Sintesi e studi computazionali per lo sviluppo di nuovi ligandi selettivi per il recettore beta degli estrogeni

UNIVERSITÁ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia

Farmaceutiche

Tesi di laurea

:

“Sintesi e studi computazionali per lo sviluppo di nuovi ligandi

selettivi per il recettore β degli estrogeni”

Relatori: Prof. Filippo Minutolo

Dr. Tiziano Tuccinardi

Candidata: Lucia Fusani (mat. 444352)

Settore Scientifico Disciplinare: CHIM 08 ANNO ACCADEMICO: 2012-2013

INDICE

1. INTRODUZIONE GENERALE ... 1 1.1. ESTROGENI ... 1 1.1.1. Struttura chimica ... 1 1.1.2. Secrezione ... 2 1.1.3. Azioni fisiologiche ... 5 1.1.4. Biosintesi e metabolismo ... 6 1.2. RECETTORI ESTROGENICI ... 9 1.2.1. Recettori di membrana ... 9 1.2.2. Recettori nucleari ... 11 1.3. LIGANDI ESTROGENICI ... 16

1.3.1. Modulatori selettivi per il recettore degli estrogeni (SERMs) ... 16

1.3.2. Ligandi selettivi per il recettore β ... 20

1.3.3. Possibili applicazioni terapeutiche dei ligandi ERβ selettivi ... 27

2. INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE ... 30

2.1. Modello farmacoforico per il ligandi ERβ-selettivi ... 30

2.2. Relative Binding Affinity (RBA) ... 33

2.3. Molecole di letteratura prese di riferimento ... 34

3. PARTE DI SINTESI ... 38 3.1. Salicilaldossime ... 38 3.1.1. Salicilaldossime A ... 40 3.1.2. Salicilaldossime B ... 41 3.2. Chetossime... 42 3.3. Saggi trascrizionali ... 43

3.4. Schema generale di sintesi ... 45

3.5. Sintesi dei composti 2 e 3 ... 46

3.6. Sintesi dei composti 4 e 5 ... 47

3.7. Conclusioni sui composti sintetizzati ... 51

4. PARTE DI SINTESI: Procedure sperimentali ... 53

4.3. Sintesi dei derivati Chetossimici ... 60

5. PARTE COMPUTAZIONALE: Metodi e procedure ... 67

5.1. Flap (fingerprints for ligands and proteins) ... 67

5.1.1. Receptor-Based Virtual Screening (RBVS) ... 70

5.1.2. Ligand- Based Virtual Screening (LBVS) ... 71

5.1.3. Pharmacophore-Based Virtual Screening (PBVS) ... 72

5.1.4. Procedure di validazione con il database ERβ selettivo ... 72

5.2. Studi di docking ... 82 5.2.1. GLIDE ... 82 5.3. Funzioni di Scoring ... 86 5.3.1. GLIDE ... 87 5.3.2. FRED ... 88 5.3.3. DOCK ... 91 5.4. Dinamica Molecolare ... 94

6. PARTE COMPUTAZIONALE: Risultati sperimentali ... 101

6.1. FLAP ... 102

6.1.1. Creazione del database ENAMINE ... 102

6.1.2. LBVS relativo al database ENAMINE ... 102

6.1.3. PBVS relativi al database ENAMINE ... 103

6.1.4. SBVS relativo al database ENAMINE ... 104

6.2. Studi di docking sui risultati del VS: GLIDE ... 107

6.3. Funzioni di scoring: analisi dei risultati ... 109

6.4. Dinamica molecolare ... 113

6.4.1. Calibrazione della procedura ... 113

6.4.2. Simulazioni di DM e analisi dei risultati ... 114

6.5. Conclusioni e prospettive future ... 121

7. APPENDICE A: grafici ... 125

1

1.

INTRODUZIONE GENERALE

Estrogeni, androgeni e progestinici sono le tre classi di ormoni steroidei alle quali appartengono i più importanti ormoni sessuali che le gonadi maschili (testicoli) e femminili (ovaie) producono.

Gli ormoni steroidei hanno varie funzioni, tra cui le principali sono:

 stimolazione dello sviluppo degli ovociti e spermatozoi dalle rispettive cellule germinali, attraverso la loro azione locale (funzione paracrina e autocrina)

 stimolazione dello sviluppo e delle funzioni degli organi sessuali secondari e regolazione della secrezione degli ormoni ipotalamo-ipofisari, agendo invece su cellule bersaglio lontane (funzione endocrina).

Nell’uomo, la modesta produzione di estrogeni avviene nelle cellule interstiziali del Leyding dei testicoli. Nelle donne, gli estrogeni sono prodotti nel follicolo ovarico dalle cellule della granulosa e della teca nella prima fase del ciclo mestruale, mentre, dopo l’ovulazione, vengono sintetizzati dalle cellule luteinizzate della granulosa e del corpo luteo, assieme al progesterone. Produzioni minime di estrogeni si hanno anche da parte dei muscoli scheletrici del tessuto adiposo e, durante la gravidanza, da parte della placenta e del surrene fetale.

1.1. ESTROGENI

1.1.1. Struttura chimica

Gli estrogeni sono tutti composti da un nucleo base comune, formato da un sistema a quattro anelli condensati, che prende il nome di ciclopentanoperidrofenantrene

2 Gli estrogeni presenti in natura sono steroidi a 18 atomi di carbonio (C18) e sono

caratterizzati da un anello aromatico A con un gruppo ossidrilico in posizione 3.

Estradiolo (E2), Estrone (E1) ed Estriolo (E3) sono i principali estrogeni femminili, che presentano, come detto, un gruppo OH, in posizione C3 dell’anello aromatico A, e un

metile in posizione 13β.

Fig.2. Estrogeni femminili

L’attività estrogenica dell’Estradiolo è da conferire alla presenza, in posizione 17β, del gruppo ossidrilico. Invece, l’ulteriore gruppo OH in posizione 16α nell’estriolo, e il chetone al C17 nell’estrone, sono probabilmente i responsabili della bassa attività ormonale e della diminuita affinità nei confronti del recettore estrogenico di questi due composti.

L’Estradiolo è il prodotto principale della secrezione ovarica, mentre Estriolo ed Estrone sono sintetizzati principalmente nel fegato a partire dall’estradiolo o in tessuti periferici a partire dall’androstenedione o altri androgeni ed hanno un minore potere estrogenico. Minime produzioni di estrogeni si hanno anche nei muscoli scheletrici e nel tessuto adiposo.1

1.1.2. Secrezione

La secrezione degli estrogeni è sotto controllo dell’asse ipotalamo-ipofisario e, a loro volta, gli estrogeni controllano il rilascio delle gonadotropine (ormoni prodotti dall’ipofisi con funzione di stimolazione delle gonadi). Il fattore ipotalamico di rilascio delle gonadotropine (GnRH) è un decapeptide che stimola l’adenoipofisi (o ipofisi anteriore) a rilasciare l’ormone follicolo stimolante (FSH) e l’ormone luteinizzante (LH), che nella donna agiscono entrambi sull’ovaio mentre nell’uomo sul testicolo.

3 Fig.3. Controllo asse ipotalamo-ipofisario

L’ormone follicolo stimolante (FSH) è una glicoproteina formata da una subunità α , che è la responsabile dell’attività ormonale, e da una subunità β, che conferisce specificità di interazione recettoriale. L’FSH nella donna stimola la gametogenesi, lo sviluppo follicolare e inoltre controlla la secrezione di estrogeni, infatti fa si che gli androgeni della granulosa si convertano in estrogeni; invece, nell’uomo è il principale fattore di regolazione della spermatogenesi, agisce sulle cellule del Sertoli e stimola la produzione di una proteina legante gli androgeni. 2

L’LH regola maggiormente la produzione degli ormoni gonadici (estrogeni e progesterone). Esso fa sì che nella donna si abbia l’ovulazione a metà ciclo ed è il principale ormone che controlla la successiva secrezione di progesterone da parte del corpo luteo; nell’uomo, agisce nelle cellule del Leyding, stimolando la produzione di testosterone.

