UNIVERSITA’ DI PISA
Dipartimento di Biologia
Corso di Laurea Magistrale in Biologia applicata alla Biomedicina
Curriculum Neurobiologico
Tesi di Laurea
Influenze trigeminali sul Locus Coeruleus: aspetti molecolari,
neurofisiologici e comportamentali
Candidata
Serena Argento
Relatore
Prof. Diego Manzoni
Ringraziamenti
Vorrei ringraziare tutti coloro che mi hanno sostenuta ed aiutata nella realizzazione di questa tesi. Vorrei, innanzitutto, ricordare che i dati di biologia molecolare sono stati raccolti all’interno del progetto “Effects of malocclusion and trigeminal asymmetries on central brain structures” che è stato reso possibile grazie al finanziamento da parte delle ditte I.A.C.E.R (Martellago, Venezia, Italia) e Implafavourite (Pinerolo, Torino, Italia).
Desidero ringraziare il Prof. Manzoni per avermi guidata sapientemente in questo percorso, fornendomi tutti gli strumenti necessari per portare a compimento la mia tesi.
Un ringraziamento va anche al Prof. Cammalleri e alla Prof.ssa D’Ascanio per i suggerimenti, le critiche e le osservazioni che hanno espresso sul mio elaborato, aiutandomi a migliorarlo.
Ringrazio il Prof. Miragliotta ed i tecnici Carla Lenzi e Andrea Pirone, per avermi accolta nel loro laboratorio ed avermi guidata nella gestione del lavoro sperimentale.
Ringrazio anche il Dott. De Cicco per l’instancabile e prezioso lavoro che svolge.
Un ringraziamento speciale va alla Dottoranda Maria Paola Tramonti Fantozzi, con la quale ho condiviso quasi un anno di lavoro: tra alti e bassi, lacrime e sorrisi ci siamo sostenute
quotidianamente, spronandoci l’un l’altra ad andare avanti e perseguire i nostri obiettivi. Vorrei ringraziare anche il mio ragazzo Raffaele che con tanta pazienza mi è stato vicino in questo percorso, supportandomi e sopportandomi.
Infine, il ringraziamento più grande va ai miei genitori per tutto il sostegno che mi hanno sempre dato: fisico, mentale, morale ed economico. Senza di voi non sarei arrivata fin qui e soprattutto non sarei diventata la persona che sono oggi.
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Indice
1. INTRODUZIONE... 10
1.1. Il sistema trigeminale ... 10
1.1.1. Il nucleo mesencefalico del trigemino ... 13
1.2. Effetti trigeminali acuti sull’arousal e sulla prestazione cognitiva ... 14
1.3. Effetti trigeminali cronici sull’encefalo ... 16
1.4. Azioni trigeminali acute e sistema reticolare attivatore ascendente (ARAS) ... 17
1.5. Input trigeminale: vie anatomiche... 20
1.6. Una via preferenziale per spiegare gli effetti trigeminali acuti sull’encefalo: il Locus Coeruleus (LC) ... 22
1.7. Il Locus Coeruleus e gli effetti trigeminali cronici sull’encefalo ... 25
1.8. Possibili influenze trofiche del trigemino sui neuroni del LC ... 27
2. SCOPO DELLO STUDIO ... 29
3. MATERIALI E METODI ... 30
3.1. Soggetti ... 30
3.2. Valutazioni preliminari ... 30
3.3. Stimolazione trigeminale ... 34
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3.5. Acquisizione dei dati ... 35
3.6. Analisi statistica... 36 3.7. Procedura sperimentale ... 37 3.8. Estrazione dell’RNA ... 38 3.9. RT-PCR quantitativa ... 38 3.10. Retrotrascrizione ... 39 3.11. qPCR ... 39
3.12. Acquisizione dei dati e analisi statistica ... 40
4. RISULTATI ... 43
4.1. Caratteristiche della popolazione studiata: asimmetrie EMG e pupillari, diametri pupillari a riposo e durante il compito tattile, parametri caratterizzanti la prestazione cognitiva ... 43
4.2. Correlazioni tra l’età, il diametro pupillare, l’attività EMG e la prestazione ... 46
4.3. Effetti della correzione occlusale sulle asimmetrie dell’attività EMG ... 48
4.4. Effetti della correzione occlusale sulle asimmetrie pupillari ... 50
4.5. Effetti della correzione occlusale sulla prestazione e sulla midriasi indotta dal compito tattile ... 57
4.6. Correlazioni osservate tra le variazioni della prestazione e le modificazioni dei parametri pupillari ... 61
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4.7. Espressione della DBH... 66
5. DISCUSSIONE ... 67
5.1. Misurazioni del diametro pupillare e dell’attività EMG: considerazioni generali ... 67
5.2. Asimmetrie nell’attività EMG e nel diametro pupillare ... 69
5.3. Variazioni del diametro pupillare e dell’anisocoria indotte da variazioni nella posizione della mandibola ... 71
5.4. Variazioni della prestazione ... 75
5.5. Effetti della malocclusione cronica ... 78
6. CONCLUSIONI ... 81
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Riassunto
È noto che, negli animali da esperimento, l’asportazione di elementi dentali e la malocclusione inducono fenomeni neurodegenerativi a livello dell’ippocampo e della corteccia cerebrale, con diminuzione dell’attività neuronale e sviluppo di deficit cognitivi. D’altra parte, nell’uomo, la correzione di occlusioni scorrette, che generano asimmetrie nell’attività delle afferenze trigeminali, aumentano la prestazione cognitiva e la midriasi indotta da un compito tattile. Questi effetti trigeminali sul Sistema Nervoso Centrale possono coinvolgere il sistema noradrenergico del Locus Coeruleus (LC) che controlla le funzioni sensoriali, motorie e cognitive, la plasticità neuronale e i processi neuroinfiammatori e neurodegenerativi. L’attività di questa struttura è strettamente correlata al diametro pupillare, che ne costituisce una vera e propria misurazione indiretta.
Abbiamo voluto studiare:
A) se le variazioni nell’asimmetria dell’attività sensorimotoria trigeminale inducano nell’uomo variazioni nella prestazione cognitiva significativamente correlate all’attività del LC, valutata mediante pupillometria;
B) se la rimozione unilaterale delle cuspidi dei denti molari nel ratto (malocclusione) possa influenzare l’espressione bulbo-pontina dell’enzima di sintesi della noradrenalina (dopamina--idrossilasi), marcatore dei neuroni del LC.
7 Lo studio A è stato condotto su 20 soggetti che mostravano, durante il morso, un’asimmetria dell’attività elettromiografica (EMG) dei masseteri uguale o maggiore al 24% della media dei due lati. In questi soggetti sono stati misurati: 1) con le arcate semi-aperte, i diametri pupillari a riposo e durante lo svolgimento di un compito tattile, come pure la differenza fra questi due valori (midriasi indotta dal compito) per ogni pupilla e la differenza dei diametri pupillari tra i due lati (anisocoria);
2) la prestazione cognitiva, valutata mediante il test delle matrici numeriche di Spinnler e Tognoni.
L’anisocoria (a riposo e durante il compito tattile) era significativamente correlata con l’asimmetria dell’attività EMG: il diametro pupillare era maggiore sul lato di maggiore attività EMG.
A questo punto, mediante stimolazione transcutanea bilaterale delle branche motorie del nervo trigemino, la mandibola veniva portata in una nuova posizione di equilibrio, mantenuta attraverso la realizzazione di un bite, indossato quotidianamente dai soggetti (eccetto durante il sonno) per almeno 7 giorni. Nella nuova posizione occlusale, l’asimmetria dell’attività EMG, osservata durante il morso in occlusione abituale, era annullata o notevolmente ridotta, al pari dell’anisocoria. Passato il periodo di 7 giorni, le valutazioni 1-2 venivano ripetute prima con le arcate semiaperte, poi con i denti a contatto e poi nuovamente con le arcate semiaperte. Le tre prove erano effettuate prima senza bite e poi con il bite posizionato fra le arcate. Abbiamo osservato che, se le arcate venivano a contatto
8 con il bite, la prestazione cognitiva migliorava; mentre, se il contatto era diretto, la prestazione cognitiva peggiorava. Analoghe modificazioni si osservavano anche per la midriasi indotta dal compito tattile. Inoltre, le variazioni della prestazione cognitiva correlavano positivamente con quelle della midriasi, mentre erano negativamente correlate con quelle del diametro pupillare medio e dell’anisocoria osservate a riposo. Ciò suggerisce che la correzione occlusale aumenti l’attività fasica del LC con conseguente incremento della prestazione cognitiva e, al contempo, diminuisca l’attività tonica del LC ed il suo sbilanciamento fra i due lati. Lo studio B è stato condotto su 12 ratti Wistar, suddivisi in un gruppo sperimentale, in cui è stata indotta una malocclusione unilaterale molando le cuspidi dei molari del lato sinistro, e in un gruppo di controllo, con le cuspidi intatte.
