“AR-V7 su RNA esosomiale come fattore predittivo di resistenza ad abiraterone ed enzalutamide. Studio retrospettivo in pazienti con carcinoma della prostata metastatico resistente alla castrazione”.
Abstract
Background: la variante di splicing 7 del recettore degli androgeni (AR-V7) sembra essere associata con la resistenza ai nuovi agenti ormonali in pazienti con carcinoma della prostata metastatico resistente alla castrazione (mCRPC). A causa dei limiti dei metodi disponibili per l'analisi di AR-V7, l'identificazione di un metodo di rilevazione affidabile può facilitare l'uso di questo biomarker nella pratica clinica.
Obiettivo: confermare AR-V7 come fattore predittivo di resistenza ai nuovi agenti ormonali e sviluppare un nuovo metodo per valutare AR-V7 attraverso digital droplet PCR (ddPCR) in RNA esosomiale derivato dal plasma.
Disegno dello studio e metodi: sono stati prelevati campioni di plasma da 40 pazienti con mCRPC all’inizio del trattamento ormonale con abiraterone o enzalutamide. Al fine di analizzare AR-V7, sono stati isolati gli Esosomi e l’RNA è stato estratto tramite ddPCR.
Analisi di Outcome e statistiche: la concentrazione del gene target espressa in copie/ml è stata determinata tramite ddPCR. Le analisi statistiche sono state effettuate con il Software SPSS.
Risultati e limiti: Dei 40 pazienti inclusi nello studio, 27 pazienti sono stati trattati con Abiraterone e 13 con Enzalutamide; il 42,5% dei pazienti è risultato AR-V7+. La sopravvivenza mediana libera da progressione è risultata significativamente più alta nei pazienti AR-V7- rispetto ai pazienti AR-V7 + (13 vs 4 mesi; p <0.001). La sopravvivenza globale è stata significativamente più lunga nei pazienti AR-V7- rispetto ai pazienti AR-V7+ (24 mesi vs. 8 mesi, p <0.001).
Conclusioni: questo studio dimostra che la presenza della variante di splicing 7 del recettore degli androgeni può essere un fattore predittivo di resistenza ai nuovi agenti ormonali, rendendo pertanto AR-V7 un biomarker clinicamente rilevante. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’RNA esosomiale è una fonte affidabile di AR-V7, che può essere sensibilmente rilevata mediante saggio ddPCR.
Introduzione
Con “malattia resistente alla castrazione (CRPC)” si definisce un gruppo di pazienti alquanto eterogeneo, sia dal punto di vista clinico che biologico, affetti per lo più da malattia localmente avanzata e/o metastatica, in progressione al trattamento con terapia di deprivazione androgenica1.
In generale, si definisce CRPC la malattia che progredisce in corso di ADT dopo che:
-la terapia androgeno-deprivativa (LH-RH agonista, LH-RH antagonista o orchiectomia) è stata convertita in BAT;
-l’eventuale monoterapia con antiandrogeno puro (nei casi in cui sia indicata) sia stata convertita in BAT; -il BAT sia stato convertito in sola terapia androgeno-deprivativa, rimuovendo l’antiandrogeno senza successo (assenza di withdrawal response).
Si stima che alla diagnosi di CRPC, più dell’80% dei pazienti abbia già sviluppato metastasi ossee1 e che dei
pazienti non metastatici alla diagnosi di CRPC, circa un terzo sviluppi metastasi nei successivi 2 anni1.
Benchè questi dati di prevalenza siano da considerare con cautela, è certo che il paziente affetto da CRPC ha generalmente prognosi infausta, con una sopravvivenza mediana attesa che fino a pochi anni fa era di circa 14 mesi 1. Parametri prognostici indipendenti storicamente validati sono: il performance status, i valori basali
di emoglobina, i livelli circolanti di LDH, fosfatasi alcalina e PSA nonché il Gleason score alla prima diagnosi 1.
Le opzioni di trattamento disponibili per questa fase di malattia sono aumentate considerevolmente nel giro di pochi anni e includono nuovi chemioterapici, oltre al docetaxel abbiamo oggi a disposizione il cabazitaxel, nuove terapie ormonali, vaccini e radiocomposti. Le nuove terapie ormonali (abiraterone ed enzalutamide) sono state inizialmente testate dopo il fallimento della chemioterapia di I linea con docetaxel, che, nell’ultimo decennio, ha rappresentato lo standard terapeutico nel paziente affetto da CRPC. Successivamente, alla luce dei buoni risultati terapeutici e del profilo di tossicità, apparentemente migliore di quello della chemioterapia, sono state testate anche nei pazienti cosiddetti “chemo-naïve”, cioè prima della chemioterapia con Docetaxel. Purtroppo, la mancanza di studi comparativi non consente di definire un algoritmo terapeutico applicabile a tutti i pazienti, incluso il docetaxel al quale è stato attribuito artificiosamente un ruolo discriminante nella storia naturale della malattia ( fungendo da “spartiacque” tra pazienti chemo-naive e pazienti post docetaxel). Solo recentemente sono apparsi in letteratura contributi relativamente a potenziali fattori predittivi di risposta ai nuovi farmaci (come ad esempio le varianti del recettore androgenico e l’alterazione di geni coinvolti nella riparazione del DNA)2, 3,4. che potrebbero aiutare
a differenziare i pazienti con maggior probabilità di risposta alle nuove terapie ormonali rispetto alla chemioterapia).
Ad oggi, al fine di valutare la risposta al trattamento in corso, consideriamo la condizione clinica del paziente e la progressione di malattia, definita secondo i criteri del Prostate Cancer Working Group (PCWG) 35
mentre il PSA è scarsamente predittivo di risposta alla ormonoterapia o alla chemioterapia.
E’ ormai un dato di fatto che il concetto di carcinoma della prostata resistente alla castrazione non coincide con quello di ormono indipendenza. L’alterazione delle vie di segnale del recettore androgenico (AR), ritenuta tappa essenziale nell’evoluzione verso il carcinoma della prostata resistente alla castrazione (CRPC), può verificarsi secondo due principali meccanismi, uno AR-indipendente e l’altro AR-dipendente6,7,8. Stante
dunque la centralità del ruolo svolto da AR, e sulla base di evidenze precliniche e cliniche, due nuove molecole hanno dimostrato di essere efficaci nella malattia CRPC sia chemio-naive, sia già trattata con la chemioterapia: abiraterone acetato, un potente e selettivo inibitore del citocromo P(CYP)17, ed enzalutamide, un antiandrogeno di nuova generazione.
Abiraterone inibisce selettivamente l’enzima 17α-idrossilasi/C17,20-liasi (CYP17). Questo enzima è normalmente espresso ed è necessario alla biosintesi degli ormoni androgenici nei tessuti testicolari, surrenalici e nei tessuti prostatici neoplastici. CYP17 catalizza la conversione di pregnenolone e di
progesterone in precursori del testosterone, rispettivamente DHEA e androstenedione, mediante 17α-idrossilazione e clivaggio del legame C17,209,10. Enzalutamide inibisce competitivamente il legame degli
androgeni al recettore androgenico, impedendo la traslocazione nucleare dei recettori attivati11,12.
Dopo che studi clinici hanno dimostrato un miglioramento in sopravvivenza con questi farmaci, abiraterone ed enzalutamide sono stati approvati prima dalla Food and Drug Administration e a seguire da EMA e AIFA per il trattamento del carcinoma prostatico metastatico resistente alla castrazione13,14,15.
Purtroppo, circa il 20-40% dei pazienti non risponde sin dall’inizio della terapia ai nuovi agenti ormonali (hanno cioè una resistenza primaria)12,13,14,15 e tra i pazienti che hanno inizialmente una risposta a
enzalutamide o abiraterone, tutti alla fine acquisiscono una resistenza secondaria. Una spiegazione plausibile alla resistenza ad entrambi gli agenti può essere la presenza di varianti di splicing del recettore degli androgeni16,17. Queste varianti di splicing codificano per una proteina del recettore androgenico troncato che
manca del dominio di legame C-terminale (LBD) ma mantiene il domininio N-terminale transattivante18,\19.
Sebbene le proteine tronche non siano in grado di legare il ligando, queste sono costitutivamente attive come fattori di trascrizione e capaci di promuovere l'attivazione di geni bersaglio. Sono state scoperte diverse varianti del recettore, ma al momento i ricercatori sono concentrati su AR-V7, perché è l'unica variante nota del recettore degli androgeni che codifica per un prodotto proteico funzionale rilevabile in campioni biologici 18,20,21,22.
