UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Magistrale in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Tesi di laurea:
STUDI COMPUTAZIONALI PER L’IDENTIFICAZIONE DI
MOLECOLE CAPACI DI INTERAGIRE CON LA PROTEINA NONO
Relatore: Prof. Tiziano Tuccinardi
Relatore: Dott.ssa Margherita Lapillo
Candidato: Natalia Martelli
(Mat. N° 441859)
Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-08
ANNO ACCADEMICO 2016-2017
Il melanoma cutaneo è un tumore che deriva dalla trasformazione tumorale dei melanociti, alcune delle cellule che formano la pelle. In Italia i dati AIRTUM (Associazione Italiana registri tumori) parlano di circa 13 casi ogni 100000 persone, con una stima che si aggira attorno a 3150 nuovi casi ogni anno tra gli uomini e 2850 tra le donne. Inoltre l’incidenza è in continua crescita ed è quasi raddoppiata negli ultimi dieci anni.
Ad oggi sono disponibili una serie di trattamenti tra cui la chirurgia, la radioterapia e la chemioterapia. Sono tuttavia in corso di studi altre tipologie di terapie mirate e vaccini. Il principale fattore di rischio per il melanoma cutaneo è l’eccessiva esposizione alla luce ultravioletta, che arriva a noi sotto forma di raggi UVA, UVB e UVC, ed è principalmente rappresentata dai raggi del sole. La troppa esposizione al sole rappresenta un potenziale pericolo perché può danneggiare il DNA delle cellule della pelle ed innescare così la tra-sformazione tumorale.
Il danno al genoma in seguito alla esposizione ad agenti mutageni può sfociare prevalen-temente in due tipologie di danno: quello a carico di un solo filamento o di entrambi (DNA DSB). Per quest’ultima, le cellule eucariote hanno sviluppato due meccanismi di riparazio-ne: la HR (riparazione per ricombinazione) e la NHEJ (riparazione non omologa).
In questo lavoro di tesi assume un ruolo fondamentale la riparazione NHEJ, in quanto in questa via entra a partecipare la proteina da me studiata (NONO): quest’ultima interviene a livello della RNA polimerasi durante la replicazione dello stesso.
Nel dettaglio NONO, insieme ad altre proteine, rientra nella famiglia delle DBHS (Droso-phila Behaviour/human splicing). NONO è una proteina dimerica ed è caratterizzata dalla presenza di due catene di cui una in grado di legarsi all’RNA mentre l’altra al DNA. NONO presenta una struttura centrale che contiene circa 300 amminoacidi, e al cui interno ritroviamo due motivi di riconoscimento in tandem dell’RNA (RRM1 ed RRM2), un do-minio NOPS ed un’estremità carbossi-terminale avvolta a spirale in senso antiparallelo e destrorsa che posiziona due dei quattro domini di riconoscimento del RNA ai lati di un ca-nale idrofilo di circa 20Å. NONO è implicata nel controllo del checkpoint G1/S nel quale ha la capacità di bloccare la replicazione del DNA in seguito a mutazioni.
Lo scopo della mia tesi è stato quindi la ricerca di molecole in grado di legarsi alla NONO ed incrementare così il meccanismo di difesa della cellula. Pertanto, è stata sviluppata una
piattaforma di Virtual Screening (VS) partendo dall’analisi della struttura cristallografica della proteina (codice PDB 3SDE).
L’intero lavoro può essere schematizzato secondo il work flow mostrato in Figura 1.
Figura 1
Inizialmente è stata applicata una procedura di self-docking utilizzando i 12 software di docking disponibili nel mio laboratorio per valutare quale tra questi fosse in grado di ri-produrre la pose cristallografica del ligando considerato, in questo caso l’RNA. La struttu-ra della proteina NONO è stata infatti risolta nella forma apo (forma non legata) per cui, dopo opportuna sovrapposizione con la struttura di una proteina omologa (codice PDB 4YOE), è stato estratto l’RNA ed utilizzato quale ligando di riferimento per il self-docking. Considerando un valore soglia di RMSD (Root Mean Square Deviation) di 2Å, il pro-gramma VINA è risultato essere il migliore allo scopo.
Il database ENAMINE è una dataset commerciale di circa 1500000 molecole. In questo studio sono state considerate solo quelle molecole aventi un peso molecolare maggiore o uguale a 350Da, valore corrispondente al peso molecolare del ligando preso come riferi-mento. I composti così selezionati sono stati circa 100000.
Le molecole considerate sono state sottoposte ad una procedura di screening Receptor-ba-sed (RB) con il programma FLAP (Fingerprints for Ligands And Proteins), il quale permet-te di esplorare lo spazio farmacoforico tridimensionale di ligandi e propermet-teine. È stata prima individua la pocket corrispondente alla cavità proteica di legame e poi valutato, attraverso la funzione pre-filtro, quali molecole fossero in grado di interagire al meglio con i MIFs (Molecular Interaction Fields) della cavità stessa.
Pre-filtro receptor-based con FLAP Docking molecolare con VINA Dinamica molecolare Validazione mediante self-docking Selezione dataset ENAMINE
Successivamente, le molecole filtrate sono state sottoposte al docking con il programma VINA, il software migliore risultante dall’analisi di self-docking. Sono stati così selezionati 19 composti d’interesse.
Infine, è stata effettuata la simulazione di dinamica molecolare dei composti ottenuti attra-verso i programmi della suite AMBER14, per verificare la stabilità delle interazioni sugge-rite dal docking. Le traiettorie ottenute sono state analizzate tenendo in considerazione sia l’andamento dell’RMSD che il mantenimento dei legami ad idrogeno dei ligandi nell’inte-ro corso della simulazione.
Alla fine di questa procedura una sola molecola è stata considerata promettente e sarà ac-quistata per valutarne l’attività attraverso futuri studi in vitro.
