Effetti dell’esperienza visiva sulla regolazione della trascrizione genica in corteccia visiva durante il periodo critico e nell’adulto

IV. DISCUSSIONE

La base di partenza degli esperimenti descritti in questa tesi è l’osservazione che l’esperienza visiva causa, durante il periodo critico, sia l’attivazione di ERK sia l’espressione genica mediata dal CREB, e che questi due effetti sono collegati in quanto il blocco farmacologico di ERK previene completamente l’attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB da parte dell’esperienza visiva (Cancedda et al., 2003). In questo studio si sono analizzati i bersagli molecolari a valle di ERK, attivati dall’esperienza visiva, che potrebbero mediare l’azione di ERK su CREB, e si è esaminato come l’esperienza visiva possa influire sulla regolazione dell’espressione genica agendo, oltre che sul CREB, anche tramite modificazioni post-traduzionali dell’impacchettamento della cromatina. Un altro importante aspetto del nostro studio è l’analisi delle differenze di azione dell’esperienza visiva sulla via di trasduzione di ERK e sulla trascrizione genica tra animali di età compresa nel periodo critico e animali adulti.

I risultati ottenuti dimostrano che l’esperienza visiva causa l’attivazione di ERK, di MSK ma non di RSK, sia durante il periodo critico che oltre la sua fine. Due risultati suggeriscono che l’attivazione di MSK sia a carico a di ERK: i) l’attivazione di MSK da parte della stimolazione visiva è interamente bloccata dal trattamento con un bloccante di ERK, ii) esperimenti di doppia marcatura per pERK e pMSK mostrano che l’attivazione avviene negli stessi neuroni. La stimolazione visiva durante il periodo critico è anche in grado di attivare l’espressione genica mediata dal CREB, sorprendentemente tale azione è fortemente attenuata in età adulta. Indagando sui meccanismi di regolazione genica durante e dopo il periodo critico, si evidenzia anche che l’esperienza visiva durante il periodo critico causa un aumento della fosforilazione dell’istone H3 con un andamento duraturo nel tempo. Risultati non ancora conclusivi suggeriscono che anche l’acetilazione dell’istone H3 possa essere attivata dalla stimolazione visiva. Le modificazioni post-traduzionali, quali la fosforilazione o l’acetilazione degli istoni destabilizzano l’interazione elettrostatica tra istone e

DNA, rendendo la cromatina in una conformazione accessibile ai fattori di trascrizione come CREB. Così come l’attivazione del MSK, anche la fosforilazione dell’istone H3 è bloccata dall’inibizione farmacologica di ERK e avviene negli stessi neuroni in cui si ritrova la marcatura per ERK fosforilato. L’analisi della fosforilazione dell’H3 nell’adulto ha dimostrato una differenza rispetto al piccolo: nell’adulto la stimolazione visiva causa la fosforilazione dell’istone H3 con un andamento di tipo transiente. Pertanto nell’adulto la stimolazione visiva causa un riarrangiamento della cromatina favorevole per la trascrizione genica mediata da CREB per una finestra temporale più breve rispetto al giovane.

