Tecnologia microfluidica ad onde acustiche di superficie integrata in microsensori basati su risonanza plasmonica di superficie

UNIVERSITA’ DI PISA

Facolt`

a di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali

Corso di laurea magistrale in fisica

Anno Accademico 2013/2014

Tesi di Laurea

Tecnologia microfluidica ad onde acustiche

di superficie integrata in microsensori basati

su risonanza plasmonica di superficie

Laureando:

Carlo Maria Lazzarini

Relatore:

Indice

1 Introduzione 5

1.1 Panoramica e stato dell’arte . . . 5

1.2 Schema della tesi . . . 7

2 Teoria 9 2.1 Dispositivi microfluidici basati su SAW . . . 9

2.1.1 SAW su materiali piezoelettrici . . . 9

2.1.2 Streaming acustico nei fluidi . . . 13

2.2 Dispositivi di sensing basati su SPR . . . 15

2.2.1 Eccitazione di plasmoni di superficie . . . 15

2.2.2 Caratteristiche e limiti dei dispositivi SPR . . . 18

3 Simulazioni MATLAB 21 3.1 Ottimizzazione del chip . . . 21

3.2 Setup SPR in configurazione Kretschmann . . . 29

4 Materiali e metodi 37 4.1 Tecniche di nanofabbricazione . . . 37

4.1.1 Litografia ottica ed elettronica . . . 37

4.1.2 Deposizione di sottili film metallici . . . 38

4.1.3 Inductively coupled plasma Reactive-ion etching . . . 39

4.2 Fabbricazione del chip . . . 41

4.2.1 Preparazione del substrato . . . 41

4.2.2 Realizzazione del trasduttore tramite EBL . . . 41

4.2.3 Realizzazione dei Pad di contatto per litografia ottica 43 4.2.4 Realizzazione delle aree di sensing SPR . . . 43

4.3 Fabbricazione dei microcanali in PDMS. . . 44

4.3.1 Maschera del canale . . . 45

4.3.2 Stampo dei canali . . . 47

4.3.3 Preparazione del PDMS . . . 48

4.4 Altre maschere e stampi . . . 49

4.5 Vibrometro laser ad effetto Doppler . . . 50

5 Risultati 55

5.1 Design del chip . . . 55

5.2 Caratterizzazione elettrica ed acustica. . . 58

5.3 Caratterizzazione microfluidica . . . 67

5.3.1 Fluidodinamica nel microcanale: analisi delle linee di

flusso. . . 67

5.3.2 Fluidodinamica nel microcanale: mappe di velocit`a

tramite PIV . . . 72

5.4 SPR sensing . . . 78

5.4.1 Montaggio del setup ottico . . . 78

5.4.2 Ottimizzazione del segnale SPR e caratterizzazione

della sensibilit`a del dispositivo . . . 81

5.5 Accoppiamento del sensing SPR con tecnologia SAW . . . . 94

6 Conclusioni 105

1

Introduzione

1.1

Panoramica e stato dell’arte

Negli ultimi anni il crescente interesse verso dispositivi portatili e comple-tamente automatizzati per applicazioni mediche ha portato allo sviluppo di dispositivi microfluidici miniaturizzati. Questi richiedono minime quantit`a di reagenti (generalmente nell’ordine di decine di nL) consentendo cos`ı di fare analisi con grande affidabilit`a ed in maniera pi`u veloce rispetto ai siste-mi tradizionali. L’idea di realizzare un laboratorio di analisi completamente integrabile su chip, conosciuta come Lab-On-a-Chip (LOC), ha portato ad un notevole sviluppo di strategie efficienti ed affidabili per l’attuazione e la gestione di fluidi su scala micrometrica. Su tale scala il moto dei fluidi risulta laminare ed `e governato dalle forze viscose e di superficie.

Uno dei metodi pi`u efficaci consiste nell’utilizzo di onde acustiche di

superficie (SAW). Queste sono onde di Rayleigh di ampiezza nanometrica, tipicamente eccitate su materiali piezoelettrici tramite trasduttori interdi-gitati integrati (IDT). Rispetto ad altre tecniche microfluidiche le SAW presentano diversi vantaggi nel manipolare sia singole gocce che fluidi al-l’interno di microcanali [1]. In questo lavoro viene sfruttato lo streaming acustico indotto nel liquido dall’interazione tra le SAW e quest’ultimo. La riserva di liquido consiste in canali chiusi in PDMS, i quali permettono di ridurre l’evaporazione e la presenza di contaminanti.

Un’altra importante applicazione dei dispositivi LOC `e quella di rilevare piccolissime concentrazioni di proteine e marker in fluidi biologici, al fine di prevenire malattie degenerative. In commercio esistono vari dispositivi di sensing rifrattometrici, sebbene non ancora miniaturizzati al punto di renderli portatili; tra questi i sensori ottici basati sull’eccitazione di plasmoni di superficie vengono comunemente chiamati sensori SPR (surface plasmon resonance). I plasmoni sono modi guidati TM del campo elettromagnetico che si propagano lungo un’interfaccia metallo-dielettrico. I sensori SPR misurano le variazioni dell’indice di rifrazione che avvengono in prossimit`a del campo elettromagnetico generato dai plasmoni; queste vengono rilevate come una variazione della condizione di risonanza dei plasmoni.

Dalla prima dimostrazione di utilizzo SPR per sensing superficiale nei primi anni ottanta [2,3], i sensori SPR hanno subito un notevole sviluppo e negli ultimi dieci anni sono stati pubblicati molti articoli su bio-sensori SPR per applicazioni di diagnostica, di monitoraggio ambientale e di sicurezza

alimentare. Il sensing SPR `e particolarmente apprezzato in queste

applica-zioni per vari motivi: analisi automatica in tempo reale, possibilit`a di essere implementato in parallelo su diverse aree target, produrre misure

quanti-tative con grande risoluzione [4]. Sebbene in commercio si trovino diversi

sistemi SPR, la ricerca `e in continua evoluzione per realizzare dispositivi sempre pi`u performanti, portatili ed economici.

L’idea alla base del mio lavoro `e quella di integrare un dispositivo SPR con la microfluidica SAW, al fine di sfruttare i vantaggi di quest’ultima per aumentare l’efficienza di sensing del dispositivo. Nell’interagire con un

fluido le SAW vengono rifratte in esso, generando a causa della viscosit`a

del liquido uno streaming acustico che favorisce il moto circolatorio nella soluzione test. Come dimostrato in [5], questo streaming pu`o effettivamente accelerare la cinetica di legami superficiali in un test biologico.

In questo lavoro di tesi ho ideato e realizzato un chip microfluidico basa-to su SAW integrabasa-to con un dispositivo ottico per sensing basabasa-to su SPR. Sia la struttura del chip che il setup ottico per eccitare e rilevare i plasmoni sono stati realizzati nella configurazione risultata ottimale da simulazioni. Ho dunque studiato come le SAW favoriscano il ricircolo dei fluidi all’inter-no di microcanali in PDMS e successivamente come esse influiscaall’inter-no sulla performance globale del dispositivo.

1.2

Schema della tesi

La tesi viene presentata nel seguente modo. Dopo la breve introduzione sul-lo stato dell’arte appena presentata, la tesi prosegue con un capitosul-lo teorico (Cap.2) nel quale descrivo la fisica delle SAW, come esse siano eccitate su materiali piezoelettrici ed il loro ruolo nel creare streaming in microcanali interagendo con del liquido. Successivamente descrivo i plasmoni di superfi-cie, la loro eccitazione ottica accoppiando luce incidente tramite un prisma ad alto indice di rifrazione nella configurazione di Kretschmann, ed infine come la risonanza plasmonica venga sfruttata per dispositivi di sensing.

Nel capitolo 3 vengono presentati i risultati delle simulazioni MATLAB effettuate per ottimizzare la sensibilit`a del dispositivo in funzione sia dei materiali e degli spessori dei sottili film metallici del chip, sia della geo-metria del setup ottico per eccitare e rilevare la risonanza plasmonica. La descrizione dettagliata della fabbricazione del chip e dei microcanali `e ri-portata nel capitolo 4, assieme alle tecniche di nanofabbricazione apprese durante il mio tirocinio in laboratorio.

Il capitolo 5 presenta i risultati ottenuti ed `e diviso in tre parti. Nella prima mostro la caratterizzazione elettrica (RF) ed acustica del chip SAW e lo studio della fluidodinamica all’interno del canale in PDMS, ricostruendo

il campo di velocit`a del liquido tramite Particle Image Velocimetry (PIV).

Nella parte centrale `e mostrato e spiegato il setup ottico da me ideato e mon-tato nella configurazione ottimale per avere il miglior segnale di risonanza

e la massima sensibilit`a. Nell’ultima parte studio come le SAW

influisca-no sulla performance del dispositivo SPR, analizzando in particolare come varia la risonanza plasmonica e la sensibilit`a in funzione della potenza di eccitazione delle onde acustiche. Infine vi sono le conclusioni e i possibili sviluppi futuri a cui questo lavoro porter`a.

2

Teoria

In questo capitolo discuto la teoria sull’eccitazione di onde acustiche di superficie (SAW) su substrato piezoelettrico e la loro interazione con un fluido all’interno di microcanali. In seguito vengono introdotti i plasmoni di superficie e mostrato come essi siano usati in un dispositivo di sensing basato su risonanza plasmonica di superficie (SPR).

