percorso MAPK NRAS e in fosfoinositide-3-chinasi (PIK3CA).

Le suddette mutazioni iniziali del percorso CIN sono poi seguite quindi da eventi successivi che promuovono nuove mutazioni e la progressione del tumore da stadi benigni a maligni.

La transizione adenoma/carcinoma è determinata innanzitutto dal gene KRAS, un proto-oncogene che codifica per la proteina GTPasi coinvolta nella trasduzione e propagazione di segnali extracellulari, ad esempio, proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPKs). Le mutazioni di KRAS portano ad una permanente stato attivo che consente alla cellula di eludere l'apoptosi e di acquisire un vantaggio di crescita.[57]

Fig.3.2 Il percorso MAPK. Normalmente il percorso è attivato mediante interazione

recettore-ligando, il recettore EGFR dimerizza e fosforila una molecola di segnalazione a valle. Questo porta infine alla trascrizione di geni coinvolti in una varietà di attività cellulari, tra cui la proliferazione, l’adesione e l'invasione. Anticorpi o piccole molecole che si legano EGFR possono inattivare questo processo. Il targeting EGFR è un percorso regolare se non ci sono proteine a valle attivate costitutivamente dalla mutazione (come KRAS, BRAF o PIK3CA).[57]

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L’attivazione di Ras scatenate da RTK (recettori tirosina chinasi) attivati (come EGFR Epidermal Growth Factor Receptor), hanno solitamente breve durata.

Come altre proteine che legano GTP, Ras funziona come un interruttore molecolare, alternando fra due stati conformazionali distinti, attivo quando è legato a GTP e inattivo quando è legato a GDP. Due classi di proteine di segnalazione regolano l’attività di Ras influenzandone la transizione fra lo stato attivo e inattivo. I fattori di scambio del nucleotide guanilico specifici per Ras (Ras-GEF) stimolano la dissociazione di GDP e la successiva assunzione di GTP dal citosol, attivando così Ras. Le proteine che attivano GTPasi specifiche per Ras (Ras-GAP) aumentano la velocità di idrolisi del GTP legato da parte di Ras, inattivando così Ras.

Forme mutanti iperattive di Ras sono resistenti alla stimolazione della GTPasi mediata da GAP e sono bloccate permanentemente nello stato attivo legato a GTP; questo è il motivo per cui promuovono lo sviluppo del cancro.

In linea di principio gli RTK potrebbero sia attivare un Ras-GEF che inibire un RAS-GAP. Anche se alcune GAP si legano direttamente (tramite i loro domini SH2) a RTK attivati, mentre i GEF si attaccano in genere solo indirettamente, è l’accoppiamento indiretto del recettore ad un Ras-GEF che sposta Ras nel suo stato attivo. Infatti la perdita di funzione di un Ras-GEF ha effetto smile alla perdita di Ras stesso.

Studi biochimici e di biologia cellulare hanno dimostrato che il collegamento di RTK a Ras avviene tramite proteine adattatrici chiamata Grb2 e il Ras-GEF è chiamato Sos [56]. Per stimolare le cellule a proliferare o a differenziarsi, questi eventi di segnalazione a breve vita devono essere convertiti in segnali di durata maggiore che possono sostenere il segnale e trasmetterlo a valle del nucleo per alterare lo schema di espressione genica. Uno dei meccanismi chiave usato a questo scopo è un sistema di proteine chiamato “modulo della proteina attivata da mitogeni” (modulo della MAP chinasi) (Fig.3.3) [56]. La chinasi finale della serie si chiama semplicemente MAP chinasi (MAPK). Quella precedente è la chinasi della MAP chinasi (MAPKK): essa fosforila quindi attiva la MAP chinasi. Ancora più a monte di questa, e che riceve il segnale attivatore direttamente da Ras, c’è la chinasi della chinasi della MAP chinasi (MAPKKK): essa fosforila e quindi attiva la MAPKK. Nella via di segnalazione Ras MAP chinasi dei mammiferi queste tre chinasi sono conosciute con i nomi più corti: Raf (che corrisponde alla MAPKKK, Mek (che corrisponde alla MAPKK) ed Erk (che corrisponde alla MAPK).