L’ipotesi di lavoro era che l’asimmetria nell’attività delle afferenze trigeminali, indotta dalla malocclusione, alterasse in modo asimmetrico l’attività ed il trofismo del LC e, di conseguenza, i livelli dell’RNA messaggero per la dopamina-β-idrossilasi (DBH), marker dei neuroni noradrenergici.
Dopo un periodo di osservazione di 75 giorni, gli animali sono stati sacrificati. L’encefalo è stato prelevato, dissezionato nelle varie aree di interesse, separando il lato sinistro da quello destro, e conservato. Successivamente è stata effettuata l’estrazione dell’mRNA per la DBH, la cui espressione è stata determinata attraverso la tecnica della “quantitative Polimerase Chain reaction” (qPCR). Sui dati ottenuti sono state eseguite due valutazioni: nella prima è stato confrontato il lato destro con quello sinistro sia nel gruppo sperimentale (p<0,151) che in quello di controllo
9 (p<0,399); nella seconda valutazione, invece, sono stati confrontati i due gruppi su ognuno dei due lati (lato sinistro: p<0,826; lato destro: p<0,263). Entrambe le analisi non hanno evidenziato differenze significative nell’espressione della DBH. Non è stato quindi possibile dimostrare che la malocclusione cronica alteri in maniera persistente l’espressione dell’enzima di sintesi della noradrenalina.
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1. Introduzione
1.1. Il sistema trigeminale
Il trigemino (V nervo cranico) è costituito da tre branche (rami):
• il ramo oftalmico che innerva l’occhio, la cute della fronte e del cuoio capelluto e la mucosa nasale;
• il ramo mascellare che innerva la parte superiore della cavità orale e i denti dell’arcata superiore, la parte intermedia della faccia, il labbro superiore, le mucose del seno mascellare, della cavità nasale e della rinofaringe;
• il ramo mandibolare che innerva l’arcata dentale inferiore, la parte inferiore della faccia e della mucosa della cavità orale e la parte anteriore della lingua.
Figura 1 Il nervo Trigemino
11 Il trigemino è un nervo misto, con una componente sensitiva somatica per la sensibilità della faccia e della testa ed una componente motoria per i muscoli masticatori. Le due componenti emergono dal nevrasse con radici separate. La componente sensitiva origina dal ganglio semilunare di Gasser, mentre la componente motoria origina dal nucleo motorio e contiene anche le fibre propriocettive dei fusi neuromuscolari che hanno il corpo cellulare nel nucleo mesencefalico del V, a livello del ponte.
Il ganglio di Gasser è formato dai corpi cellulari dei neuroni sensitivi i cui neuroni a T pseudo unipolari generano un prolungamento centrale che si dirige verso i nuclei sensitivi (principale e spinale) ed un prolungamento periferico che decorre in una delle tre branche del trigemino.
Nel complesso dei nuclei sensitivi trigeminali, che si estendono dai primi neuromeri cervicali al mesencefalo si distinguono tre componenti:
• un nucleo mesencefalico, responsabile della sensibilità propriocettiva dei muscoli masticatori, formato dai corpi cellulari dei propriocettori muscolari, unico caso di ganglio sensitivo situato all’interno del cervello;
• un nucleo pontino sensitivo principale, responsabile della sensibilità tattile; • un nucleo spinale responsabile della sensibilità tattile, termica e dolorifica.
12 Dai nuclei principale e spinale originano fibre che proiettano a regioni talamiche da cui partono proiezioni per aree somestesiche della circonvoluzione postcentrale, responsabili della percezione sensoriale nel territorio orofaciale.
La radice motoria, invece, origina dai motoneuroni del nucleo masticatorio, situato tra ponte e mesencefalo, emerge dal ponte e passa al di sotto del ganglio di Gasser e, seguendo la branca mandibolare innerva i muscoli massetere, temporale, pterigoideo laterale e mediale, il muscolo tensore del timpano, il tensore del palato, il muscolo miloioideo ed il ventre anteriore del muscolo digastrico.
Figura 2 Nuclei trigeminali, visione dorsale del tronco encefalico. Da: Wilson-Pauwels, L. et al.” Cranial Nerves”, PMPH-USA, 2010.
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1.1.1. Il nucleo mesencefalico del trigemino
Il nucleo mesencefalico del trigemino (Me5) è l’unica formazione del sistema nervoso centrale in cui sono presenti i corpi cellulari di neuroni afferenti primari. Il Me5 forma una banda ristretta di cellule che si estendono dal margine rostrale del nucleo sensitivo principale al collicolo superiore del mesencefalo, rostralmente al nucleo motorio trigeminale.
I rami periferici dei neuroni del nucleo mesencefalico del trigemino innervano i recettori da stiramento dei muscoli della mandibola e i meccanocettori del legamento parodontale (Brodal, 1981; Dessem et al., 1997).
La maggior parte delle fibre periferiche dei neuroni del nucleo mesencefalico decorre nella branca mandibolare del trigemino.
Un ramo collaterale delle fibre di questi neuroni proietta direttamente, attraverso il tratto mesencefalico del trigemino, al nucleo motore del trigemino. Questa connessione dà origine al riflesso masseterino, che determina la contrazione dei muscoli masseteri in risposta all’abbassamento della mandibola e il riflesso parodonto-masseterino, che aumenta l’attività dei motoneuroni corrispondenti a seguito di una pressione esercitata sui denti, tale da attivare i recettori parodontali a soglia più bassa.
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1.2. Effetti trigeminali acuti sull’arousal e sulla prestazione cognitiva
Studi recenti indicano che le afferenze trigeminali, oltre ad originare la sensibilità della regione orofaciale e a controllare il movimento possono avere effetti immediati sulle prestazioni cognitive e sull’attività cerebrale ad esse legata; inoltre possono anche esercitare azioni a lungo termine che modulano il trofismo neuronale e lo sviluppo di patologie neurodegenerative (Tramonti Fantozzi et al., 2017).
È stato dimostrato che la masticazione migliora la vigilanza (Allen and Smith, 2012; Johnson et al., 2012) e l’attenzione (Tucha et al., 2004) ed aumenta la velocità dei processi cognitivi (Hirano et al., 2013). La masticazione induce anche una diminuzione significativa nei tempi di reazione a stimoli sensoriali e nella latenza dei potenziali evocati dalle operazioni cognitive indotte da tali stimoli (Tucha et al., 2004; Sakamoto et al., 2009, 2015; Allen e Smith, 2012; Hirano et al., 2013). Inoltre, essa fa aumentare il flusso ematico cerebrale (Hirano et al., 2013) e la prestazione (Tramonti Fantozzi et al., 2017) durante compiti cognitivi. Questi effetti sono specifici della masticazione, in quanto non sono prodotti dai movimenti ritmici della mano o dai movimenti di apertura e chiusura della mandibola in assenza di bolo masticato (Sakamoto et al., 2015; Tramonti Fantozzi et al., 2017). È interessante notare che la masticazione aumenta sia la prestazione nell’esecuzione del test delle matrici numeriche di Spinnler-Tognoni (in cui il soggetto deve individuare dei numeri target all’interno di matrici numeriche) che la
15 midriasi indotta dallo svolgimento di un compito tattile, parametro che rappresenta un indicatore del livello di arousal associato ad un compito cognitivo (Tramonti Fantozzi et al., 2017). Queste variazioni nella prestazione e nell’arousal sono significativamente correlate e possono quindi sottendere un meccanismo comune. Mentre la masticazione stimola l’arousal e la prestazione cognitiva, l’asimmetria dell'attività sensorimotoria trigeminale sembra avere l'effetto opposto.
È stato infatti dimostrato che, in pazienti affetti da disturbi dell’articolazione temporo-mandibolare (ATM) e che presentano un'asimmetria nell'attività elettromiografica (EMG) del massetere durante il morso, il posizionamento di un ortotico (bite) rende simmetrica l’attività EMG e aumenta la midriasi sviluppata durante un compito tattile (De Cicco et al., 2014). Inoltre, in soggetti sani in cui l’asimmetria EMG è secondaria alla mancanza di superficie occlusale, il ripristino della superficie mancante tramite impianto dentale, oltre a ridurre l’asimmetria, aumenta sia la prestazione nel test Spinnler-Tognoni che la midriasi generata durante l’esecuzione di un compito tattile (De Cicco et al, 2016). La mancanza, in questi studi, di un’analisi correlativa, non permette però di accertare che le variazioni di prestazione ed arousal indotte dalla modificazione della condizione occlusale possono condividere un analogo meccanismo, come nel caso di quelle indotte dalla masticazione.