IV.1 Le CREB chinasi a confronto: il ruolo dell’esperienza visiva

per la loro attivazione

Come abbiamo visto nell’introduzione, è molto discusso quale possa essere la CREB chinasi a valle di ERK e se ERK utilizzi lo stesso meccanismo in tutti i tipi cellulari. Inizialmente, RSK2 era considerata come la CREB chinasi in base alla sua purificazione biochimica nelle cellule PC12 (Xing et al., 1996) stimolate dal NGF e alle osservazioni sulle linee cellulari dei pazienti affetti dalla sindrome di Coffin Lowry, in cui vi è una mutazione che inattiva RSK2 e in cui la fosforilazione di CREB indotta dall’EGF è danneggiata (De Cesare et al., 1998). Tuttavia, è stato trovato che, nelle cellule derivate da topi mutanti con delezione del gene RSK o da pazienti affetti dalla malattia di Coffin Lowry, la stimolazione con fattori di crescita causava una normale fosforilazione di CREB (Bruning et al., 2000). Pertanto l’ipotesi di RSK come CREB chinasi è stata messa in discussione e viene ipotizzato che un'altra chinasi, MSK, possa essere in realtà più importante. MSK media la fosforilazione di CREB indotta da stress in fibroblasti (Wiggin et al., 2002). Inoltre, un recente lavoro del gruppo di Impey (Arthur et al., 2004), ha mostrato che la stimolazione di neuroni corticali con neurotrofine attiva la fosforilazione di CREB in modo dipendente da ERK. Questo lavoro evidenzia che MSK potrebbe avere il ruolo di CREB chinasi ERK-dipendente. Infatti, se tali neuroni corticali sono transfettati con dei vettori per degli RNA di

tipo inibitorio (siRNA) per RSK1-2, pur attenuandosi l’attività di RSK, la fosforilazione di CREB e la trascrizione regolata dal CREB non vengono alterate. Invece, nei topi knock-out di MSK1-2, seppure la fosforilazione di ERK1-2 e RSK1-2 sia inalterata, la fosforilazione di CREB indotta dal BDNF era completamente abolita. Inoltre, in seguito a induzione con il BDNF, l’espressione di un dominante negativo di MSK1 inibisce la fosforilazione di CREB. Questi dati suggeriscono che MSK1 sia nei neuroni corticali la CREB chinasi regolata dalle neurotrofine.

Il nostro studio ha rilevato che l’esperienza visiva causa l’attivazione di MSK1 in vivo, in accordo con i lavori del gruppo di Impey (Arthur et al., 2004) sui neuroni corticali in coltura. Nel nostro lavoro abbiamo anche analizzato il possibile coinvolgimento dell’attivazione di RSK. Abbiamo utilizzato lo stesso anticorpo usato in un recente studio che ha mostrato una riduzione dell’attivazione di RSK nella corteccia visiva contralaterale all’occhio deprivato in topi deprivati monocularmente durante il periodo critico (Suzuki et al., 2004). Abbiamo osservato che nelle fettine degli stessi animali in cui avevamo misurato un evidente fosforilazione del MSK, non si aveva alcuna attivazione del RSK ne nelle conte delle cellule positive ne nella misura dell’intensità media di fluorescenza. E’ interessante notare che la deprivazione visiva riduce l’attivazione di una CREB chinasi come RSK (Suzuki et al., 2004), mentre i nostri dati dimostrano che la stimolazione visiva attiva un’altra CREB chinasi, la chinasi MSK. Tuttavia occorre ricordare che la riduzione della fosforilazione del RSK indotta dalla deprivazione monoculare non correla né con variazioni della fosforilazione del CREB, né con variazioni dell’espressione genica mediata dal CREB (Suzuki et al., 2004). Nei nostri risultati l’esposizione alla luce durante il periodo critico causa un evidente attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB correlabile con l’attivazione del MSK.

Lo stimolo visivo attiva la fosforilazione dell’istone H3 attraverso processi che probabilmente coinvolgono l’azione di ERK e MSK. La serina 10 dell’istone H3 è un bersaglio della chinasi MSK e il blocco di ERK blocca sia MSK che la fosforilazione di H3 su questo sito. Inoltre ERK fosforilato colocalizza sia con MSK che con ERK. Purtroppo gli anticorpi specifici da noi utilizzati non hanno permesso di eseguire una doppia marcatura tra istone H3 fosforilato e MSK fosforilato dato che questi anticorpi sono stati prodotti entrambi nel topo, comunque le evidenze presentate sembrano convergere su un modello di attivazione in cui l’attivazione di ERK causa l’attivazione di MSK il quale va a fosforilare la serina 10 di H3.