Poiché enzalutamide esercita la sua attività antitumorale attraverso l’interazione con il dominio di legame del recettore degli androgeni, ci si aspetta che la presenza della proteina codificata dalla variante di splicing del recettore degli androgeni (che manca del dominio di legame) possa essere associata a resistenza ad enzalutamide. Inoltre, questa proteina codificata dalla variante di splicing è ligando-indipendente e quindi costitutivamente attiva, e pertanto ci si aspetta che la sua attività non sia limitata da agenti che inibiscono il ligando, come abiraterone. Anche se queste ipotesi sono supportate da studi preclinici16,17,19,20, il significato
clinico della presenza di varianti del recettore androgenico nei pazienti trattati con enzalutamide o abiraterone non è ancora del tutto chiaro. A tal proposito, recentemente, Antonarakis e al.2 hanno dimostrato
che è possibile valutare in cellule tumorali (CTC) circolanti la variante di splicing 7 del recettore androgenico (AR-V7) e che tale variante è associata con la resistenza ad enzalutamide e abiraterone.
In considerazione dei numerosi farmaci a nostra disposizione, l’identificazione di AR-V7 potrebbe essere di importanza strategica per la gestione del trattamento. Ai fini di un corretto utilizzo nella pratica clinica, la rilevazione di AR-V7 dovrebbe avvenire con un test altamente sensibile, specifico, facile da eseguire e poco costoso. AR-V7 può essere rilevato nel tessuto tumorale23, in CTC 2, 24 o in mRNA estratto da sangue
intero25. Purtroppo, questi metodi hanno delle sostanziali limitazioni: l’identificazione in tessuto tumorale
potrebbe richiedere una rebiopsia di alcuni sedi metastatiche e questo è non sempre fattibile, mentre gli svantaggi dell’isolamento dalle CTC e dal mRNA estratti da sangue intero sono i costi, la complessità della metodica e la bassa sensibilità.
Al fine di confermare il ruolo di AR-V7 come fattore predittivo di resistenza ai nuovi agenti ormonali e sviluppare un nuovo approccio metodologico basato su “highly sensitive digital droplet PCR (ddPCR)”, abbiamo valutato retrospettivamente la variante di splicing 7(AR-V7) del recettore degli androgeni su RNA messaggero estratto dagli esosomi di pazienti con carcinoma prostatico metastatico resistente alla castrazione trattati con enzalutamide o abiraterone. Il nostro studio ha fornito nuovi dati per valutare la correlazione tra AR-V7 esosomiale e la resistenza alla terapia ormonale di nuova generazione.
Materiali e metodi
I pazienti
Abbiamo retrospettivamente arruolato 40 pazienti con carcinoma prostatico metastatico resistente alla castrazione in trattamento con enzalutamide o abiraterone. I pazienti avevano una diagnosi di adenocarcinoma della prostata confermata istologicamente, erano in fase di resistenza alla castrazione, cioè malattia in progressione nonostante i livelli di castrazione (testosterone sierico<50 ng/dL), i pazienti dovevano presentare metastasi linfonodali, viscerali o ossee documentate alla tomografia computerizzata o alla scintigrafia ossea, avere un PSA basale di 2 ng/ml e almeno 3 valori di PSA in aumento con dosaggi ripetuti ogni 2 settimane, secondo PCWG – 2. Era consentita una precedente chemioterapia con Taxani. Tutti i pazienti avevano dato il loro consenso informato firmato prima di sottoporsi al prelievo, alla raccolta e all’analisi dei dati.
Disegno dello studio e valutazioni
Il nostro studio ha valutato retrospettivamente il ruolo dello stato di AR-V7 (positivo vs negativo) in mRNA esosomiale come fattore predittivo di risposta o resistenza ai nuovi agenti ormonali. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana e condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki. I prelievi sanguigni per l’analisi dell’mRNA esosomiale sono stati ottenuti dai pazienti eleggibili al basale e per otto pazienti al momento della progressione di malattia. Enzalutamide veniva somministrato al dosaggio standard di 160mg/die, abiraterone al dosaggio di 1000mg/die con prednisone alla dose di 5mg per 2 volte al giorno.
La modalità di valutazione dei paziente è stata condotta secondo pratica clinica: dosaggio del PSA ogni mese, Tac o scintigrafia ossea ogni 3 mesi. La terapia con abiraterone ed enzalutamide è stata continuata fino a progressione del PSA, progressione radiologica/clinica o comparsa di tossicità.
Estrazione di AR-V7-RNA da VCAP e rilevazione con ddPCR
Per settare il metodo ddPCR, sono state utilizzate Cellule VCaP (ATCC® CRL-2876 ™) che sono portatrici note di AR-V7. L’RNA è stato estratto dalle VCaP utilizzando l’RNeasy Mini kit (QIAGEN®, Valencia, CA, USA), è stato trascritto in cDNA e amplificato utilizzando il
Duplex One-Step RT-ddPCR Kit
(BioRad®, Hercules, CA, USA)
. I primers e le sonde sia per AR full length (AR-FL) sia per AR-V7 sono stati progettati nel nostro laboratorio dal software Primer 3. Le marcature FAM/HEX e la sintesi dei primers sono stati prodotte da laboratori BioRad. Di seguito i primers utilizzati:AR-FL primer forward: 5'-CATCAAGGAACTCGATCGT-3 ' AR-FL primer reverse: 5'-GAACTGATGCAGCTCTCTC-3 ' Sonda AR-FL: 5'-ACATCCTGCTCAAGACGCTCCT-3 ' AR-V7 primer forward: 5'-CTGTGCGCCAGCAGAAAT-3 ' AR-V7 primer reverse: 5'-TCAGGGTCTGGTCATTTTGA-3 ' Sonda AR-V7: 5'-TGTCCATCTTGTCGTCTTCG-3 '.
Le reazioni PCR sono state assemblate in singoli pozzetti secondo il seguente schema: 1 ng di stampo di RNA (5 ml), 1 ml di 20X AR-V7 primer/sonda (FAM), 1 ml di 20X AR-FL Primer/sonda (HEX), 5 ml di 1X ddPCR Super Mix, 2 ml di RT 20U/ml, 1 ml di 300 mM DTT, 5 ml di DNAsi/RNasi (volume totale 20 ml). è stato aggiunto Olio generatore di goccioline (70 ml), 40 microlitri della soluzione sono state quindi trasferite in 96-pozzetti di PCR. In seguito è avvenuta la reazione RT/PCR secondo il seguente schema:
50°C x 60 min, 95°C x 10 min, 95°C × 30 s e 55°C × 60 s (40 cicli), 98°C × 10 min, 4°C in attesa. Il lettore di goccioline è stato utilizzato per la quantificazione del segnale di fluorescenza. Il software QuantaSoft misura il numero di goccioline positive e il numero di goccioline negative per entrambi i fluorofori (FAM/HEX); il loro rapporto viene poi valutato mediante distribuzione di Poisson per determinare il numero di copie della molecola bersaglio, espresse come copie/ml. Per valutare la sensibilità del test ddPCR su AR-V7, il cDNA ottenuto dall’RNA delle cellule VCAP è stato diluito in acqua a 250, 100, 50, 25, 15, 10, 5, 1, 0,5 e 0,1 ng/ml. La quantità di copie/ml è stata misurata tramite ddPCR.
Raccolta del plasma e dell’RNA dagli esosomi
Al momento dell’inizio della terapia con abiraterone o enzalutamide sono stati raccolti 3 ml di sangue; in 8 soggetti è stato prelevato un campione di sangue anche al momento della progressione della malattia. Il sangue è stato trasferito in provette in EDTA e centrifugato a 3000 giri/min per 10 min a 4 ° C entro due ore dal prelievo. Il Plasma è stato conservato a -80°C fino all'analisi. I campioni di plasma sono stati poi scongelati e centrifugati a 3000g per 15 min per rimuovere i detriti cellulari. L’ isolamento degli esosomi dal plasma è stata effettuata utilizzando il Kit exoRNeasy (QIAGEN®, Valencia, CA, USA) e l’RNA è stato estratto dalle vescicole legate alla membrana di silice usando la soluzione di lisi basata su QIAzol phenol/guanidine. Ai QIAzol-campioni è stato aggiunto del Cloroformio e centrifugato a 12000 g per 15 min a 4°C. La fase acquosa contenente RNA è stato recuperata e applicato alla RNeasy MinElute spin-column, dove l'RNA si lega alla membrana e i contaminanti vengono scartati. L'RNA è stato infine eluito in 20 ml di tampone di eluizione.