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1.3. Effetti trigeminali cronici sull’encefalo
L’azione cronica degli input trigeminali sull’encefalo, invece, potrebbe aiutare a preservare le funzioni cerebrali, che si deteriorano con l’invecchiamento (Ono et al., 2010).
È stato osservato che la manutenzione della dentatura ed il suo ripristino, nonché l’abitudine a masticare su entrambi i lati riducono significativamente il rischio di sviluppare demenza o malattia di Alzheimer (AD) (Weijenberg et al., 2011; Okamoto et al., 2015), mentre, negli animali, la riabilitazione masticatoria migliora le prestazioni nei compiti di memoria spaziale (Mendes et al., 2013).
Negli animali, la disfunzione masticatoria a lungo termine, provocata dall'estrazione bilaterale dei molari, provoca degli effetti degenerativi a livello dell’ippocampo, con riduzione del numero delle cellule piramidali nella regione CA1 dell’ippocampo (Oue et al., 2013); a questo si associano anche altri segni di neurodegenerazione, come la proliferazione e l’ipertrofia degli astrociti (Onozuka et al., 2000), la ridotta densità delle spine dendritiche (Kubo et al., 2005) e la riduzione della neurogenesi (Aoki et al., 2010). Tutti questi fenomeni portano a dei severi deficit alla memoria spaziale (Kato et al., 1997; Onozuka, 1999), con una ridotta eccitazione ippocampale durante lo svolgimento dei compiti di tipo spaziale, evidenziata dalla ridotta espressione di c-Fos, un gene ad induzione rapida, la cui espressione aumenta all’aumentare dell’attività neuronale (Watanabe et al., 2002). La gravità di questi deficit aumenta con l’età dell’animale e con il tempo trascorso
17 dalla rimozione dei denti (Onozuka et al., 2000). Quando gli elementi dentali vengono sostituiti con delle corone artificiali, sia il numero di cellule c-Fos positive nella regione CA1 dell’ippocampo sia la prestazione nello svolgimento dei compiti spaziali ritornano normali (Watanabe et al., 2002). Inoltre, gli stessi effetti della perdita di elementi dentali sono ottenuti somministrando agli animali una dieta a base di cibo morbido (Tsutsui et al., 2007; Yamamoto et al., 2009; Frota de Almeida et al., 2012): questa procedura riduce anche i livelli di BDNF, che svolge un ruolo importante nei meccanismi della memoria (Yamamoto et al., 2008).
Anche una manipolazione trigeminale meno traumatica rispetto all’estrazione dei denti, come ad esempio l’eliminazione delle cuspidi dei molari, può indurre effetti neurodegenerativi importanti. Questa operazione, infatti, aumenta sia i livelli dei
marker apoptotici che del β-amiloide nell’ippocampo (Ekuni et al., 2011). Non si
può far a meno di osservare che l’accumulo di β-amiloide è uno dei sintomi associati all’AD (Sisodia et al., 1990).
Gli effetti di interventi più lievi, come la molatura unilaterale dei molari non sono ancora stati oggetto di studio.
1.4. Azioni trigeminali acute e sistema reticolare attivatore ascendente (ARAS)
Quali potrebbero essere i meccanismi neurofisiologici e neurobiologici alla base di queste influenze trigeminali sull’encefalo?
L’efficacia dell’input trigeminale nel migliorare acutamente l’arousal e la prestazione cognitiva suggerisce che esso possa influenzare l'attività dell'ARAS.
18 Tutte le strutture dell’ARAS possono modulare l’arousal, agendo a vari livelli: sui nuclei talamici a proiezione specifica e su quelli a proiezione diffusa (Saper et al., 2005), sulla corteccia cerebrale (Saper et al., 2005), nonché sui neuroni del nucleo di Meynert (Peyron et al., 1998; Jones, 2004; Fuller et al., 2011; Monti, 2011), che svolgono un ruolo essenziale nel controllo dell'arousal (Fuller et al., 2011) e la cui componente colinergica è responsabile del rilascio di acetilcolina nella corteccia cerebrale. L'ARAS promuove la transizione della scarica dei neuroni talamici e corticali da periodi alternati di attività e silenzio elettrico (sincronizzati diffusamente fra i neuroni) (Steriade et al., 1993), ad una scarica continua, dove la sincronizzazione avviene solo all'interno di ristrette popolazioni neuronali che partecipano allo stesso processo neurale (Uhlhaas et al., 2009). Queste due differenti tipologie di attività neuronale danno origine a diversi quadri di attività elettroencefalografica (EEG): nel primo caso, tipico della sonnolenza e del sonno ad onde lente, l’EEG ha alto voltaggio e bassa frequenza, mentre nel secondo, caratteristico della veglia, l’EEG ha basso voltaggio ed alta frequenza (Steriade et al., 1993; Steriade, 1995). Pertanto, l'attivazione globale dell’ARAS facilita il risveglio e migliora la vigilanza.
L'osservazione che l’attività sensorimotoria trigeminale sia più efficace rispetto a quella di altri distretti nell'aumentare la prestazione e l’arousal (Tramonti Fantozzi et al., 2017) è coerente con l'osservazione che, in seguito ad una sezione cervicale del midollo spinale, per cui l’ARAS viene privato di tutte le afferenze spinali, un'ulteriore lesione delle fibre trigeminali porta ad un pattern di sonno
19 sincronizzato persistente (Roger et al., 1956), mentre la lesione degli altri sistemi sensoriali non ha il medesimo effetto.
Una forte influenza dell'input trigeminale sull’ARAS può quindi giustificare l’azione particolarmente efficace della masticazione sulla midriasi e sulla prestazione cognitiva osservata negli esperimenti citati (Sakamoto et al., 2015; Tramonti Fantozzi et al., 2017).
D'altra parte, l’influenza trigeminale sull’ARAS potrebbe anche spiegare la diminuzione della prestazione cognitiva e della midriasi indotta dall’asimmetria trigeminale. Un’attività sensorimotoria trigeminale asimmetrica, come quella evidenziata durante il morso in alcuni soggetti (De Cicco et al., 2014, 2016) potrebbe infatti indurre un'attività asimmetrica dell'ARAS e di conseguenza, un livello asimmetrico di eccitabilità corticale. Ci sono dati sperimentali che indicano come le asimmetrie nell’attività degli emisferi cerebrali portino ad evidenti disfunzioni comportamentali. Ad esempio, negli animali da esperimento, i deficit cognitivi indotti da una lesione della corteccia temporo-parietale (incapacità di orientare l’attenzione nella metà opposta dello spazio circostante) scompaiono dopo una lesione della stessa regione sul lato opposto (Lomber and Payne, 1996): questo indica che l'asimmetria, piuttosto che la quantità di tessuto distrutto, è effettivamente responsabile del deficit osservato a seguito della prima lesione. Inoltre, lo stesso deficit cognitivo (associato, in questo caso all’incapacità di riconoscere come propria la metà del corpo sul lato opposto alla lesione) indotto nell'uomo dalla lesione del lobo parietale destro, può essere eliminato o
20 notevolmente attenuato dalla stimolazione asimmetrica di specifici canali sensoriali (Rubens, 1985; Bottini et al., 1995; Schiff and Pulver, 1999). L’influenza negativa dell’asimmetria emisferica sulle prestazioni comportamentali non si osserva solo nel caso delle lesioni cerebrali. Popolazioni di operatori medici esposti cronicamente a basse dosi di radiazioni che colpiscono l’emisfero sinistro, mostrano infatti prestazioni neuropsicologiche peggiori rispetto ai soggetti non esposti (Marazziti et al., 2015). Da dati ancora non pubblicati risulta che in questi soggetti l’analisi elettroencefalografica (EEG) rivela un’asimmetria emisferica assai maggiore rispetto a quella osservabile nei soggetti non irradiati (Prof. Ugo Faraguna, comunicazione personale). Considerando la potente azione trigeminale sull’ARAS, e, di conseguenza, sull’eccitabilità dei circuiti corticali, non sorprende che un’asimmetria trigeminale porti a una riduzione dell’arousal e della prestazione cognitiva.