Nei neuroni ippocampali, Crosio e collaboratori (Crosio et al., 2003) hanno utilizzato dei farmaci agonisti dei recettori dopaminergici, dei recettori muscarinici, e dei recettori glutammatergici ionotropi e hanno osservato un aumento della fosforilazione in serina 10 dell’istone H3 con la stessa cinetica temporale di ERK. La fosforilazione dell’istone H3 avveniva negli stessi neuroni che possedevano ERK attivato. Questi autori hanno anche correlato il rimodellamento della cromatina in seguito a cambiamenti come la fosforilazione dell’istone H3 con la trascrizione genica trovando un aumento della trascrizione del gene c-fos. E’importante rilevare che la fosforilazione della serina 10 dell’istone H3 era strettamente correlata con l’acetilazione della vicina lisina 14 e che tali modificazioni influiscono sul rimodellamento della cromatina e quindi sulla regolazione genica. Questo sinergismo tra fosforilazione ed acetilazione dell’istone H3 dopo stimolazione di ERK è stato ulteriormente confermato da studi in cellule di topo in cui si è osservato che EGF causa la fosforilazione dell’istone H3 e che l’istone fosforilato richiamerebbe un acetiltransferasi capace di indurre la successiva acetilazione dell’istone stesso (Cheung et al., 2000). Questi dati suggeriscono che la stimolazione visiva della fosforilazione dell’istone H3 potrebbe essere importante per diminuire l’impacchettamento della cromatina nei neuroni corticali visivi non solo direttamente, ma, come vedremo nel paragrafo successivo, anche indirettamente, favorendo l’acetilazione dell’istone H3.

IV.3 L’acetilazione dell’ istone H3: un possibile reclutamento di

CBP

I nostri dati dimostrano che durante il periodo critico l’esperienza visiva causa un’acetilazione dell’istone H3 da parte della stimolazione visiva. L’acetilazione potrebbe essere dovuta all’intervento di un coattivatore del CREB per la trascrizione genica cioè il CBP (proteina che lega il CREB). Infatti il CREB fosforilato lega il CBP, il quale svolge due funzioni importanti per la trascrizione: la prima è di reclutare i componenti del macchinario utile per la trascrizione sul promotore, la seconda permette, con la sua azione acetiltranferasica, di acetilare le code N-terminali degli istoni e diminuire l’impacchettamento della cromatina. Alarcon e collaboratori, (Alarcon et al., 2004) hanno studiato la sindrome di Rubinstein –Taiby, caratterizzata da ritardo mentale, in cui vi è una mutazione con perdita di funzione del gene per il CBP, usando come modello il topo. Gli studi su i topi mutanti per il CBP riportano la presenza di deficit a livello della memoria a lungo termine, come il condizionamento alla paura. Sono stati osservati dei deficit anche a livello del LTP a lungo termine ippocampale, ma non a livello di quella a breve termine. Questo dato propone pertanto un ruolo del CBP in queste forme di plasticità e di memoria. Nei topi mutanti per il CBP, i deficit sull’apprendimento e la memoria sono dovuti a un danneggiamento della trascrizione mediata dal CREB; infatti l’espressione transgenica di una forma costituivamente attiva di CREB (VP16-CREB), che direttamente recluta il macchinario di trascrizione, indipendentemente dal CBP, permette la trascrizione genica mediata dal CREB. Inoltre anche i difetti sul LTP a lungo termine vengono migliorati seppur non completamente. I deficit sulla memoria e sull’LTP a lungo termine potevano essere migliorati anche inibendo le deacetilasi in modo da compensare la riduzione dell’acetilazione causata dalla mancanza del CBP. Ciò sottolinea l’importanza della funzione del CBP nell’acetilazione degli istoni. Ulteriori studi (Korzus et al., 2004) confermano il ruolo dell’attività intrinseca acetiltraferasica del CBP nel consolidamento delle tracce della memoria. Questi autori hanno generato dei topi transgenici in cui era mutata selettivamente la parte del CBP

responsabile dell’attività acetiltransferasica. In questi animali il consolidamento della memoria a breve termine in quella a lungo termine viene danneggiato e il trattamento di questi topi con degli inibitori delle deacetilasi come la Tricostatina miglioravano la memoria a lungo termine. Da questi studi si evidenzia che CBP è reclutato dal coattivatore CREB ed è importante per l’acetilazione degli istoni. Il CBP potrebbe essere attivato direttamente da ERK, infatti ERK può fosforilare il CBP sul dominio C-terminale e tramite un cambiamento conformazionale potrebbe causare l’attivazione della sua azione acetiltrasferasica (Ait-Si-Ali et al., 1999).