4 Fig.4. Controllo della secrezione estrogenica

I prodotti dell’attività secretoria delle gonadi esercitano un effetto a feedback negativo diretto, e lo fanno sia a livello ipotalamico sia ipofisario, inibendo rispettivamente il rilascio di GnRH, FSH e LH. Quando invece le concentrazioni ematiche di estrogeni e androgeni sono basse, il controllo sull’asse ipotalamo-ipofisario, è a feedback positivo, ossia viene promosso il rilascio di GnRH e, di conseguenza, il rilascio di FSH e LH. Le gonadi elaborano anche altri ormoni, tra cui l’inibina e l’attivina che influenzano la secrezione delle gonadotropine e hanno azioni contrapposte sull’FSH: l’attivina ne promuove la sintesi e la secrezione mentre l’inibina ne blocca il rilascio.3

5 1.1.3. Azioni fisiologiche

Gli estrogeni, oltre ad essere coinvolti nello sviluppo e nel mantenimento dei caratteri secondari femminili e ad intervenire nella regolazione dei processi riproduttivi maschili, producono effetti benefici sulla struttura ossea e sul cuore. Infatti, gli estrogeni sembrano avere effetti benefici a livello cardiovascolare e del sistema nervoso centrale. Essi svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’omeostasi ossea1

: inibiscono la velocità di riassorbimento osseo promuovendo l’apoptosi degli osteoclasti ed antagonizzano gli effetti osteoclastogenici e pro-osteoclastici dell’ormone paratiroideo e dell’interleuchina-6; inoltre gli estrogeni sono importanti in quanto vanno a regolare i centri cerebrali che controllano il mantenimento della temperatura corporea.

Fig.5. Effetti fisiologici degli estrogeni

Effetti dovuti agli estrogeni si riscontrano anche a livello del fegato, in cui si possono avere alterazioni metaboliche che causano l’aumento dei livelli ematici di proteine e alterazioni della composizione dei lipidi plasmatici, caratterizzata da aumento dei livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL), da una leggera riduzione di quelle a bassa densità (LDL) e da una riduzione dei livelli plasmatici di colesterolo totale. Con l’insorgenza della menopausa, le donne vanno incontro ad una diminuzione di estrogeni che innesca una serie di disturbi, come ad esempio piccoli shock termici (vampate di calore), incremento di colesterolo (LDL) ematico con successivo aumento della probabilità di insorgenza di patologie cardiache e diminuzione della densità minerale ossea che può portare a patologie come l’osteoporosi. Questa serie di eventi può essere tenuta sotto controllo con una terapia ormonale sostitutiva (HRT); spesso però, questo comporta l’insorgenza di patologie ormone-dipendenti, come neoplasie alla mammella e all’utero.

6 1.1.4. Biosintesi e metabolismo

La biosintesi degli estrogeni, come quella di altri ormoni steroidei, ha come substrato iniziale il colesterolo, generato in situ dall’acetilcoenzima A (AcetilCoa) o captato dalle LDL (lipoproteine plasmatiche a bassa densità) 1,2. Questo processo, nelle donne non in menopausa, avviene principalmente nelle ovaie. Piccole quantità vengono prodotte anche in altri distretti dell’organismo, tra cui il fegato; perciò nelle donne in post-menopausa questa piccola produzione diventa di fondamentale importanza.

Il colesterolo contiene 27 atomi di carbonio, mentre estradiolo, estrone ed estriolo sono costituiti da 18 atomi di carbonio. Il primo step nella sintesi degli estrogeni comporta la rimozione di una unità C6 dal colesterolo; successivamente, l’enzima 20-22 desmolasi (A) promuove l’ossidrilazione delle posizioni 20 e 22 della catena laterale e catalizza la scissione di quest’ultima, con la conseguente formazione di pregnenolone. (Fig. 6) Il progesterone si forma dal pregnenolone in due step, catalizzati rispettivamente dall’enzima 5-ene-3β-idrossisteroide deidrogenasi (B), che ossida il gruppo ossidrilico in posizione 3, e dall’enzima 3-ossosteroide-4,5-isomerasi (C), che isomerizza il doppio legame ∆5.

I precursori obbligati degli estrogeni sono gli androgeni. La sintesi degli androgeni inizia con l’idrossilazione del C17 del progesterone ad opera della 17-α-idrossilasi (D) a dare il 17α-idrossipregnenolone, cui segue la rimozione dei carboni C20 e C21 catalizzata dall’enzima 17-20 liasi (E), che porta alla formazione dell’androstendione. L’androstendione, per riduzione del gruppo chetonico in posizione 17 promossa dall’enzima 17-β-idrossisteroide deidrogenasi (F), porta alla formazione del testosterone. Androstendione e testosterone si possono formare anche dal deidroepiandrosterone, che si ottiene dal 17-α-idrossipregenolone per rimozione della catena laterale, e dell’analogo ridotto.

L’estradiolo e l’estriolo vengono sintetizzati a partire, rispettivamente, da testosterone e da androstendione, per azione dell’enzima aromatasi, appartenente alla famiglia del citocromo P450. L’aromatasi catalizza, in sequenza, l’idrossilazione e l’ossidazione del gruppo metilico in posizione 19, la formazione di un doppio legame in posizione 1-2 e la decarbossilazione in posizione 19, portano alla formazione del caratteristico anello benzenico degli estrogeni.

7 Fig.6. Biosintesi

Gli estrogeni, immessi nel torrente sanguigno, circolano in parte legati a una globulina, la SHBP (sex hormone-binhing protein), con un’affinità molto inferiore rispetto al testosterone, in parte legati debolmente all’albumina.1,2

Estradiolo ed estrone subiscono, per la maggior parte, un metabolismo di tipo epatico che comporta prima l’idrossilazione e poi la coniugazione, come glucuronidi o come solfati. Una volta coniugati, vengono escreti con le urine. In parte i coniugati possono

8 essere escreti attraverso la bile, in questo caso vengono idrolizzati nell’intestino, riassorbiti e riportati al fegato tramite il circolo portale.4

Inoltre, gli estrogeni vanno incontro ad un metabolismo di tipo catecolico, che comporta l’idrossilazione in posizione 2 o in posizione 4. Essendo substrati simili alle catecolammine, subiscono una successiva metilazione da parte delle O-metiltranferasi, portando alla formazione di 2-metossiestradiolo e di 4-metossiestradiolo.

9

1.2. RECETTORI ESTROGENICI

L’estradiolo, dopo che è entrato in circolo, si lega alla α2-globulina, (Sex

Hormone-Binding Protein, SHBG), dalla quale si dissocia per entrare nelle cellule e legarsi al suo recettore. I recettori degli estrogeni sono localizzati in prevalenza nel nucleo, dove si trovano associati a heat shock protein (Hsp) che li stabilizzano1.

Negli ultimi anni, però, si è anche ipotizzata la presenza di un secondo tipo di recettori in grado di interagire con gli estrogeni: i recettori di membrana, che mediano risposte rapide, non attribuibili all’attivazione dei recettori nucleari

Quindi, ad oggi, sono individuate due classi di recettori che interagiscono con gli estrogeni:

 recettori di membrana

 recettori nucleari

1.2.1. Recettori di membrana

I recettori di membrana mediano risposte rapide non genomiche (non attivano la trascrizione genica) che sono già note da molti anni, ma nonostante ciò, i meccanismi alla base di tali risposte non sono ancora del tutto chiariti. È stato però recentemente affermato che l’attivazione di questi recettori possa essere di significativa importanza nella regolazione e nella protezione del sistema cardiovascolare.

I recettori in questione sono proteine integrali di membrana, che interagiscono con uno specifico ligando e mediano una risposta biochimica intracellulare; strutturalmente sono formati da 7α-eliche transmembrana, che hanno un dominio extracellulare N-terminale di lunghezza variabile e un dominio intracellulare C-terminale. Il terzo lungo loop citoplasmatico del recettore rappresenta la regione della molecola che si accoppia alla proteina G.

Le proteine G consistono di tre subunità α, β, γ e quando l’agonista (in questo caso E2)

si lega al recettore, si attiva un cambiamento conformazionale che coinvolge il dominio citoplasmatico.

10 Fig.8. Segnale mediato da ER di membrana nelle caveole di cellule endoteliali

Il meccanismo d’azione dei recettori non nucleari è stato studiato in cellule endoteliali5

, dove si è potuto osservare che il legame con gli estrogeni promuove la rapida attivazione di eNOS (NO sintetasi endoteliale) che a sua volta libera di ossido di azoto e quindi provoca vasodilatazione.

In numerosi laboratori è stato studiato nel dettaglio il meccanismo d’azione dei recettori di membrana localizzati nelle caveole (piccole invaginazioni della membrana cellulare) di cellule endoteliali ed è stato osservato che il legame estrogeno-ER causa l’attivazione della proteina G, alla quale i recettori di membrana sono associati, della tirosina chinasi src e della serina/treonina chinasi PI3K che produce fosfatidilinositolo (3,4,5)-trifosfato (PIP3) e della chinasi Akt che fosforila eNOS così da produrre NO.