1.5. Input trigeminale: vie anatomiche
Le informazioni trigeminali possono raggiungere la maggior parte delle strutture del Sistema Reticolare Attivatore Ascendente (ARAS), il sistema centrale che regola l'attività cerebrale durante il ciclo sonno-veglia (Moruzzi e Magoun, 1949). L'ARAS è un complesso molto eterogeneo, che include i neuroni glutammatergici della formazione reticolare (RF), i neuroni colinergici dei nuclei peduncolopontino e tegmentale laterodorsale (PPT / LTD), i neuroni noradrenergici del Locus Coeruleus (LC), i neuroni istaminergici nel nucleo tuberomammillare (TMN)
21 dell'ipotalamo posteriore, i neuroni peptidergici (oressinergici) dell'ipotalamo laterale, i neuroni dopaminergici del mesencefalo ed i neuroni serotoninergici dei nuclei del rafe (Jones, 2003; Saper et al., 2005).
Le fibre trigeminali primarie arrivano direttamente alla RF. I nuclei trigeminali distribuiscono, invece, fibre secondarie alla RF (Brodal, 1981; Shammah-Lagnado et al., 1987, 1992; Schmid et al., 2003) al sistema talamico diffuso (Krout et al., 2002) al LC (Cedarbaum and Aghajanian, 1978; Luo et al., 1991; Craig, 1992; Couto et al., 2006; Dauvergne et al., 2008) e ai neuroni colinergici del PPT/LDT (Semba and Fibiger, 1992). Le fibre secondarie trigeminali possono giungere al LC anche attraverso vie indirette che passano per il nucleo del tratto solitario (NTS), la RF (Zerari-Mailly et al., 2005; Schwarz and Luo, 2015), il nucleo paragigantocellulare (PGI) e il nucleo preposito ipoglosso (PH) (Aston-Jones et al., 1986; Lovick, 1986; Buisseret-Delmas et al., 1999). Le vie passanti per il PH ed il PGI potrebbero essere particolarmente efficaci nel modificare la scarica dei neuroni del LC, poiché esse terminano nella regione centrale del LC, dove si trovano i corpi cellulari dei neuroni (Aston-Jones et al., 1991).
Inoltre, le afferenze del Me5 raggiungono anche i neuroni istaminergici del TMN (Fujise et al., 1998; Sakata et al., 2003) ed i neuroni noradrenergici del LC (Cedarbaum and Aghajanian, 1978).
È stato proposto che i neuroni del Me5 e quelli del LC siano accoppiati elettrotonicamente (Matsuo et al., 2015) in quanto il tracciante “fluorogold”
22 applicato sul nervo periferico viene assorbito dai neuroni del Me5 ed in parte si ritrova anche nell’area del LC (Fujita et al., 2012).
1.6. Una via preferenziale per spiegare gli effetti trigeminali acuti sull’encefalo:
il Locus Coeruleus (LC)
Il LC è un nucleo pontino situato vicino alla giunzione pontomesencefalica ed il più grande gruppo di neuroni noradrenergici del sistema nervoso centrale.
Studi recenti suggeriscono che il LC possa rappresentare la struttura più importante nel mediare le influenze trigeminali acute sull’encefalo.
È noto infatti che, sia negli animali (Rajkowski et al., 1993, 1994) che nell'uomo (Murphy et al., 2014), l'attività del LC è strettamente legata al diametro pupillare, infatti le misurazioni di quest’ultimo vengono attualmente considerate come un indicatore dell'attività del LC (Silvetti et al., 2013; Hoffing and Seitz, 2015; Kihara et al., 2015; Einhäuser, 2016; Joshi et al., 2016; Reimer et al., 2016).
La correlazione tra il diametro pupillare e il LC dipende dal fatto che la contrazione del muscolo dilatatore dell'iride non può aumentare il diametro della pupilla a meno che il muscolo costrittore dell'iride non sia rilassato (Wilhelm et al., 2011) dall'inibizione dei neuroni parasimpatici pregangliari del nucleo di Edinger-Westphal, che sostengono la sua contrazione tonica. L’inibizione dei neuroni del nucleo di Edinger-Westphal è dovuta all’azione del LC che proietta a questi neuroni (Breen et al., 1983) e li inibisce con un meccanismo mediato da recettori
23 α2 (Szabadi e Bradshaw, 1996; Samuels and Szabadi, 2008). Quindi, i neuroni del LC devono aumentare la loro attività per consentire la dilatazione della pupilla. Le dimensioni della pupilla aumentano nello stato di arousal (Bradshaw, 1967; Bradley et al., 2008), covariano fortemente con le sue fluttuazioni (McGinley et al., 2015) ed il loro ulteriore aumento durante l’esecuzione di un compito è considerato come l'espressione di un'attivazione fasica del LC (Gabay et al., 2011).
È interessante notare che, in presenza di un’asimmetria nell'attività EMG dei muscoli masticatori durante il morso, questa è fortemente correlata ad una corrispondente asimmetria del diametro pupillare (anisocoria), con il diametro pupillare maggiore sul lato ipertonico (De Cicco et al, 2014, 2016). La relazione tra asimmetria trigeminale e pupillare sembra essere causale, poiché la correzione della prima riduce notevolmente anche la seconda (De Cicco et al., 2014, 2016). Inoltre, l'aumento della prestazione cognitiva indotta dalla masticazione è significativamente correlato all’aumento della midriasi indotta da un compito tattile, cioè all'aumento dell'attività fasica del LC (Tramonti Fantozzi et al., 2017). Tutti questi dati indicano un forte accoppiamento tra afferenze trigeminali e neuroni del LC.
Se questa ipotesi è corretta ci si dovrebbe aspettare che l'efficacia del riequilibrio dell’attività trigeminale nel migliorare le prestazioni cognitive sia significativamente correlata al corrispondente miglioramento della midriasi indotta dal compito tattile.
24 Inoltre, dovrebbero essere previste due ulteriori correlazioni fra variazioni nella prestazione cognitiva e modificazioni pupillari. Come abbiamo visto, l’attività del LC è rilevabile attraverso la misurazione del diametro pupillare ed un’anisocoria è indicativa di un’asimmetrica attivazione del sistema noradrenergico centrale, condizione questa che può portare ad uno squilibro nell’eccitabilità dei due emisferi. Se, come discusso precedentemente, uno squilibrio emisferico è dannoso per la prestazione cognitiva, le variazioni di prestazione prodotte dalle modificazioni occlusali dovrebbero essere negativamente correlate ai corrispondenti cambiamenti dell'anisocoria (un aumento dell’anisocoria dovrebbe corrispondere ad un peggioramento della prestazione e viceversa).
In secondo luogo, gli esperimenti condotti sugli animali indicano che, quando il soggetto è attento, una buona prestazione cognitiva è associata a un livello moderato di attività a riposo del LC, che va incontro ad un notevole incremento durante il compito cognitivo (risposta fasica) (Aston-Jones and Cohen, 2005): questa condizione comportamentale è stata indicata come "exploitation".
Invece, un alto livello di attività tonica del LC è unito ad un'attivazione fasica ridotta e porta ad un deterioramento della prestazione cognitiva (Aston-Jones and Cohen, 2005): questa condizione è indicata come "exploration", dal momento che comporta una continua oscillazione dell’attenzione tra diverse scelte comportamentali, senza la capacità di focalizzare l’attenzione su di un compito specifico. Questi dati sono stati confermati anche in ambito umano, utilizzando le registrazioni dei diametri pupillari invece del monitoraggio diretto dell'attività del
25 LC (McGinley et al, 2015). Quindi, se le variazioni nell’occlusione modificano la prestazione cognitiva attraverso il LC, possiamo aspettarci che i cambiamenti nelle prestazioni siano dipendenti dalle variazioni del diametro pupillare a riposo.
1.7. Il Locus Coeruleus e gli effetti trigeminali cronici sull’encefalo
Il rapporto tra sistema trigeminale e LC potrebbe essere alla base degli effetti trigeminali cronici sul cervello. Studi recenti hanno dimostrato che il LC è molto più che un importante regolatore dell’attività elettrica cerebrale, capace di promuovere l’arousal e la prestazione cognitiva. Innanzitutto, le fibre del LC hanno una chiara relazione con gli astrociti (Paspalas and Papadopoulos, 1996; Cohen et al., 1997) e, durante l'esercizio fisico, questa relazione è fondamentale per migliorare i livelli intracellulari di Ca2+ (Paukert et al., 2014), un processo correlato alla dilatazione dei vasi sanguigni (Koehler et al., 2009; Carmignoto and Gomez-Gonzalo, 2010; Girouard et al., 2010; Petzold and Murthy, 2011). Sebbene il problema sia ancora controverso, la stimolazione del LC sembra aumentare la perfusione cerebrale (Toussay et al., 2013).