2.1

Dispositivi microfluidici basati su SAW

2.1.1 SAW su materiali piezoelettrici

Nel 1887 Lord Rayleigh scopr`ı che onde meccaniche si possono propagare in modo tale che l’energia acustica sia confinata vicino alla superficie di solidi isotropi e non, quali cristalli piezoelettrici. Questo modo

propagan-te, conosciuto come onda di Rayleigh, `e molto importante in microfluidica

quanto in altri campi; ad esempio lo stesso tipo di onde vengono generate nei terremoti.

Le caratteristiche peculiari di queste onde per le applicazioni microflui-diche sono il confinamento superficiale dell’energia e la polarizzazione nel piano sagittale, ovvero perpendicolare alla superficie ed alla direzione di propagazione. Quest’ultima rende possibile il trasferimento di onde acusti-che nei liquidi, infatti senza di essa non sarebbe possibile l’accoppiamento tra il campo acustico nel substrato solido e quello nel liquido. D’ora in poi considero solo cristalli piezoelettrici; in questi le suddette onde vengono eccitate e propagano lungo la superficie, svanendo ad una profondit`a tipica di qualche lunghezza d’onda (per questa ragione sono chiamate SAW).

Nella realizzazione di un dispositivo microfluidico le SAW sono preferite alle onde acustiche di volume (BWA), le quali presentano deformazione del

solido della stessa ampiezza ad ogni profondit`a. A causa del confinamento

dell’energia le SAW sono molto sensibili a perturbazioni superficiali, come la presenza di gocce di liquido o microstrutture.

Figura 1: (a) Campo di deformazione dovuta ad una SAW propagante verso destra (asse z) lungo una superficie solida e (b) la associata distribuzione dell’energia potenziale in funzione della profondit`a nel substrato [6].

La pi`u generica forma per una SAW movente lungo l’asse z `e:

u(x, y, z, t) = [ux(y)eiφ1x + uy(y)eiφ2y + uz(y)eiφ3z]ei(ωt−γz) (1)

dove ω `e la frequenza angolare, γ `e il fattore complesso di propagazione, ui

le componenti della deformazione del reticolo cristallino nelle tre direzioni spaziali, φi le loro fasi rispetto a uz. La componente uy `e normale alla

superficie, uz`e lungo la direzione di propagazione dell’onda e ux`e trasversale

al piano y-z (chiamato piano sagittale). Le componenti ui vanno come e

y λ,

dove λ `e la lunghezza d’onda delle SAW sulla superficie del cristallo e y `e la profondit`a in esso.

In Fig. 1`e mostrata la vista trasversale della deformazione della super-ficie di un cristallo piezoelettrico e l’energia potenziale associata in funzione della penetrazione dell’onda nel substrato. Una conseguenza di questo anda-mento `e che ad alte frequenze (ovvero per corte lunghezze d’onda) l’energia risulta pi`u confinata in superficie e dunque la sensibilit`a dell’onda verso per-turbazioni superficiali risulta maggiore. Le velocit`a di propagazione delle SAW nelle tre direzioni dipendono dal materiale in cui si propagano e sono proporzionali alle rispettive ampiezze d’onda.

Tra i vari modi acustici confinati in superficie l’onda di Rayleigh (RSAW)

polarizzata sagittalmente `e caratterizzata dall’assenza della componente

perpendicolare alla direzione del moto (ux=0), come risulta

matematica-mente imponendo la condizione di zero stress ai bordi del cristallo. Poich´e uy e uz sono sfasati di 90◦, le particelle si muovono sia nella direzione di

propagazione (z) sia in quella perpendicolare alla superficie (y), facendo una traiettoria ellittica nel piano sagittale. Una conseguenza della condizione di zero stress ai bordi del cristallo `e che la componente compressionale e di shear dell’onda sono accoppiate in modo che non ci sia nessuna forza fre-nante perpendicolare alla superficie. Per cui una compressione del materiale lungo l’asse z genera una deformazione lungo y e viceversa.

Alcuni materiali diventano elettricamente polarizzati sotto deformazioni meccaniche. Questo effetto viene chiamato piezoelettricit`a, `e di natura li-neare e la polarizzazione indotta cambia segno quando cambia il verso dello

stress meccanico subito dal cristallo. L’effetto opposto `e chiamato

effet-to piezoelettrico inverso, ovvero quando un solido viene deformaeffet-to a causa dell’applicazione di un campo elettrico. L’accoppiamento tra campo elet-trico e deformazione indotta nel cristallo viene espresso con le costanti di strain, indicanti quanto un dato potenziale riesca a deformare un solido e viceversa. Pi`u sono alti e pi`u l’ampiezza delle SAW prodotte `e grande. Il niobato di litio (LiN bO3) rappresenta la scelta standard come substrato per

applicazioni SAW a causa delle sue ottime propriet`a piezoelettriche.

Dalle equazioni costitutive per materiali piezoelettrici si ricavano le

equa-zioni del moto, dove la velocit`a risulta aumentata rispetto al caso

non-piezoelettrico di un fattore 1 + K2_{. Qui K =} e2

c `e chiamato coefficiente

di accoppiamento elettro-meccanico del materiale; e `e la costante di strain piezoelettrico lungo la direzione di propagazione, c il coefficiente di rigidit`a che lega strain distorsione effettiva del substrato,  `e la permittivit`a. Il dispositivo usato `e realizzato in modo tale che la direzione di propagazione delle SAW sia lungo la direzione cristallina con il maggiore coefficiente K2_.

Esso varia nei materiali piezoelettrici a seconda della direzione di taglio del wafer dalla matrice cristallina originaria, rispetto alle direzioni principali del cristallo.

Substrato Taglio wafer Direzione propagazione Velocit`a (m/s) K2_(%) LiN bO3 Y + 41◦ Z 4840 21 LiN bO3 Y + 64◦ Z 4695 11.6 LiN bO3 Y + 128◦ Z 3980 5.4 LiT aO3 Y + 36◦ Z 4240 4.7 LiT aO3 X Y +112◦ 3300 0.85 Quarzo Y + 36◦ X 3150 0.12

Tabella 1: Materiali tipicamente usati come substrati per dispositivi SAW con direzioni di taglio del cristallo, direzioni di propagazione dell’onda, velocit`a e coefficienti di accoppiamento elettro-meccanico.

R. M. White scopr`ı [7] che le SAW possono essere eccitate e rilevate

da trasduttori elettrici interdigitati (IDT), realizzati sulla superficie del cri-stallo tramite litografia. Applicando un voltaggio alternato agli elettrodi si genera un campo elettrico periodico nel cristallo; questo a sua volta genera un campo di stress periodico dal quale si generano per interferenza costrut-tiva le SAW polarizzate verticalmente. Esse sono lanciate in entrambe le direzioni uscenti dall’IDT con fronti d’onda paralleli agli elettrodi.

Le SAW vengono eccitate in maniera ottimale quando la lunghezza d’on-da coincide con la periodicit`a d del trasduttore (Fig. 2), data dalla distanza tra due elettrodi soggetti allo stesso potenziale. Questo avviene quando l’IDT `e alimentato alla frequenza di risonanza

f0 =

vSAW

d (2)

dove vSAW `e la velocit`a del suono nel substrato. Tipicamente `e attorno

ai 4000 m_s e le periodicit`a sono nel range 1-100 µm; queste generano SAW

con frequenze dalle decine alle centinaia di MHz. La risposta in frequenza dell’IDT nel rilevare un’onda dipende dall’interferenza tra i contributi dei vari elettrodi ed `e relativamente insensibile alla risposta in frequenza dei singoli elementi.

Figura 2: Trasduttore interdigitato per l’eccitazione di SAW, realizzato tra-mite elettrodi sulla superficie di un cristallo piezoelettrico: (a) potenziale elettrico SAW, (b) visione planare [6].

2.1.2 Streaming acustico nei fluidi

Quando una SAW incontra un liquido sulla superficie del chip viene trasmes-sa in esso cedendogli energia e momento. Infatti, a cautrasmes-sa delle differenti ve-locit`a del suono nel LiN bO3 vs= 3994m/s e nell’acqua vf = 1485m/s,

l’on-da viene rifratta nel liquido in un’onl’on-da longitudinale secondo l’equivalente acustico della legge di Snell ad un angolo

θR= arcsin(

vf

vs

) = 22◦ (3)

chiamato angolo di Rayleigh. Le SAW si attenuano propagando dal-l’interfaccia dentro la goccia, prendendo il nome di leaky-SAW (lSAW). Al contempo l’onda longitudinale viene dissipata nel liquido a causa della sua

viscosit`a dinamica, generando in esso un moto vorticoso chiamato acoustic

streaming, come schematizzato in Fig. 3.

Per varie potenze RF di eccitazione SAW il fluido subisce differenti effetti [8]. La difficolt`a nel gestire fluidi alle scale micrometriche, dove dominano le forze viscose e di superficie, `e accentuata nel caso di microcanali. Infatti la pressione per capillarit`a scala inversamente con le dimensioni del canale e il rate di flusso volumetrico alla quarta con esse [9].

Figura 3: Streaming acustico generato nel liquido dalle SAW difratte in esso all’angolo di Rayleigh θR.

Io ho lavorato con microcanali chiusi in PDMS riempiti completamente per capillarit`a, agenti come riserva di liquido per i test. Per cui, esclusa ogni possibilit`a di moto del fluido, quello che ho studiato `e la fluidodinamica indotta nel canale dalle SAW.