I recettori citosolici presenti nelle caveole inoltre, si legano direttamente con una proteina detta “striatina”, necessaria per la mediazione delle rapide risposte non genomiche degli ER di membrana, e questa a sua volta lega un’altra proteina detta “caveolina-1”.

In generale, quindi, si può affermare che l’interazione tra estrogeno e recettore di membrana causa l’attivazione di un complesso segnale che si risolve nella rapida attivazione di specifiche chinasi che come ultimo scopo hanno quello di fosforilare e attivare l’enzima eNOS.

Le regioni maggiormente interessate da questo tipo di risposte sembrano essere oltre che il sistema cardiovascolare anche il SNC e il tessuto osseo, benchè in ogni tessuto ER interagirà con una grande varietà di complessi proteici differenti.

L’attivazione di questi recettori sembra avere un’azione vasodilatatoria e di protezione nei confronti dei cardiomiociti e delle arterie nel sistema cardiovascolare, mentre nel SNC sembra proteggere i neuroni.

11 1.2.2. Recettori nucleari

I recettori nucleari mediano risposte genomiche. Nel citosol si trovano sottoforma di complessi oligomerici costituiti dal recettore nucleare complessato con particolari proteine dette Hsp90 (Heat shock protein 90) che hanno la funzione di renderli più stabili1.

Fig.9. Meccanismo d’azione dei recettori nucleari

Il legame dell’ormone al suo recettore causa un cambiamento conformazionale del recettore stesso che viene così liberato dall’interazione con le proteine stabilizzatrici. Il complesso estrogeno-recettore forma omodimeri che si legano a specifiche sequenze di nucleotidi dette elementi responsivi agli estrogeni (EREs), presenti nei promotori di vari geni e regolano la loro trascrizione. L’interazione del dimero recettoriale con l’ERE coinvolge anche una serie di proteine nucleari, definite coregolatori, ed altri componenti dell’apparato trascrizionale.6

L’interazione dei coattivatori (CoA) con la regione del recettore detta AF-2 (Activation Function-2, spiegata di seguito), causa l’attivazione della trascrizione. L’interazione con corepressori (CoR), invece, provoca il blocco della trascrizione.

1.2.2.1. Recettori nucleari: ERα e ERβ

Nel tardo 1950 è stato scoperto un recettore in grado di legare E2 da Jensen e

Jacobsen12. Questo recettore venne considerato per un lungo periodo come l’unico in grado di mediare gli effetti estrogenici finchè nel 1996 venne scoperto un secondo sottotipo recettoriale. Quindi ad oggi, esistono due sottotipi recettoriali dei recettori nucleari degli estrogeni: ERα e ERβ.

I recettori nucleari sono costituiti da un sequenza che varia da 500 a 600 aminoacidi, che vengono codificati da geni diversi localizzati su cromosomi separati con una omologia variabile dal 22 al 96%.

12 Fig.10. Struttura e domini funzionali di ERα, ERβ

 una porzione –NH2 terminale: detto dominio A/B che è responsabile del

processo di dimerizzazione che fa seguito all’interazione ligando-recettore. Questa porzione contiene la regione AF-1 che regola i processi di trascrizione di ER in modo ormone-indipendente.

 una porzione centrale C: detta DBD (DNA binding domain) che presenta affinità per specifiche sequenze di DNA. Questa sequenza recettoriale è costituita, in prevalenza, da aminoacidi basici che favoriscono il legame al DNA. Ѐ la regione della specificità di legame che contiene le sequenze HRE (Hormone Responsive Elements). Sono anche presenti residui di cisteina ed istidina che, interagendo tramite legami di coordinazione con un atomo di zinco, costituiscono un dominio, definito “zinc finger”, che ha la funzione di mantenere il recettore nella conformazione necessaria per l’interazione con il DNA.

 Una porzione E, detta dominio LDB (ligand binding domain) , formato da 12 α-eliche disposte a “sandwich” che racchiudono il binding pocket e vanno così a costituire la tasca idrofobica responsabile del legame con il ligando. LBD è formato da tre strati di α-eliche antiparallele, uno centrale a tre eliche (H5/6, H9 e H10), posto tra due strati addizionali di eliche (H1-4 e H7, H8, H11) ed infine possiede due tratti con struttura β-sheet (S1, S2) a un tratto α-elicoidale (H12).

Contiene la regione AF-2 (Activation Function-2), che regola i processi di trascrizione in modo ormone-dipendente, ed è anche responsabile della maggior parte delle azioni mediate dal legame con l’estradiolo, come per esempio il legame dei coattivatori (CoA) e la dimerizzazione del complesso ligando-recettore8.

13  Una porzione D detta “hinge region” (dominio cerniera) che separa il dominio DBD e LBD. Questa regione favorisce i cambiamenti conformazionali dovuti alla formazione del legame tra ligando e recettore.

 Una porzione COOH-terminale F, che promuove la trascrizione da parte della RNA polimerasi.

I domini leganti il DNA (DBD) sono molto simili, hanno un omologia del 96%, mentre quelli leganti il ligando mostrano solo il 53% di omologia nella sequenza aminoacidica. Per i domini A/B e D l’omologia è del 27% e del 26% rispettivamente. Infine, la regione F è quella che presenta la minore omologia 22%.

Il gene per il recettore α codifica per 595 amminoacidi, mentre quello per il recettore β codifica per 530 amminoacidi.

Il volume del binding pocket di ERβ è più piccolo rispetto a quello di ERα e ha delle piccole differenze nella forma, dovute alla diversa composizione nei residui presenti nelle due cavità. Infatti dei 23 aminoacidi che si protendono nel binding pocket, due residui non sono conservati (Fig.12a e Fig12.b): ERβ presenta una metionina (Met336) e una isoleucina (Leu373), sostituite rispettivamente, in ERα, da una leucina (Leu384) e da una metionina (Met421). Queste differenze, come vedremo, sono molto importanti per lo sviluppo di ligandi selettivi per il sottotipo recettoriale β.

1.2.2.2. Recettori nucleari: distribuzione tissutale

Le due forme del recettore hanno la stessa affinità per l’estradiolo, mentre quella per l’estrone e per numerosi agonisti e antagonisti di sintesi è molto diversa. La loro distribuzione mostra ampie regioni di sovrapposizione, ma anche differenti distribuzioni tissutali.

Il recettore α è maggiormente espresso a livello dell’endometrio uterino, della mammella, delle cellule della teca dell’ovario, e inoltre, seppur in bassi livelli, si ritrova a livello delle ossa, dell’endotelio vascolare, del fegato, della prostata, dell’ipofisi e a livello di alcune regioni del SNC.

14 Il recettore β è espresso in molti di questi tessuti ma in genere a livelli più bassi ed è invece espresso in modo quasi esclusivo in altre regioni del cervello, nei polmoni, nel colon e nelle cellule della granulosa nell’ovaio9

.

La differente localizzazione tissutale ha fornito anche una spiegazione della diversa attivazione di questi recettori. È interessante notare, inoltre, come i livelli di ERα e ERβ possano variare da tessuti sani a tessuti malati. Questo suggerisce che i due recettori possano mediare azioni contrastanti tra loro. Un esempio è dato dai differenti livelli recettoriali che si osservano nella mammella. ERβ predomina in condizioni normali, mentre ERα è sovra-espresso nel tumore e, con il progredire della malattia, i livelli di ERβ diminuiscono. Queste osservazioni hanno portato a ipotizzare che ERα sia coinvolto nella proliferazione cellulare estrogeno-mediata, mentre ERβ vada a regolare e a limitare l’azione di ERα 9_{. L’azione contrastante di ERα e di ERβ è stata riscontrata}

anche in diverse colture cellulari.

1.2.2.3. Recettori nucleari: interazioni a livello del binding pocket

Entrambi i recettori complessati con l’estradiolo (E2) presentano l’OH fenolico

dell’anello A implicato in un network di legami a idrogeno con una molecola d’acqua e con due residui del LBD, Glu353 e Arg394 in ERα e Glu305 e Arg346 in ERβ.