Un'altra importante funzione del LC è quella di mantenere l'integrità delle giunzioni strette fra le cellule endoteliali, che sono alla base della barriera emato-encefalica (Harik and McGunigal, 1984; Kalinin et al., 2006), controllando così la composizione del liquido interstiziale nell’encefalo.
Il LC esercita anche importanti funzioni metaboliche, poiché la noradrenalina migliora il metabolismo del glucosio negli astrociti (Segal et al., 1980; Sorg and
26 Magistretti, 1991) e stimola gli enzimi mitocondriali (Hertz et al., 2010). Parallelamente alla stimolazione dei processi che producono energia, la noradrenalina stimola anche i processi che consumano energia, come l'assorbimento del glutammato (che influenza l'attività della rete) e l'attività della Na+/K+ ATPasi (Hertz, 2010). Queste azioni metaboliche della noradrenalina,
liberata nell’encefalo dalla stimolazione del LC, potrebbero modulare l'interazione fra il neurone e la glia. L’alterazione di questo rapporto può portare alla morte neuronale in aree critiche dell’encefalo, come l'ippocampo e il nucleo basale di Meynert (Hertz, 1989).
Inoltre, il LC induce la fagocitosi della placca β-amiloide da parte della microglia (Heneka et al., 2002; Kalinin et al., 2007; Pugh et al., 2007; Kong et al., 2010), mentre inibisce il rilascio di citochine e chemochine da parte di quest’ultima durante l’infiammazione cerebrale (Yao et al., 2015).
Queste azioni del LC, unitamente al fatto che i neuroni noradrenergici sono i primi colpiti dalla malattia, ha indotto a considerare la degenerazione del LC come l’evento iniziale che promuove le modificazioni patologiche osservate nella AD, nel morbo di Parkinson e nella sclerosi multipla (Feinstein et al., 2016).
Alla luce di queste considerazioni, si può ipotizzare che gli effetti cronici della riduzione delle informazioni trigeminali, osservati a livello cerebrale e ippocampale, dipendano dalla sofferenza/degenerazione che tale intervento induce a livello del LC.
27
1.8. Possibili influenze trofiche del trigemino sui neuroni del LC
L'azione del trigemino sul LC va oltre la semplice modulazione della sua attività. Le fibre muscolari ed i fusi del massetere sono un'importante fonte di BDNF e neurotrofina-3 (NT3), rispettivamente (Fan et al., 2000). Il tessuto muscolare, i denti e le vibrisse esprimono anche il fattore neurotrofico derivato dalla glia (GDNF) (Buj-Bello et al., 1995; Nosrat et al., 1996). Durante lo sviluppo, tutte queste neurotrofine migliorano la sopravvivenza dei neuroni propriocettivi del Me5 (Buj-Bello et al., 1995; Fan et al., 2000), mentre il GDNF protegge anche i neuroni sensoriali cutanei del ganglio trigeminale (Buj-Bello et al., 1995) e i motoneuroni del trigemino (Henderson et al., 1994). Queste neurotrofine svolgono un ruolo importante anche nello sviluppo e nella differenziazione dei neuroni del LC.
Infatti, la NT3 è essenziale per prevenire la morte dei neuroni del LC (Arenas and Persson, 1994), mentre il BDNF favorisce l'espressione degli enzimi di sintesi della noradrenalina, regolando la differenziazione dei neuroni del LC (Traver et al., 2006).
Infine, alti livelli di GDNF sono stati documentati nel LC durante lo sviluppo (Nosrat et al., 1996) e questa neurotrofina è necessaria per la sopravvivenza dei neuroni del LC che proiettano all’ippocampo (Quintero et al., 2004).
È possibile quindi che, negli adulti, un deterioramento dell'input afferente del trigemino riduca la disponibilità di neurotrofine per i neuroni noradrenergici del LC, rendendoli più inclini a processi neurodegenerativi, che si possono diffondere
28 alle strutture centrali che ricevono un'innervazione noradrenergica, cioè a tutto l’encefalo (Braak and Del Tredici, 2011; Del Tredici and Braak, 2013).
Il deterioramento dell’omeostasi cellulare nei neuroni del LC può facilmente propagarsi (Moore and O'Brien, 2015) da neurone a neurone e dai neuroni alla glia, attraverso le sinapsi elettriche che uniscono questi elementi (Alvarez-Maubecin et al., 2000; Heister et al., 2007).
La morte dei neuroni del LC comporterebbe una diminuzione degli enzimi di sintesi della noradrenalina nel tronco encefalico, quali la tirosina-idrossilasi e la dopamina-β-idrossilasi (DBH). L’induzione di questi enzimi dipende dall'attività neuronale (Ciaranello et al., 1974; Dreyfus et al., 1986).
Pertanto, una condizione di asimmetria trigeminale cronica producesse variazioni permanenti nell’attività dei neuroni del LC, queste potrebbero alterare l’espressione degli enzimi di sintesi della noradrenalina. Tali alterazioni sarebbero potenziate se esse si accompagnassero a fenomeni neurodegenerativi all’interno del LC.
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2. Scopo dello studio
Lo scopo di questa indagine era di studiare gli effetti acuti e cronici dell'asimmetria trigeminale sull'attività noradrenergica centrale. Con questo obiettivo sono stati condotti due studi paralleli. Il primo (A), condotto nell’uomo, è stato effettuato, in una popolazione di soggetti normali con un’asimmetria dell’attività EMG del massetere durante il serramento delle arcate dentali. In questa popolazione sono state osservate le modificazioni della prestazione cognitiva indotte dalla correzione di questa asimmetria ed è stato verificato se esse fossero correlate con i cambiamenti paralleli indotti nel diametro medio pupillare a riposo, nella differenza del diametro pupillare tra i due lati (sinistra-destra) e nella midriasi indotta da un compito tattile. Gli ultimi tre parametri possono essere considerati rispettivamente come indicatori dell'attività dei neuroni del LC a riposo, del suo squilibrio tra i due lati e dell’aumento dell’attività del LC durante l'esecuzione di un compito cognitivo.
Nel secondo studio (B), condotto nel ratto, abbiamo prodotto una malocclusione cronica rimuovendo unilateralmente le cuspidi dei denti molari e abbiamo studiato se la procedura inducesse cambiamenti asimmetrici a lungo termine nella trascrizione dell'mRNA per la DBH, l’enzima che sintetizza la noradrenalina, marcatore specifico dei neuroni noradrenergici.
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3. Materiali e metodi
• Studio A
3.1. Soggetti
Gli esperimenti sono stati condotti su 30 soggetti destrimani (15 maschi e 15 femmine), di età compresa tra i 18 e i 56 anni. Nessuno di essi era affetto da dolore ai muscoli masticatori o del collo, né da malattie metaboliche, endocrine, neurologiche o psichiatriche. Tutti avevano una dentatura completa e non mostravano segni rilevanti di disfunzione dell’articolazione temporo-mandibolare (ATM).
Tutti i partecipanti hanno firmato un consenso informato approvato dalla Commissione Etica dell’Università di Pisa.
3.2. Valutazioni preliminari
Come si può osservare nella Fig.3, in una sessione iniziale è stata registrata l’attività EMG dei muscoli masseteri durante il morso. In questa condizione, alcuni soggetti mostravano una maggiore attività EMG su di un lato che chiameremo lato ipertonico, rispetto all’altro (lato ipotonico). Subito dopo i soggetti ritornavano alla normale posizione di semi-apertura delle arcate dentali (posizione che chiameremo Apertura) e venivano sottoposti alle seguenti misurazioni su entrambi i lati:
1. diametro pupillare a riposo;
31 Questi dati venivano utilizzati per valutare:
3. la differenza tra il diametro pupillare durante il compito tattile ed il diametro pupillare a riposo (midriasi indotta dal compito);
4. la differenza dei diametri pupillari tra i due occhi (anisocoria), sia a riposo che durante il compito tattile.
Le valutazioni da 1 a 4 richiedevano complessivamente 15 minuti.
La prestazione cognitiva dei soggetti veniva valutata attraverso l’esecuzione del test delle matrici numeriche di Spinnler e Tognoni (Spinnler e Tognoni, 1987); in questo test venivano mostrate ai soggetti tre matrici, ciascuna delle quali era
Figura 3 Diagramma della procedura sperimentale, articolata in tre sessione successive. La sessione 2 è stata eseguita due volte: in assenza di bite (BITE OFF) e con il bite posto sull’arcata inferiore (BITE ON). Le registrazioni del diametro pupillare venivano eseguite sia a riposo che durante l’esecuzione di un compito tattile. Vedi testo per ulteriori spiegazioni.