Nonostante la sua facilit`a di fabbricazione ed economicit`a, l’utilizzo del PDMS sul substrato presenta alcuni svantaggi. Infatti, come tutti i materiali elastomerici, la sua natura acustica dispersiva introduce forti assorbimenti

della radiazione acustica propagante in esso. L’attenuazione delle SAW

avviene a causa della differente impedenza acustica tra canale e substrato, a 50 MHz presenta una lunghezza caratteristica d’attenuazione

xs = 0, 45λs

ρscs

ρfcf

= 618 µm (4)

dove λs, ρs and cs sono lunghezza d’onda, densit`a e velocit`a del

suo-no nel substrato di LiN bO3, invece f indica il canale in PDMS. Questo

assorbimento pu`o generare un riscaldamento eccessivo, strane risonanze o

riflessioni, ed aumentare il consumo in potenza diminuendo cos`ı l’efficienza del dispositivo [10].

Grazie ai numeri di Reynolds relativamente piccoli, tipici dei sistemi microfluidici (Re < 100), i flussi circolatori azimutali indotti nel liquido dalle

SAW sono particolarmente efficienti nel creare un ricircolo delle particelle presenti in soluzione all’interno dei microcanali. Questo moto circolatorio, congiunto con il riscaldamento del campione dovuto alla dispersione viscosa delle SAW nel liquido, porta ad un miglioramento delle rese di reazioni biochimiche e ad una riduzione dei tempi di reazione [11].

2.2

Dispositivi di sensing basati su SPR

2.2.1 Eccitazione di plasmoni di superficie

I sensori SPR sono rifrattometri ottici misuranti variazioni dell’indice di ri-frazione che avvengono sulla superficie metallica supportante i plasmoni di superficie. Questi sensori sono diventati uno strumento cardine nel caratte-rizzare e quantificare interazioni bio-molecolari.

La prima osservazione di plasmoni superficiali venne fatta nel 1902 da Wood, il quale riport`o anomalie nello spettro della luce difratta da un grating me-tallico [12]. Successivamente Fano dimostr`o [13] che queste sono associate all’eccitazione di onde elettromagnetiche sulla superficie del grating difrat-tivo e nel 1968 Otto mostr`o che il dip osservato in riflettivit`a, tramite il metodo della riflessione totale attenuata (ATR), `e dovuto all’eccitazione di plasmoni [14].

Nella pi`u semplice configurazione un plasmone di superficie corrisponde

ad un modo guidato del campo E.M. propagante lungo l’interfaccia tra

un metallo (con permittivit`a complessa m = 

0 m +  00 m) ed un dielettrico (d =  0 d+  00

d). Dalle soluzioni delle equazioni di Maxwell con appropriate

condizioni al contorno per questa struttura risulta che il plasmone `e un modo TM del campo elettromagnetico, ovvero il vettore del campo magnetico giace nel piano dell’interfaccia metallo-dielettrico ed `e perpendicolare alla direzione di propagazione.

In un sistema di coordinate cartesiano dove il metallo `e nella regione a z < 0 e il plasmone propaga lungo l’asse x, il campo magnetico risulta

Hj = (0, Hy, 0)j = (0, 1, 0)Ae−αjz+i(βx−ωt) (5)

dove ω `e la frequenza, t il tempo, β la costante di propagazione e αj =

pβ2_{− (ω/c)}2_

Figura 4: Distribuzione spaziale dell’intensit`a del campo magnetico di un plasmone superficiale nella direzione perpendicolare all’interfaccia tra oro e dielettrico (n = 1, 328), per λ = 850 nm [15].

L’intensit`a del campo magnetico `e massima all’interfaccia tra metallo e dielettrico e decade esponenzialmente da entrambe le parti. Le caratteri-stiche lunghezze di penetrazione, definite come le distanze dall’interfaccia alle quali l’ampiezza del campo decresce di un fattore e, dipendono sia dalla

lunghezza d’onda che dalle permittivit`a dei materiali. Ad esempio, per un

plasmone propagante all’interfaccia tra oro e un dielettrico con nd = 1.32, la

lunghezza di penetrazione varia da 100 a 600 nm aumentando la lunghezza d’onda incidente da 600 a 1000 nm.

La costante di propagazione di un plasmone di superficie all’interfaccia metallo-dielettrico risulta essere

βSP = ω c r md m+ d = 2π λ r md m+ d (6) dove c `e la velocit`a della luce e λ la lunghezza d’onda nel vuoto. Nel caso di struttura senza perdite, l’equazione 6 indica un modo guidato del campo E.M. solo se le permittivit`a 0<sub>m</sub> e 0<sub>d</sub>sono di segno opposto e vale 0<sub>m</sub> < 0<sub>d</sub>. La permittivit`a dei dielettrici `e tipicamente positiva e metalli quali oro, argento e alluminio hanno parte reale della permittivit`a negativa nell’infrarosso.

Questi materiali presentano anche una notevole parte immaginaria, per

nulla. Quest’ultima `e responsabile dell’attenuazione del plasmone lungo la direzione di propagazione. Dalla costante di propagazione si ricavano l’indice di rifrazione effettivo nef e la costante di attenuazione b come

nef =

c

ωRe[βSP], b =

0.2

ln10Im[βSP]. (7)

I plasmoni superficiali possono essere eccitati dalla luce incidente se e solo se la componente del suo vettore d’onda parallela all’interfaccia com-bacia con quella del plasmone βSP. Tuttavia questa `e tipicamente maggiore

del vettore d’onda della luce nel dielettrico, quindi i plasmoni non possono essere eccitati con luce incidente direttamente su una superficie metallica liscia. Per superare questa limitazione esistono metodi per aumentare il vettore d’onda della luce ed accoppiare cos`ı la luce ai plasmoni. I

meto-di meto-di accoppiamento pi`u comunemente usati nei sensori SPR sono tramite

prisma, guide d’onda e grating.

Il setup ottico da me ideato `e basato sul metodo ATR realizzato usando

un prisma ad alto indice di rifrazione nella configurazione chiamata

Kre-tschmann (Fig. 5). La luce attraversa il prisma e viene riflessa totalmente

in presenza del metallo, oro nel mio caso. In esso viene quindi generata un’onda evanescente la cui costante di propagazione viene modificata agen-do sull’angolo di incidenza θ. La condizione di risonanza per generare i plasmoni usando un prisma di indice np (> nd) `e

2π

λ npsin(θ) = Re[βSP]. (8)

Quando avviene una variazione dell’indice di rifrazione del dielettrico

cambia anche la costante di propagazione del plasmone βSP; che tramite la

condizione di accoppiamento risulta in una variazione della condizione di risonanza per la luce incidente. A seconda del parametro della luce usato per misurare questa variazione, i sensori SPR vengono classificati in sensori a modulazione angolare, di lunghezza d’onda, d’intensit`a o di fase.

Nel mio lavoro ho realizzato un sensore SPR operante nel secondo modo, chiamato wavelength scanning. L’effettiva eccitazione di plasmoni in riso-nanza, usando luce policromatica collimata, viene osservata come un dip nello spettro della luce riflessa dal chip. Dove il minimo della curva di

riflet-tivit`a corrisponde al massimo accoppiamento tra l’onda E.M. evanescente ed i plasmoni.

Figura 5: Schema dell’accoppiamento della luce incidente con i plasmoni di superficie tramite prisma ad alto indice di rifrazione (np > nd) [15].

2.2.2 Caratteristiche e limiti dei dispositivi SPR

I biosensori SPR sono dispositivi di sensing dotati di un elemento di bio-riconoscimento superficiale interagente con uno specifico analita e di un trasduttore SPR, che lega l’evento di legame ad un segnale in uscita. Gli

elementi di bio-ricognizione vengono immobilizzati in prossimit`a della

su-perficie del film metallico supportante i plasmoni. Quando una molecola in soluzione si lega a questi avviene un aumento dell’indice di rifrazione effet-tivo del dielettrico ∆n, misurabile otticamente dallo spettro riflesso.

Questa variazione dipende dalla concentrazione molecolare c della sostanza legatasi sulla superficie. Se avviene in un sottile strato di altezza h, la rispo-sta del sensore risulta proporzionale alla variazione dell’indice di rifrazione, espressa come

∆n = (dn

dc) Γ

h (9)

Il parametro pi`u importante per caratterizzare un sensore SPR `e la sua sensibilit`a che dipende da due fattori, la sensibilit`a del segnale letto (lunghezza d’onda risonante) verso l’indice di rifrazione e l’efficienza della conversione degli eventi di legame in variazioni di indice di rifrazione. La sensibilit`a viene espressa come prodotto di due termini

S = δY

δnef

δnef

δnd

(10) dove Y indica il segnale in uscita sul sensore. Il primo termine descrive la sensibilit`a del segnale letto rispetto all’indice di rifrazione effettivo del plasmone e dipende dal metodo di eccitazione. Il secondo termine descrive invece la sensibilit`a dell’indice effettivo del plasmone in funzione dell’indice

di rifrazione del dielettrico, non dipende dal metodo di eccitazione n´e di

modulazione, ma dalla distribuzione delle variazioni dell’indice di rifrazione sull’area di sensing.