Analisi di AR-V7 su RNA esosomiali derivati dal plasma
La parte sperimentale di questo studio includeva la valutazione di AR-V7 nei pazienti con mCRPC. Altre mutazioni del recettore androgenico non sono state esaminate a causa della limitata quantità di RNA a disposizione e la mancanza di una forte evidenza scientifica relativa al loro ruolo nella resistenza ai nuovi agenti ormonali. L'analisi di AR-V7 su RNA è stata effettuata attraverso ddPCR utilizzando il One-Step RTddPCR Kit, come sopra descritto in "Estrazione di AR-V7-RNA in VCAP e sua individuazione da ddPCR". Il VCaP RNA è stato utilizzato per addizionare i campioni di sangue e i campioni vuoti come controllo. I risultati sono stati riportati come copie dell’allele mutato/ ml di plasma.
Risultati clinici
Gli endpoint primari del nostro studio erano la sopravvivenza libera da progressione clinica o radiologica e la sopravvivenza globale. La progressione clinica o radiologica era definita come una progressione sintomatica (peggioramento dei sintomi o complicazioni cancro correlate), progressione radiologica (incremento >20% della somma dei diametri delle lesioni target alla tac o comparsa di più di 2 metastasi scheletriche alla scintigrafia ossea). La sopravvivenza globale era definita come il tempo alla morte per ogni causa.
L’endpoint secondario era la percentuale di pazienti con un tasso di risposta del PSA (riduzione del PSA >50% rispetto al basale) in qualsiasi momento della terapia; per ogni paziente è stato determinata la miglior risposta del PSA (cioè la massima riduzione percentuale del livello di PSA rispetto al basale). La progressione del PSA era definita come un incremento del PSA del 25% o più rispetto al nadir confermato a 4 settimane (criteri PCWG2).
Analisi dei dati
Il software ddPCR QuantaSoft ha determinato la concentrazione assoluta del gene target in termini di copie/ml. Le analisi statistiche sono state eseguite separatamente nelle coorti AR-V7+ e AR-V7-. I tassi di risposta del PSA (RR) sono stati valutati con il test esatto di Fisher. La sopravvivenza libera da progressione radiografica[PFS] e la sopravvivenza globale[OS] sono state valutate con il metodo Kaplan-Meier e le
differenze di sopravvivenza sono state confrontate con log-rank test. Ulteriori analisi statistiche sono state effettuate tramite t-test appaiati. Tutti i test erano a due code e sono stati considerati statisticamente significativi se P<0.05. La curva ROC è stata generata tracciando la percentuale di veri positivi contro la percentuali di falsi positivi a diverse impostazioni di soglia. Il software SPSS v.2.0 è stato utilizzato per i calcoli.
Risultati Rilevazione di AR-V7 in RNA esosomiali
Prima di tutto, abbiamo dimostrato la nostra capacità di estrarre trascritti di AR-V7 in cellule VCaP, (linea cellulare di tumore prostatico che esprime sia il recettore androgenico full-length sia AR-V7). Quindi abbiamo raccolto i campioni di sangue dai nostri pazienti affetto da mCRCP (vedi materiali e metodi). Utilizzando ddPCR siamo stati in grado di rilevare il trascritto di AR-V7, anche a bassa concentrazione (cioè 2 copie/ml; Figura. 1). Nessun segnale di AR-V7 è stato rilevato nel plasma di controllo non addizionato o nei campioni vuoti, confermando la specificità del test. Il numero mediano di copie per unità di volume di plasma misurato tramite ddPCR, l’intervallo di confidenza (95% CI) e i coefficienti di variazione sono riportati nella tabella 1.
Le caratteristiche dei pazienti e l’ espressione di AR-V7
Da Novembre 2013 a Luglio 2016, abbiamo retrospettivamente arruolato 40 pazienti, 27 dei quali hanno ricevuto abiraterone e 13 hanno ricevuto enzalutamide; il tempo mediano di follow-up è stato di 6 mesi (range 2,0-31,0). Le caratteristiche della popolazione in studio sono riportate in Tabella 2. 17 su 40 pazienti (42,5%) sono risultati AR-V7+ (100-2400 copie/ml, Fig. 2) prima dell'inizio dell’ormonoterapia, 23 pazienti sono risultati AR-V7- (57,5%). Sette pazienti dei 14 risultati AR-V7 + avevano un campione di plasma al basale (numero mediano di copie 500/ml), e anche alla progressione (numero mediano di copie 887/ml), (anche se c'è stato un aumento del numero mediano di copie la differenza non è statisticamente significativa, paired t-test, p= 0.25) e alla progressione è stata nuovamente confermata la presenza della variante di splicing 7 del recettore androgenico; tra i 23 pazienti AR-V7 negativi, un paziente aveva il prelievo anche alla progressione che è risultato invece AR-V7 positivo, dimostrando una variabilità nell’espressione della variante di splicing. L'AR-FL è stato utilizzato come controllo interno per convalidare il processo di estrazione; i campioni di sangue AR-V7- erano veramente negativi perché il segnale AR-FL era rilevabile. Il volume iniziale di campioni di plasma (1 vs. 2 ml) non ha inciso in modo significativo sul rapporto tra il numero totale e il numero di goccioline positive. Il numero mediano di tutte le goccioline generate è stato di 11.000. La curva ROC è riportata in Fig. 2; essendo la curva molto vicino all'angolo superiore sinistro, la precisione complessiva del test è molto alta.
Outcomes clinici secondo l'analisi AR-V7
Le caratteristiche dei pazienti e lo stato di AR-V7 sono riportati in Tabella 2. I soggetti AR-V7 + avevano un Gleason Score alla diagnosi più alto di quello dei pazienti AR-V7 -, livelli di PSA, PAL e LDH più alti rispetto agli ARV7 negativi, livelli di emoglobina più bassi rispetto ai pazienti AR-V7 negativi e ed era più frequente che presentassero metastasi viscerali e che avessero ricevuto un trattamento con docetaxel prima dell’ormonoterapia.
La PFS mediana è risultata significativamente più lunga (13 mesi, IC95%: 11,0-14,9 mesi) nei pazienti AR-V7- rispetto a quelli ARV7+ (4 mesi; IC95%: 2,5-5,5 mesi)(p<0.001 test di log-rank) (Fig 3a). La sopravvivenza globale è risultata più lunga nei pazienti AR-V7- al basale (mediana 24 mesi, IC95%: 19,5-28,5 mesi) , rispetto ai pazienti AR-V7+ (8 mesi, IC95%: 4,2-11,8 mesi) (p <0.001 test di log-rank) (Fig. 3b), rendendo l’identificazione di AR-V7 dagli esosomi un prezioso marcatore di resistenza all’ormonoterapia. La percentuale complessiva di pazienti che ha raggiunto una risposta del PSA durante ormonoterapia è stata del 45% (18/40). Tra i pazienti AR-V7+, il tasso di risposta del PSA è stata del 17,7% (3/17), mentre nel gruppo di pazienti AR-V7- il tasso di risposta del PSA è stato del 60,9% (14/23). I tassi di risposta del PSA sono evidenziati in Fig. 4.
27 di 40 pazienti sono stati trattati con docetaxel prima dell’HT, di cui 12 pazienti erano AR-V7- e 15 erano AR-V7+. Le PFS cliniche o radiologiche non differivano significativamente a seconda dello stato di AR-V7. La PFS mediana è stata di 11 mesi nei pz AR-V7+ (IC95%: 7,3-14,7 mesi) e 11 mesi nel gruppo AR-V7- (IC95%: 9,9-12,0 mesi, p = 0,45) (Figura 5).
Al fine di valutare l'effetto dello stato di AR-V7 sugli outcomes clinici, è stata condotta un’analisi univariata e multivariata secondo il modello di Cox. Nel modello univariato, abbiamo analizzato i fattori di rischio noti per la progressione, come PAL (<130 U/L vs ≥ 130 U/L), LDH (<250 U/L vs ≥ 250 U/L) e livelli di emoglobina (<12 g/dL vs ≥ 12 g/dL). Quest'ultimo è stato l'unico fattore che ha dimostrato una correlazione con una PFS migliore (25 mesi vs 3 mesi; p<0.05). A causa della piccola dimensione del campione e il numero limitato di eventi, il modello multivariato ha incluso solo lo stato di AR-V7, i livelli di espressione di AR-V7, il precedente utilizzo di taxani e i livelli di emoglobina. Tuttavia, probabilmente a causa della piccola popolazione in studio, il modello multivariato non ha confermato il ruolo di AR-V7 come fattore indipendente di prognosi (HR 3.6, p = 0,18).
