CLINICA E MODALITA’ DI DIFFUSIONE 7.1 “Cenni” di anatomia patologica
10.4 Analisi di mutazione
Il kit “Myriapod® Colon status” permette il rilevamento e l’identificazione delle principali mutazioni dei geni KRAS, BRAF, NRAS e PIK3CA correlate con la risposta al trattamento con anticorpi monoclonali anti-EGFR (Anti-EGFR MoAb) del tumore del colon-retto.
Il rilevamento ad elevato livello di multiplex si basa sul principio della spettrometria di massa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight) sul sistema strumentale “MassARRAY® system” (Sequenom, Inc. - California), associata alla tecnologia Single Base Extension.
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Il kit “Myriapod® Colon status” permette di identificare le principali mutazioni somatiche correlate con la risposta alla terapia del tumore del colon-retto.
Il DNA, estratto da sezioni di 10 µm tessuto tumorale, viene amplificato tramite multiplex-PCR su Labcycler (SensoQuest GmbH, Germania) utilizzando 8 diverse miscele di primers in modo da ottenere frammenti comprendenti tutti i siti polimorfici d’interesse. I prodotti di amplificazione vengono trattati con Shrimp Alkaline Phosphatase (reazione SAP) per rimuovere i nucleotidi residui. Segue una reazione di primer extension (reazione iPLEX®), in presenza di primer di estensione adiacenti ad ogni sito polimorfico e di nucleotidi con massa modificata (Termination Mix). Per ciascun sito polimorfico si ottengono, dunque, uno o più analiti di massa nota (corrispondente alla somma delle masse del primer di estensione e del nucleotide di massa modificata, inserito in corrispondenza del sito polimorfico). L’analisi mediante spettrometro di massa genera un picco a massa nota per ciascun analita, che sarà associato ad un genotipo wild type, mutato oppure parzialmente mutato del campione analizzato.
Il kit “Myriapod® Colon status” permette l’identificazione delle più importanti mutazioni dei geni KRAS (codoni 12, 13, 59, 61, 117, 146), BRAF (codoni 594, 600, 601), NRAS (codoni 12, 13, 18, 59, 61, 117, 146) e PIK3CA (codoni 38, 81, 88, 93, 108,118, 345, 420, 539, 542, 545, 546, 549, 1021,1025, 1043, 1047, 1049) che possono influenzare l’esito della terapia del tumore del colon-retto con Anti-EGFR MoAb. [155]
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Come possiamo vedere dallo schema sopra riportato si parte da una reazione di PCR multiplex che ha lo scopo di amplificare i tratti di genoma d’interesse, cioè tutti i tratti in cui si trovano gli SNPs candidati per l’analisi. Al posto quindi di due soli primer forward e reverse è utilizzata una primer mix che contiene tutte le coppie dei primer necessarie. Viene quindi preparata una miscela di amplificazione (Master Amp-mix) comune per le 8 diverse PCR mix. Una piastra piena, comprendente 10 campioni clinici (DNA1-DNA10) e i controlli di reazione (Control DNA, WATER). (96 pozzetti).
Master Amp-mix per una piastra piena:
Water 156,0 µl
PCR Buffer 60,0 µl
MgCl2 48,0 µl
dNTP Mix 12,0 µl
PCR Enzyme 24,0 µl
Per una piastra piena vengono dispensati 35 µl della Master Amp-mix in ciascuno degli 8 pozzetti contenenti i primer di amplificazione.
Dipsensare in ogni pozzetto della piastra 3 µl della rispettiva PCR MIX e infine aggiungere per ciasuna delle otto PCR MIXnei rispettivi pozzetti 2 µl di controollo negativo, di campione e controllo positivo per un volume totale di reazione per pozzetto di 5 µl. Sigillare la piastra con SQ sealing foil, centrifugare ed inserire nel termociclatore.
Profilo Myriapod PCR:
Una volta terminata la reazione di amplificazione, procedere immediatamente al trattamento con SAP, altrimenti conservare la piastra di PCR a -35/-20 °C, correttamente identificata.
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Il trattamento con SAP ha il compito di rimuovere i gruppi fosfato dai dinucleotidi che non sono stati incorporati. Per questa reazione viene preparata una SAP mix.