E’ stato mostrato in [15] che la sensibilit`a dell’indice effettivo del pla-smone, per una variazione dell’indice di rifrazione sull’intero volume, va come (δnef δnd )B = ( nef nd )3 > 1. (11)

Molto pi`u rilevante per il dispositivo realizzato `e la sensibilit`a per una variazione superficiale dell’indice di rifrazione che avviene in uno strato di spessore h. Supponendo che h << Lpd = 1/Re[αd] e |

0

m| >> 

00

m, questa

sensibilit`a pu`o essere scritta come

(δnef δnd )S = 2( δnef δnd )B h Lpd . (12)

Poich´e la lunghezza di penetrazione Lpd del plasmone nell’oro `e

propor-zionale alla lunghezza d’onda λ della luce incidente, aumentando quest’ul-tima la sensibilit`a superficiale diminuisce pi`u velocemente rispetto a quella di volume.

Un’altra importante caratteristica che descrive la performance di un

sensore SPR `e la sua risoluzione, legata al limite di rilevamento (LOD).

La risoluzione SPR `e definita come il pi`u piccolo cambiamento nell’indice di rifrazione che produce una variazione osservabile in uscita sul sensore.

L’ampiezza delle variazioni del segnale in uscita che il sensore pu`o rileva-re dipende dal livello di incertezza di lettura, influenzata dal rumorileva-re sul

dispositivo. La risoluzione rSP R viene tipicamente espressa come

rSP R = σso/S (13)

con σso si indica la deviazione standard del rumore sul segnale in uscita

e S `e la sensibilit`a sull’indice di rifrazione di volume. Sebbene il LOD defini-tivo possa essere calcolato solo conoscendo tutti i parametri dell’interazione tra l’analita e gli elementi di bio-rilevazione, la minima massa molecolare

catturata misurabile σΓ pu`o essere stimata partendo dalla variazione

del-l’indice di rifrazione che avviene in uno strato di spessore h << Lpd, tramite

la formula

σΓ = σRI

Lpd

2(δn_δc)vol

. (14)

Per un sensore SPR operante a lunghezza d’onda di 760 nm (Lpd = 320

nm) ed un tipico analita (come DNA o BSA) con incremento (δn/δc)vol =

0.18 cm3_{/g, una risoluzione sull’indice di rifrazione σ}

RI = 10−6 RIU

3

Simulazioni MATLAB

In questo capitolo presento i risultati delle simulazioni svolte in MATLAB ad inizio tesi per ottimizzare la performance del dispositivo basato su surfa-ce plasmon resonansurfa-ce (SPR). Ho prima ottimizzato il segnale di risonanza e la sensibilit`a del chip formato da una struttura metallica multistrato, in funzione sia dei materiali usati e che degli spessori degli strati. Successi-vamente ho simulato l’eccitazione plasmonica tramite il setup ottico nel-la configurazione di Kretschmann per trovare nel-la configurazione geometrica ottimale.

3.1

Ottimizzazione del chip

La tecnica di sensing SPR si basa sull’osservazione della variazione della risonanza plasmonica in funzione di variazioni dell’indice di rifrazione della soluzione dielettrica supportante i plasmoni, dovute ad eventi di legami su-perficiali. Infatti luce incidente di lunghezza d’onda λ accoppia con plasmoni di superficie all’interfaccia tra un metallo ed un dielettrico se il suo vettore d’onda parallelo all’interfaccia coincide con la costante di propagazione del

plasmone βSP (definita nel Cap.2):

ksin(θin) = Re[βSP] (15)

inducendo una risonanza osservabile come un dip nello spettro della luce riflessa dalla superficie metallizzata del chip. Questo avviene perch´e i fo-toni p-polarizzati incidenti interagiscono con gli elettroni liberi dello strato metallico, inducendo un’oscillazione elettronica che riduce quindi l’intensit`a della luce riflessa. La risonanza pu`o essere osservata in funzione sia del-l’angolo di incidenza per fissata lunghezza d’onda (tecnica chiamata angle-scanning), sia della lunghezza d’onda usando una sorgente policromatica ad un angolo di incidenza fissato (wavelength-scanning). Nel mio lavoro ho scelto di usare la seconda modalit`a.

L’obiettivo della tecnica di sensing SPR alla quale sono interessato `e quello di misurare concentrazioni di molecole in fluidi osservando la va-riazione del segnale letto dal sensore, ovvero la vava-riazione della lunghezza d’onda risonante ∆λmin. Al fine di avere la massima sensibilit`a `e necessario

massimizzare l’ampiezza del dip e minimizzare la sua larghezza. In que-sto modo la lettura del minimo della curva di risonanza risulta pi`u precisa, consentendo al dispositivo di rilevare concentrazioni minori.

Il minimo della riflettivit`a Rmin pu`o essere reso molto vicino a zero

selezionando l’appropriato spessore dello strato metallico, dipendente dalla

lunghezza d’onda utilizzata, tipicamente tra i 40 e 50 nm [16]. Invece la

larghezza della curva di risonanza dipende principalmente dalla costante dielettrica complessa dei metalli usati. Tipicamente una grande parte reale (negativa), assieme ad una piccola parte immaginaria, genera una curva stretta.

Per quanto riguarda i materiali usati le possibilit`a sono oro o argento. Anche se l’argento presenta migliori caratteristiche in termini del fattore di qualit`a della risonanza (Fig. 6), `e chimicamente meno inerte dell’oro; ho quindi deciso di realizzare tutte le componenti del chip in oro. Sempre in

Fig. 6 si nota che lunghezze d’onda maggiori generano curve di risonanza

pi`u strette. Questo `e uno dei motivi per cui gli esperimenti SPR nel vicino infrarosso ultimamente stanno attraendo particolare attenzione. Tuttavia rendere la curva di risonanza pi`u stretta implica necessariamente aumentare

la lunghezza di propagazione plasmonica (Lx), definita come

Lx=

1

2k00_x. (16)

Questo potrebbe essere uno svantaggio per applicazioni di imaging SPR dove `e richiesto un alto controllo di posizionamento laterale sulle aree di sensing. Ad esempio aumentare la lunghezza d’onda da 450 a 1500 nm per

uno strato d’oro implica un aumento di Lx da 100 µm a quasi 1 mm.

Inoltre un aumento in λ genera anche un aumento della lunghezza di penetrazione 1/ky (con y la direzione normale alla superficie), di

conseguen-za la posizione di minima riflettivit`a diviene pi`u sensibile a variazioni nel dielettrico relativamente lontane dall’interfaccia metallo-dielettrico e la ca-ratteristica sensibilit`a superficiale perde importanza. Quindi per dispositivi

SPR per la rilevazione di sottili film superficiali la scelta della lunghezza

d’onda ottimale `e diversa (λ minori) rispetto a dispositivi in cui si deve

rilevare una variazione dell’indice di rifrazione su tutto il volume del fluido.

Figura 6: Riflettivit`a del segnale SPR a diverse lunghezze d’onda incidenti per 46 nm di oro (linea intera) e argento (tratteggiata), con acqua come dielettrico a basso indice di rifrazione [16].

Figura 7: Schema dell’eccitazione di plasmoni di superficie all’interfaccia Au-H2O, realizzata sopra un substrato di niobato di litio per l’eccitazione

SAW.

Come mostrato in Fig. 7, lo schema pi`u elementare per eccitare un

plasmone consiste in un interfaccia Au-H2O; nel presente lavoro l’oro viene

depositato sul substrato piezoelettrico di niobato di litio (LiN bO3) scelto per

eccitare le SAW. Considerando ad esempio luce incidente monocromatica

Esistono varie tecniche per calcolare le propriet`a radiative quali rifles-sione e trasmisrifles-sione per film sottili, dipendentemente dai loro spessori e

propriet`a ottiche. Nelle mie simulazioni ho usato il metodo della matrice

di trasferimento, pi`u diretto ed efficace per il calcolo di strutture

multistra-to rispetmultistra-to, ad esempio, al memultistra-todo del tracciamenmultistra-to di campo [17]. Per

ogni strato m-esimo della struttura (Fig. 8) con spessore dm ed indice di

rifrazione complesso nm, `e possibile scrivere la matrice di interferenza come

Mm = M1,1 M1,2 M2,1 M2,2 ! = cosβm − i qmsinβm

−iqmsinβm cosβm

! M = N Y m=1 Mm

dove βm e qm sono definiti come 2π_λ nmdmcosθm e nmcosθm. La matrice

Mm lega tra loro i campi magnetici ed elettrici ad entrambe le interfacce,

considerate semi-infinite nel codice. Infatti le loro componenti trasverse devono essere continue ad ogni interfaccia. Con questo metodo, applicabile solamente per luce incidente polarizzata TM, `e quindi possibile calcolare la matrice totale M per l’intera struttura multistrato.

Dalla matrice M si ricavano i coefficienti riflessione r e di trasmissione t attraverso i vari strati:

r = (M11+ M12nm)n0− (M21+ M22nm) (M11+ M12nm)n0+ (M21+ M22nm) (17) t = 2n0 (M11+ M12nm)n0+ (M21+ M22nm) (18) dove n0 indica l’indice di rifrazione dell’aria, considerato lo strato di

incidenza.

La riflettivit`a totale R, la trasmittivit`a T e la fase si scrivono quindi come:

R = |r|2 (19)

T = nm

n0

|t|2 ₍₂₀₎

Φ = arctg|r|. (21)

Per prima cosa ho calcolato la mappa di riflettivit`a, in funzione sia

dell’angolo di incidenza (nel range 0−90◦) che della lunghezza d’onda (350− 1200 nm), per un singolo strato d’oro spesso 60 nm tra il substrato di

LiN bO3 e la soluzione acquosa come dielettrico. Come si vede in Fig. 9,

il minimo assoluto risulta Rp = 0, 093, per θmin = 40, 1◦ e λmin = 700

nm. Tenendo fisso uno dei due parametri (θ o λ) `e possibile plottare lo

spettro riflesso mostrante il caratteristico dip corrispondente all’eccitazione di plasmoni.

