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Alla famiglia, Agli amici
3 INDICE ANALITICO
1. ABSTRACT ...
2. INTRODUZIONE E FINALITÀ DELLO STUDIO ...
3. MATERIALI E METODI ...
3.1. Ruolo del GH nel fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati a livello del tessuto adiposo; risultati dai modelli animali di acromegalia e di obesità indotta dalla dieta.. . . 3.2. Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico . . . 3.3. Impatto della terapia medica con analoghi della somatostatina sulla mortalità dei soggetti acromegalici. Studio su una ampia coorte di soggetti acromegalici . . .
4. RISULTATI ...
4.1. Ruolo del GH nel fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati a livello del tessuto adiposo; risultati dai modelli animali di acromegalia e di obesità indotta dalla dieta.. . . 4.2. Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico . . . 4.3. Impatto della terapia medica con analoghi della somatostatina sulla mortalità dei soggetti
acromegalici. Studio su una ampia coorte di soggetti acromegalici . . .
5. DISCUSSIONE ...
5.1. Ruolo del GH nel fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati a livello del tessuto adiposo; risultati dai modelli animali di acromegalia e di obesità indotta dalla dieta. . . 5.2. Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico . . . 5.3. Impatto della terapia medica con analoghi della somatostatina sulla mortalità dei soggetti
acromegalici. Studio su una ampia coorte di soggetti acromegalici . . .
6. CONCLUSIONI ... 7. REFERENZE BIBLIOGRAFICHE ... 8. RINGRAZIAMENTI ... 04 08 16 16 22 31 38 38 46 54 61 61 67 72 79 80 86
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1 - ABSTRACT
1.1 IntroduzioneL’acromegalia si caratterizza per una morbilità e una mortalità superiori rispetto a quanto osservato nella popolazione generale. Tra i principali determinanti di questo aumentato rischio possiamo annoverare le anomalie del metabolismo glicemico che spesso si osservano in questa classe di pazienti. I meccanismi attraverso i quali l’eccesso di GH ed IGF1 si associa ai disturbi dell’omeostasi glucidica sono numerosi e compresi solo in parte.
L’introduzione degli analoghi della somatostatina (SSA) e dell’antagonista recettoriale del GH (pegvisomant, PEG) ha consentito di controllare l’acromegalia nella maggior parte dei pazienti modificando la storia naturale della malattia.
Sebbene vari studi siano andati ad indagare l’impatto delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico, il dato che emerge dalla letteratura non può essere considerato ad oggi conclusivo. Analogamente poco è noto circa l’impatto dei diversi trattamenti disponibili sulla mortalità dei pazienti affetti da acromegalia.
1.2 Finalità dello studio
Lo studio ha i seguenti scopi primari:
A. Esplorare il ruolo del GH nel modulare i fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati a livello del tessuto adiposo di un modello animale di acromegalia e di un modello di obesità indotta dalla dieta.
B. Valutare gli effetti delle diverse tipologie di terapia medica per l’acromegalia (SSA, PEG o la loro combinazione) sul metabolismo glicemico in una coorte di pazienti acromegalici.
C. Comparare l’impatto dei diversi approcci terapeutici sulla mortalità del paziente acromegalico.
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1.3 Materiali e Metodi
A. Effetti del GH nel modulare i fenomeni di insulino-resistenza indotti da p53 nel tessuto adiposo: nello studio sul modello animale sono stati utilizzati tre gruppi di topi maschi C57BL/6J×CBA; 1) animali con obesità indotta dalla dieta (OBE), 2) animali transgenici per il gene bovino del GH (ACRO), 3) animali a dieta normocalorica (LEAN). Gli effetti del GH sulle vie di trasduzione del segnale a livello del tessuto adiposo ed il ruolo del GH nel modulare le azioni di p53 sono stati valutati mediante Western Blot.
B. Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico: in questo studio storico-prospettico sono stati valutati 50 pazienti acromegalici giunti consecutivamente alla attenzione del Dipartimento di Endocrinologia dell’Università di Pisa e trattati con SSA. Di questi 19 risultavano controllati con gli SSA mentre i restanti soggetti 31 intraprendevano terapia combinata SSA+PEG. 18 di quest’ultimo gruppo di pazienti è stato successivamente convertito alla terapia con solo PEG. Alla diagnosi e durante le varie terapie proposte sono stati studiati i valori di glicemia ed insulinemia a digiuno e durante OGTT e sono stati determinati gli indici della funzione β-cellulare (ad. es. QUICK-I, HOMA2-IR, HOMA-β). Il confronto tra le diverse tipologie di trattamento medico è stato eseguito mediante analisi per dati appaiati.
C. Effetti dei trattamenti dell’acromegalia sulla mortalità: il tasso di mortalità di una coorte di 438 pazienti acromegalici è stato confrontato con quello della popolazione generale italiana mediante stima dello standard mortality ratio (SMR) mentre gli effetti delle terapie dell’acromegalia sulla sopravvivenza di questi pazienti è stata studiata mediante il modello di regressione di Cox.
1.4 Risultati
A. Effetti del GH nel modulare i fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati nel tessuto adiposo: Gli animali ACRO ed OBE presentavano insulino-resistenza. Questa è risultata essere indotta da un selettivo aumento della espressione di p53 a livello del tessuto adipose. Il trattamento con il PEG si associava ad una normalizzazione nella espressione di p53 e ad un ripristino di una normale
6 sensibilità insulinica in entrambi i gruppi di animali. L’espressione di p53 è risultata essere influenzata dal blocco del GH unicamente a livello del tessuto adiposo dove sembra che sia modulata attraverso la via di trasduzione di p38. Il tessuto adiposo degli animali acromegalici ed obesi si caratterizzava per una aumentata espressione delle proteine SOCS 1-3 e STAT-1,-3 e 5b suggerendo, pertanto che, il tessuto adiposo dell’animale obeso, sia caratterizzato per una aumentata sensibilità al GH. Nel gruppo di animali a dieta normocalorica non sono state osservati effetti significativi a seguito del blocco della trasduzione del segnale attivata dal GH. B. Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico:
indipendentemente dalla tipologia di terapia medica proposta (SSA, SSA+PEG, PEG), il controllo biochimico di malattia si è associato ad un miglioramento dei fenomeni di insulino-resistenza. Tuttavia i valori glicemici a digiuno e durante OGTT sono risultati più elevati durante il trattamento con SSA (come unica terapia o in combinazione con il PEG) rispetto sia ai valori basali che al trattamento con PEG. Allo stesso modo, la prevalenza dell’alterata tolleranza glicemica e del diabete mellito sono risultate maggiori durante terapia con SSA rispetto a quanto osservato in condizioni basali e durante il trattamento con PEG anche a parità di controllo biochimico di malattia.
C. Effetti dei trattamenti dell’acromegalia sulla mortalità: nel periodo compreso tra il 1999 ed il 2009 si sono osservati 20 decessi nella popolazione acromegalica in studio (4.5% dei pazienti). Lo SMR corretto per l’età ed il sesso della popolazione acromegalica è risultato 0.70 (95% CI 0.43–1.08). Il modello di regressione di Cox ha evidenziato come, nei soggetti acromegalici, i decessi fossero associati sia a fattori di rischio generali (età e stato fisico del paziente) che a fattori specifici per l’acromegalia (macroadenoma, ipopituitarismo, mancato controllo biochimico di malattia). Il tasso di mortalità dei pazienti trattati chirurgicamente (come unico trattamento, 2.4% o in associazione agli SSA, 2,6%) è risultato inferiore rispetto a quanto osservato nei pazienti trattati unicamente con terapia medica con SSA (11.4%). Il rischio di morte dei soggetti acromegalici trattati soltanto con SSA è risultato maggiore (hazard ratio (HR) 5.52, 95% CI 1.06–28.77, P=0.043) rispetto a quello dei pazienti sottoposti al trattamento neurochirurgico. Se i pazienti venivano
7 stratificati per la presenza o l’assenza del diabete mellito, si è osservato come il rischio di decesso aumentasse unicamente nel gruppo di soggetti diabetici trattati con SSA (HR 21.94, 95% CI 1.56–309.04, P=0.022).
