Src e STAT, sono altri due oncogeni critici, è stato dimostrato che sono coinvolti nello sviluppo, nella progressione di tumori epiteliali e nell’angiogenesi del cancro ed entrambi operano nella cascata del percorso EGFR. Uno studio mostra che l’aumentata espressione di EGFR nelle cellule del cancro determina un aumento di 10 volte l’attività di Src se comparata con cellule del cancro a bassa espressione di EGFR e questo aumento dell’attività di Src è associato con l’aumento del comportamento aggressivo del tumore e ad una potenzialità metastatica delle cellule del CRC.[60]
Src appartiene ad una delle più grosse famiglie di tirosina chinasi citoplasmatiche non recettori dei mammiferi. Questa proteina chinasi contiene domini SH2 e SH3 e sono posti sul lato citoplasmatico della membrana plasmatica, trattenute in parte dalla loro
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interazione con proteine recettoriali transmembrana e in parte da catene lipidiche attaccate covalentemente. Questi recettori che agiscono attraverso tirosine chinasi citoplasmatiche funzionano in modo molto simile agli RTK, eccetto che il loro dominio chinasi è codificato da un gene separato ed è associato non covalentemente alla catena polipeptidica del recettore. A questa categoria di recettori appartengono diverse classi di recettori, inclusi i recettori per l’antigene e per le interleuchine presenti sulla superficie dei linfociti, le integrine e i recettori per diverse citochine e per alcuni ormoni.[56]
Src può anche legarsi a RTK attivati va ad accendere molte vie di sopravvivenza come il percorso R.AS MAPK. Attiva ulteriormente la tirosina del recettore tirosina chinasi che crea un continuo segnale di crescita per le cellule cancerogene. L’attivazione di mutazioni di Src è correlata ad esiti negativi di CRC. [60]
Le proteine STAT (signal transducers and activetor of trascription, trasduttori del segnale e attivatori della trascrizione) si trovano nel citosol e sono definite proteine latenti che regolano i geni perché, dopo essere state attivate, migrano nel nucleo e attivano la trascrizione genica. Queste proteine STAT (non recettore) sono per la maggior parte fosforilate e attivate da tirosine chinasi Janus (JAK o JNK) che sono associate a recettori delle citochine. Sebbene molte vie di segnalazione intracellulare portino da recettori di superficie al nucleo, dove alterano la trascrizione dei geni, la via di segnalazione JAK-STAT fornisce una delle vie più dirette. [56]
STATs sono anche attivati da EGFR e funzionano come fattori di trascrizione nel percorso dei recettori tirosina chinasi oltre che recettori di citochine. Induzione di STAT attraverso la segnalazione EGFR potrebbe anche alimentare l’angiogenesi nel microambiente del tumore. Sebbene l’attivazione di STATs ha mostrato essere in relazione all’aumentata proliferazione delle cellule del cancro in CRC l’esatto ruolo di STATs nello sviluppo e nella progressione del CRC è ancora in studio.[60]
Un altro tipo di tirosina chinasi citoplasmatica si associa con integrine, la principale famiglia di recettori che le cellule usano per legarsi alla matrice extracellulare. L’attacco di componenti della matrice a integrine può attivare vie di segnalazione intracellulare che influenzano il comportamento della cellula . Quando le integrine si raggruppano a livello di siti di contattato con la matrice, aiutano a scatenare l’assemblaggio di giunzioni cellula-matrice chiamate adesioni focali. Fra le molte proteine reclutate in queste giunzioni vi è la tirosina chinasi citoplasmatica chiamata chinasi dell’ adesione focale (FAK), che si lega alla coda citosolica di una delle subunità delle integrine con
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l’assistenza di altre proteine. Le molecole raggruppate di FAK si fosforilano a vicenda, creando siti di attacco di fosfotirosina dove si può attaccare la chinasi Src. Src e FAK adesso si fosforilano l’un l’altra e fosforilano altre proteine che si assemblano nella giunzione, comprese molte proteine di segnalazione usate dagli RTK. In questo modo le due chinasi segnalano alla cellula che ha aderito ad un substrato adatto dove la cellula può adesso sopravvivere, crescere, dividersi, migrare e così via.[56]
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4.