15

Fig.12a. Interazioni di E2 in ERβ Fig.12b. Interazioni di E2 in ERα

L’OH in posizione 17β, inoltre, instaura un legame a idrogeno con l’istidina: His524 in ERα e His475 in ERβ. Tutte queste interazioni sono fondamentali ai fini del legame con il recettore. Inoltre, in entrambi i casi, gli anelli E2 sono coinvolti in interazioni

idrofobiche.

Come detto precedentemente, è importante sottolineare che nei due sottotipi recettoriali, dei 23 residui presenti solo due sono diversi. In ERα questi residui si trovano tra l’anello B e l’anello C, vicino alla posizione 8β di E2, mentre nel caso di ERβ si trovano vicino

16

1.3. LIGANDI ESTROGENICI

1.3.1. Modulatori selettivi per il recettore degli estrogeni (SERMs)

I modulatori selettivi del recettore degli estrogeni (SERMs), sono molecole dotate di particolari attività tali da differenziarli sia dagli agonisti sia dagli antagonisti puri. Queste molecole sono dotate di duplice attività:

 si comportano da agonisti su alcuni tessuti, come SNC, ossa e sistema cardiovascolare;

 si comportano da antagonisti in altri tessuti, come cervello e mammella.

I SERMs sono una nuova categoria di agenti terapeutici per la prevenzione e il trattamento di patologie come l’osteoporosi e il tumore al seno10

.

A differenza degli estrogeni che sono uniformemente agonisti e degli antiestrogeni che sono uniformemente antagonisti, i SERMs dimostrano una inusuale azione tessuto-dipendente: essi sono agonisti in molti tessuti (ossa, fegato e il sistema cardiocircolatorio), antagonisti in altri (cervello e seno), e agonisti/antagonisti sull’utero. Per questi motivi si spera che i SERMs possano mimare gli effetti benefici su ossa e sul sistema cardiocircolatorio ma che possano anche agire come antiestrogeni sul seno e sull’utero così da poter evitare gli effetti nocivi che hanno su questi tessuti.

I tre più importanti SERMs sono tamoxifene (Nolvadex), raloxifene (Evista) e toremifene (Fareston).

Sebbene non sia ancora ben chiaro come i SERMs possano avere un’azione antiestrogenica su alcune cellule e un’azione estrogenica su altre, si ritiene che questa loro particolare proprietà farmacologica possa essere spiegata tenendo conto di tre meccanismi correlati tra loro7:

1. differente conformazione assunta dai recettori in seguito al legame con i SERMs 2. differente espressione e tipo di legame sui recettori da parte delle proteine regolatrici

3. differente espressione tissutale dei recettori estrogenici e loro attivazione senza il legame agli EREs.

17 Il meccanismo d’azione vero e proprio, tuttavia, non è ancora del tutto compreso ma è comunque evidente che il loro bersaglio principale sono gli ER come via di traduzione del segnale atta a modulare l’azione del farmaco nei differenti tessuti.

Come già precedentemente detto, gli ER sono divisi in 6 regioni. Il dominio di legame con il DNA (regione C) è essenziale per l’interazione dell’ER con gli elementi di risposta agli estrogeni. Il dominio di legame con il ligando (regione E) è il sito di legame degli agonisti come l’estradiolo e degli antiestrogeni (inibitori competitivi). Le regioni della funzione attivante (AF-1 AF-2) sono aree dell’ER che interagiscono con le proteine regolatrici (coattivatori) e che permettono la formazione di unità trascrizionali efficaci.

Fig.14. Modello di interazione dei SERMs

Le azioni dei SERMs possono essere spiegate tenendo conto dei cambi conformazionali che questi inducono sul recettore stesso; infatti i SERMs permettono che il recettore adotti stati conformazionali diversi da quelli che si ritrovano con i classici agonisti e antagonisti.

Una caratteristica fondamentale degli agonisti è che fanno in modo che l’elica H12 racchiuda il ligando stesso all’interno della tasca idrofobica del dominio di legame. La posizione dell’elica H12 a livello della tasca idrofobica è essenziale sia per il reclutamento di coattivatori per la regione AF-2 sia per l’attività della RNA polimerasi. I SERMs, con la loro catena laterale ingombrante, vanno a prevenire la chiusura dell’elica H12 causando l’impossibilità da parte delle proteine attivatrici di legarsi al complesso SERMs-recettore a livello della regione AF-2. Perciò, secondo questa ipotesi di meccanismo, i SERMs agirebbero da antagonisti nelle cellule in cui l’attività

18 trascrizionale dipende da AF-2, e da agonisti in quelle cellule dove la trascrizione è regolata dalla regione AF-1.

Alternativamente è stato proposto che il complesso SERM-recettore potrebbe attivare la trascrizione legandosi con regioni del promotore diverse dalle classiche EREs. È stato dimostrato che i SERMs invece di legarsi agli EREs, possono aumentare l’attivazione genica interagendo con la proteina AP-1, in particolare con i fattori trascrizionali c-fos e c-jun, perciò l’attivazione di differenti vie potrebbe avere ripercussioni importanti sulle differenze di comportamento dei SERMs.

Un’ultima ipotesi sul meccanismo d’azione dei SERMs è stata fatta in base al fatto che le isoforme α e β dei recettori possano rispondere in modo diverso al legame con i SERMs stessi. Nei tessuti troviamo una differente distribuzione e concentrazione recettoriale in termini quantitativi e di isoforme. Topi con alterazioni a livello dei recettori α o β mostrano differenti fenotipi, dimostrando così che ogni recettore ha una differente azione. Nella maggior parte dei casi ERα agisce come un attivatore mentre ERβ può inibire l’azione di ERα formando con esso stesso un eterodimero. Comunque, da analisi microarray su topi con delezioni a livello di ERα o ERβ è stato visto che il recettore β inibisce la trascrizione di 240 elementi di risposta agli estrogeni. Pertanto il livello di espressione di questi due recettori può influenzare la risposta cellulare agli estrogeni11.

Per esempio il raloxifene e il tamoxifene legano entrambi i recettori e agiscono come puri antagonisti quando si legano al recettore β sui geni che contengono gli EREs, mentre agiscono come parziali agonisti quando si legano al recettore α.

1.3.1.1. Attuali valutazioni sull’uso dei SERMs come farmaci 12

Il tamoxifene, derivato trifeniletilico, è il capostipite dei Modulatori Selettivi dei Recettori Estrogenici (SERMs) ed è stato testato esclusivamente per il trattamento del cancro al seno . Ѐ stato approvato per questo scopo dalla United States Food and Drug Administration nel 1977. L’attività agonista del tamoxifene a livello dell’utero rappresenta il limite principale di questo farmaco, in quanto con terapie a lungo termine aumenta di molto la possibilità di sviluppare neoplasie a livello dell’endometrio.

19 Fig.15. Tamoxifene

Il raloxifene, in origine descritto come un antiestrogeno non steroideo in grado di ridurre l’atrofia nell’utero degli animali, adesso è stato approvato con successo per il trattamento e la prevenzione dell’osteoporosi e sembra che possa anche ridurre l’insorgenza del cancro al seno10

.

Inoltre, il raloxifene, a differenza del tamoxifene, non ha attività agonista a livello dell’utero pertanto ha il vantaggio di non aumentare le probabilità di sviluppo di tumore all’endometrio. Esso è stato recentemente impiegato in uno studio in cui viene messo a confronto con il tamoxifene per capire il modo nel quale riesce a ridurre il rischio di cancro al seno nelle donne in post-menopausa. I risultati di questi test detti test STAR sono stati rilasciati nel Giugno 2006.

Fig.16. Raloxifene (sinistra) e Toremifene (destra)

Il toremifene è un SERM con caratteristiche simili al tamoxifene ma, a differenza di questo, non causa tumori al fegato nel ratto.

Da un recente studio clinico si è appreso che il toremifene è equivalente al tamoxifene per quanto riguarda il trattamento del cancro al seno però, è anche stato evidenziato che comporta un raddoppiamento nell’insorgenza di tumori all’endometrio.

Altri quattro SERMs meritano di essere trattati in quanto sono composti che si trovano attualmente impiegati in test clinici:

20 Lasoxifene (CP-336156), attualmente in fase 3, potrebbe essere in grado di ridurre il rischio di fratture, cancro al seno e di ridurre lo sviluppo di patologie cardiovascolari in donne in post-menopausa.

Arzoxifene(LY353381) può essere descritto come un derivato a lunga azione del raloxifene però in recenti studi di fase 2 su donne con cancro al seno in stato avanzato e cancro all’endometrio, ha dimostrato solo effetti marginali.