Discussione
Il recettore androgenico (AR) svolge un ruolo chiave nella progressione del tumore prostatico metastatico resistente alla castrazione. Agisce come fattore di trascrizione attivato dal ligando e regola l'espressione di geni definiti. Il gene del recettore degli androgeni (AR), mappato sul cromosoma Xq11-12, appartiene alla famiglia dei geni dei recettori degli ormoni steroidei. La struttura del gene AR e i domini proteici assomigliano a quella dei membri della famiglia dei recettori degli estrogeni e del progesterone. Otto differenti esoni del gene di AR codificano per corrispondenti regioni funzionali26. La struttura del recettore
androgenico include un dominio N terminale di trans-attivazione (NDT o TAD - amino-terminal transactivation domain, parte dell'esone 1), un dominio centrale per il legame del DNA (DBD-DNA binding domain, esoni 2 e 3), ed un dominio C terminale di binding per il ligando (LBD - ligand binding domain, dall'esone 4 fino a parte dell'esone 8)27. Tra il dominio DBD e LBD è localizzata l'hinge regione (HR -
regione cerniera). Il legame degli androgeni sul dominio LBD causa una traslocazione nucleare del complesso ligando-recettore ed innesca una serie di eventi molecolari che culminano nell'interazione del domino DBD con 12 elementi affini di risposta e con l'attivazione di geni di risposta agli androgeni. L’attività trascrizionale del recettore risiede nel dominio amino-terminale della proteina, che è codificata dall’esone 1. Il dominio di trans-attivazione amino-terminale (AR TAD) rappresenta più della metà della sequenza codificante del recettore e, all’interno dei suoi 254 amminoacidi, contiene il dominio AF-1 e il dominio AF- 5, importanti rispettivamente per la trans attivazione dell’intero AR e per la trans attivazione di un recettore degli androgeni costituzionalmente attivo28. AF-1 media l'interazione con i coregolatori
trascrizionali, con elementi del sistema basale della trascrizione e contiene motivi che interagiscono con la regione LBD dopo il suo legame, portando ad interazioni amino-carbossi-terminali intra e/o inter molecolari, che possono essere critiche per l'attivazione della trascrizione29. La NTD può includere un numero variabile
di poliglutamine (17-29) e poliglicine, codificate dalle unità polimorfiche ripetute (CAG)n e (GGN)n, la cui lunghezza influenza l'attività della trascrizione AR. In particolare, l'attività del recettore è aumentata in caso di ripetizioni poliglutaminiche più brevi, mentre la perdita di aminoacidi 141-338 (soprattutto residui 210-337) altera sensibilmente la funzione di AR30. La regione AR-DBD (DNA Binding Domain) è caratterizzata
da nove residui di cisteina, otto dei quali coordinano due atomi di zinco per formare la caratteristica forma chiamata zinc fingers; la sua lunghezza è di circa 80 aminoacidi27. Il dominio ha una struttura compatta,
globulare. Il primo zinc-finger contiene un P-box deputato al riconoscimento degli elementi denominati ARE (Androgen Response Elements) per il legame diretto con il DNA. La seconda zinc finger, chiamata D-box, è coinvolta nell’interazione proteinaproteina e stabilizza le unità per la dimerizzazione dei recettori. Attraverso l’interazione con il solco maggiore dell’elica di DNA, le zinc fingers sono in grado di legare il recettore degli androgeni ai suoi geni bersaglio. Ulteriori funzioni operate da questi domini includono la dimerizzazione, il legame con proteine co-regolatorie, l’interazione con heat-shock proteins e la regolazione della trascrizione31. I due cluster di zinco sono strutturalmente e funzionalmente differenti e sono codificati da due
differenti esoni32. Tra i domini DBD e il dominio LBD (precisamente tra l'ultima α-elica del dominio DBD e
la prima del dominio LBD) è localizzata la regione cerniera, variabile nelle dimensioni nei differenti recettori steoidei. La regione cerniera contiene una serina in posizione 650 che può essere fosforilata dalla MEKK-chinasi e che sembra essere coinvolta nella regolazione della traslocazione di AR33,34. La regione denominate
AR-LBD (Ligand Binding Domain) media le interazioni dell'AR con i suoi ligandi steroidei e non steroidei ed è importante per le interazioni dell'AR con gli chaperoni35. AR-LBD 14 è composto da 12 α-eliche che
formano un "tasca" per il legame con il ligando. Al momento del legame avviene un cambiamento di conformazione della proteina, che provoca la stabilizzazione dell'elica e la formazione della proteina AF-2 sulla superficie di questo dominio. AF-2 svolge un ruolo essenziale per le interazioni N/C intra e intermolecolari, che possono ulteriormente stabilizzare il complesso ormone-recettore, giocando un ruolo importante sulla sua dimerizzazione 36,37.
Analogamente all’epitelio ghiandolare sano della prostata, anche le cellule tumorali sono strettamente dipendenti dagli androgeni. In virtù dell’elevata ormono-dipendenza del carcinoma della prostata, la terapia di deprivazione androgenica (ADT) rappresenta da anni il gold standard per il trattamento in prima linea dei pazienti con carcinoma della prostata recidivato o avanzato. Tuttavia, la malattia di solito è sensibile alla castrazione solo nelle sue fasi iniziali, e la progressione si verifica entro 12-24 mesi dall’inizio della deprivazione androgenica, per arrivare nella fase di “carcinoma prostatico resistente alla castrazione (CRPC), definita come la malattia che progredisce alla ADT, nonostante livelli di castrazione di testosterone sierico1.
Il concetto di resistenza alla castrazione non coincide con quello di “ormonoindipendenza”, infatti, nonostante l’ADT il recettore androgenico permane attivo e fornisce la fonte per la crescita e la sopravvivenza delle cellule tumorali. Stante dunque la centralità del ruolo svolto da AR, e sulla base di evidenze precliniche e cliniche, due nuove molecole hanno dimostrato di essere efficaci nella malattia CRPC non ancora trattata con la chemioterapia (chemo-naïve): abiraterone acetato, un potente e selettivo inibitore del citocromo P (CYP) 17, enzima chiave della steroidogenesi surrenalica, ed enzalutamide, un antiandrogeno di nuova generazione, che agisce come un antagonista del recettore androgenico, legandosi al recettore e impedendo la traslocazione nucleare del complesso ligando-recettore. Questi farmaci sono stati testati inizialmente nei pazienti già sottoposti a chemioterapia con docetaxel. Alla luce dei buoni risultati e della buona tollerabilità, essi sono stati successivamente testati anche nei pazienti chemo-naïve per docetaxel.
Anche se questi agenti rappresentano un’innovazione nel trattamento del mCRPC, quasi tutti i pazienti sviluppano una resistenza innata o acquisita a tali trattamenti con una durata della risposta ampiamente variabile. Non abbiamo ancora compreso chiaramente i meccanismi alla base della resistenza alla castrazione e della persistente attività di AR. Sono state proposte diverse ipotesi che non si escludono a vicenda:
(1) L'amplificazione e sovra-espressione del gene wild-type di AR, che permette alle cellule tumorali androgeno-dipendenti di proliferare nonostante la bassa concentrazione di androgeni sierici38,39.
(2) mutazioni puntiformi somatiche nel gene AR che forniscono una resistenza alla terapia di deprivazione androginica, sia di prima 40,41,42 che di seconda generazione43,44,45. Inoltre, delezioni nel LBD portano a
recettori costitutivamente attivi46.
(3) stimoli proliferativa innescati da vie alternative possono modulare e stimolare la cascata di segnalazione AR 47,48,49.
(4) L’eccessiva produzione di testosterone intratumorale e di DHT dagli androgeni surrenalici può rappresentare una possibile causa del fallimento della terapia di deprivazione androgenica 50,51.
(5) L'attivazione di percorsi non convenzionali coinvolti nella biosintesi di DHT, come risultato di mutazioni degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli steroidi, può contribuire alla progressione tumorale 52.
Pertanto, nonostante la poca conoscenza approfondita della eziopatogenesi, il targeting di segnalazione di AR rimane un importante opzione di trattamento per il CRPC.