Per ogni configurazione del chip testata il parametro pi`u importante da

verificare `e la sua sensibilit`a S, definita come la variazione della lunghezza d’onda del minimo della curva di risonanza in funzione della variazione dell’indice di rifrazione del liquido dielettrico

S = ∆λ

∆n (22)

θ (a.u.) λ (a.u.) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100 200 300 400 500 600 700 800 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 minimo assoluto R = 0,093 θ min = 40,1° λ min = 700 nm (a) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Riflettività R p 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 λ (nm) FWHM= 50 nm @ θ= 40,1° fissato (b) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Riflettività R p 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 θ (°) FWHM= 0,61¡ @ λ= 700 nm fissato (c)

Figura 9: (a) Mappa a colori della riflettivit`a Rp(λ, θ) per un singolo

stra-to di oro spesso 60 nm tra dielettrici considerati semi-infiniti e relative proiezioni per θ = 40, 1◦ fissato (b) e per λ = 700 nm fissato (c).

d1 (nm) S a θ0 = 38, 9◦(nm/RIU ) S a θmin(nm/RIU ) 30 24000 229 40 25657 857 50 27000 6857 60 26543 4000 100 no dip no dip

Tabella 2: Sensibilit`a ad angolo fisso per differenti spessori dello strato d’oro; θ0 indica l’angolo per il quale si ha la massima sensibilit`a, θmin corrisponde

alla condizione ottimale di risonanza (minimo della curva).

In un test con marker biologici di dimensioni nanometriche sono attese variazioni dell’indice di rifrazione di circa 0.02 RIU in seguito ad eventi di legame superficiali, partendo da una soluzione di sola acqua con n = 1, 33. Nelle simulazioni ho considerato un range ∆n = 0.001 − 0.005, per il quale mi aspetto un andamento lineare della variazione della lunghezza d’onda, cos`ı da poter avere una stima della sensibilit`a del dispositivo tramite fit lineare.

In Tab. 2 sono elencati i risultati ottenuti dai fit delle variazioni ∆λ

per un singolo strato d’oro di diversi spessori; θ0 = 38.9◦ `e l’angolo per il

quale `e risultata la massima sensibilit`a S, θmin invece l’angolo di risonanza

corrispondente al minimo assoluto della riflettivit`a per ogni configurazione. Dai risultati trovati posso concludere che come singolo strato metallico la scelta ottimale risulta essere 50 nm di oro. Per uno strato di 100 nm non c’`e risonanza perch´e la penetrazione del plasmone nell’oro per λ = 700 nm `e di soli 75 nm, non generando quindi accoppiamento tra il campo evanescente nell’oro e quello del plasmone.

Nello stesso modo ho simulato la sensibilit`a per una struttura

multi-strato con un primo film metallico sottile promotore di adesione (di titanio

o cromo) ed un secondo film d’oro. Ho trovato che il titanio (Ti) `e

leg-germente migliore del cromo (Cr), infatti per 55 nm di oro la sensibilit`a `e S = 4000 nm/RIU, contro i 3734 del caso con il cromo. Sebbene entrambi i materiali siano ottimi promotori d’adesione dell’oro sul LiN bO3, ho quindi

scelto di usare il titanio, simulando la sensibilit`a per differenti combinazioni di spessori di Ti/Au (elencate in Tab.3).

Figura 10: Schema dell’eccitazione plasmonica su chip con doppio strato metallico.

d1(nm) d2(nm) S(nm/RIU ) Smax(nm/RIU )

5 50 4143 27143 5 55 3886 26914 5 60 4000 26657 10 50 4000 27000 10 55 4000 26771 10 60 4000 27000 15 50 3857 26886

Tabella 3: Sensibilit`a ad angolo fisso per diverse combinazioni di strati tita-nio/oro; l’ultima colonna mostra la massima sensibilit`a ottenibile, uscendo per`o dalla condizione ottimale di risonanza.

La miglior configurazione risulta per strati di spessore 10/55 nm, in quanto essa presenta la massima sensibilit`a in risonanza e risulta anche la pi`u stabile contro possibili errori di spessore nell’evaporazione dei metalli. L’angolo ottimale corrispondente al minimo della riflettivit`a `e θ = 40.3◦

per λ = 685 nm. Sebbene la sensibilit`a simulata sia sei volte maggiore

a 38.9◦(λ = 1022 nm), in questa seconda configurazione l’eccitazione dei

plasmoni risulta essere meno efficiente poich´e il minimo della riflettivit`a presenta un valore maggiore, come si vede in Fig. 11. Inoltre la risonanza `e molto pi`u larga, per cui l’effettiva sensibilit`a di lettura della variazione ∆λ risulta minore, producendo un errore di lettura del segnale maggiore.

Poich´e la lunghezza di penetrazione dei plasmoni di superficie nell’acqua

per luce incidente di 685 o 1022 nm `e rispettivamente 214 e 634 nm,

sensibile a variazioni superficiali dell’indice di rifrazione. 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Riflettività R p 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 λ (nm) 38,9¡ 40,3¡ FWHM= 56 nm @ 685 nm FWHM= 137 nm @ 1022 nm

Figura 11: Riflettivit`a per strati Ti/Au spessi 10/55 nm selezionando l’an-golo di incidenza per avere la risonanza ottimale (in blu) o la massima sensibilit`a S.

3.2

Setup SPR in configurazione Kretschmann

Per soddisfare la condizione di SPR la luce deve quindi avere un ango-lo θSP = 40, 3◦ nel LiN bO3, ma a causa dell’alto indice di rifrazione del

substrato non `e possibile secondo la legge di Snell incidere dall’aria. Una possibile soluzione sarebbe usare uno strato sottostante ad indice di rifrazio-ne maggiore dell’aria, a 700 nm n = 1, 51 per il BK7 e n = 1, 51 per l’ SF11. In questi materiali l’angolo risonante risulta rispettivamente per θBK7 = 72◦

e θSF 11 = 55◦, come mostra la Fig. 12a. Tuttavia risulta poi

nuovamen-te impossibile accoppiare la luce incidendo direttamennuovamen-te dall’aria in questi

materiali vetrosi (Fig. 12b). La soluzione consiste nell’aumentare il

vet-tore d’onda della luce per poterlo accoppiare con i plasmoni all’interfaccia metallo-dielettrico sfruttando la riflessione totale attenuata (ATR).

Ho scelto quindi di usare un prisma ad alto indice di rifrazione nella

co-siddetta configurazione Kretschmann, mostrata schematicamente in Fig. 13.

Considerando luce di 700 nm, una struttura Ti/Au di spessore 10/55 nm ed

un prisma di SF11, la risonanza ottimale per avere θSP = 40.3◦ corrisponde

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 θ 1 incidente (°) θ 2 in LN (°) aria, n=1 SF11, n=1,77 BK7, n=1,51 strato 1 (a) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 θ 0 in aria (°) θ 1 (°) BK7 SF11 (b)

Figura 12: (a) Legge di Snell per luce incidente a 700 nm tra diverse inter-facce di incidenza e lo strato di niobato di litio (LN), in verde la condizione di risonanza per θSP = 41◦; (b) legge di Snell per incidenza normale

dall’a-ria ad un matedall’a-riale vetroso ad alto indice di rifrazione, nessuna risonanza possibile.

Nelle simulazioni la faccia piana del prisma `e considerata parallela al

piano laboratorio. Ho successivamente simulato la riflettivit`a in funzione

della lunghezza d’onda λ della luce incidente (nel range 400-1240 nm) e della sua inclinazione angolare θb (0-45◦) In Tab. 4 sono riportati i valori

Nell’ultima colonna `e riportata la sensibilit`a superficiale prevista, defi-nita come Ssuperf icie = S h LP D ≈ 2(δnef f δnd )B h LP D (23) dove h `e lo spessore dello strato dove avviene il cambiamento dell’indice di rifrazione dovuto al legame molecolare (circa 10 nm per uno strato di PEG 400 [18]) e LSP `e la lunghezza di penetrazione dei plasmoni nell’acqua

(≈ 200 nm). La miglior risonanza si ha con un fascio inclinato a 29◦ per

λ = 681 nm, ovvero con un angolo di incidenza sulla faccia obliqua del prisma di 16◦.

Figura 13: Prisma ad alto indice di rifrazione per accoppiare la luce

(a)

(b) (c)

Figura 14: (a) Mappa a colori della riflettivit`a Rp in funzione della

lun-ghezza d’onda e dell’angolo di incidenza rispetto al piano del laboratorio, accoppiato tramite un prisma SF11 supposto allineato ad esso. (b) Varia-zione della risonanza dalla condiVaria-zione ottimale θb = 29◦ (in blu) a θb = 25◦

(in rosso) e (c) in funzione di una variazione dell’indice di rifrazione del dielettrico ∆n = 0, 01 RIU, rispetto al caso di pura acqua (nW A = 1, 33).