INSTABILITA’ MICROSATELLITARE
4.1 Pathway MSI
La seconda via identificata nella patogenesi del CRC coinvolge i geni del mismatch repair (MMR) che codificano per proteine necessarie all’identificazione, escissione e riparazione degli errori che si verificano durante la replicazione del DNA. [38]
L’inattivazione del DNA MMR provoca un aumento di 100 volte il tasso di mutazione nella mucosa colon rettale. MMR è un sistema multiproteico che agisce come una macchina di prova per aumentare la fedeltà delle replicazioni del DNA mediante identificazione e riparazione diretta di nucleotidi non corrispondenti. [38]
Il sistema MMR agisce solo quando un errore elude il sistema di controllo degli errori intrinseco della DNA polimerasi. [38]
Il complesso del MMR è formato da 5 geni: MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 e MSH6; nel 60% dei casi la mutazione riguarda MSH2 (cromosoma 2p) e MLH1 (cromosoma 3p); più raramente sono coinvolti i geni PMS1 (cromosoma 2q), PMS2 (cromosoma 7p) e MSH6. [55]
MSI pathway rappresenta una forma di instabilità genomica che coinvolge circa il 2-4% di CRC collegati alla sindrome di Lynch, il 15% sono CRCs. Il resto sono casi sporadici determinati dall’ipermetilazione del gene promotore MLH1. [55]
I pazienti affetti da HNPCC o LS ereditano un allele normale e uno mutato; quando una mutazione o un silenziamento epigenetico comportano la perdita della seconda copia di uno dei geni MMR, si determina la cosiddetta instabilità dei microsatelliti (MSI). Tale condizione è generata da un accumulo di mutazioni durante la replicazione del DNA, responsabile dalla ripetizione di brevi sequenze di DNA (DNA microsatelliti) a livello di regioni codificanti del genoma. .[61]
In condizioni normali i microsatelliti sono brevi sequenze (1-6 paia di basi) di DNA non codificante, variamente ripetute a tandem lungo l’intero genoma; costituiscono il 3% del materiale genetico, presentano un alto livello di polimorfismo interindividuale che permette la creazione di impronte genetiche, utilizzabili per identificare un individuo o effettuare studi di popolazione.[61]
In sostanza la presenza di MSI è l’espressione fenotipica dell’alterazione dei geni MMR. Quando si verifica un difetto del sistema del MMR, a causa di una mutazione
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somatica o ereditaria, l’insorgenza di MSI causa l’inattivazione di oncosoppressori o modifica alcune sequenze non codificanti.
Le mutazioni rendono silenti regioni codificanti o promotrici dei geni coinvolti nella regolazione della crescita cellulare, come ad esempio il recettore TGFβ di tipo II e la proteina proapoptotica BAX.
Le neoplasie colon rettali con MSI possono essere distinte ulteriormente in MSI-High (MSI-H) o MSI-Low (MSI-L) in base al valore della percentuale dei loci mutati (>/< 30%). I tumori MSI-H mostrano una marcata differenziazione mucinosa e infiltrati linfocitari peritumorali, si sviluppano con maggior frequenza nel colon destro e presentano un vantaggio prognostico del 15% rispetto alle altre categorie.[31]Mentre le caratteristiche cliniche e molecolari dei tumori MSI-L sono paragonabili a quelle dei tumori microsatelliti stabili MSS.[62]
Il CRC che si sviluppa attraverso il percorso MSI presenta caratteristiche cliniche peculiari: più spesso si trova nel colon prossimale scarsamente differenziato e mucinoso o istotipo midollare e spesso presenta intensa infiltrazione linfocitaria peritumorale e intratumorale. In generale, la prognosi e la sopravvivenza di pazienti affetti da CRC di MSI-High è migliore e più lunga di pazienti con CRC positivi a CIN. [38]
Nella sindrome di HNPCC, lo sviluppo di CRC è determinato dalla mutazione germinale in uno dei due componenti MMR. HNPCC è un disturbo genetico autosomico dominante caratterizzato da una giovane età di insorgenza (<50 anni) del cancro del colon-retto e altri tumori maligni, incluso l'endometrio e tumori ovarici.[38]
Nel 95% delle HNPCC, le mutazioni sono presenti in hMLH1 e hMSH2. Le manifestazioni cliniche possono essere diverse, a seconda di quale gene è coinvolto e dove si verificano mutazioni. L'hMSH2 difettoso è associato ad un aumento del rischio di sviluppo del 40%-60% endometriale, mentre hMLH1 difettoso con un rischio aumentato del 50% -80% di sviluppo CRC. Inoltre le mutazioni in hMSH6 sono associate all'11%-19% aumento del rischio di sviluppo cancro gastrico, mentre mutazioni in hPMS2 con un rischio aumentato del 9% -12% cancro ovarico .[38]
Recentemente, è stata trovata una sottoclasse delle famiglie HNPCC deficienti di MMR trasportare le delezioni germinali nella molecola adesione delle cellule epiteliali (EpCAM), con conseguente silenziamento del gene hMSH2 . I portatori di EPCAM mostrano un rischio minore di sviluppare tumori endometriali. HNPCC è un buon esempio di un'associazione genotipo-fenotipo, e l'identificazione di portatori di mutazione è critica per l'attuazione di procedure di screening e follow-up ottimali.