Le varianti di splicing AR (AR-VS) costitutivamente attive, che come risultato di uno splicing alternativo del gene AR, portano a perdita del dominio di legame con il ligando, rappresentano un emergente e fondamentale meccanismo responsabile della progressione nel carcinoma della prostata resistente alla castrazione. Le varianti AR tronche (AR-VS) possono essere il risultato di mutazioni nonsense somatiche che introducono codoni di stop nel gene AR53, riarrangiamenti genici di AR, o proteolisi post-traslazionale di
AR54(figura 6). Inoltre, lo splicing alternativo del trascritto primario, considerando la complessità della
struttura del recettore androgenico, può effettivamente mettere in pericolo l’attività trascrizionale di AR generando recettori funzionalmente distinti dallo stesso gene AR. Strutturalmente, queste varianti AR sono
prive del LBD a seguito di inserzioni di introni a valle degli esoni codificanti del DBD o eliminazioni degli esoni che codificano il dominio C terminale19,20,18,. Le proteine AR tronche, mancando del LBD, sono
costitutivamente attive e in grado di sostenere la trascrizione genica indipendentemente dal ligando55,56. È
interessante notare che l'AR-Vs può indurre un segnale sia attraverso una attività trascrizionale migliorata o tramite un meccanismo non genomico (come nel caso della isoforma AR8). Pertanto, queste forme di recettori tronchi guidano una trascrizione di geni bersaglio androgeno independente, sostenendo così una crescita delle cellule tumorali della prostata indipendente dallo stimolo orrnonale57. Rappresentano un
interessante meccanismo di resistenza alla terapia di deprivazione androgenica e alla progressione del tumore.
Tra i 15 diversi AR-Vs che sono stati riconosciuti fino ad ora, AR-V7 (noto anche come AR3) e ARv567es (o AR-V12) sono le due principali varianti del recettore individuate nei campioni di cancro alla prostata58. In
futuro andrà studiato anche il ruolo di AR-V1, che è sovraespresso nei tessuti tumorali della prostata, specialmente in CRPC rispetto ai campioni di cancro alla prostata ormone-naive, ma evidenze solide che supportino il valore prognostico di questa variante recettoriale mancano ancora. L'isoforma ARv567es conserva gli esoni 1-4 e l'esone 8, mentre mancano gli esoni 5-7 (Fig. 1 e S1); mantiene la seconda e più importante parte della sequenza segnale di localizzazione nucleare (NLS) all'interno della regione cerniera della esone 4, facilitando così la localizzazione nucleare. Questa variante agisce come recettore costitutivamente attivo, aumenta l'espressione di full-length AR, rafforza l'attività trascrizionale di AR indipendentemente dal ligando contribuendo così allo sviluppo di cancro della prostata resistente alla castrazione. Infatti, anche se la forma del recettore ARv567es può essere espresso sia in tumori della prostata benigni, maligni e metastatici, i suoi livelli tendono ad aumentare in caso di soppressione degli androgeni come conseguenza di un processo dinamico influenzato da condizionamenti ambientali e volto a sostenere la proliferazione cellulare e la progressione58.
Tra i vari AR-Vs noti, AR-V7 è la variante di AR meglio caratterizzata, è quella più clinicamente significativa, essendo coinvolta nella progressione tumorale e nella resistenza ai trattamenti antineoplastici strutturalmente è formata dall’esone 1, 2, 3 e dall’esone criptico 319,20 che contiene l’NLS, permettendo una
localizzazione intra-nucleare e un’attività trascrizionale ligando-indipendente. È importante sottolineare che: - L’AR-V7 mRNA può essere rilevato mediante RT-PCR in normale tessuto prostatico, in tessuto di cancro alla prostata ormono naive e resistente alla castrazione, con un gradiente di rilevamento 20 volte superiore in CRPC rispetto al tumore prostatico ormono naive; P <0,0001)19.
- La proteina tronca di AR-V7 (identificata da un saggio di immunoistochimica che utilizza specifici anticorpi policlonali contro il 16aa C-terminale codificato dall’esone CE3) può essere espressa raramente nei tessuti prostatici benigni, raramente in campioni di cancro alla prostata ormone-naive, e comunemente nei campioni CRPC19,20.
- Dal punto di vista funzionale, l’isoforma tronca di AR-V7 è costitutivamente attiva nella trascrizione, indipendentemente dal legame degli androgeni, rappresentando così un modo per il tumore di sfuggire alla terapia ormonale. Pertanto, la variante AR-V7 costitutivamente attiva59, ha un ruolo chiave nel sostenere la
crescita androgeno-indipendente e la progressione tumorale.
- Le varianti di splicing di AR (e AR-V7 in particolare) fino ad oggi sono state rilevate in cellule tumorali circolanti (CTC). Questo rappresenta un metodo interessante, non invasivo e facile per monitorare cambiamenti nelle concentrazioni ematiche periferiche della isoforma del recettore durante differenti terapie. È interessante notare che sono state identificate variazioni dello stato di AR-V7, in campionamenti seriali di AR-V7 durante differenti trattamenti ormonali o citotossici. Cambiamenti dello stato di AR-V7 (conversione da AR-V7 negativo a positivo durante terapie AR-mirate e da AR-V7 positivi a negativo durante trattamento con taxani) sembrano sostenere il ruolo potenziale di AR-V7 come marcatore dinamico60. Sono necessari
ulteriori studi per chiarire il significato clinico di queste modificazioni di AR-V7, grazie alla disponibilità di biopsie liquidi per il monitoraggio di CTC.
La rilevanza clinica di AR-V7 costituisce uno degli attuali grandi temi della ricerca sul cancro alla prostata. Fino ad oggi, la conoscenza raggiunta attraverso ricerche multiple permette di affermare che:
- AR-V7 svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del cancro alla prostata e nella progressione. Supporta la transizione epitelio mesenchimale (EMT), contribuisce alla diffusione metastatica e alla resistenza al trattamento [49].
- Elevati livelli di AR-V7 mRNA (identificati tramite PCR) correlano significativamente con un aumentato rischio di recidiva di malattia dopo prostatectomia radicale in 82 pazienti affetti da cancro alla prostata ormone-naive (P = 0,012)19, suggerendo il suo potenziale valore prognostico negativo in malattia in stadio
precoce.
- L'espressione di livelli molto elevati di trascritto di AR-V7 (o espressione rilevabile di ARv567es) nel cancro alla prostata con metastasi ossee correla con una prognosi infausta, come dimostrato da Hornberg e colleghi61. Essi hanno confrontato i livelli di mRNA di FL-AR e AR-Vs(AR-V1, AR-V7, e AR-V567es) in
campioni di pazienti con CRPC ormone-naïve con metastasi ossee rispetto alla concentrazione in pazienti con carcinoma prostatico ormonosensibile e in campioni di cellule prostatiche non maligne. È interessante notare che l’espressione di AR-V7 è più alta in CRPC rispetto a quella che si ha nelle cellule ormonosensibili, sottolineando una correlazione con lo sviluppo di resistenza alla castrazione e con un tumore prostatico dal comportamento più aggressivo61.
- AR-V7 presenta un peculiare pattern di espressione in diverse fasi della malattia prostatica (significativamente più alto nel mCRPC rispetto al tumore di nuova diagnosi o localizzato). Inoltre, un'analisi recentemente pubblicata sull'espressione immunoistochimica di AR-V7 in diverse fasi del cancro alla prostata (100 casi di carcinoma prostatico localizzato [coorte 1], 104 di casi di carcinoma prostatico metastatico di nuova diagnosi[coorte 2], e 46 pazienti CRPC [coorte 3]) ha rivelato che l'espressione di AR-V7 correla con lo sviluppo di CRPC (il tasso di espressione di AR-AR-V7 nella coorte 3 era significativamente maggiore rispetto alle altre due coorti, e AR-V7 era un fattore predittivo indipendente per lo sviluppo di CRPC all'analisi multivariata, P = 0,001), ed è associato ad una minore sopravvivenza nei pazienti CRPC, rappresentando così un interessante biomarker prognostico di un tumore dal comportamento aggressivo, e un marker predittivo promettente per la progressione di CRPC62.