θb λmin Rp F W HM DIP/F W HM S Ssuperf icie

(◦) (nm) (a.u.) (nm) (1e − 3/nm) (nm/RIU ) (nm/RIU )

25 653 0.056 23 6.8 1000 60 27 666 0.062 27 12.3 1000 55 28 673 0.069 28 13.3 1000 51 29 681 0.079 30 13.1 1200 58 30 691 0.092 36 11.0 1600 72 31 706 0.108 44 9.1 2200 90 32 728 0.125 54 7.4 escluso escluso 33 765 0.150 56 6.8 escluso escluso

Tabella 4: Valori caratterizzanti le risonanze e sensibilit`a per diversi angoli della luce incidente θb rispetto il piano laboratorio. Gli ultimi due angoli

non sono presi in considerazione poich´e il minimo della risonanza `e vicino alla regione rumorosa dello spettrometro.

(a)

(b)

Figura 15: (a) Rappresentazione della divergenza geometrica per una sor-gente puntiforme generata da un diaframma di diametro 2 mm e (b) per una sorgente estesa di 9 mm usando due diaframmi a distanza d fra loro.

Parte del mio lavoro di tesi ha riguardato la progettazione e realizzazione del setup ottico per SPR. Per collimare la luce policromatica divergente in uscita dalla lampada ho usato due diaframmi di apertura variabile. Grazie a questi `e possibile selezionare un fascio di 2 mm di diametro in modo tale

che vada ad incidere completamente sulle aree di sensing SPR da 4 mm2,

realizzate sulla superficie del dispositivo come illustrato nel Cap. 5.1. Nelle precedenti simulazioni ho considerato la luce propagante senza di-vergenza. Questo sarebbe il caso di una sorgente puntiforme, per il quale, posizionando un singolo diaframma di 2 mm di diametro ad una distanza di 10,20 o 30 cm dalla sorgente, si avrebbe una divergenza geometrica rispet-tivamente di soli 0.57◦, 0.29◦ e 0.19◦ attorno alla direzione di propagazione, e dunque varrebbe l’approssimazione ad onda piana (PWA).

Tuttavia la lampada ha un diametro di 9 mm e, mettendo un primo diaframma a 10 cm dalla lampada ed il secondo a 10, 20 o 30 cm dal primo, il fascio uscente ha una divergenza ∆θ = 1.15◦, 0.57◦e 0.38◦(Fig. 15).

Per verificare i possibili effetti della divergenza sulla risonanza, ho sosti-tuito nel codice per ogni angolo θ la riflettivit`a R(λ, θ) con una riflettivit`a efficace Ref f, calcolata come la media sul range [θ − ∆θ; θ + ∆θ]. In Fig. 16

`e mostrato l’effetto della divergenza per varie distanze tra i due diaframmi,

sempre con prisma SF11, substrato di LiN bO3 di 500 µm, 10 nm di Ti, 55 di

Au e H2O come dielettrico (n=1,33). Si vede che per separazioni maggiori

di 20 cm la curva di risonanza risulta simile al caso senza divergenza (curva in rosso).

Ricalcolando le sensibilit`a in funzione dell’angolo di incidenza con i mi-nimi ricavati dalle riflettivit`a efficaci (elencate in Tab. 5), la condizione

ottimale risulta ancora per θb = 29◦, con un valore leggermente maggiore

del caso senza divergenza. Cambiando l’angolo di mezzo grado la sensibilit`a simulata pu`o variare dal 5 al 20%. Al fine di avere misure affidabili `e quindi necessario avere almeno 0.5◦ di controllo angolare nel setup ottico.

In conclusione ho simulato l’eccitazione di plasmoni di superficie trovan-do la configurazione geometrica ottimale per sensing SPR, sia per il chip supportante i plasmoni che per il setup ottico per la loro eccitazione

(mo-strato in Fig. 17). Ho quindi fabbricato il chip e montato il setup secondo

0,40 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 λ (µm) R eff no div 10 cm 20 cm 30 cm 751 nm 0.155 −50% 93 nm 742 nm 0.081 −10% 72 nm 740 nm 0.060 −5% 68 nm 738 nm 0.0386 0.46 64 nm λ R_min DIP FWHM

Figura 16: Riflettivit`a effettiva per diverse distanze tra i due diaframmi

mostrati in Fig. 15b, confrontata con il caso senza divergenza (in rosso).

θb(◦) S(nm/RIU ) Ssuperf icie(nm/RIU )

25 900 53.7 26 900 51.1 27 900 48.4 28 1100 56.3 28.5 1200 59.5 29 1300 62.0 29.5 1600 74.1 30 1900 84.5 31 2900 117.8

Tabella 5: Sensibilit`a di volume e superficiale per diversi angoli di incidenza rispetto al piano laboratorio, considerando la divergenza del fascio generata da due diaframmi posti a 200 mm.

Figura 17: Illustrazione della configurazione risultata ottimale dalle simulazioni.

4

Materiali e metodi

In questo capitolo discuto la fabbricazione del chip ad onde acustiche di superficie (SAW) e dei microcanali in PDMS, assieme agli strumenti e alle tecniche di nanofabbricazione che ho appreso durante il mio periodo di te-si. Inoltre viene descritto il funzionamento del vibrometro laser ad effetto Doppler (LDV), usato per caratterizzare il profilo delle ampiezze SAW e la loro propagazione sul substrato, e la tecnica Particle Image Velocimetry (PIV) usata per ricostruire la mappa di velocit`a dei flussi all’interno dei microcanali.

4.1

Tecniche di nanofabbricazione

4.1.1 Litografia ottica ed elettronica

Per realizzare microstrutture sui chip vengono usati processi di litografia, nei quali un sottile strato di materiale organico (chiamato resist ) viene esposto secondo la geometria delle strutture da realizzare. Il resist viene deposto uniformemente sulla superficie del chip tramite spin-coating e viene successivamente irraggiato con fotoni (litografia ottica) o con un fascio di elettroni (litografia elettronica, EBL). A seconda che il resist sia positivo o negativo l’azione chimica della radiazione incidente `e quella di indebolire o rafforzare le catene di monomeri. Tramite l’azione chimico-fisica dello sviluppatore lo strato di resist viene rispettivamente rimosso o lasciato in

corrispondenza del pattern esposto, come mostrato in Fig. 18.

Figura 18: Illustrazione della litografia ottica per contatto.

La macchina per litografia ottica MJB4 utilizza una lampada ad

incan-descenza che emette radiazione UV con potenza 20 W/cm2_{. Per la}

(SEM) Zeiss ULTRAPlus con stage di posizionamento interferometrico ed un generatore di pattern Raith Elphy Plus. Ho regolato la macchina con un voltaggio d’accelerazione degli elettroni di 10 KeV ed un’apertura del fascio di diametro 10 µm, questi parametri generano una corrente di 0,026 nA nella camera ad alto vuoto (e-5 mbar). La macchina regola in automatico la velocit`a alla quale muovere il fascio per esporre le aree con la desiderata dose.

La distanza di lavoro (WD) `e regolata ad 1 cm poich´e in funzione di

questa e del voltaggio dipende il campo di vista, che deve combaciare con

l’intero campo di scrittura (WF) di 200 µm. Quest’ultimo `e l’area sulla

quale la macchina riesce a lavorare senza muovere lo stage.

La risoluzione ottenibile tramite litografia dipende dalla lunghezza d’on-da della radiazione utilizzata per l’esposizione; con il setup a disposizione, mentre tramite litografia ottica UV si possono realizzare strutture fino al µm, l’EBL raggiunge i 10 nm di risoluzione.

4.1.2 Deposizione di sottili film metallici

Per realizzare le strutture metalliche nanometriche ho utilizzato un

evapo-ratore termico Kurt J. Lesker Nano 38. Esso `e stato calibrato realizzando

varie evaporazioni di spessori differenti sia di titanio che di oro, trovando la relazione tra lo spessore nominale impostato e quello reale.

Per poter profilare lo spessore reale, prima dell’evaporazione del titanio,

ho coperto met`a substrato con del resist S1818 per litografia ottica. In

questo modo, tramite il successivo lift-off in acetone, ho potuto misurare lo spessore dello strato evaporato rispetto al substrato usando un profilometro a contatto. Una volta trovato il fattore di conversione per il titanio, ho realizzato vari spessori in oro evaporando per ciascuno di essi 10 nm reali di titanio come strato adesivo sul substrato. I risultati sono mostrati in Tab. 6.

Ti nominale Ti reale Au nominale Au reale (nm) (nm) (nm) (nm) 40 37,8 40 39,5 50 47,5 50 49,3 60 60,8 60 64,6 70 72,2 70 73,7 80 86 100 104,8

fattore correzione = 1,014 fattore correzione = 1,037

Tabella 6: Calibrazione dell’evaporatore termico per titanio ed oro.

4.1.3 Inductively coupled plasma Reactive-ion etching

La rimozione di strati metallici avviene tramite attacco chimico o fisico, usando un resist come maschera protettiva per le strutture metalliche.

L’attacco chimico (wet etching) avviene agitando il campione in una soluzione contenente sostanze che reagiscono chimicamente con il metallo

da rimuovere. Il processo `e fortemente isotropo, quindi risulta non

idea-le nel realizzare precise strutture ma piuttosto viene usato per rimuovere completamente uno strato metallico dalla superficie.