I risultati dei test STAR (tra tamoxifene e raloxifene) possono anche essere sfruttati per valutare la possibilità di sviluppare altri farmaci come potenziali chemioterapici per il trattamento del cancro al seno. A causa della farmacocinetica sfavorevole e della rapida velocità di escrezione, il raloxifene non ha portato a un miglioramento significativo sul tamoxifene per quanto riguarda il trattamento del cancro al seno, perciò sarebbe opportuno sfruttare i test STAR sull’arzoxifene poiché, come detto, risulta essere simile strutturalmente al raloxifene ma con il vantaggio di avere una buona farmacocinetica. Bazedoxifene ha una struttura simile al raloxifene, in cui il “core” benzotiofenico è sostituito con un indolo 3-metilsostituito; è attualmente in fase 3 e si spera possa essere utilizzato per il trattamento dell’osteoporosi post-menopausale e per ridurre il rischio di sviluppo di tumore al seno. Ha un’attività antagonista sull’utero e sulla mammella, perciò il suoi impiego a lungo termine risulta essere sicuro.

Alcobifene (EM652) ha una struttura simile al raloxifene ma è somministrato come pro farmaco EM-800. Recenti studi hanno dimostrato una modesta attività su pazienti con cancro al seno divenuti resistenti alla terapia con tamoxifene e inoltre sembra che possa essere in grado di prevenire l’osteoporosi.

1.3.2. Ligandi selettivi per il recettore β 9

Fin dal 1996, l’ottenimento di ligandi selettivi per il recettore β è stato oggetto di numerosi studi e ricerche poiché le possibili applicazioni terapeutiche, che verranno trattate di seguito, sono molto interessanti.

I ligandi selettivi per il recettore ER β possono essere suddivisi in due classi principali che contengono numerose sottoclassi.

Le due classi principali sono:

 Derivati steroidei

21

1.3.2.1. Derivati steroidei

I primi ad essere studiati come possibili agonisti selettivi verso i recettori β sono stati i metaboliti degli ormoni steroidei (nel 1998).

Il più efficace tra i metaboliti del deidroepiandrosterone è risultato il 3β-androstandiolo. La più grande limitazione di questa classe di composti è rappresentata dal gruppo OH in posizione 3, poiché da studi in vivo è risultato che tale gruppo verrebbe facilmente ossidato a chetone dalle 3-idrossisteroide deidrogenasi, andando a perdere l’affinità per ERβ e incrementando l’affinità per il recettore degli androgeni (AR).

Sono stati presi in considerazione anche derivati sintetici dell’androstene e dell’estradiolo.

Per quanto riguarda i derivati dell’androstene, la presenza di un sostituente vinilico in posizione 10β contribuisce molto alla selettività di azione e di legame per ERβ, ma ciò non impedisce anche il legame con il recettore per gli androgeni. Sono stati studiati derivati 3,5 dienici in cui il gruppo ossidrilico in posizione 3 è rimpiazzato da un alchile o da un arile e inoltre viene aggiunto un doppio legame tra le posizioni 3,4.

Tra gli analoghi sintetici dell’estradiolo troviamo 8β-VE2 che presenta un sostituente

vinilico in posizione 8β, e il 16α-LE2 che invece è stato ottenuto mediante l’inserimento

di un anello lattonico nelle posizioni 16α e 17α. Mentre la prima modifica comporta un decremento sull’attività del recettore α ma un mantenimento dell’attività su β rispetto all’estradiolo, la seconda modifica ha conseguenze del tutto opposte alla precedente. Un altro composto molto interessante è il TAS-108 anche detto SR16234 che presenta oltre a un gruppo metilico sullo scheletro di E2 anche un ingombrante sostituente aromatico

al posto dell’ossidrile in posizione 17β; queste modifiche fanno in modo che il composto sia in grado di manifestare antagonismo puro per ERα e un agonismo parziale per ERβ9

.

Infine, l’ultima tipologia di derivati steroidei che è stata presa in considerazione è quella che prevedeva modifiche all’anello B dell’estradiolo. I più significativi composti sono stati il 17α-Eqn e il 17β-Eqn in cui l’anello B è stato reso insaturo così che questo potesse formare con l’anello A un sistema naftalenico e anche i composti ACD-pseudosteroidi ottenuti dall’apertura dell’anello B.

22 Fig.17. Derivati steroidei 8β-VE2 e 16α-LE2

1.3.2.2. Derivati non steroidei

Composti naturali

Alcuni composti naturali, come cumestrolo e genisteina, hanno dimostrato una buona selettività nei confronti di ERβ (rispetto ad ERα). Il cumestrolo, derivato del cromenone, presenta una selettività di 7 volte per ERβ mentre la genisteina, che è un isoflavone estratto dalla soia, presenta una selettività di 20 volte.

La Liquirizigenina, derivato flavonoide estratto dalla Glycyrrhizae Uralensis e usato nella medicina cinese per trattare i sintomi della menopausa, si è dimostato un agonista selettivo nei confronti di ERβ mentre è praticamente nulla l’azione su ERα. Infine anche la naringenina, apigenina hanno dimostrato una significante selettività per ERβ nei saggi di binding.

Indazoli

I derivati di tipo indazolico sono stati sviluppati dal Prof. Katzenellenbogen e rappresentano un valido esempio farmacoforico che verrà trattato di seguito 14.

A partire da tale modello farmacoforico che prevedeva la presenza di due o tre sostituenti arilici, di cui uno o due p-idrossifenili legati ad un core centrale, sul quale potevano anche essere presenti sostituenti non aromatici, si è arrivati a strutture in cui l’anello fenolico è stato fuso con il “core” centrale e, in contemporanea, è stato rimosso il terzo sostituente aromatico. Il composto con l’OH fenolico in posizione 5 che presenta un Cl come sostituente ha dimostrato avere una buona selettività nei saggi di binding, una buona attività agonista su ERβ e una trascurabile attivazione su ERα.

23 Fig.18. Modello farmacoforico per ligandi ERβ selettivi e sua applicazione ai derivati

indazolici

Diaril-proprionitrile (DPN)

Il DPN, scoperto anni fa da Katzenellenbogen e dai suoi collaboratori dell’Università dell’Illinois, è risultato essere come uno dei più potenti e selettivi agonisti ERβ con una selettività di 70 volte nei saggi di binding e di 78 volte nei saggi trascrizionali. In questi studi, anche se è presente un centro chirale, è stato testato solo la miscela racemica. Un recente articolo ha però dimostrato che l’entantiomero S è il più attivo su ERβ. Questo va a confermare le ipotesi predette da studi di modellistica molecolare in cui l’entantiomero S con il suo gruppo CN va ad interagire con la Met336 mentre l’R non permette tale interazione a causa della lontananza del CN dal residuo amminoacidico.

Fig.19. DPN

Derivati dibenzilici

Questi composti prendono spunto dal DPN e infatti presentano lo stesso motivo strutturale. La sostituzione con gruppi polari e non della catena centrale ha portato ad un incremento marcato della selettività nei confronti del sottotipo recettoriale β. In particolare le sostituzioni di questa catena con gruppi non polari sembrano essere quelle aventi maggiore interesse farmacologico.

24 Fenetil piridine

Anche in questa categoria i ligandi prendono spunto dal DPN; essi in particolare hanno una struttura che si basa sullo scaffold comune fenetilpiridinico. Tuttavia nessuno di questi composti risulta avere proprietà migliori rispetto alla loro controparte “omociclica”, probabilmente perché l’eterociclo, essendo più polare, sposta questi composti dall’acqua verso la sezione del sito attivo più lipofila. Comunque sia, anche questi composti rispecchiano una grande selettività verso il sottotipo recettoriale β.

Fig.21. Fenetil piridine

Benzossazoli

Tra tutti questi derivati sicuramente il più importante e significativo è ERB-041 in quanto esso mostra una selettività di 200 volte nei saggi di binding . Nonostante siano stati sintetizzati molti derivati a partire da ERB-041, questa è rimasta la molecola con il profilo migliore. La differenza nel legame con ERα e ERβ è stata studiata combinando l’analisi della cristallografia a raggi X con studi di docking; in entrambi i recettori è risultato che le interazioni fondamentali con i residui di Glu/Arg e His vengono mantenute in entrambi i sottotipi recettoriali perciò la differente affinità può essere invece attribuita al comportamento del residuo vinilico con i residui non conservati Met421 (ERα)/ Ile373 (ERβ). Infatti la Ile373 permette al gruppo vinilico di posizionarsi nel binding pocket mentre la catena lunga della Met421 provoca repulsione sterica.