Dal punto di vista clinico, AR-V7 è coinvolto nella resistenza ai trattamenti ormonali come abiraterone e enzalutamide. Primo di tutto, l'isoforma del recettore costitutivamente attivo, mancando il LBD, sfugge alla terapie di deprivazione androgenica63. Come già detto, AR-V7 è sovra-espresso nel tumore della prostata
resistente alla castrazione rispetto al cancro alla prostata hormone naïve, probabilmente come conseguenza della pressione selettiva di terapie anti-AR64. Infatti, l'osservazione in modelli preclinici di una correlazione
inversa tra livelli di mRNA AR-V7 (e ARV1) e le concentrazioni sieriche di androgeni65 sostiene il ruolo
degli androgeni nel regolare negativamente l'espressione di AR-V7 e mette in evidenza il potenziale contributo di AR-V7 nell’aggirare la soppressione androgenica. Pertanto, varianti di splicing AR sono comuni in tessuti di carcinoma prostatico/cellule resistenti alla castrazione e sono implicati come potenziale meccanismo di resistenza al ADT17
Nel 2014, Antonarakis et al. hanno valutato prospetticamente l’espressione di mRNA AR-V7 nelle cellule tumorali circolanti di pazienti con CRPC trattati con abiraterone o enzalutamide2. Sono stati arruolati 31
pazienti trattati con enzalutamide e 31 pazienti trattati con abiraterone, il 39% e il 19%, rispettivamente, ha presentato AR-V7 rilevabile in CTC. Lo studio ha dimostrato che AR-V7 in CTC è associato con la resistenza ad enzalutamide e abiraterone. I pazienti AR-V7+ avevano tassi di risposta significativamente più
bassi di PSA (0% vs 53%, P = 0,004 tra i pazienti trattati con enzalutamide; 0% vs 68%, P = 0,004 tra i pazienti trattati con abiraterone), e sopravvivenza libera da progressione di PSA più breve (mediana 1.4 vs 6.0 mesi; p <0.001; e 1.3 mesi vs non raggiunto, P <0.001 in pazienti trattati rispettivamente con enzalutamide e abiraterone), sopravvivenza mediana libera da progressione clinica o radiografica più bassa (2.1 vs 6.1 mesi; p <0.001; e 2,3 mesi vs non raggiunto, P <0,001) e sopravvivenza globale più bassa (OS mediana 5,5 mesi vs non raggiunto, P = 0,002; e 10,6 mesi vs non raggiunta, P = 0.006) rispetto ai pazienti AR-V7-negativi.
Allo stesso modo, un recente studio tedesco prospettico condotto da Steinestel e al ha dimostrato che la presenza di AR-V7 in CTCs dei pazienti in terapia ormonale correla con una limitata efficacia delle terapie sequenziali (enzalutamide-abiraterone o abiraterone-enzalutamide)66.
Attualmente, diversi nuovi inibitori AR sono in fase di sviluppo (Compresi galeterone, EPI-001, ARN-509, VT-464, AZD3514, e ODM-201), con l’obiettivo di superare la resistenza ad enzalutamide e abiraterone67.
Dal momento che l'espressione di varianti di splicing AR (come l'isoforma AR-V7) rappresenta un potenziale meccanismo di fuga, alcuni di questi nuovi agenti agiscono riconoscendo e bloccando AR-Vs. In particolare, due piccole molecole antagonisti della NTD di AR, EPI-001 e EPI-506, inibiscono l'attività trascrizionale AR-Vs attraverso il legame alla regione AF1 nel dominio NTD. Uno studio di fase 1/2 sta valutando l'attività di sicurezza e antitumorale di EPI-506 in pazienti mCRPC (NCT02606123).
Galeterone (TOK-001) è un inibitore anti-androgeno che agisce con un meccanismo trimodale: (1) inibisce selettivamente ed irreversibilmente CYP17A1 (come abiraterone) attraverso l'inibizione specifica di C17,20-liasi (ma non 17a-idrossilasi), quindi impedendo la sintesi intratumorale degli androgeni; (2) blocca il legame con gli androgeni (in modo simile all'antagonista enzalutamide AR); (3) ha la proprietà peculiare di degradare l'AR e diminuire i livelli di AR68. Lo studio di fase 3 ARMOR3 che randomizza pazienti AR-V7
+ a galeterone o enzalutamide, chiarirà il ruolo predittivo di AR-V7 nel conferire resistenza primaria (NCT02438007). Testare galeterone in pazienti mCRC dopo la progressione a enzalutamide o abiraterone sarebbero di grande interesse per studiare il ruolo di AR-V7 come biomarker di resistenza secondaria.
VT-464 è un nuovo inibitore selettivo del CYP17A1- 17,20-liasi. Risultati preclinici indicano una superiore soppressione dell'asse AR rispetto ad abiraterone in linee di cellule di cancro alla prostata resistente alla castrazione69. Diversi studi di fase 1-2 stanno attualmente testando la sicurezza e l'attività antitumorale di
VT-646, sia in pazienti mCRPC abiraterone e/o enzalutamide naive (NCT02361086, NCT02012920) o resistenti (NCT02130700, NCT02445976). In questo setting, sarebbe interessante indagare il ruolo predittivo della AR-V7.
ARN-509 è un antagonista del AR che inibisce la traslocazione nucleare AR. E’ dimostrato un buon profilo di sicurezza e un'attività antitumorale interessante in pazienti mCRPC non precedentemente trattati con abiraterone o enzalutamide70. ARN-509 è in fase di valutazione in pazienti mCRPC in combinazione con
abiraterone (NCT02123758) o associata a everolimus dopo il fallimento di abiraterone (NCT02106507). Analogamente, l’inibitore di AR ODM-201, che si lega al AR con alta affinità impedendone la traslocazione nucleare, ha mostrato promettente attività antitumorale sia in pazienti chemio-resistenti sia in pazienti mCRPC chemo naive71,72. È interessante notare che, ODM-201 sopprime AR mutati (AR F876L, AR W741L
e AR T877A); non ci sono i dati disponibili sull'impatto di questo farmaco sulla AR-Vs 73. Uno studio di fase
3 di efficacia e sicurezza controllato con placebo di ODM-201 in pazienti ad alto rischio con CRPC non metastatico è in corso (NCT02200614 - ARAMIS studio).
AZD3514 è un inibitore selettivo di AR androgeno dipendente e indipendente e downregulatore di AR, disponibile per via orale. AZD3514 modula la segnalazione di AR tramite due diversi meccanismi (osservati in vitro e in vivo): inibisce la traslocazione nucleare AR ligando-driven e la down-regulation dei livelli di
AR74. Ha dimostrato attività antitumorale in pazienti CRPC avanzati75, la capacità di AZD3514 di bloccare
AR-Vs è ancora sconosciuta.
È interessante notare che, le varianti di splicing AR-Vs possono influenzare non solo la resistenza a molecole anti-androgeni, ma intervengono anche nella risposta agli agenti chemioterapici antimitotici.
I Taxani (docetaxel e, più recentemente, cabazitaxel) sono un parte importante nell’armamentario terapeutico per il trattamento del CRPC, con un dimostrato vantaggio di sopravvivenza76,77. I taxani legano in modo
reversibile la forma polimerizzata della subunità beta-tubulina, promuovono la polimerizzazione della tubulina e impediscono lo disaggregazione dei microtubuli. L'effetto è l'arresto mitotico con morte cellulare apoptotica. Tuttavia, l’ effetto antimitotico dei taxani non copre da solo il potenziale antitumorale di questi farmaci. I Taxani stabilizzando i microtubuli, impediscono la traslocazione nucleare del recettore degli androgeni, compromettendo quindi la sua attività trascrizionale78,79. Inoltre, sembra che taxani e AR-inibitori
condividano un meccanismo di resistenza congiunto80,81,82. Non sorprende che, una sostenuta segnalazione
del AR derivante dalla AR-Vs costitutivamente attiva (ma non dalla sovra-espressione FL-AR) potrebbe influenzare la sensibilità ai taxani, considerando l'effetto inibitorio sul AR che rappresenta un meccanismo fondamentale dell'azione degli antimicrotubuli nel tumore della prostata.
Thadani-Mulero e colleghi sono stati i primi a descrivere il coinvolgimento di AR-Vs nella resistenza alla chemioterapia con taxani in modelli di xenotrapianto di topo82: la ARv567es, che mantiene la regione
cerniera, è microtubulo-dipendente per la sua traslocazione intra-nucleare e per la successiva attività trascrizionale, mentre l'AR-V7, mancando la regione cerniera necessaria per l’interazione coi microtubuli, è microtubuli-indipendente. Perciò, le cellule tumorali che esprimono i ARv567es (ma non AR-V7) sono suscettibili di beneficio dal trattamento con taxano. L'espressione di ARv567es può quindi essere considerato un indicatore di sensibilità ai taxani, mentre la espressione AR-V7 conferisce resistenza alla chemioterapia con taxano 82.