32 costituita da 10 righe e 10 colonne. I soggetti dovevano sottolineare con una matita tutti i numeri uguali a quelli stampati in cima alla matrice (target: “5” nella prima, “6-8” nella seconda, “1-4-9” nella terza); essi erano invitati a trovare il numero maggiore di target possibile, scansionando ordinatamente ogni riga di ogni matrice, dalla prima alla terza, nel tempo di 15 secondi.
I parametri valutati in questo test erano:
5. Indice di performance (PI), calcolato come numero di target trovati in 15 secondi;
6. Frequenza di scansione (SF), calcolata come numeri totali (sia target che non
target) scansionati in 15 secondi;
7. Frequenza di errore (EF), calcolata come errori totali commessi (numeri target non trovati + numeri non target erroneamente sottolineati) in 15 secondi.
Per minimizzare i processi di apprendimento associati alla ripetizione del compito, le matrici, presentate in sessioni successive (vedi Fig.1), presentavano i target in posizioni differenti.
Tutti i parametri (da 1 a 7) sono stati valutati almeno tre volte, ogni 2-3 giorni, per accertarne la stabilità nel tempo.
Venti dei 30 soggetti iniziali sono stati selezionati per ulteriori indagini in quanto mostravano un’asimmetria dell’attività EMG maggiore del 24% (valore ottenuto dividendo la differenza sinistra-destra per la media sinistra-destra).
Dieci-15 giorni dopo la sessione iniziale, veniva eseguita una nuova sessione (1, vedi Fig.3), in cui i 20 soggetti asimmetrici sono stati sottoposti ad una
33 stimolazione transcutanea bilaterale della branca motoria del trigemino (Noaham and Kumbang, 2008) in modo tale da stimolare gli assoni motori (Gomez and Christensen, 1991). La procedura portava ad un abbassamento della mandibola e in questa nuova posizione veniva ottenuta un’impronta dentale con un materiale auto-indurente. La nuova posizione ottenuta in queste condizioni è in genere associata ad un corretto rapporto tra le arcate (occlusione).
A questo punto, venivano nuovamente rilevati i valori dell’attività EMG dei muscoli masseteri di sinistra e di destra durante il morso effettuato con l’impronta tra le arcate. Il posizionamento dell’impronta portava ad una riduzione dell’asimmetria EMG precedentemente osservata. Questa impronta dentale è stata utilizzata per realizzare un bite (Dao et al., 1994) che è stato poi consegnato ai soggetti 3-5 giorni dopo la sessione 1. I soggetti hanno indossato il bite continuamente (eccetto durante il sonno) per almeno 7 giorni, prima di essere sottoposti alla sessione sperimentale finale (sessione 2).
La sessione 2 iniziava ripetendo le valutazioni iniziali da 1 a 4, con la mandibola nella sua naturale posizione, ad arcate semi-aperte (Apertura1 e senza il bite in bocca, condizione che chiameremo Bite OFF). Tutte le valutazioni venivano ripetute con le arcate dentali a contatto (Contatto) e poi un’altra volta nella posizione di apertura (Apertura2). A questo punto i soggetti dovevano attendere circa un’ora (vedi Fig.1) prima di ripetere l’intera sequenza con il bite (condizione che chiameremo Bite ON).
34
3.3. Stimolazione trigeminale
La stimolazione bipolare delle branche mandibolari del trigemino è stata eseguita con due coppie di elettrodi (superficie di 1600mm2) posizionati sull’incisura
sigmoidea di entrambi i lati in modo da produrre la contrazione bilaterale dei masseteri e la chiusura della mandibola. Altre due coppie di elettrodi venivano posizionate bilateralmente sulla regione sottomentoniera, in modo da attivare i muscoli depressori della mandibola. L’attivazione dei muscoli elevatori e depressori è stata eseguita simultaneamente con due stimolatori I.A.C.E.R indipendenti (Martellago, Venezia, Italia) che inviavano impulsi elettrici (0,54msec, 21-25mA) bifasici (corrente catodica/anodica). L’intensità della corrente a destra e a sinistra è stata regolata in modo da ottenere una risposta EMG simmetrica su entrambi i lati. La frequenza della stimolazione corrispondeva a 0,618Hz e a 40Hz, per il massetere ed i muscoli sottomentonieri, rispettivamente. In questo modo il massetere si contraeva e si rilassava, mentre i muscoli depressori erano attivati tonicamente. Questi stimoli generavano dei movimenti mandibolari di piccola ampiezza (1mm).
3.4. Compito tattile
Il compito tattile veniva eseguito utilizzando il Tangram, un puzzle costituito da sette tavolette con diverse forme geometriche: due triangoli rettangoli grandi, uno medio e due piccoli, un quadrato ed un parallelogramma. L’operatore rimuoveva dal puzzle il pezzo a forma di parallelogramma, riponendolo nella mano destra del
35 soggetto; la testa del soggetto era bloccata dal dispositivo utilizzato per monitorare il diametro pupillare, così da impedire il controllo visivo. Il soggetto doveva rimettere il pezzo del puzzle al suo posto originario.
La misurazione del diametro pupillare veniva eseguita quando il soggetto iniziava l’esplorazione della superficie del puzzle.
3.5. Acquisizione dei dati
Il diametro pupillare veniva misurato ad una illuminazione artificiale costante di 40 lux (condizione fotopica) fornita da una lampada alogena (luce bianca) appartenente allo stesso strumento utilizzato per la registrazione, un pupillografo-topografo corneale (MODI’ 02, con supporto mentoniero, CSO, Firenze, Italia). Questo strumento, dotato di una camera con sensore CCD1/3” (distanza di lavoro: 56 mm), consentiva di monitorare l’immagine dell’iride con un tempo di acquisizione di 33 msec.
I valori delle misurazioni eseguite su entrambi gli occhi venivano immediatamente visualizzati sullo schermo del computer e salvati su disco assieme all’immagine dell’iride per le analisi successive.
L’attività EMG del massetere veniva registrata tramite degli elettrodi Duotrode con superficie in Ag/AgCl (distanza interelettrodo 19,5 mm, Myotronics, Seattle, WA, USA). Maggiori dettagli sul posizionamento degli elettrodi sono stati forniti in un precedente studio (De Cicco et al., 2014).
36 L’attività EMG è stata campionata a 720 Hz dal sistema Myotronics K6-I, utilizzando un filtro high pass con una frequenza di cutoff di 15 Hz ed un filtro
notch di 50 Hz; il segnale generato durante il morso veniva rettificato e mostrato
sul monitor dello strumento, insieme al suo valore medio.
3.6. Analisi statistica
Gli effetti del bite sull’attività EMG durante il morso sono stati valutati mediante un’ANOVA a misure ripetute con 2 Condizioni (Bite ON, Bite OFF) X 2 Lati (ipertonico, ipotonico). Il fattore Lato non è stato, invece, utilizzato per verificare le modificazioni indotte dal bite nell’asimmetria dell’attività EMG, calcolata come differenza fra lato ipertonico e lato ipotonico, divisa per la corrispondente media. Gli effetti del contatto tra le arcate dentali e del bite sul diametro pupillare (a riposo e durante il compito tattile), e sulla midriasi indotta dal compito tattile sono stati valutati da un’ANOVA a misure ripetute con 2 Condizioni (Bite ON, Bite OFF) X 3 Posizioni (Apertura1, Contatto, Apertura2) X 2 Lati (ipertonico, ipotonico). Per analizzare, invece, i cambiamenti nelle differenze del diametro pupillare a riposo e durante il compito tattile, così come le variabili relative alla prestazione cognitiva è stata utilizzata un’ANOVA a misure ripetute con 2 Condizioni X 3 Posizioni.
Il genere non è stato utilizzato come fattore tra soggetti, in quanto le dimensioni dei gruppi di genere erano piccole e sbilanciate (13 femmine e 7 maschi); comunque
37 sono state effettuate analisi separate per i due gruppi, in modo tale da verificare se maschi e femmine si comportavano allo stesso modo.
Quando necessario, il valore di significatività dell’ANOVA è stato modificato applicando la correzione ɛ di Greenhause-Geisser.
Le correlazioni tra le variabili sono state valutate mediante un’analisi di regressione lineare. Il livello di significatività è stato fissato a p<0,05. Tutta l’analisi statistica è stata eseguita con il software SPSS (IBM).