Fig.22. ERB-041

Benzoimidazoli

Questa classe strutturale è stata investigata alla Pfitzer dove sono stati ottenuti buoni risultati con quattro principali composti. Buone proprietà di binding sono state ottenute

25 con il derivato 2-fenilsostituito ma la sostituzione di questo gruppo con un anello eterociclico a cinque atomi di carbonio come l’anello N-metilpirrolico, ha portato a un significativo aumento della selettività verso il recettore ERβ. Come è stato confermato da studi di docking, questa aumentata selettività è dovuta al fatto che il gruppo N-metilico instaura un’interazione idrofobica con la catena lipofila laterale di Ile373 in ERβ, mentre ciò non avviene con il residuo Met421 di ERα.

Fig.23. Derivati benzoimidazolici

Tetraidrofluorenoni

Questi derivati, sviluppati alla Merck, hanno una struttura che viene considerata “parzialmente steroidea” poiché il sistema triciclico ricorda gli anelli A-C degli steroidi. Sono stati sintetizzati composti sostituiti in posizione 9a con un gruppo n-butile; gli effetti di questo sostituente sono stati valutati su miscele racemiche e si è potuto riscontrare che la configurazione S mostrava nei saggi di binding un affinità maggiore di 100 volte rispetto all’enantiomero R.

L’analisi a raggi X dei complessi cocristallizzati con il recettore ERβ ha permesso di evidenziare il ruolo della catena n-butilica nella posizione 9a dell’enantiomero S : in questa struttura l’OH fenolico è implicato in un network di legami a idrogeno con Glu305 e Arg346 mentre la catena n-butilica si pone molto vicino al residuo di Ile373, cosa che non è affatto possibile nell’ERα a causa dell’ingombrante residuo della Met421.

Fig.24. Derivati tetraidrofurenoni

Isocumarine

Una serie di isocumarine, ispirate alla classe degli isoflavoni fitoestrogeni, ha riportato una notevole selettività verso ERβ sia nei saggi di binding che trascrizionali.

26 Queste molecole differiscono tra loro per il sostituente in posizione 5; in particolare il 5-bromoderivato ha mostrato la migliore affinità in termini ERβ-binding affinity [Cap.2.2 pag. 33].

Fig.25. Isocumarine

Pirimidine

All’università dell’Illinois sono stati scoperti ligandi con struttura pirimidinica 2,5-diaril sostituita. In particolare, il composto 4,6-dimetilsostituito è risultato essere quello con il maggiore livello di selettività verso il recettore beta.

Fig.26. Pirimidine

Difenilamine

Il motivo strutturale difenilamminico che ha ottenuto il miglior risultato dai saggi di binding prevedeva anche la presenza di un sosituente ossidrilico in posizione para su entrambi gli anelli aromatici. Il derivato N-benzil sostituito, inoltre, ha mostrato la più alta selettività mentre il rimpiazzo dell’anello N-benzilico con un sostituente isopentilico ha portato a una significativa riduzione della selettività.

Fig.27. Difenilamine

Benzossazine

Questi composti non si legano in maniera così forte al recettore beta però dimostrano una buona potenza nei saggi trascrizionali. Uno tra i composti più interessanti è il

27 derivato 2-etil-5-metil sostituito che ha mostrato un EC50 di 8 nM con un rapporto di

selettività β/α pari a 21 nM.

Studi di docking hanno evidenziato che il gruppo OH dello scaffold benzossazinico interagisce con His524(α)/475(β) e l’altro OH partecipa al network di legami a idrogeno con Glu353(α)/305(β) e Arg394(α)/346(β); la selettività verso ER β sembra possa dipendere dal sostituente in posizione 5 , e quando è un metile risulta essere troppo vicino alla Met421 in α mentre si accomoda molto bene nel binding pocket del recettore beta dove si trova la Ile373.

Fig.28. Benzossazine

Sulfonamidi

I derivati a struttura benzensulfonamidica diarilsostituita hanno recentemente dimostrato un interessante profilo estrogenico; inoltre, i derivati con due gruppi OH nelle posizioni para degli anelli aromatici sono quelli che possiedono il più alto livello di ER-β selettività.

Fig.29. Benzensulfonamidi

1.3.3. Possibili applicazioni terapeutiche dei ligandi ERβ selettivi 9

L’attenzione rivolta verso la ricerca di ligandi selettivi per il recettore ERβ è dovuta proprio al fatto che hanno un ruolo cruciale in molti processi patologici. Lo sviluppo di agonisti verso il sottotipo recettoriale β può promuovere gli effetti benefici che gli estrogeni hanno in quegli organi e tessuti dove il recettore β è espresso selettivamente, limitando così l’azione proliferativa mediata da ERα, nel caso di tessuti che contengono anche questo sottotipo recettoriale.

28 Trattamento del cancro - Il ruolo del recettore β risulta essere fondamentale nella cura del cancro al seno. L’azione degli estrogeni sul recettore ERβ modera la forza proliferativa che gli estrogeni stessi hanno attraverso ERα, infatti è stato dimostrato che l’introduzione di ERβ in linee cellulari di tumori alla mammella in cui sia presente anche ERα, riduce la proliferazione e la crescita del tumore9

.

I recettori ERβ svolgono un ruolo importante anche nel cancro della prostata, dei polmoni e nei tumori colon-retto. È stato osservato che ERβ è presente nella prostata in condizioni fisiologiche mentre nel caso di ipertrofia prostatica benigna e nel tumore confinato a livello della prostata i livelli del recettore diminuiscono con il progredire della malattia così che viene perso il ruolo di controllo dell’attività proliferativa di ERα. Al contrario, i livelli di ERβ sembrano aumentare drasticamente nelle metastasi derivanti dal cancro alla prostata. Infine, ERβ è il sottotipo recettoriale che predomina anche a livello del colon; è stato riscontrato che i livelli di questo recettore decrementano con la progressione della patologia.

Riproduzione e Fertilità – la predominanza del recettore β nelle cellule granulose delle ovaie suggerisce che farmaci selettivi su tale recettore potrebbero essere molto utili nel trattamento dell’infertilità, infatti si è visto che i ligandi selettivi per ERβ stimolano la follicologenesi in modelli di ratti privati dell’ipofisi.

Trattamento dei disturbi che insorgono durante la menopausa – la menopausa è collegata a molti aspetti fisiologici, tra cui la perdita ossea ed effetti sul sistema cardiovascolare. Mentre non sono stati riscontrati effetti benevoli sulla perdita ossea dovuta alla menopausa, l’azione di ligandi selettivi su ERβ, se somministrati negli stadi pre-menopausali sembra avere effetti positivi per quanto concerne la protezione del sistema cardiovascolare.

Attività anti-infiammatoria – il recettore β non è importante solo nell’implicazione di patologie come l’artrite reumatoide, ma anche in altre patologie infiammatorie quali shock settico e infiammazioni seguite a danni polmonari. Importante anche l’implicazione che tale recettore può avere sulla regolazione di affezioni epatiche, spleniche ed ai linfonodi.

29 Neuroprotezione ed effetti sul comportamento – ligandi selettivi per ERβ sembrano mostrare una sorta di neuroprotezione in modelli animali che presentano danni di natura ischemica. Questi inoltre sembra che possano ridurre anche dolori neuropatici. Alcuni comportamenti inusuali riscontrati in topi ERβ knock-out, hanno suggerito che estrogeni ERβ-selettivi possano avere effetti nel trattamento di stati ansiosi e depressivi oltre che giocare un ruolo importante sulla sfera dell’apprendimento e della memoria.

Altri effetti metabolici – ERβ sembra essere coinvolto anche in molti processi metabolici e potrebbe quindi diventare un possibile target per il trattamento di alterazioni metaboliche come l’obesità. In un recente studio si è valutato l’azione dei ligandi ERβ selettivi su topi in cui era stata precedentemente indotta l’obesità così si è potuto riscontrare che l’utilizzo di queste sostanze porta ad un diminuzione di peso, ad una riduzione del tasso plasmatico di colesterolo e di glucosio con un aumento della massa magra a discapito di quella grassa.