In contrasto con la teoria del Thadani-Mulero, Zhang et al. hanno recentemente sostenuto l’indipendenza di entrambe le varianti AR (non solo di ARV7) dal percorso dei microtubuli83. Ciò può spiegare, almeno in
parte, la capacità delle varianti di AR di superare la traslocazione intranucleare causata dai taxani. Inoltre, queste due varianti di AR possono compromettere la interazione di FL-AR con i microtubuli, impedendo così la accumulo citoplasmatico di FL-AR innescato dal taxano. Pertanto, AR-V7 e AR-v567es potrebbero conferire resistenza ai farmaci antimitotici83. Da segnalare, che esistono differenze metodologiche tra i due
studi, che probabilmente spiegano i risultati discrepanti.
Recentemente Antonarakis at al. hanno prospetticamente indagato il ruolo predittivo di AR-V7 mRNA in CTC di 37 pazienti affetti da cancro alla prostata trattati con taxani84. Inoltre, lo studio ha valutato il potenziale impatto dello status di AR-V7 in diversi tipi di trattamento (taxano vs enzalutamide o abiraterone), ampliando i risultati del loro precedente studio2. I pazienti AR-V7-positivi hanno avuto una
risposta peggiore ai taxani, rispetto ai pazienti ARV7- negativi, anche se non statisticamente significativa. Pertanto, nonostante il piccolo studio, la rilevazione di AR-V7 ha fallito nel predire un’attività ai taxani. È interessante notare che il rilevamento di AR-V7 in CTC di pazienti mCRPC non ha correlazione con una resistenza primaria alla chemioterapia antimicotica (a differenza dei farmaci anti-androgeni). Inoltre, i pazienti con CRPC ARV-V7+ avevano più probabilità di trarre beneficio dalla terapia con taxano che da terapie AR-mirate, mentre in pazienti AR-V7-negativi il tipo di trattamento (chemioterapia vs abiraterone/enzalutamide) non differiva in efficacia in modo significativo. Anche se sono necessarie conferme in studi clinici di grandi dimensioni prospettici, lo stato AR-V7 può rappresentare un biomarker affidabile per la selezione del trattamento84,85.
Analogamente, Onstenk e altri, hanno dimostrato che la rilevazione della variante di splicing di AR-V7 in CTC di 29 pazienti sottoposti a trattamento con cabazitaxel non è associato ad un beneficio clinico
rilevante86. Cabazitaxel può pertanto essere considerato un'opzione terapeutica valida (rispetto al
Enzalutamide/abiraterone) in pazienti AR-V7 positivi, essendo la risposta alla chemioterapia indipendenti dallo stato AR-V7. Ulteriori indagini sono necessarie per far luce su questi dati contrastanti e meglio delineano il ruolo di AR-Vs nel predire la sensibilità del cancro alla prostata alla chemioterapia con taxani. Siamo in attesa dei risultati dello studio corso di fase II (studio PRIMCAB - NCT02379390) che confronta cabazitaxel a enzalutamide o abiraterone in pazienti naïve alla chemioterapia mCRPC o resistente ad AR-inibitori (abiraterone o enzalutamide). Questo studio analizzerà anche il ruolo predittivo del biomarcatore AR-V7 mR in CTC.
Nel loro insieme, questi risultati promettenti suggeriscono che il rilevamento di AR-V7 può diventare una strategia interessante nei prossimi anni, dato il suo potenziale ruolo come biomarker di CRPC a cattiva prognosi, e come marker predittivo di resistenza a enzalutamide o abiraterone.
Tuttavia alcune domande dovrebbero essere risolte al fine di introdurre questa tecnica nella pratica clinica quotidiana:
(1) AR-V7 è associato ad una resistenza primaria o acquisita a enzalutamide e abiraterone, oppure ad una ridotta sensibilità a questi agenti?
(2) Il tasso di incidenza di AR-V7 è molto variabile nei diversi studi. Abbiamo una tecnica convalidata per la rilevazione di AR-V7 nei pazienti CRPC?
(3) il rilevamento di AR-V7 in CTC è routinariamente applicabile e ha un giusto rapporto costo-efficacia? (4) Nello studio di Antonarakis, solo il 14% (6/42) dei pazienti AR-V7 negativi è diventato positivo durante il trattamento (4 con enzalutamide e 2 con abiraterone)2. E’ AR-V7 un marcatore dinamico?
Al fine di rispondere ad alcune di queste domande, confermare il ruolo di AR-V7 come fattore predittivo di resistenza ai nuovi agenti ormonali e sviluppare un nuovo approccio metodologico basato su “highly sensitive digital droplet PCR (ddPCR)”, abbiamo condotto il nostro studio e abbiamo valutato retrospettivamente la variante di splicing 7(AR-V7) del recettore degli androgeni su RNA messaggero estratto dagli esosomi di pazienti con carcinoma prostatico metastatico resistente alla castrazione trattati con enzalutamide o abiraterone. Il nostro studio ha fornito nuovi dati per valutare la correlazione tra AR-V7 esosomiale e la resistenza alla terapia ormonale di nuova generazione.
AR-V7 può essere rilevato nel tessuto tumorale23, in CTC2,24 o in mRNA estratto da sangue intero25.
Purtroppo, questi metodi hanno delle sostanziali limitazioni: l’identificazione in tessuto tumorale potrebbe richiedere una rebiopsia di alcuni sedi metastatiche e questo non è sempre fattibile, mentre gli svantaggi dell’isolamento dalle CTC e dal mRNA estratti da sangue intero sono i costi, la complessità della metodica e la bassa sensibilità.
Recentemente è stata convalidata un’analisi immunoistochimica per il rilevamento di AR-V7 da biopsia tissutale23. Lo studio ha dimostrato un chiaro effetto di AR-V7 sui parametri di sopravvivenza e ha
confermato il ruolo predittivo di questo biomarcatore su OS nei pazienti stratificata in terzili secondo l’espressione di AR-V7 (15.6 vs 9.6 vs 8.8 mesi, rispettivamente) 23. Tuttavia, l'uso di questo approccio per
monitorare lo sviluppo di resistenza è limitata dalla invasività della procedura. Inoltre, un campione di tessuto singolo non è rappresentativo di eterogeneità tumorale e l’evoluzione molecolare nel tempo non può essere monitorata, rendendo questo approccio scientificamente valido ma praticamente meno attraente. L’RNA per l’analisi di ARV7 può anche essere estratto da sangue intero25, ma questo approccio può essere
influenzato negativamente dall'instabilità di RNA libero nel sangue e dalla grande quantità di RNA contaminato da leucociti. Probabilmente questo è il motivo per cui, nello studio di
Takeuchi a al
25, l'analisidi AR-V7 da mRNA nel sangue intero ha fallito nel predire la risposta del PSA e la resistenza al trattamento nei pazienti trattati con ormonoterapia. Va precisato però che il confronto tra metodi diversi dovrebbero essere effettuato con grande cautela.
Per studiare la biologia molecolare di un tumore e identificare l’AR-V787,88, possono infine essere utilizzate
le CTCs89,90,91; ma l'uso delle CTC ha limiti morfologici e legati all’eterogeneità immuno-fenotipica (cioè, i
marcatori epiteliali possono significativamente variare)92, inoltre la fragilità delle CTC può portare a
rilevazioni imprecise di AR-V7. D’altra parte invece, l'estrazione e la lavorazione degli esosomi è considerevolmente meno costosa e difficoltosa rispetto all’estrazione delle CTCs. Nello studio condotto da Antonarakis , che ha valutato AR-V7 nelle CTC, l’OS mediana è risultata di 8 mesi per i pazienti AR-V7 negativi, versus un OS mediana non raggiunta per i pazienti AR-V7 positivi. Questo risultato è simile a quello ottenuto nel nostro studio (8 mesi nei pazienti AR-V7 + contro 24 mesi nei pazienti AR-V7-). Tuttavia, le PFS mediane sono risultate differenti; nello studio di Antonarakis che ha identificato AR-V7 nelle CTC è risultata di 2.2 mesi nei pazienti AR-V7 positivi vs 6.2 mesi nei pazienti AR-V7 negativi, mentre nel nostro studio che ha identificato AR-V7 negli esosomi, la PFS mediana è risultata di 4 mesi nei pazienti V7 positivi vs 13 mesi nei pazienti V7 negativi. Le maggiori PFS mediane dei pazienti AR-V7- (valutate su RNA esosomiale) possono essere dovute alla presenza di falsi negativi nella coorte di soggetti in cui l’RNA è stato estratto da CTC, a dimostrazione di una maggiore sensibilità del metodo di estrazione dagli esosomi rispetto alle cellule tumorali circolanti.