• Studio B
3.7. Procedura sperimentale
Gli esperimenti sono stati condotti su 12 ratti Wistar di età 13 mesi (forniti da ENVIGO RMS, Udine, Italia), stabulati singolarmente ad una temperatura di 25 ± 1°C e sottoposti ad un ciclo circadiano artificiale luce-buio (12 ore di luce/ 12 ore di buio). Ad ogni ratto è stato consentito libero accesso a cibo ed acqua. La stabulazione degli animali e il loro trattamento è avvenuto in ottemperanza della normativa italiana ed europea sulla sperimentazione animale.
Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico dell’Univerisità di Pisa e dal Ministero della Salute.
Gli animali sono stati divisi in due gruppi: uno sperimentale in cui è stata indotta una malocclusione unilaterale e uno di controllo, non trattato. La malocclusione è stata ottenuta attraverso la rimozione delle cuspidi dei denti molari sul lato sinistro, praticata con un micromotore da laboratorio odontoiatrico Ario35 (Zhermack,
38 Badia Polesine, RO, Italia; giri/minuto 0-20000, utilizzati 8000). Nelle due settimane successive all’intervento gli animali sono stati controllati e pesati quotidianamente, per verificare che la malocclusione non interferisse con la normale alimentazione.
Dopo un periodo di osservazione di 75 giorni, gli animali sono stati sacrificati. L’encefalo è stato prelevato, dissezionato nelle varie aree di interesse, separando il lato sinistro da quello destro, e conservato in RNAlater® (QIAGEN, Milano, Italia), reagente di stoccaggio, acquoso e non tossico, che permea i tessuti, stabilizzando e proteggendo l’RNA.
3.8. Estrazione dell’RNA
Per estrarre l’RNA dal tronco encefalico è stato utilizzato l’RNeasy® Mini kit (Cat No./ID: 74106, QIAGEN) ed è stato seguito il protocollo con esso fornito.
Successivamente, è stata eseguita una quantificazione della concentrazione di RNA estratto, mediante il fluorometro Qubit® 2.0 (Invitrogen, California, USA).
3.9. RT-PCR quantitativa
Per quantificare il livello di espressione dell’mRNA specifico per il gene target è stata utilizzata la tecnica della RT-PCR quantitativa che combina retrotrascrizione e PCR quantitativa (qPCR).
39
3.10. Retrotrascrizione
La retrotrascrizione consiste nella sintesi DNA complementare (cDNA) a partire dall’RNA estratto, grazie all’utilizzo della trascrittasi inversa, una DNA polimerasi in grado di catalizzare questa particolare reazione utilizzando come filamento stampo una molecola di RNA. Il vantaggio di utilizzare il cDNA risiede nel fatto che è molto più stabile e meno sensibile ai processi di degradazione rispetto all’RNA.
Per effettuare la retrotrascrizione è stato utilizzato il QuantiTect Reverse Transcription Kit (Cat No./ID: 205311, QIAGEN) ed è stato seguito il protocollo con esso fornito.
3.11. qPCR
Una volta ottenuti i cDNA, è stata eseguita la qPCR, una tecnica che permette di amplificare e quantificare simultaneamente il DNA. Il segnale che viene quantificato è l’intensità della fluorescenza emessa da fluorofori, aggiunti alla miscela.
In questo studio è stato utilizzato il QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Cat No./ID: 204145, QIAGEN) che contiene la HotStarTaq DNA Polimerasi e come fluoroforo il SYBR Green che assorbe luce blu ad una lunghezza d’onda di 488 nm ed emette luce verde a una lunghezza d’onda di 522 nm.
40 I geni amplificati erano la DBH (dopamina-β-idrossilasi), gene d’interesse dello studio, e il GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi), utilizzato come gene
housekeeping, in quanto costitutivamente espresso.
Le sequenze dei primers utilizzati sono state ottenute dalla letteratura (Li et al., 2007; Julian et al., 2014) e sono riportati nella tavola I.
Gene Primers Tm Lunghezza del prodotto (bp) GLICERALDEIDE-3-FOSFATO DEIDROGENASI (GAPDH) Forward CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA 61, 28°C 118 Reverse GGCATGGACTGTGGTCATGA 60, 04°C DOPAMINA B IDROSSILASI (DβH) Forward CACAATCCACGGAATATACAAGG 57, 33°C 129 Reverse GGGTCGGAGACTAGCTGTGTA 60, 68°C
Tavola I Primers forward e reverse dei geni target amplificati in questo studio.
3.12. Acquisizione dei dati e analisi statistica
L’intensità del segnale di fluorescenza, emesso durante la PCR, è proporzionale alla quantità di DNA amplificato. Il segnale fluorescente viene rilevato da un sistema ottico e memorizzato da un computer. I valori di fluorescenza vengono misurati ad ogni ciclo e rappresentano la quantità di prodotto amplificato fino a quel momento. La quantificazione si basa sul concetto di ciclo soglia (Threshold Cycle, CT), ovvero il numero di cicli necessari affinchè il segnale di fluorescenza raggiunga la cosidetta threshold line, una linea arbitraria tracciata nella fase lineare
41 di amplificazione. La soglia viene definita come il valore per cui la fluorescenza comincia a crescere esponenzialmente in tutti i campioni.
Il valore di CT del gene della DBH (gene target) di ogni campione è stato espresso come differenza rispetto al CT ottenuto per il gene della GAPDH (gene housekeeping), ottenendo così un parametro indicato come ΔCT. Questi valori sono stati calcolati per il lato destro e per il lato sinistro, sia per il gruppo sperimentale che per quello di controllo. Dai valori di ΔCT si ottiene una stima dell’espressione relativa del gene target rispetto all’housekeeping, utilizzando la formula E-ΔCT, dove
E rappresenta l’efficienza di reazione. Il valore di E è stato fissato uguale a 2. I valori di E-ΔCT sono stati sottoposti a due valutazioni statistiche:
1) nella prima valutazione è stato verificato se esistevano differenze significative nell’espressione relativa della DBH tra il lato destro e quello sinistro, sia all’interno del gruppo sperimentale che in quello di controllo; il confronto è stato eseguito mediante un T-test per dati appaiati;
2) nella seconda valutazione è stata confrontata l’espressione relativa della DBH nel gruppo sperimentale con quella osservata nel gruppo di controllo, sia sul lato destro, sia sul lato sinistro; questo confronto è stato eseguito mediante un T-test per dati indipendenti.
Sia nella prima che nella seconda analisi sono state calcolate le differenze tra il ΔCT dei campioni “test” (1: lato sinistro, 2: gruppo sperimentale) e quello dei campioni di “riferimento” (1: lato destro, 2: gruppo di controllo): questo parametro prende il nome di ΔΔCT e la sua trasformazione, secondo l’espressione E-ΔΔCT,
42 corrisponde alla “fold expression”, parametro che quantifica la variazione dell’espressione della DBH dei campioni test rispetto a quelli di riferimento. Nell’analisi 1 è stato considerato campione test il lato sinistro, mentre il lato destro (coi denti sempre integri) è stato preso come riferimento e il ΔΔCT è stato calcolato sia nel gruppo sperimentale che in quello di controllo. Nell’analisi 2 il campione test era il gruppo sottoposto a malocclusione e quello di riferimento il gruppo di controllo (coi denti integri su ambedue i lati) e il ΔΔCT è stato calcolato sia a sinistra che a destra.
L’analisi delle differenze di espressione della DBH fra i due gruppi su ogni lato e fra i singoli lati di ogni gruppo è stata anche valutata con il software Rest 2009 (fornito con Rotor-Gene® Q, QIAGEN) che implementa una procedura di bootstrap. Questa procedura genera un numero (n) assai elevato di stime della fold expression, scegliendo per n volte in maniera casuale fra i valori di ΔCT osservati nei due gruppi confrontati, calcolando contemporaneamente la significatività delle differenze nell’espressione della DBH fra campioni test e campioni di riferimento.
43
4. Risultati
4.1. Caratteristiche della popolazione studiata: asimmetrie EMG e pupillari,
diametri pupillari a riposo e durante il compito tattile, parametri
caratterizzanti la prestazione cognitiva
Nella popolazione analizzata, molti soggetti (n=20) mostravano un’attività asimmetrica EMG dei masseteri durante il morso, superiore al 24% della media dei due lati. La differenza di attività fra sinistra e destra variava da -75 a 100 μV, corrispondenti al -51,9% e al 67,6% del valore medio dei due lati. Si poteva anche osservare, con la mandibola semiaperta e i muscoli masticatori rilassati, un’asimmetria del diametro pupillare (anisocoria). Quando i soggetti non erano impegnati in alcuna attività, la differenza fra i diametri pupillari di sinistra e destra variava da -0,84 a 0,67 mm, cioè dal -23,5 a 17,4% del valore medio dei diametri pupillari di destra e di sinistra. L’anisocoria persisteva anche quando il soggetto era impegnato in un compito tattile (da -0,58 a 0,77 mm, cioè dal -10,3% al 16,8% del valore medio). Come si può osservare nella Fig.4, l’anisocoria osservata a riposo era significativamente correlata con quella durante il compito tattile (r=0,679; p<0,0005; Y=0,567x+0,015).