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Una volta attivata, la MAP chinasi trasmette il segnale a valle fosforilando varie proteine cellulari, comprese proteine che regolano geni e altre proteine chinasi (Fig.3.3). La MAP chinasi Erk, per esempio, entra in gioco nel nucleo e fosforila uno o più componenti di un complesso che regola geni. In questo modo la via di segnalazione Ras-MAP chinasi trasmette segnali dalla superficie cellulare al nucleo e altera lo schema di espressione genica. Fra i geni attivati da questa via ce ne sono alcuni necessari per la proliferazione cellulare, come i geni che codificano le cicline G1 . Le MAP chinasi sono in genere attivate soltanto temporaneamente in risposta a segnali extracellulari e il periodo di tempo in cui restano attive influenza la natura della risposta.[56]

Fig. 3.3 Il modulo di fosforilazione in serina/treonina delle MAP chinasi attivata da Ras. Il

modulo a tre componenti inizia con una (MAPKKK) chiamata Raf. Ras recluta Raf sulla membrana plasmatica ed aiuta ad attivarlo. Raf quindi attivata la MAP chinasi chinasi (MAPKK) Mek, che attiva quindi la MAP chinasi (MAPK)Erk. Erk a sua volta fosforila varie proteine a valle, comprese altre proteine chinasi, oltre che proteine che regolano geni nel nucleo. I cambiamenti che ne risultano nell’espressione genica e nell’attività di proteine provocano complessi cambiamenti nel comportamento cellulare

Mutazioni puntuali nei codoni 12, 13 e 61 degli esoni 2 e 3 del gene KRAS incrementano l’attività dell’ enzima Kras.

Più del 90% delle mutazioni nel gene KRAS si verificano al codone 12 e al codone 13. Le mutazioni al codone 12 sono più oncogeniche rispetto alle mutazioni del codone 13, suggerendo che sono le mutazioni del codone 13 le più coinvolte nella transizione

(Raf)

(Mek)

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adenoma-carcinoma; mentre le mutazioni del codone 12 predispongono le cellule tumorali colon rettali all’invasione e alla metastasi. Imamura e colleghi hanno rafforzato questa ipotesi confermando che la relativa malignità delle mutazioni del codone 12 e 13 è indipendente dalla mutazione BRAF che spesso sono associate a una prognosi sfavorevole CRC, anche dopo l'eliminazione di BRAF come fattore confondente, le mutazioni del codone 12 sono state implicate nell’aumento del tumore colon retto con indice di mortalità superiore per mutazioni nel codone 13.

Studiare la mutazione nel codone KRAS 12 e 13, in pazienti affetti da CRC consente la valutazione simultanea della prognosi CRC e della scelta di strategie chemioterapiche da perseguire.[38]

Il percorso RAS è anche coinvolto con altri segnali critici per l'inizio della cancerogenesi. Horst E colleghi hanno dimostrato che l’aumento dell’attività di WNT è connessa con l'aumento della segnalazione MAPK, nei campioni CRC mutati KRAS. Inoltre, Baba e colleghi hanno visto un'interazione tra il AMP-attivatore protein chinasi (AMPK) e MAPK. AMPK è un sensore di stato di bilancio energetico cellulare e svolge un ruolo nella regolazione della proliferazione cellulare e della crescita attraverso l'inibizione del percorso mTOR (proteina serina/treonina ) e l'attivazione del percorso CDKN1A (p21) e p53. Maggiore espressione di fosforilato-AMPK è associato ad una buona prognosi tra i pazienti CRC attivati da p-ERK.[38]