IV.4 Altri meccanismi di regolazione della trascrizione genica

mediata dal CREB: gli inibitori di CREB

Abbiamo visto che l’espressione genica mediata dal CREB è fortemente ridotta nell’adulto. Una delle possibili ipotesi che potrebbero spiegare una ridotta trascrizione genica mediata dal CREB potrebbe essere data dall’intervento di fattori con un’azione inibitrice sulla trascrizione genica mediata dal CREB. Nell’Aplysia sono stati individuati fattori con un’azione di repressione sulla trascrizione genica mediata dal CREB nel processo di sensibilizzazione a lungo termine. La sensibilizzazione nell’Aplysia è un processo di facilitazione per cui una stimolazione nocicettiva sulla coda attiva degli interneuroni di tipo serotoninergico che potenziano la trasmissione sinaptica dei neuroni sensitivi del sifone sui motoneuroni che guidano la retrazione delle branchie. La sensibilizzazione a lungo termine comporta ripetute stimolazioni sulla coda che causano a livello dei neuroni sensitivi del sifone un aumento del cAMP che si lega alla PKA rendendola attiva. Nel processo di sensibilizzazione a lungo termine la subunità catalitica della PKA rimane per un tempo più lungo attiva e insieme a MAP chinasi entra nel nucleo dove avviene la fosforilazione di CREB1 mentre viene inibita l’azione repressoria di CREB2. Di conseguenza si ha l’attivazione di geni precoci come C/EBP (Kandel, 2001). La riduzione di espressione genica mediata dal CREB che noi osserviamo in corteccia visiva potrebbe essere dovuta quindi a fattori omologhi a CREB2, inibitori per la trascrizione genica mediata dal

CREB. In particolare, nei mammiferi l’omologo di CREB2 potrebbe essere ATF4. Alcuni sostengono che ATF4 sia importante per la plasticità sinaptica anche nei mammiferi. Ad esempio ATF4 regola la plasticità sinaptica a lungo termine nell’ippocampo di topi. Chen e altri (Chen et al., 2003) hanno usato un dominante negativo di C/EBP che è in grado di legarsi ai dimeri di ATF4 e ne causa la degradazione. Si è osservato che ciò facilita i fenomeni di plasticità sinaptica a lungo termine; infatti nonostante la trasmissione sinaptica basale rimanga invariata si ha un maggiore potenziamento a lungo termine dei topi transgenici e viene inoltre aumentata la memoria spaziale a lungo termine. Un recentissimo articolo ha individuato una chinasi, GCN2, che stimola la traduzione di ATF4. Analizzando un topo con una mutazione che rimuoveva il GCN2 si osservava una diminuzione dell’attività di ATF4 e un aumento dell’attività del CREB. Ciò era associato a un miglioramento delle capacità di memoria spaziale dopo un allenamento moderato e con un aumento del LTP con una stimolazione non saturante (Costa-Mattioli et al., 2005). Ulteriori esperimenti cercheranno quindi di analizzare se l’attivazione visiva dei neuroni corticali produce un aumento maggiore dellazione di ATF4 nell’adulto rispetto che al piccolo.