44 È interessante osservare che il diametro pupillare, valutato con la mandibola semiaperta e i masseteri rilassati, era in genere maggiore sul lato che mostrava l’attività EMG più elevata durante il morso. Esisteva pertanto una correlazione significativa tra l’anisocoria e l’asimmetria nell’attività EMG dei masseteri durante il morso.
Tale correlazione è mostrata in Fig.5A per le asimmetrie pupillari a riposo (r=0,827; p<0,0005; Y=0,006x-0,088) e in Fig.5B per quelle osservate durante il compito tattile (r=0,539; p<0,002; Y=0,004x+0,007).
Figura 4 Relazione fra l’anisocoria osservata a riposo e durante il compito tattile. La linea tratteggiata rappresenta punti di ugual valore. L’anisocoria è calcolata come differenza fra i diametri pupillari di sinistra e di destra. Punti neri e quadrati bianchi rappresentano rispettivamente le femmine ed i maschi.
45 La Tavola II illustra i valori medi dell’attività EMG durante il morso, dei diametri pupillari osservati a riposo e durante il compito tattile, nonché la loro differenza (che corrisponde alla midriasi indotta dal compito tattile). Tali medie sono state calcolate separatamente per i lati di maggior e minor attività EMG durante il morso (indicati rispettivamente come lato ipertonico e ipotonico). La Tavola II mostra pure le medie delle differenze nei diametri pupillari fra lato ipertonico ed ipotonico, nonché le medie dei diversi parametri caratterizzanti la prestazione nel test delle matrici di Spinnler e Tognoni. È interessante osservare che, mentre i diametri pupillari (a riposo e durante il compito tattile) erano maggiori sul lato ipertonico, la midriasi indotta dal compito tattile era invece maggiore su quello ipotonico.
Figura 5 Relazione fra anisocoria ed asimmetria EMG. A. Relazione fra le due variabili a riposo B. Relazione fra le
due variabili durante il compito tattile. Sia l’anisocoria che l’asimmetria EMG sono calcolate come differenza fra i
valori di sinistra e quelli di destra. Le linee tratteggiate corrispondono a quelle delle equazioni di regressione
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A B
LATO Ipertonico Ipotonico
Differenza Ipertonico-Ipotonico Diametro pupillare (a riposo) 4,01±0,78 3,72±0,76 0,284±0,252 Indice di Performance 1,74±0,502 Diametro pupillare (compito tattile) 5,35±0,93 5,19±0,97 0,163±0,305 Frequenza di Scansione 12,95±2,12 Midriasi 1,35±0,36 1,47±0,43 Frequenza di Errore 0,30±0,31
Tavola II. A. Valori di media±deviazione standard dei diametri delle singole pupille (sul lato ipertonico e ipotonico)
osservati a riposo e durante il compito tattile e della loro differenza che corrisponde alla midriasi indotta dal
compito tattile. B. Valori di media±deviazione standard dei parametri caratterizzanti la prestazione.
4.2. Correlazioni tra l’età, il diametro pupillare, l’attività EMG e la prestazione
Nella popolazione studiata né l’anisocoria, né l’asimmetria EMG durante il morso erano correlati con l’età. Abbiamo invece osservato una correlazione per il diametro delle singole pupille che con il passare degli anni tendeva a ridursi sempre di più. Come mostrato nella Fig.6, questa correlazione poteva essere osservata sia a riposo (r=0,647; p<0,0005; Y=-0,040x+5,335) sia durante l’esecuzione del compito tattile (r=0,609; p<0,0005; Y=-0,046x+6,594).
47 Non è stata invece osservata alcuna dipendenza dall’età per la midriasi associata all’esecuzione del compito tattile.
Anche la prestazione dei soggetti, almeno relativamente alla velocità di esecuzione, diminuiva con l’età. Infatti, sia l’Indice di Performance (PI; Fig.7A) che la Frequenza di Scansione (FS: Fig.7B) risultavano negativamente correlate con quest’ultima (PI: r=0,444; p<0,014; 0,018x+2,386; FS: r=0,547; p<0,002; Y=-0,092x+16,307).
Figura 6 Relazione fra il diametro delle singole pupille e l’età. Sia in A che in B le linee tratteggiate rappresentano le equazioni di regressione lineare indicate nel testo.Punti neri e quadrati bianchi rappresentano rispettivamente le femmine ed i maschi.
48 Non vi era invece correlazione significativa fra l’età e la Frequenza di Errore, parametro che riflette la precisione nell’esecuzione del compito.
La dipendenza dall’età dei diametri pupillari e dei parametri di prestazione era sostanzialmente simile nei maschi e nelle femmine, anche se, nelle femmine, il coefficiente di correlazione del PI non raggiungeva il livello di significatività statistica (p<0,142).
4.3. Effetti della correzione occlusale sulle asimmetrie dell’attività EMG
Questa analisi è stata condotta su 20 dei 30 soggetti studiati. Tutti mostravano un’asimmetria dell’attività EMG, registrata durante il morso, superiore al 24%. Come descritto nei Metodi, la correzione di tale asimmetria avveniva mediante
Figura 7 Relazione fra i parametri caratterizzanti la prestazione nel test di Spinnler-Tognoni e l’età. A. Indice di Performance (PI), corrispondente alla frequenza di ritrovamento dei target. B. Frequenza di Scansione dei numeri delle matrici. Sia in A che in B le linee tratteggiate rappresentano le equazioni delle rette di regressione indicate nel testo. Punti neri e quadrati bianchi rappresentano rispettivamente le femmine ed i maschi.
49 l’uso dell’impronta dentale rilevata dopo la procedura di elettrostimolazione; quest’impronta fungeva da correttore occlusale provvisorio (bite).
Il posizionamento di tale impronta fra le arcate, giungeva quasi ad annullare l’asimmetria EMG osservabile durante il morso (T-test, p<0,0005, vedi Tavola III). Come dimostrato da un’ANOVA a misure ripetute con 2 Condizioni (Bite ON, Bite OFF) X 2 Lati (ipertonico, ipotonico), che metteva in evidenza un significativo effetto Condizione X Lato [F(1,18)=112,32, p<0,0005], la scomparsa dell’asimmetria era dovuta ad un aumento dell’attività sul lato ipotonico e ad una riduzione dell’attività sul lato ipertonico, ambedue significative.
Bite OFF Bite OFF
vs Bite ON Bite ON Variabile
Asimmetria EMG 54,10±18,48 p<0,0005 6,25±6,14
EMG lato ipertonico 159,4±54,06 p<0,0005 131,6±41,03 EMG lato ipertonico vs
EMG lato ipotonico p<0,0005 p<0,0005 EMG lato ipotonico 105,30±44,53 p<0,004 125,35±39,87
Tavola III. Valori di media±deviazione standard dell’attività EMG, registrata durante il morso sia sul lato
ipertonico sia su quello ipotonico, nonché della relativa differenza (asimmetria EMG). Bite ON: occlusione corretta
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4.4. Effetti della correzione occlusale sulle asimmetrie pupillari
La correzione occlusale non modificava solo le asimmetrie EMG durante il morso, ma anche quelle pupillari. Come illustrato in Fig.8, il passaggio dalla posizione mandibolare semiaperta (Apertura1) a quella di contatto produceva effetti diversi nelle due condizioni occlusali (Bite OFF, Bite ON).
Infatti, l’anisocoria aumentava quando le arcate entravano in contatto senza bite (Fig.8A), mentre diminuiva quando il bite era stato precedentemente posizionato (Fig.8B). In entrambi i casi l’anisocoria in posizione di contatto era significativamente correlata a quella in apertura (Bite OFF: r=0,94; p<0,0005; Y=1,315x+0,007; Bite ON: r=0,89; p<0,0005; Y=0,292x-0,009).
Figura 8 Relazione fra l’anisocoria (sinistra – destra) a riposo in posizione di apertura e con i denti a contatto. Sia in A che in B le linee continue rappresentano valori uguali in ascissa ed ordinata, mentre quelle tratteggiate corrispondono alle equazioni di regressione lineare.