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Inoltre, nelle famiglie con elevati sospetti HNPCC, i parametri clinici possono aiutare a dirigere nuovi casi sospetti verso la destinazione test genetici.[38]
I carcinomi del CRC sono dovuti principalmente al silenziamento del promotore del gene hMLH1. Il fenotipo mutante risultante, come nelle impostazioni di HNPCC, porta all'inattivazione di geni bersaglio, in particolare soppressori tumorali aventi una sequenza microsatellica nella loro regione di codifica.[48]
Importanti, i casi sporadici di CRC di H-MSI portano la mutazione V600E del oncogene BRAF. [48]
Mutazoni in BRAF al codone 594 e 596 sono state identificate in CRCs metastatici con diversa patologia, clinica e caratteristiche prognostiche quando comparate con la mutazione BRAF V600E. [48]
Nella mutazione BRAF V600E la frequenza di instabilità microsatellitare è relativamente alta circa il 20% negli stadi metastatici; al contrario tutti i codoni 594 o 596 BRAF mutati hanno stabilità microsatellitare. [48]
CRC sporadici con H-MSI visualizzano le funzionalità di CIMP (una combinazione di due percorsi), e sarà descritto ulteriormente nella sezione del percorso CIMP.
Più dell’80% delle mutazioni di MSI-CRC portano mutazioni di TGF-β. Mutazioni in TGF-βRII si ritrovano in adenomi che presentano displasia di alto grado e in qualunque caratteristica di displasia di alto grado o di progressione verso adenocarcinoma e rappresenta una causa comune di progressione neoplastica nelle fasi tardive e metastatiche di CRC MSI-High. Mutazioni addizionali, nei geni SMAD2 e SMAD4, parte del percorso TGF-β pathway, sono comuni in MSI-H CRC.
Mutazioni in SMAD4 facilitano l’accensione della progressione del tumore nella via di segnalazione di TGF-β. Eppert e colleghi hanno dimostrato che la perdita di funzione di Smad2 contribuisce, indipendentemente da Smad4, a disattivare la segnalazione di TGF-β. Un altro obiettivo mutazionale nella genesi di CRC H-MSI è l'alterazione dei 2 tratti polyadenina (A8) in esone 10 del recettore del tipo 2 attivina (ACVR2). Il gene ACVR2 codifica per un recettore transmembrana la cui attivazione provoca la differenziazione e la soppressione della crescita attraverso la segnalazione fosforilazione delle proteine Smad2 e Smad3. Jung e colleghi hanno identificato queste mutazioni solo in CRC di H-MSI, dimostrando inoltre che la mutazione ACVR2 si è verificata frequentemente con mutazioni TGF-βR2.[38]
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Un altro gene target nel percorso CRC di MSI-high è il gene pro-apoptotico del tumore soppressore BAX.[38]
Le mutazioni omozigotiche di frameshift di BAX si verificano nel 50% dei casi di CRC e promuovono la fuga della cellula dai meccanismi di apoptosi intrinseca. Le mutazioni del gene BAX, come le mutazioni TGF-βRII, possono essere presenti nelle progressioni neoplastiche nonostante le mutazioni precoci nell’adenoma.[38]
Tuttavia, Shima e colleghi hanno studiato le mutazioni coinvolte di TGF-βRII e BAX in una grande coorte di pazienti e hanno dimostrato che CRC H-MSI sono stati associati ad una migliore prognosi rispetto ai CRC stabili di MS, indipendentemente dalla presenza di mutazioni di TGF-βRII e BAX.
Oltre ai geni sopra menzionati frequentemente presenti in CRC di H-MSI, altri geni sono presenti a una frequenza più bassa (circa il 20%), incluse le mutazioni nei geni MMR hMSH3 (36,5%) e hMSH6 (17,5%), fattore di crescita insulinica tipo 2 (IGFIIR) (22%), BLM gene (16%), PIK3CA (15%), G-proteina-accoppiato recettore di prostaglandina – endoperossidasi sintasi2 (PTGS2) (33%) e il gene Cyclin D1 (28%). Recentemente, Baba e colleghi hanno trovato che G-proteina-accoppiata a sovra espressione recettore PTGER2, l’obiettivo a valle di PGE2, che è coinvolto nell'infiammazione e nel cancro, è fortemente associato MSI.[38]
Infine, Ogino ha dimostrato che la presenza di ciclina D1 nella mucosa neoplastica del colon era non solo nei pazienti con il percorso CIN alterato, ma anche in quelli con il percorso MSI modificato. La sua sovra espressione è stata associata a una mortalità più bassa del tumore del colon e della mortalità complessiva.[38]
Nei tumori con MSI sono frequenti le mutazioni dell’oncogene BRAF e il silenziamento del gene MLH1 dovuto all’ipermetilazione di CpG, mentre in genere KRAS e p53 non presentano mutazioni. Di conseguenza la combinazione di instabilità dei microsatelliti, mutazioni di BRAF e la metilazione di bersagli specifici, come MLH1, costituisce la firma di questa via di carcinogenesi.[63]
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