Il RAS attivato attiva Raf-MEK-ERK e PI3K/AKT/PKB (PI3- chinasi Akt) o Ral piccola GTPasi. PIK3CA è prima attivata da Ras e poi dalla tirosina del recettore chinasi come evidente nell’inattivazione incompleta di PI3K attraverso l’inattivazione di KRAS. Tuttavia la maggior parte dei casi CRC con PI3K mutato hanno anche mutazioni in KRAS. L’attivazione di PI3K porta all’attivazione di AKT1 e AKT2 che poi promuovono la crescita del tumore attraverso la progressione dall’epitelio al mesenchima di transizione (EMT). La perdita di funzione per mutazione di PTEN che è un oncosopressore e un antagonista del percorso PI3K/AKT, induce AKT (proteina serina/treonina chinasi) regolatore di metastasi in CRC.[55]

Il fosfatidilinositolo -3-chinasi (PI3K) appartiene ad una famiglia di chinasi lipidiche eterodimeriche costituitre da un regolatore e da una subunità catalitica, la fosforilazione del fosfatidilinositolo e un importante elemento ed è un secondo messaggero coinvolto nella segnalazione intracellulare. L’attivazione attraverso diversi recettori tirosin chinasici come EGFR, nell’uomo EGFR2 (HER2), fattore di crescita dell’insulina (IGF-1R) e fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR) il PI3K promuove e regola

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vari processi cellulari, inducendo proliferazione, sopravvivenza, apoptosi, migrazione e metabolismo. PIK3CA (fosfatidilinositolo-4.5-bisfosfato 3-chinasi subunità catalitica alfa), la subunità catalitica p110-alfa di PI3K è mutata in diversi tipi di cancro, come glioblastoma, gastrico, seno, ovarico, polmonare e CRC. Più dell’80% di mutazioni individuate in PIK3CA sono riportate “hot spot” il dominio elicasi dell’ esone 9 (codone 542 e 545) e domini di chinasi esone 20 (codone 1047). Gli effettori successivi del percorso PI3K includono AKT (proten chinasi B), una chinasi serina-treonina direttamente attivata da PI3K e mTOR (target nei mammiferi della rapamicina), altra serina-treonina chinasi che porta ad un aumento ad una maggiore traduzione di vari mRNA che codificano per regolatori del ciclo cellulare tra cui MYC e ciclina D1 e un potenziale target di inibizione terapeutica.

Nel percorso PI3K/AKT/mTOR, il gene oncosoppressore PTEN è un diretto antagonista e mutazioni o perdita di espressione di PTEN sono state correlate con un scarso esito nei CRC.

PIK3CA risulta mutato in circa il 10-20% di CRC. Le mutazioni sono state ritrovate più comunemente nell’esone 9 rispetto al 20. Interessante è sottolineare come un analisi abbia mostrato un graduale calo della mutazione di PIK3CA nella porzione prossimale (cieco/colon ascendente) verso il distale (sigma/retto) dal 21-25% al 8-9%. Tuttavia mutazioni in PIK3CA nel CRC sono associate con un fenotipo mucinoso. In contrasto con altri markers molecolari ossia BRAF e KRAS, che sono mutamente esclusive, mutazioni PIK3CA hanno mostrato nella maggior parte degli studi essere significativamente associate con mutazioni in KRAS e perdita di espressione MGMT (O 6-metilguanina-DNA metiltransferasi). [59]

Ogino e collaboratori, in uno studio, hanno riportato che pazienti con CRC stadio I-III con intervento di resezione nel 18% dei casi mostravano mutazioni in PIK3CA e questo era associato un esito peggiore della malattia. Questo effetto, tuttavia, era ristretto a tumori KRAS wild-type.[59]

Un alterazione che spesso si presenta contemporaneamente alla mutazione sul gene APC è stata trovata nel percorso del fosfoinositolo-3-chinasi (PIK3CA) che determina l’attivazione di diversi fattori trascrizionali attraverso chinasi a cascata. Le mutazioni nel gene PIK3CA stimolano la crescita cellulare e la produzione la sintesi di acidi grassi attraverso la via di segnalazione AKT. PIK3CA mutato interagisce con una regolatore centrale di crescita cellulare e del metabolismo mTOR ( mammalian target of