La tecnica basata sull’attacco fisico, usata nel mio lavoro, si chiama Inductively coupled plasma Reactive-ion etching (ICP-RIE). In essa viene

prima creato un plasma da un mix di gas Ar:Cl2:BCl3 in rapporto di

con-centrazione 3:5:4, gli ioni prodotti vengono poi accelerati verticalmente sul campione da una sorgente RF a 100 W con un voltaggio di bias di 40 V. La macchina utilizza due sorgenti RF per controllare indipendentemente la densit`a e l’energia degli ioni prodotti. Il processo, sebbene sia meno seletti-vo tra metallo e substrato, risulta molto pi`u preciso rispetto all’etching ad umido.

Per caratterizzare l’efficienza del processo ho prima metallizzato tramite resist lift-off (S1818) met`a substrato, ho poi coperto met`a strato metallico con altro resist in modo da avere tutte le combinazioni metallo-substrato protetto e non dal resist. Al termine dell’etching ho potuto quindi profilare lo spessore di metallo rimosso ed anche l’effetto sul substrato.

Sono state testate varie combinazioni di spessori sia di oro che di titanio

per diversi tempi di etching. Fittando i risultati mostrati in Tab. 7 ho

ottenuto un etching rate di 0.85±0.06 nm/sec per il titanio e di 0.106±0.008 nm/sec per l’oro.

tempo etching Ti Ti rimosso tempo etching Au Au rimosso

(sec) (nm) (sec) (nm) 30 8 150 16,3 45 26 300 31,7 60 37 450 52,1 75 45,5 600 58,8 90 62 750 82

Tabella 7: Calibrazione del processo ICP-RIE per titanio ed oro.

(a)

(b)

Figura 19: (a) Schema della deposizione di sottili strati metallici tramite evaporazione termica e successivo lift-off. (b) Differenza tra l’etching ad umido svolto manualmente e tramite ICP-RIE direzionale.

4.2

Fabbricazione del chip

Il chip consiste in un substrato piezoelettrico di niobato di litio sul quale `e stato realizzato sia un trasduttore d’oro per l’eccitazione di SAW sia aree di titanio/oro per supportare plasmoni di superficie. Attorno a queste vi sono le microcamere riserve di liquido realizzate in PDMS. Descrivo ora la procedura seguita per la realizzazione di tutte le componenti.

4.2.1 Preparazione del substrato

Il primo passo nella realizzazione del chip consiste nella preparazione del substrato sul quale vengono realizzate le strutture metalliche. Questo con-siste in un quadrato di un pollice di niobato di litio (LiN bO3) 128◦ Y-cut,

tagliato da un wafer tramite una punta diamantata in modo che abbia un lato parallelo alla direzione ottica X del cristallo (lungo la quale eccitare le SAW). Questo cristallo piezoelettrico birifrangente `e un comune substra-to per dispositivi SAW a causa del grande coefficiente di accoppiamensubstra-to elettro-meccanico che presenta. Il substrato viene pulito con bagni ultraso-nici in acetone (ACE), seguiti da risciacquo in alcool isopropilico (IPA) ed asciugatura con flusso di azoto.

4.2.2 Realizzazione del trasduttore tramite EBL

Il passo successivo consiste nel realizzare il trasduttore interdigitato in oro (IDT) per eccitare le SAW sul substrato, mostrato in Fig. 20. L’IDT `e stato realizzato per litografia elettronica, disegnando il CAD della sua struttura al computer.

Il substrato `e stato innanzitutto metallizzato Ti/Au/Ti con spessori

10/50/15; successivamente ho depositato per spin-coating un sottile stra-to del resist negativo sensibile agli elettroni Microresist ma-N-2403 per 1’

a 6000 rpm e cotto per 1’ a 90◦C, pre-depositando il promotore di adesione

Allresist AR 300-80 per 1’ a 4000 rpm e cotto poi per 5’ a 90◦C.

Il pattern `e stato esposto con una dose di 7,5 µC/cm2 _{e consiste in un}

IDT a singolo elettrodo con apertura di 5 mm formato da 19 coppie di elettrodi con periodicit`a 80 µm. Dopo l’esposizione il resist `e stato svi-luppato in una soluzione basica chiamata Microresist ma-D-525 per 1’ con

stop in H2O. Poich´e il resist `e negativo rimane solo in corrispondenza delle

strutture esposte durante la litografia.

Quindi le aree di titanio non protette sono state rimosse tramite etching ad umido con acido fluoridrico (HF) ed l’oro sottostante rimosso tramite RIE usando gas argon a 53 sccm. Il tempo necessario per questo processo (circa 25’) `e stato regolato controllando ad occhio quando tutto l’oro fosse rimosso. Infine lo strato di titanio rimasto `e stato rimosso, assieme al resist ancora presente, usando una soluzione di acido solforico e perossido di idrogeno (chiamata in gergo soluzione piranha). Sul substrato rimane cos`ı solo l’IDT formato dal doppio strato Ti/Au.

Figura 20: IDT in oro con periodicit`a 80 µm e rapporto di metallizzazione

50%, gli elettrodi soggetti allo stesso potenziale sono connessi da bus-bar.

La soluzione piranha ha ossidato la superficie rendendola idrofila, ci`o

avrebbe potuto compromettere la riuscita dei successivi lift-off. Quindi

ho eseguito un trattamento della superficie con molecole di APTES per ristabilire l’angolo di contatto del niobato di litio ai tipici valori tra 50-70◦. Con una pipetta di vetro ho preparato una soluzione di 10 ml di ACE con il 3% di APTES ed ho lasciato il chip in essa per 10’. Dopo la pulizia con

ACE ed IPA `e richiesta una cottura a 90◦C per almeno 20’ in modo da

4.2.3 Realizzazione dei Pad di contatto per litografia ottica In seguito ho realizzato due grandi pad in oro per contattare le due bus-bar dell’IDT con il canale della PCB connesso al generatore RF. I pad sono stati realizzati per litografia ottica usando il resist positivo S1818, deposto

per spin-coating a 4000 rpm per 1’, cotto a 90◦C per un altro minuto ed

esposto per 2,2”. Dopo lo sviluppo per 1’ in MF 319 (stop in H2O) sono

stati evaporati in successione 15 nm di titanio e 100 nm d’oro.

Il chip `e stato lasciato poi in ACE per un lungo lift-off. Ho concluso il processo mettendo il campione in un bagno ultrasonico di IPA, favorendo il lift-off spruzzando sul campione IPA con una siringa da distanza ravvi-cinata. Ogni alone organico rimasto sulla superficie, dovuto al trattamento

con APTES, `e stato rimosso tramite un plasma ossigeno di 3’.

4.2.4 Realizzazione delle aree di sensing SPR

Prima di realizzare le aree per il sensing SPR sulla superficie del chip, ho studiato la dinamica dei fluidi nel microcanale indotta dalle SAW. Gli espe-rimenti microfluidici sono stati osservati al microscopio ottico con sei diverse inquadrature per camera, quindi ho realizzato dei marker per poter allinea-re le immagini in fase di post-analisi e ricostruiallinea-re la dinamica completa del fluido nel microcanale. Ogni marker `e stato realizzato in resist tramite li-tografia ottica e consiste in una croce con due linee parallele; ne sono stati realizzati due per camera del microcanale subito prima di allinearlo sul chip ed acquisire le misure.

In seguito i marker sono stati rimossi semplicemente pulendo la superficie del chip e sono state realizzate le quattro aree SPR di Ti/Au spesse 10/55 nm. Tutte queste sono quadrati di 2x2 mm e sono state realizzate per litografia ottica usando il resist positivo S1818 ed una specifica maschera in alluminio fabbricata in precedenza (foto in Fig. 24a).

Ai bordi delle quattro aree sono state realizzate delle linee d’oro (visibili in Fig. 21a) per l’allineamento del canale in modo che le aree SPR si trovino

al centro delle due camere. Le aree sono alte solo 65 nm contro i 360

µm del canale, quindi la presenza di queste non dovrebbe influenzare la fluidodinamica.

(a) (b)

Figura 21: (a) Chip-SAW con IDT, pad di contatto e quattro aree di sensing in oro, con il microcanale in PDMS allineato manualmente di fronte all’IDT. (b) Stesso dispositivo con il canale riempito per capillarit`a.

4.3

Fabbricazione dei microcanali in PDMS

I test biologici richiedono piccole quantit`a di fluidi per poter essere analizzati velocemente senza che questi evaporino o si spostino dall’area test. Per questo motivo `e necessario usare canali chiusi come riserva del fluido attorno alle aree SPR.

I canali sono realizzati in PDMS, il polimero organico pi`u utilizzato nel campo della microfluidica in ricerca di base. Esso presenta una grande resistenza alla temperatura, agli attacchi chimici e all’ossidazione; inoltre `e

un buon isolante elettrico resistente all’invecchiamento. Il PDMS `e

visco-elastico, ovvero si comporta come un fluido molto viscoso (tipo miele) alle alte temperature o per lunghi tempi di flusso e come un solido (tipo gomma) per basse temperature o tempi di flusso brevi. Nel realizzare un canale viene prima costruito uno stampo in resist su un wafer, sul quale viene poi versato il PDMS in fase liquida e cotto in forno. I passaggi seguiti nel realizzare i canali sono riportati di seguito.