In un recente studio sull'analisi di AR-V7 su CTC, è stato dimostrato che l'incidenza e la quantità di AR-V7 aumenta con l’aumentare delle successive linee di terapia, e questo conferma nuovamente il ruolo di AR-V7 come meccanismo di resistenza acquisita alla terapia sistemica93. Anche se in precedenti lavori2,93 è stato
dimostrato che i livelli di AR-V7 aumentano nel corso del tempo, nel nostro studio solo 4 di 7 campioni hanno presentato un aumento di AR-V7 espresso in copie / ml. Una spiegazione potrebbe essere lo sviluppo di meccanismi aggiuntivi di resistenza. Inoltre, un paziente ha avuto alla progressione una conversione dallo stato AR-V7- ad AR-V7+, dimostrando che questo può essere un biomarcatore dinamico.
In conclusione, il potenziale ruolo predittivo di resistenza agli agenti ormonali di nuova generazione suscita l'interesse collettivo per utili implicazioni nella difficile scelta del miglior algoritmo di trattamento nella pratica clinica quotidiana. I medici dovrebbero essere in grado di identificare pazienti con maggiori probabilità di beneficiare di un trattamento specifico, evitando terapie inefficaci e potenzialmente dannose. Devono essere prese in considerazione molte variabili che vanno dalle caratteristiche del paziente (ECOG PS, età, comorbidità), alle caratteristiche del tumore (massa tumorale, sedi di metastasi - Ossee vs viscerali-, trattamenti precedenti, durata della risposta), fino a includere caratteristiche molecolari come fattori predittivi di resistenza o sensibilità al trattamento. Sebbene promettente, il ruolo clinico di AR-V7 come biomarker predittivo di resistenza ai nuovi agenti ormonali in CRPC e la sua inclusione nella pratica clinica è ancora in discussione a causa del piccolo numero di pazienti arruolati negli studi pubblicati. Sono necessari sforzi per chiarire meglio la capacità predittiva di ARV7, standardizzare un test di laboratorio clinico sensibile ed economicamente sostenibile per la misurazione, e convalidare i risultati in ampi studi. Diversi esperienze hanno dimostrato e convalidato il suo ruolo non solo in vitro, ma anche in vivo2,86,94,95. Gli studi
sulle CTCs2,86,84, su campioni tissutali provenienti da biopsie23 e il nostro studio su RNA esosomiale
confermano chiaramente che i pazienti AR-V7 + hanno un PSA-RR inferiore, una PFS e una OS più breve rispetto a soggetti AR-V7-.
Il nostro è il primo studio che ha dimostrato che gli esosomi derivati dal plasma forniscono una valida fonte di RNA per l'analisi di AR-V7 e conferma il ruolo di forte biomarcatore di resistenza all’ormonoterapia in pazienti CRPC. Lo studio fornisce la prova che l'RNA estratto dagli esosomi derivati dal plasma può offrire evidenti vantaggi, razionalizzare il workflow diagnostico riducendo i costi, eliminando l'invasività della biopsia per un prelievo tissutale, e minimizzando l'effetto negativo dell’ eterogeneità tumorale. La
disponibilità di un biomarker ottenuto mediante biopsia liquida darebbe la possibilità rivoluzionaria di valutare istantaneamente un marker dinamico potenzialmente predittivo nel corso del tempo, guidando i medici nelle decisioni di trattamento in diversi momenti durante il corso della malattia96.
Figure
Figura 1. copie AR-V7 / ml a diverse diluizioni cDNA da ddPCR.
Tabella 1
.
Numero mediano di copie/ml nel plasma misurato tramite ddPCR, deviazione standard (SD), 95% intervallo di confidenza (CI) e coefficienti di variazione (CV).Baseline Characteristic All patients n = 40 AR-V7 negative n = 23 AR-V7 positive n = 17
Age, median (range), y 62 (51-81) 66 (51-81) 64.5 (56-73)
Race, No. (%) - White - Nonwhite 40 (100%) 0 (0%) 23 (100%) 0 (0%) 17 (100%) 0 (0%) ECOG performance status, No. (%)
- 0 - 1 or 2 29 (72,5%) 101(27,5%) 18 (78%) 5 (22%) 11(65%) 6(35%)
Time since diagnosis, median (range), y 1,73(0,32-17,30) 3.79
(1,47-17.30)
2,02 (0.32-12.80) Tumor stage at diagnosis, No. (%)
- T1/2 - T3/4 - unknown 3 (8%) 14 (35%) 23(57%) 2 (8,7%) 10 (43,5%) 11 (47,8%) 1(5,9%) 4 (23,5%) 12 (70,6%) Gleasor Sum at diagnosis, No. (%)
- ≤7 - ≥8 - unknown 17 (42,5%) 22 (55%) 1 (2,5%) 13 (56,5%) 9 (39%) 1 (4,35%) 4 (23,5%) 13 (76,5%) 0 (0%) Type of local treatment, No. (%)
- Surgery - Radiation therapy - None 18 (45%) 10 (25%) 12(30%) 12 (52%) 8 (35%) 3 (13%) 6 (35%) 2 (12%) 9(53%)
No. of prior hormonal therapies, median 2 2 2
Current treatment - Abiraterone - Enzalutamide - Docetaxel - Cabazitaxel 27 (67,5%) 13 (32,5%) 0 (0%) 0 (0%) 18 (78,3%) 5 (21,7%) 0 (0) 0 (0) 9 (53%) 8 (47%) 0 (0) 0 (0) Prior use of abiraterone, No (%)
- Yes - No 4 (10%) 36 (90%) 0 (0%) 23 (100%) 4(23,5%) 13 (76,5%) Prior use of enzalutamide, No (%)
- Yes - No 0 (0%) 40 (100%) 0 (0%) 23 (100%) 0 (0%) 17 (100%) Prior use of docetaxel, No (%)
- Yes - No 27 (67,5%) 13 (32,5%) 12 (52%) 11 (48%) 15 (88%) 2(12%) Prior use of cabazitaxel, No (%)
- Yes - No 5 (13,5%) 35(87,5%) 1 (5%) 22(95%) 4 (23,5%) 13(76,5%) Presence of bone metastases, No. (%)
- Yes - No 34(85%) 6(15%) 17(74%) 6 (23%) 17(100%) 0 (0%) Presence of lymph node metastases, No. (%)
- Yes - No 23 (67,5%) 17 (42,5%) 13 (56,5%) 10(43,5%) 10 (59%) 7 (41%) Presence of visceral metastases, No. (%)
- Yes - No 7 (18,5%) 33(82,5%) 1 (4,5%) 22 (95,5%) 6(43,3%) 11 (64,7%)
Baseline PSA level, median (range), ng/mL 184,60 (0.63-4581) 11,53
(0.78-4581)
399,94 (0.63-461) Baseline Alkaline phosphatase level, median (range),
U/l
199,50(49-917) 64,5
(49-917)
375 (53-575) Baseline lactic dehydrogenase level, median (range),
U/l
368(110-1723) 223
(110-1723)
380 (150-1720)
Baseline Hgb level, median (range), g/dl 12(7.9-14.9) 13
(9.9-14.9)
10 (7.9-12) Use of opioid, No. (%)
- Yes - No 16(40%) 24(60%) 5(22%) 18(78%) 11(65%) 6 (35%)
Figura 2. In alto, è rappresentata l’amplificazione di AR-V7 con ddPCR. I puntini blu rappresentano le
goccioline positive per l’amplificazione di AR-V7. I puntini verdi rappresentano le goccioline positive per l’amplificazione wild-type di AR-V7. I punti grigi sono goccioline vuote o goccioline contenenti primers. In basso la curva ROC generata dai dati del nostro studio.
Figura 3a. Sopravvivenza libera da progressione clinica o radiologica in pazienti V7- vs pazienti
AR-V7+.
Figura 4. Waterfall plot raffigurante i tassi di risposta del PSA, in base allo stato di AR-V7. La linea
tratteggiata mostra la soglia per definire una risposta PSA (riduzione ≥50% del livello di PSA da basale). Gli asterischi indicano un aumento di oltre il 100% nella risposta del PSA.
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