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rapamycin proteina chinasi che fosforila serina e treonina e che regola la crescita la proliferazione cellulare e la trascrizione) e K-ras. È dimostrato che la presenza simultanea di mutazioni in APC e PIK3CA in modelli animali è associata con l’aumento del numero e della dimensione dei tumori e di un più aggressivo comportamento. È stato anche studiato che l’uso cronico di aspirina allunghi la sopravvivenza in individui con PIK3CA mutato e CRC, determinando l’apoptosi dove PIK3CA è inibito.[60]

BRAF, è un membro della famiglia RAF chinasi ne esistono di tre tipi denominati A,B e C. BRAF funziona come una proteina serina treonina chinasi e fa parte dello stesso segnale della percorso KRAS è uno dei suoi principali effettori e per la sua attivazione necessita di essere fosforilato da KRAS. [48]

La mutazione attivante BRAF è principalmente V600E e si ritrova in circa nell’ 8-10% di CRCs.

V660E è determinata da una mutazione CTG a CAG al codone 600 e si ritrova nel percorso RAS/RAF/MEK/ERK e ne determina un’ attivazione costitutiva così come le mutazioni KRAS.

BRAF V600E correla con un fenotipo molto aggressivo di scarsa prognosi e OS<1 anno.[48]

BRAF mutato determina resistenza all’apoptosi se confrontato con BRAF wild-type, determina l’espressione di proteine che promuovono il ciclo e l’espansione dei cloni. BRAF mutato è anche associato con l’attivazione costitutiva di NF-kB, massima angiogenesi e miglior microambiente per le cellule cancerogene. [60]

3.4 Sistema p53

La perdita di funzione p53 è frequente nelle fasi successive della tumorogenesi del colon-retto. Il gene p53 si trova sul cromosoma 17p e la sua mutazione è uno dei passaggi chiave nella carcinogenesi colon rettale e stimola l’attività proliferativa attraverso la perdita del controllo del ciclo cellulare e apoptosi.

Un'altra funzione del gene p53 è quella di regolare equilibrio energetico, attraverso l'attivazione del percorso AMPK. Morikawa e colleghi hanno ulteriormente esplorato questo ruolo di p53 nel bilancio energetico e hanno descritto che tra i pazienti non obesi la positività p53 è associata a ridotta sopravvivenza nei pazienti cancro specifici mentre

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l’ effetto contrario dell'obesità sulla mortalità dei pazienti con CRC è osservato nei soggetti negativi p53.

Durante la progressione della patologia CRC, si presentano mutazioni in differenti cicline chinasi dipendenti (CDKs). P53 attraverso la via AMPK, va ad up-regolare la ciclina CDK 1A (CDKN1A o p21) che è coinvolta nella regolazione del ciclo cellulare (il bilancio energetico, la senescenza cellulare e invecchiamento delle cellule staminali). È stato anche osservato che la perdita di funzione di p21 nel 79% dei CRC è associata con espressione di p53, dimostrando una positiva correlazione tra la perdita di p21 e sopravvivenza al CRC con l’aumento dell’età del paziente, specificatamente per pazienti con età>60 anni. Tuttavia questo effetto avverso non è stato osservato nei pazienti obesi con la perdita di p21. Un’altra CDK associazione con mutazione di p53 è con CDK 1B inibitore (CDKN1B o p27). P27 è coinvolto nel controllo e nella progressione nella fase S del ciclo cellulare e la sua degradazione è associata con la progressione del CRC. L’espressione CDKN1B è inversamente associata con i seguenti tipi di CRC: MSI-H(alta istabilità microsatellitare) e CIMP-H (alta metilazione delle isole CpG) ed in quelli p53 negativi.[38]

P53 interagisce anche con ciclossigenasi-2 (COX-2) che gioca un ruolo nel promuovere l’infiammazione e la proliferazione cellulare in CRC. È interessante notare che i tumori COX-2 positivi sono stati associati con un aumento della mortalità specifica del cancro, indipendentemente dallo stato p53, indicando che COX-2 potrebbe essere un fattore prognostico indipendente di tumori del colon-retto.[38]