Trattamento del morbo di Alzheimer13 – è stato osservato che ERβ gioca un ruolo importante anche nella regolazione dell’Insuline-Degrading Enzyme (IDE), enzima coinvolto nella degradazione dell’insulina e nel catabolismo della proteina β-amiloide, che se si accumula a livello cerebrale e che sembra possa contribuire allo sviluppo del morbo di Alzheimer. È interessante notare che la ridotta secrezione di estrogeni nelle donne in menopausa sembra possa portare a un decremento nella produzione di IDE e ad un aumento nel rischio di sviluppare la malattia.

30

2.

INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

2.1. Modello farmacoforico per il ligandi ERβ-selettivi 9

Il modello farmacoforico per i ligandi ERβ-selettivi è stato sviluppato a partire da un modello per i ligandi non selettivi per il recettore degli estrogeni, che prevedeva la presenza di due o tre sostituenti arilici, di cui uno o due p-idrossifenili, legati a un core centrale (arilico, etilenico), sul quale potevano essere presenti anche sostituenti non aromatici17.

Per lo sviluppo di tale modello farmacoforico si sono presi in considerazione diversi parametri:

 Interazioni fondamentali al fine del legame con ER [Cap.1.2.2.3 pag.14 e seg.]

 Strutture di molecole di natura non steroidea che nei saggi di binding avevano mostrato affinità e selettività verso gli ERβ

 Analisi dei binding-pocket dei due recettori, tenendo in considerazione la differenza dei volumi di ERα e di ERβ e la presenza di due residui amminoacidici non conservati.

Il questo modello, l’anello fenolico è stato fuso con il “core” centrale e in contemporanea è stato rimosso il terzo sostituente aromatico.

Fig.30. Modello farmacoforico

In generale le caratteristiche strutturali che sono risultate importanti per l’ottenimento di molecole affini e selettive per gli ERβ sono9

(Fig.31):

 OH di tipo fenolico: è l’interazione energeticamente più importante ai fini del legame con ERβ poiché è implicato in un network di legami a idrogeno con Arg346 e

31 Glu305 e con una molecola d’acqua. Questa interazione però non è in grado di assicurare la selettività recettoriale perché si instaura sia nell’ERα che nell’ERβ.

 OH di tipo fenolico/pseudo fenolico o alcolico, opposto al precedente : serve per instaurare un legame a idrogeno con His475 in ERβ e con His524 in ERα. Nel momento in cui questo gruppo si trovasse vicino all’OH descritto sopra, si creerebbe un’interazione con Thr299 di ERβ che porterebbe ad un aumento di selettività recettoriale. Tale aumento è dovuto al fatto che la Thr347 presente in ERα risulta parzialmente ostacolata nel formare il legame con l’OH per la presenza dell’ingombrante residuo di Leu384 che è meno flessibile della Met336 che si trova in ERβ.

Tuttavia, ci sono alcune molecole che non possiedono questo gruppo ossidrilico perciò si può dedurre che l’interazione che si crea è meno importante della prima e che questo legame può essere rimpiazzato dalla presenza di interazioni lipofile positive.

 “Bulge A”: è una protuberanza che si trova nei pressi del residuo non conservato Met336 di ERβ ed è uno degli elementi più importanti ai fini della selettività recettoriale. Infatti, la presenza della catena laterale flessibile della metionina permette che questa protuberanza si possa accomodare in ERβ, mentre la Leu384 in ERα, più ingombrata e meno flessibile, lo impedisce. In molti esempi di ligandi l’inserimento di un sostituente a questo livello è fondamentale per la selettività verso ERβ.

 “Bulge B”: è la seconda protuberanza che si trova in corrispondenza del secondo residuo non conservato (Ile373 in ERβ, Met421 in ERα) e rappresenta un altro elemento importante per la selettività recettoriale in quanto l’interazione con il recettore β viene mantenuta anche se vengono inseriti piccoli sostituenti, mentre con il recettore α viene perduta a causa della presenza della catena laterale della metionina.

 “Inlet”: cioè un’insenatura vicino al bulge B in corrispondenza della posizione 16α di E2. Questa sembra essere una caratteristica molto importante per ottenere un legame con il recettore ERβ: posizioni ingombranti a questo livello portano a una perdita di affinità verso ERβ.

32 Fig.31. Caratteristiche strutturali necessarie per ottenere selettività verso ERβ

33 2.2. Relative Binding Affinity (RBA) 9

In letteratura si utilizzano due differenti sistemi per specificare l’affinità di un ligando verso il recettore ERα o ERβ.

I laboratori accademici, in generale, esprimono l’attività degli estrogeni, nei confronti di entrambi i sottotipi recettoriali, calcolando il valore delle relative affinità di binding (RBA). Più precisamente, tale valore di RBA, calcolato in percentuale, prende come riferimento il valore dell’IC50 dell’estradiolo. Questo viene poi diviso per il valore

dell’IC50 del ligando analizzato ed il conseguente risultato viene poi moltiplicato per

100, in modo da ricavarne un valore percentuale.

RBA(%) = (IC50 estradiolo/ IC50ligando) x 100

Quindi un valore di RBA uguale al 100% rappresenta un’attività identica a quella dell’estradiolo sia che si parli di ERα o di ERβ.

Ѐ importante, inoltre, conoscere la selettività di un composto verso un dei due sottotipi recettoriali; pertanto, per avere un valore numerico di tale selettività basterà fare un rapporto dei due valori di RBA. Il valore del rapporto sarà indicativo per la selettività recettoriale.

Il secondo modo di trattare l’affinità recettoriale è quello di esprimerla come un valore di Ki che si calcola dal valore di IC50 ottenuto dai saggi di binding dei ligandi (una

procedura competitiva che misura il binding dei ligandi) utilizzando l’equazione di Cheng-Prussof:

Ki = IC 50 /(1 + [tracer]/ )

Nei saggi di binding che sono saggi radiometrici competitivi, il “tracer” è generalmente [H3]E2; i risultati di Kd per E2 sono 0.2 nM per ERα e 0.5 per ERβ.

Questi due valori di Kd ottetuti per E2 possono essere usati per calcolare la Kd dei ligandi

partendo dai valori di RBA:

= /(RBA/100)

Se vengono usati esperimenti fluorimetrici la concentrazione del “tracer” e il suo valore di Kd devono essere sostituiti per ottenere i valori di Ki a partire dai valori di IC50.

34 2.3. Molecole di letteratura prese di riferimento

Le molecole utilizzate per la ricerca di nuovi ligandi selettivi per ERβ sono state estrapolate da articoli di letteratura. Le molecole di riferimento per gli studi computazionali sono state scelte in modo da avere un composto per ognuna delle classi strutturali di agonisti β e in particolare sono state considerate quelle che possiedono il maggior valore di RBA [pag.34]. Questa decisione è stata necessaria al fine di avere un quadro completo di come tutte le differenti strutture siano in grado interagire all’interno del recettore β.

Nel dettaglio i ligandi presi in considerazione si possono dividere in varie classi strutturali che sono già state ampiamente trattate nel capitolo 1.3.2; in particolare, tutti i ligandi utilizzati come riferimento vengono riportati in Tabella1 dove viene indicata: la classe strutturale di appartenenza, la precisa struttura utilizzata e i relativi valori di RBA.

Classe strutturale Struttura RBA Nome utilizzato in questa tesi Indazoli14 N N OH O H CF_{3 69 Lig6} Aldossime aromatiche,15,16,17 _O H N O H Cl OH 4.2 Lig7 OH F N O H O H Cl 87.1 Lig8 Analoghi dell’E2 mancanti dell’anello B18 CH₃OH H H Cl O H 168 Lig9

35 Isocumarine9 O Br OH O H O 129 Lig10 Derivati del DPN19 CN CN O H OH _{82 Lig11} Fenetil piridine20 N O H OH CH₃ H3C _{7.5 Lig12} Dibenzili21 O H OH CH₃ H3C _{697 Lig13} Benzoimidazoli9 N N O H 137 Lig14 Tetraidrofluorenoni22 _HC O 3 C H₃ O H 16 Lig15 Benzossazine23 O N OH OH C H3 O H 310 Lig16

36 Di fenilammine24 N OH O H 18.1 Lig17 Diarilprimidine9 N N O H OH Et Et 11 Lig18 Sulfonamidi 25 S O O N CF₃ OH 2.56 Lig19

Tabella1: Molecole di letteratura utilizzate come riferimento nelle procedure di VS [Cap.6.1 pag. 102 e seg.]

37

38

3.