1.5 Conclusioni
La terapia medica dell’acromegalia si associa ad una riduzione della resistenza insulinica e ad un aumento nella sensibilità insulinica. Tuttavia, le diverse classi farmacologiche si caratterizzano per un diverso profilo di azione sui livelli glicemici. In particolar modo, la terapia con SSA si associa ad un aumento dei valori di glicemia e HbA1c mentre la terapia con PEG si caratterizza per una riduzione dei valori glicemici e di HbA1c. L’introduzione di tali terapie, in associazione al moderno management delle complicanze sistemiche, ha permesso di ridurre la mortalità di questi soggetti ai livelli osservati nella popolazione generale. Tuttavia i risultati che emergono dal Nostro studio indicano che nei soggetti diabetici la terapia con SSA sia meno efficace nel ridurre il numero di decessi rispetto al trattamento chirurgico. Al contrario, nei soggetti non diabetici la terapia medica con SSA e il trattamento chirurgico si equivalgono nel ridurre il tasso di mortalità del paziente acromegalico. Infine, i risultati degli studi eseguiti sui modelli animali suggeriscono che a livello del tessuto adiposo il GH contribuisca all’induzione dei fenomeni di insulino-resistenza attraverso una aumentata espressione.
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2 - INTRODUZIONE E FINALITA’ DELLO STUDIO
2.1 IntroduzioneL’acromegalia è una rara patologia endocrina dovuta ad una cronica esposizione a livelli elevati dell’ormone della crescita (GH) e della sua molecola effettrice, l’insulin-like growth factor 1 (IGF1)1-3.
Generalmente l’acromegalia è manifestazione della presenza di un adenoma ipofisario GH-secernente (in circa il 98% dei pazienti) sebbene questa condizione possa essere osservata anche in caso di neoplasie neuroendocrine con una secrezione ectopica di GH-RH o, ancor più raramente, di GH1.
Il tipico corteo sintomatologico del soggetto acromegalico comprende sia sintomi riferibili ad un effetto massa da parte della lesione ipofisaria (cefalea, deficit del campo visivo o dei nervi cranici) che sintomi riferibili al cronico eccesso ormonale.
La gradualità con cui si manifesta clinicamente l’eccesso ormonale rende conto della latenza di alcuni anni che intercorre tra la diagnosi dell’acromegalia e la comparsa dell’eccesso ormonale.
Tale ritardo diagnostico non è privo di significato. Difatti, se rapportata alle altre tipologie di adenoma ipofisario secernente, l’acromegalia si distingue per una maggior prevalenza di lesioni ipofisari superiori al centimetro od extra-sellari4, 5 e per un
percentuale inferiore di radicalità chirurgica1-4, 6.
L’eccesso di GH influenza pressoché ogni tessuto come documentato dalla ampia gamma delle complicanze sistemiche dell’acromegalia1-4. Tra queste, le più frequenti
riguardano gli apparati cardiovascolare, respiratorio ed osteo-articolare nonché il metabolismo intermedio e la presenza di neoplasie1, 3, 4.
La latenza della diagnosi può avere un impatto sulle complicanze sistemiche come testimoniato dal numerosità di queste al momento della diagnosi. Inoltre è possibile ipotizzare che la prolungata esposizione all’eccesso ormonale possa contribuire alla
9 gravità di tali complicanze ed alla possibilità che queste, per l’istaurarsi di fenomeni di danno indipendente dall’eccesso ormonale, possano persistere e progredire anche a seguito del raggiungimento di una remissione stabile di malattia.
L’associazione tra le complicanze sistemiche e locali dell’acromegalia spiega sia il deterioramento della qualità della vita7 che l’elevato indice di morbilità e mortalità di
questi soggetti1-4.