3.5 Ruolo di Src e STAT

Src e STAT, sono altri due oncogeni critici, è stato dimostrato che sono coinvolti nello sviluppo, nella progressione di tumori epiteliali e nell’angiogenesi del cancro ed entrambi operano nella cascata del percorso EGFR. Uno studio mostra che l’aumentata espressione di EGFR nelle cellule del cancro determina un aumento di 10 volte l’attività di Src se comparata con cellule del cancro a bassa espressione di EGFR e questo aumento dell’attività di Src è associato con l’aumento del comportamento aggressivo del tumore e ad una potenzialità metastatica delle cellule del CRC.[60]

Src appartiene ad una delle più grosse famiglie di tirosina chinasi citoplasmatiche non recettori dei mammiferi. Questa proteina chinasi contiene domini SH2 e SH3 e sono posti sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica, trattenute in parte dalla loro

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interazione con proteine recettoriali transmembrana e in parte da catene lipidiche attaccate covalentemente. Questi recettori che agiscono attraverso tirosine chinasi citoplasmatiche funzionano in modo molto simile agli RTK, eccetto che il loro dominio chinasi è codificato da un gene separato ed è associato non covalentemente alla catena polipeptidica del recettore. A questa categoria di recettori appartengono diverse classi di recettori, inclusi i recettori per l’antigene e per le interleuchine presenti sulla superficie dei linfociti, le integrine e i recettori per diverse citochine e per alcuni ormoni.[56]

Src può anche legarsi a RTK attivati va ad accendere molte vie di sopravvivenza come il percorso R.AS MAPK. Attiva ulteriormente la tirosina del recettore tirosina chinasi che crea un continuo segnale di crescita per le cellule cancerogene. L’attivazione di mutazioni di Src è correlata ad esiti negativi di CRC. [60]

Le proteine STAT (signal transducers and activetor of trascription, trasduttori del segnale e attivatori della trascrizione) si trovano nel citosol e sono definite proteine latenti che regolano i geni perché, dopo essere state attivate, migrano nel nucleo e attivano la trascrizione genica. Queste proteine STAT (non recettore) sono per la maggior parte fosforilate e attivate da tirosine chinasi Janus (JAK o JNK) che sono associate a recettori delle citochine. Sebbene molte vie di segnalazione intracellulare portino da recettori di superficie al nucleo, dove alterano la trascrizione dei geni, la via di segnalazione JAK-STAT fornisce una delle vie più dirette. [56]

STATs sono anche attivati da EGFR e funzionano come fattori di trascrizione nel percorso dei recettori tirosina chinasi oltre che recettori di citochine. Induzione di STAT attraverso la segnalazione EGFR potrebbe anche alimentare l’angiogenesi nel microambiente del tumore. Sebbene l’attivazione di STATs ha mostrato essere in relazione all’aumentata proliferazione delle cellule del cancro in CRC l’esatto ruolo di STATs nello sviluppo e nella progressione del CRC è ancora in studio.[60]

Un altro tipo di tirosina chinasi citoplasmatica si associa con integrine, la principale famiglia di recettori che le cellule usano per legarsi alla matrice extracellulare. L’attacco di componenti della matrice a integrine può attivare vie di segnalazione intracellulare che influenzano il comportamento della cellula . Quando le integrine si raggruppano a livello di siti di contattato con la matrice, aiutano a scatenare l’assemblaggio di giunzioni cellula-matrice chiamate adesioni focali. Fra le molte proteine reclutate in queste giunzioni vi è la tirosina chinasi citoplasmatica chiamata chinasi dell’ adesione focale (FAK), che si lega alla coda citosolica di una delle subunità delle integrine con

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l’assistenza di altre proteine. Le molecole raggruppate di FAK si fosforilano a vicenda, creando siti di attacco di fosfotirosina dove si può attaccare la chinasi Src. Src e FAK adesso si fosforilano l’un l’altra e fosforilano altre proteine che si assemblano nella giunzione, comprese molte proteine di segnalazione usate dagli RTK. In questo modo le due chinasi segnalano alla cellula che ha aderito ad un substrato adatto dove la cellula può adesso sopravvivere, crescere, dividersi, migrare e così via.[56]