IV.5 Ipotesi sulle fosfatasi e sviluppi futuri

Un’altra ipotesi che possa spiegare la riduzione dell’attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB nell’adulto è data da possibili variazioni dell’attività delle fosfatasi durante lo sviluppo. Ad esempio, Sala e collaboratori (Sala et al., 2000), mostra che neuroni ippocampali in coltura mostrano un progressivo disaccoppiamento dell’azione di ERK sulla fosforilazione di CREB. Infatti nei neuroni maturi l’attività dei recettori NMDA, che ricordiamo sono importanti nella maturazione dei circuiti corticali e della plasticità sinaptica, è incapace di ottenere una fosforilazione del CREB nella serina 133 che viene addirittura defosforilata pur essendo presente una normale fosforilazione di ERK. Questo lavoro suggerisce quindi che durante la maturazione neuronale l’attivazione del recettore NMDA sia legata a specifiche fosfatasi che defosforilino efficacemente il CREB. E’ possibile che dei meccanismi di defosforilazione del CREB

attraverso delle fosfatasi siano presenti anche nella corteccia visiva del topo adulto. Una maturazione delle fosfatasi durante lo sviluppo potrebbe intervenire anche nella regolazione della fosforilazione dell’istone H3. Infatti i nostri dati mostrano che gli animali adulti rispondano alla stimolazione visiva con un minore rimodellamento della cromatina. In particolare, si nota un andamento della cinetica della fosforilazione dell’istone H3 in risposta alla stimolazione visiva più transiente nell’adulto. Questa breve cinetica di fosforilazione dell’ istone H3 non è spiegabile con differenze di attivazione in quanto la chinasi MSK si attiva ugualmente durante e dopo il periodo critico. Un’attivazione maggiore o più veloce delle fosfatasi nell’adulto porterebbe a un tempo molto minore in cui la cromatina possa essere accessibile al macchinario della trascrizione e quindi a una minore espressione genica. Questo meccanismo potrebbe spiegare il diverso comportamento dell’espressione genica mediata dal CREB nei topi transgenici Lac Z.

I nostri dati si riassumono in un modello di attivazione della trascrizione genica da parte dell’esperienza visiva mostrato in fig.32. I geni sotto il controllo di CREB sono responsabili nella plasticità sinaptica in molte strutture cerebrali inclusa la corteccia visiva e i fenomeni di maturazione della corteccia visiva dipendono da fenomeni di plasticità. L’individuazione di una regolazione durante lo sviluppo dei meccanismi di segnalazione intracellulare che mediano l’azione dell’esperienza visiva su CREB e sulla regolazione dell’impacchettamento della cromatina individua un importante meccanismo molecolare per spiegare la riduzione di plasticità che avviene nella corteccia visiva in concomitanza con la chiusura del periodo critico. L’individuazione dei geni attivati dall’esperienza visiva tramite la regolazione da parte di CREB o tramite modifiche post-traduzionali degli istoni permetterà di individuare importanti mediatori della plasticità della corteccia visiva.

Trascrizione genica

ERK

ERK

Trascrizione genica

Figura 32: Modello proposto di attivazione dell’esperienza visiva

Durante il periodo critico l’esperienza visiva attiva la via di ERK. ERK attiva MSK. MSK fosforila CREB e l’istoneH3. Al CREB fosforilato vi si lega il coattivatore CBP che recluta il macchinario della trascrizione e tramite la sua attività acetiltransferasica acetila l’istone H3. La fosforilazione (P) e l’acetilazione (Ac) dell’istone H3 causerebbero dei cambiamenti conformazionali sull’ impacchettamento della cromatina, favorendo pertanto l’espressione genica mediata dal CREB. Nell’adulto l’esperienza visiva causa analogamente l’attivazione di ERK e di MSK. Tuttavia la fosforilazione da parte di MSK e probabilmente l’acetilazione dell’istone H3 sono ristrette in una finestra temporale più breve e quindi diminuisce il rimodellamento della cromatina e la trascrizione mediata dal CREB. Nell’adulto potrebbero possono essere coinvolti fattori come ATF4 con azione inibitoria su CREB o delle fosfatasi che agiscono sull’ istone o sul CREB.

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