PARTE DI SINTESI

La parte relativa alla sintesi di questo progetto di tesi è rivolta all’ottenimento di composti con struttura salicilaldossimica e chetossimica. Queste strutture, già precedentemente sintetizzate dallo stesso gruppo di ricerca del Prof. Minutolo, hanno dimostrato di possedere buone proprietà in ambito di affinità e selettività nei confronti del recettore β degli estrogeni. Poiché sia dai saggi di binding sia dai saggi trascrizionali (come si vedrà di seguito) si sono ottenuti promettenti risultati, è stato deciso di sintetizzare i composti in scala maggiore in modo da avere a disposizione centinaia di mg per composto così da poter effettuare ulteriori test farmacologici per valutare l’attività antiproliferativa in diversi tipi di linee cellulari tumorali sensibili alla stimolazione di ERβ.

3.1. Salicilaldossime

Il gruppo ossimico è stato introdotto per la prima volta in composti 3,4-diarilsalicilaldossimici e 3,4-diarilantranilaldossimici sulla base del modello farmacoforico [trattato nel Cap.2.1 pag. 30] sviluppato per i ligandi non selettivi del recettore degli estrogeni9.

Il raggruppamento salicilaldossimico, di nostro interesse, è stato inserito come gruppo bioisostero dell’anello A dell’estradiolo poiché ne mima le sue principali caratteristiche grazie alla formazione del legame a idrogeno intramolecolare tra l’azoto ossimico e l’OH fenolico (anello psudofenolico).

La prima classe di composti, a cui si è arrivati a partire dal modello farmacoforico proposto dal Prof. Katzenellenbogen, sono stati i derivati monoaril-salicilaldossimici o anche detti “Salicilaldossime A” che hanno visto come prima e significativa modifica strutturale la rimozione dell’anello arilico in posizione 3 15

39 O H central core OH substituent OH O H N O H OH N O H O H R R1 R1 R Salicilaldossime A Salicilaldossime B Modello farmaciforico ER selettivo

Fig.32. Derivazione strutturale delle due serie di salicilaldossime, Salicilaldossime A e Salicilaldossime B a partire dal modello farmacoforico ERβ

40 3.1.1. Salicilaldossime A

Le Salicilaldossime A17 più significative sono state il composto 1a, 1b e 1c riportati in figura: 1a 1b 1c RBA ER0.007 % RBA ER0.55 % 79 RBA ER0.065 % RBA ER4.21 % 65 RBA ER0.011 % RBA ER7.01 % 64 OH O H N O H OH Cl O H N O H OH Cl F O H N O H

Il composto 1a, pur mostrando un’affinità piuttosto bassa si è dimostrato selettivo verso ERβ (RBA ERβ=0.55%, β/α= 79); da questo composto sono seguite una serie di modifiche strutturali che hanno permesso l’introduzione di un sostituente in posizione 3 del nucleo centrale. La migliore modifica si è ottenuta introducendo un atomo di cloro. Nei saggi trascrizionali il composto 1b si è dimostrato un agonista parziale su ERβ (EMAX= 60%, EC50= 11 nM).

Infine l’inserimento di un fluoro in posizione meta rispetto all’OH sull’arile periferico (1c) ha comportato un miglioramento sia nel binding che nell’attività funzionale (EMAX=

85%, EC50= 4.8 nM, β/α EC50= 4 )17.

Visti i risultati ottenuti dai composti 1a, 1b e 1c, sono state apportate ulteriori cambiamenti alle strutture molecolari per esplorare in modo esaustivo questi derivati. La modifica strutturale che ha condotto proprio ai composti sintetizzati in questo lavoro di tesi, è stata quella di invertire la posizione del gruppo ossimico con il gruppo OH dando origine così a quelle identificate come Salicilaldossime B17.

OH O H N O H groups exchange CH₃ F 3 4 3'

41 3.1.2. Salicilaldossime B

Il composto 2 ha portato ottimi risultati sia riguardo all’affinità sia riguardo alla selettività nei confronti del recettore ERβ, infatti come è stato riportato dai saggi di binding il valore di selettività calcolato come rapporto tra β e α è risultato pari a 41 (per i saggi trascrizionali si veda più avanti).

Il composto 3, si ottiene grazie all’inserimento di un atomo di fluoro in posizione meta del sostituente 4-idrossifenilico (cioè in posizione 3’); questa sostituzione è stata fatta perché presente anche nel derivato ERB-041, uno tra i più potenti agonisti ERβ17. Il composto 3, nei saggi di binding ha mostrato una leggera perdita di selettività verso ERβ. O OH N O H H 2 RBA ER0.064 % RBA ER2.64 % 41 O OH N O H H F RBA ER0.021 % RBA ER0.970 % 46 3

In seguito ai buoni risultati ottenuti per il composto 2 è stato inserito un atomo di cloro in posizione 2 ottenendo il derivato 2a che ha dimostrato un’alta affinità, superiore a quella dell’E2. L’inserimento di un metile ha invece portato a un decremento sia per

l’affinità che per la selettività su entrambi i sottotipi recettoriali (2b).

O OH N O H H Cl O OH N O H H Cl CH₃ 2a 2b RBA ER4.46 % RBA ER130 % 29 RBA ER0.074 % RBA ER0.64 % 8,6

42 I composti 2c, con un metile in posizione 2 e un atomo di cloro in posizione 5, e il composto 2d, con un metile in 2, un atomo di cloro in 5 e un atomo di fluoro in 3’, hanno mostrato buoni livelli di affinità verso ERβ però con scarsa selettività16

. O OH N O H H CH₃ Cl O OH N O H H CH₃ Cl F 2c 2d RBA ER1.47 % RBA ER15.8 % 11 RBA ER0.039 % RBA ER7.90 % 20

In conclusione, dai dati ottenuti, è stato deciso di sintetizzare i derivati 2 e 3, appartenenti alla categorie delle Salicilaldossime B in modo da poter effettuare ulteriori approfondimenti farmacologici. Infatti, la semplice inversione tra il gruppo ossidrilico e quello ossimico dello scaffold salicilaldossimico, ha permesso di ottenere il derivato 2 che presenta, rispetto al derviato 1a (classe delle Saliciladossime A) un incremento dell’affinità di legame verso il recettore β di 5 volte (1a: RBA ERβ = 0.55%, 2: RBA ERβ= 2.64%)16

. Inoltre, la scelta di sintetizzare sia il composto 2 sia il composto 3 è anche dipesa dal fatto che entrambi sono in grado di mantenere un significativo livello di ERβ selettività. (2: RBA β/α= 41, 3: RBA β/α= 46).

3.2. Chetossime

Questa classe strutturale è stata ottenuta a partire da quella delle Salicilaldossime B introducendo sul carbonio ossimico un gruppo metilico o meglio sostituendo il gruppo aldossimico con quello chetossimico. In questo modo si è dato origine a una serie di derivati metil-chetossimici.

Il primo composto sintetizzato (4) è stato l’analogo metilato della salicilaldossima 2 e inoltre, analogamente alle modifiche strutturali descritte precedentemente, è stato anche introdotto in posizione 3’ un atomo di fluoro ottenendo così il composto 5.

43 OH N O O H O H OH N O O H O H F 4 5

Nei saggi di binding hanno mostrato eccellenti livelli di affinità e selettività: composto 4 ERα= 0.54%, RBA ERβ= 47.5%, β/α= 84.5

composto 5 ERα= 0.16%, RBA ERβ= 11.9%, β/α= 72.3.

3.3. Saggi trascrizionali

Il composto 2 poiché ha mostrato la più alta affinità e selettività per ERβ è stato sottoposto a vari test biologici per valutare il suo carattere farmacologico. L’attività trascrizionale è stata determinata in cellule endometriali umane (HEC-1) per entrambi i sottotipi recettoriali utilizzando E2 come riferimento17. Il composto 2 è risultato un

potente agonista di ERβ con un valore di EC50 pari a 10 nM, un’attivazione recettoriale

uguale a quella dell’estradiolo (100%) e anche con una buona selettività verso ERβ (EMAX= 100%, EC50= 10 nM, β/α-EC50= 1.7).

Fig.34. Attività trascrizionale di 2 e di E2

Anche derivati chetossimici sono stati utilizzati per i saggi trascrizionali e hanno condotto a risultati piuttosto soddisfacenti.

Il buon profilo dimostrato nei saggi di bindig viene mantenuto anche nei saggi trascrizionali dove hanno dimostrato di possedere un carattere pienamente agonista: -il composto 4 ha mostrato EC50= 4 nM, β/α-EC50= 7.2, RTP β/α=18