SAP mix:
Water 183.6 µl
SAP Buffer 20.4 µl SAP Enzym 36,0 µl
Mescolare accuratamente la SAP mix, dispensare 2 µl in ciascun pozzetto della piastra per un volume totale di 7 µl. Sigillare la pioastra con SQ sealing foil, centrifugarla e posizionarla nel termociclatore.
Profilo Myriapod SAP
Dopo qusto trattamento viene allestita la iPLEX mix che consentirà, l’estensione a singola base, permettendo a sua volta la genotipizzazione. Per ciasvun campione e controllo viene preparata una miscela di esptensione comune alle 8 EXT MIX (Master Ext-Mix), secondo il seguente schema per una piastra piena.
Master Ext-Mix:
Water 67.2 µl
Buffer Plus (10x) 24.0 µl
Termination mix 24.0 µl
Thermosequenase 4.8 µl
Dispensare 14 µl della Master Ext-Mix in ciascuno degli otto pozzetti dei primer di iPLEX, aggiungere ad ogni pozzetto della piastra 2 µl della relativa Ext-Mix per un volume di reazione finale di 9 µl. Sigillare la piastra con SQ sealing foil, centrifugarla e inserirla nel termociclatore.
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Al termine di quest’ultima reazione di PCR i prodotti vengono diluiti con 41 μl di WATER MS plus così da ottenere un volume finale di 50 µl (9 µl di PCR,SAP, iPLEX + 41 µl WATER MS plus) e purificati con l’aggiunta di una resina in forma di sabbia compatta, la piastra viene poi chiusa con apposito film termosaldabile e centrifugata a 2000 rpm per 15 minuti per favorire il deposito della resina sul fondo dei pozzetti. Solo ora i campioni hanno subito i trattamenti necessari per l’allestimento dello SpectroCHIP.
Piastra e chip vengono inseriti all’inerno del Nanodispenser e i campioni saranno spottati dalla piastra al chip [155]
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Il chip viene analizzato tramite l’utilizzo della spettometria di massa con il sistema MALDI - TOF
(Matrix, Assisted, Laser, Desorption, Ionization, Time Of Flight) ionizzazione e desorbimento di una matrice assistita da laser e rilevamento mediante il tempo di volo degli ioni generati.(Fig. 10.3)
Fig 10.3 Schema MALDI-TOF
1. SORGENTE (o camera di ionizzazione): ambiente dove vengono generati gli ioni attraverso il desorbimento/ionizzazione assistita da laser (MALDI).
Desorbimento: (fenomeno consistente nella liberazione di una sostanza adsorbita su un solido); il campione è rilasciato in forma "clusterizzata", complessato con la matrice. La matrice smorza gli effetti del fascio laser proteggendo l' analita, ionizzato e vaporizzato dall'energia in eccesso ceduta secondariamente dalla matrice stessa. Si ottengono ioni quasi molecolari, generalmente a singola carica (come quelli creati dall'acquisizione o dalla perdita di un protone).
2. ANALIZZATORE (a magnete, a campo elettrico o a tempo di volo TOF): tubo verticale dove le molecole vengono sparate in funzione della massa/carica (m/z). Per accelerare le cariche è presente un campo elettrico magnetico. Gli ioni con valore più alto del rapporto m/z raggiungono il detector più lentamente (hanno un tempo di volo maggiore) degli ioni con valori m/z più bassi.
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Nell’analizzatore e nel detector si mantiene un alto grado di vuoto per limitare la probabilità che collisioni con molecole gassose disturbino la migrazioni degli ioni provenienti dalla sorgente.
3. RIVELATORE: cattura gli ioni e li moltiplica in elettroni; utilizzati poi per trasformare il segnale in un grafico. È un moltiplicatore di cariche negative, quando ogni ione arriva al rilevatore viene indotta l’emissione da 1-3 elettroni. In un secondo processo chiamato emissione secondaria gli elettroni si muovano in un’altra piastra liberando nuovamente da 1-3 elettroni. Questo processo si ripete diverse volte causando l’amplificazione del segnale digitale visualizzato in tempo reale nel computer.
Una volta acquisiti gli spettri, i risultati vengono automaticamente caricati su database MassARRAY e successivamente analizzati per individuare i possibili SNPs.
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