4.3.1 Maschera del canale

Per realizzare lo stampo del canale tramite litografia ottica ho realizzato innanzitutto la corrispondente maschera metallica, tramite il processo illu-strato in Fig. 23. Su un substrato di quarzo (SiO2) realizzato uno strato di

150 nm di alluminio, depositato per spin-coating il resist e-beam negativo ma-N-2403 con promotore di adesione AR 300-80 e realizzato il pattern del canale tramite EBL. La ricetta usata `e

• AR 300-80 per 5” a 500 rpm + 60” a 4000 rpm • cottura a 90◦_{C per 5’}

• ma-N-2403 per 5” a 500 rpm + 60” a 6000 rpm • cottura a 90◦_{C per 1’}

• esposizione agli elettroni

• sviluppo in ma-D-525 per 60” con stop in H2O

Agitando poi il campione in una soluzione Al etchant type A per circa 5’ lo strato di alluminio non protetto dal resist `e stato rimosso, avendo cos`ı la

maschera del canale mostrata in Fig. 22.

Il passo successivo consiste nel duplicare la maschera realizzandone una sua replica in negativo, da usare poi nella litografia ottica per realizzare lo

stampo. La replica `e stata realizzata depositando un doppio strato Ti/Au

di 10/140 nm sul substrato, nel quale ho realizzato un’apertura della forma del canale per litografia ottica e successivo ICP-RIE. Nel processo di lito-grafia ho protetto lo strato metallico della maschera originale depositando un sottile strato di resist ARP-679-04 (PMMA) per 5” a 500 rpm, 1’ a 4000

rpm e 5’ di cottura a 120◦C. Il contatto tra le due maschere durante la

litografia `e assicurato da una lastra di vetro borosilicato molto spessa che pressa la maschera sul campione da litografare. I passi seguiti sono:

• AR-N-4340 per 5” a 500 rpm + 60” a 4000 rpm • pre-baking a 85◦_{C per 3’30”}

• post-baking a 95◦_{C per 5’}

• sviluppo in AR-300-475 per 60” con stop in H2O

• hard-baking a 105◦_{C per 5’}

• ICP-RIE per circa 25’ • rimozione resist in ACE

Figura 23: Schema del processo per realizzare la maschera in alluminio del canale di Fig. 22e la sua replica negativa.

4.3.2 Stampo dei canali

In seguito ho realizzato su un wafer di silicio da 3 pollici lo stampo del canale, usando il resist ottico SU8 2100 e la maschera metallica negativa del canale, secondo la procedura:

• deposizione di pasting PMMA per 5” a 500 rpm + 60” a 4000 rpm

• cottura a 120◦_{C per 15’ per evaporazione solvente}

• incollaggio maschera su lastra di vetro con pasting PMMA, per 10’ a 120◦C

• spin coating di SU8 2100 sul wafer di Si per 60” a 800 rpm

• pre-baking a 65◦_{C per 7’ + 60’ a 95}◦_{C raggiunti gradualmente}

• post-baking a 65◦_{C per 5 + 25’ a 95}◦_{C fino a solidificazione del resist}

• sviluppo agitando in soluzione di SU8 Developer per 20’ ca.

• stop in H2O per 10”

Il wafer `e stato esposto in quattro aree diverse in modo da avere quattro stampi del canale per ogni colata di PDMS. Tutti i tempi nel processare l’SU8 sono in funzione del suo spessore, dipendente dalla velocit`a di centri-fugazione nel processo di spin-coating. Inoltre il tempo di sviluppo, dipen-dente dall’agitazione meccanica durante il processo, va verificato di volta in volta controllando ad occhio quando il resist venga rimosso completamente.

4.3.3 Preparazione del PDMS

In un bicchiere di plastica viene preparata una soluzione di 27,8 g di PDMS allo stato liquido con il suo agente reticolante in concentrazione 1:10, me-scolando con un cucchiaino. La soluzione viene versata omogeneamente sul wafer con lo stampo del canale all’interno di un beaker fino un’altezza di circa 5 mm. Viene poi degassato per alcune ore al fine di eliminare tutte le bolle d’aria createsi durante il mescolamento e la colata. Infine deve essere cotto in forno a 80◦C per almeno un’ora.

Una volta solidificato i canali vengono rimossi semplicemente tagliando-li con un bisturi ed i fori per il riempimento sono fatti con uno specifico foratore di diametro 2 mm. Una volta rimosso un canale il corrispondente

spazio sullo stampo pu`o essere riempito versandoci del PDMS trattato in

fase liquida, degassandolo e cuocendolo nuovamente. I canali fatti con que-sto stampo sono alti 360 ± 20 µm, misurati tagliando trasversalmente un canale e profilandolo al microscopio ottico con una lente 5x.

4.4

Altre maschere e stampi

Oltre alla maschera per i microcanali agenti da riserva del liquido ho rea-lizzato le maschere per la litografia ottica delle aree di sensing SPR e dei marker in resist utilizzati nelle analisi di fluidodinamica, mostrate rispetti-vamente in Fig. 24a e 24b. I passi seguiti sono i seguenti:

• evaporazione di 150 nm di alluminio su due substrati di quarzo • spin coating del promotore di adesione AR 300-80 per 5” a 500 rpm

+ 60” a 4000 rpm sul primo campione • cottura a 90◦_{C per 5’}

• spin coating del resist ma-N-2403 per 5” a 500 rpm + 60” a 6000 rpm • cottura a 90◦_{C per 1’}

• EBL

• sviluppo con ma-D-525 per 1’ e stop in H2O

• etching ad umido dell’alluminio con Al etchant type A per circa 5’ • spin coating sul secondo substrato del resist AR-N-4340 per 5” a 500

rpm + 60” a 6000 rpm • pre-baking a 85◦_{C per 3’30”}

• esposizione UV per 1,7” usando il primo chip come maschera • post-baking a 95◦_{C per 5’}

• sviluppo con AR-300-475 per 1’

(a) (b)

Figura 24: Maschere per litografia ottica di: (a) quattro aree di sensing SPR e (b) marker in resist per fare stitching delle immagini di analisi microfluidica.

4.5

Vibrometro laser ad effetto Doppler

Per caratterizzare l’eccitazione e la propagazione delle SAW sul substrato ho usato lo strumento LDV col quale `e possibile misurare il profilo superficiale del substrato evitando il contatto.

Il fascio laser viene diviso in due, una met`a viene usata come segnale di riferimento coerente e l’altra met`a viene focalizzata sulla superficie in movi-mento tramite una lente 20x, che genera una spot size di 3 µm. L’ampiezza e la frequenza della superficie vibrante vengono estratte dalla variazione doppler del segnale riflesso rispetto a quello di riferimento, usando una cel-la di Bragg per moducel-lare il segnale alcel-la frequenza portante di 662 MHz. Il segnale in uscita viene letto da un fotodiodo e consiste in un voltaggio analogico modulato in frequenza il quale, dopo una ricostruzione FFT del

segnale, risulta direttamente proporzionale alla componente della velocit`a

superficiale lungo la direzione del fascio incidente. E’ quindi possibile sia osservare le vibrazioni superficiali dovute alle SAW in un singolo punto del campione, sia osservare il profilo in un’area maggiore.

Il voltaggio AC per le misure pu`o essere generato dal generatore di

se-gnali vettoriale interno o da qualsiasi generatore esterno che va triggerato con l’LDV, affinch´e sia possibile ricostruire la fase dell’onda misurata.

Il segnale in uscita viene letto da un oscilloscopio veloce LeCroy (fino a 2 GHz), usando come segnale di riferimento 10% del segnale fornito dal gene-ratore. Questo viene diviso da una porta CPL ed accoppiato tramite cavi all’impedenza del generatore di 50 Ω.

4.6

Particle Image Velocimetry

Particle Image Velocimetry, o PIV, `e un diffuso metodo ottico per

analiz-zare la fluidodinamica in microstrutture. Il metodo classico consiste nel ricostruire il campo di velocit`a nel piano di messa a fuoco della lente. Una

variante comune del PIV planare `e il micro-PIV, o µPIV. Questo viene

adoperato per studiare i fluidi in microcanali.

Per permettere al software di tracciare i campi di flusso si utilizzano particelle micro- o sub-micrometriche in soluzione; il codice PIV analizza quindi le sequenze di immagini ricostruendo quantitativamente il loro moto

ed il campo di velocit`a del fluido nel quale esse si muovono. Le immagini

acquisite vengono divise in regioni di lavoro pi`u piccole e sono usate tecniche di cross-correlazione per stimare lo spostamento medio di gruppi di particelle in ogni regione. Gli algoritmi moderni aggiungono poi una variet`a di filtri, analisi di segnale, metodi iterativi e varie tecniche di post-processing.

Ho usato il codice PIV per MATLAB chiamato Prana [19], processando

ogni video acquisito a 30 fps (200 frame) tramite la tecnica iterativa Multi-grid Ensemble con Discrete Window Offset (DWO), usando l’interpolazione a primi vicini per determinare il campo di velocit`a nel liquido.

Le velocit`a delle particelle vengono calcolate dai vettori di spostamento tramite Standard Cross-Correlation processing (SCC), questa tecnica agisce su ogni coppia di immagini acquisite con un intervallo temporale dt nel modo seguente:

• le immagini vengono divise in sub-aree tramite apposite finestre, usan-do funzioni di winusan-dowing Gaussiane per non perdere in risoluzione sul segnale

• queste vengono poi mascherate tramite un filtro disegnato per esclu-dere dalla correlazioni alcune aree, io ho applicato su tutti i frame una maschera statica in corrispondenza dei bordi del canale

• le finestre sono trasformate nel dominio spettrale tramite una FFT • tra le due immagini F-trasformate viene applicata la funzione di