Numerosi studi hanno valutato l’impatto dell’eccesso del GH e delle sue co-morbilità sulla mortalità. Nel complesso, tali indagini indicano che i soggetti acromegalici si differenzino dalla popolazione generale per un aumento nel tasso di mortalità (figura 2.1)1, 4, 8-20. A conferma di quest’ultima affermazione, possono essere indicati i risultati
dei due studi di meta-analisi che hanno documentato un aumento di circa il 70% del tasso di morte nella popolazione acromegalica (standard mortality rate, SMR, 1.7) 8, 9.
Tuttavia, se si osserva la distribuzione temporale dei vari studi, non è difficile riconoscere come vi sia stata una progressiva riduzione nel tasso di mortalità con gli studi più recenti. In particolare si può osservare come gli studi degli anni ’60 abbiano evidenziato valori di SMR prossimi o superiori a 314 mentre molti dei lavori che hanno
preso in esame i pazienti con diagnosi di acromegalia successiva al 1990 hanno
FIGURA 2.1. Studi che hanno preso in esame la mortalità nei soggetti acromegalici. Nel grafico è la
numerosità del campione esaminato nel singolo studio è espressa dalla larghezza delle colonne mentre il valore dello SMR è rappresentato dall’altezza della colonna. La linea orizzontale tratteggiata indica un valore di SMR pari ad 1. Nella parte inferiore del grafico è riportato l’anno di pubblicazione dello studio e il periodo di osservazione a cui fanno riferimento i singoli studi.
10 documentato valori di SMR prossimi a quello della popolazione generale (figura 2.1) 12,
18, 20.
La progressiva riduzione nel tasso di mortalità dei pazienti acromegalici è stata associata allo sviluppo nell’approccio terapeutico all’acromegalia.
In particolar modo, questa è stata associata all’introduzione e disponibilità di terapie mediche, quali gli analoghi della somatostatina (SSA) e l’antagonista recettoriale del GH (pegvisomant, PEG), in grado di permettere il raggiungimento del controllo biochimico di malattia nella maggioranza del pazienti acromegalici1, 2, 21, 22.
Sebbene l’approccio chirurgico per via transfenoidale rimanga il gold standard terapeutico dell’acromegalia, sempre più pazienti intraprendono tali trattamenti a scopo adiuvante per una persistenza postchirurgica di malattia o come terapia medica primaria in quei pazienti in cui il trattamento chirurgico sia controindicato o caratterizzato da una scarsa probabilità di radicalità2, 21.
Sebbene i dati esposti sino ad ora suggeriscano un impatto positivo della terapia medica dell’acromegalia sulla mortalità, non vi sono al momento studi che abbiano confrontato l’efficacia dei differenti approcci terapeutici dell’acromegalia sulla mortalità di questi pazienti.
* * * * *
Le anomalie del profilo glico-metabolico rappresentano una delle più frequenti ed importanti complicanze sistemiche dell’eccesso del GH1-4.
La reale prevalenza di tali condizioni nei soggetti acromegalici non è chiara come testimoniato dall’ampio divario tra le prevalenze di diabete mellito osservate nei vari studi in letteratura (dal 16 al 56% dei pazienti esaminati)3, 4, 20, 23, 24.
I meccanismi molecolari che sottendono alle alterazioni del metabolismo glicemico che si osservano nel paziente acromegalico sono complessi e rispecchiano sia gli effetti discordanti del GH e dell’IGF1 sui valori glicemici e sulla sensibilità insulinica che gli effetti indiretti dovute alle azioni del GH a carico del metabolismo lipidico e proteico25, 26.
L’eccesso cronico di GH si associa a importanti effetti contro-insulari sia a livello epatiche che periferico responsabili dell’incremento dei valori di glicemia sierica,
11 dell’induzione dei processi di gluconeogenesi epatica e della riduzione dell’uptake e
dell’ossidazione del glucosio a livello del muscolo scheletrico (figura 2.2). 25, 26.
Al contrario, la presenza di valori elevati valori di IGF1 si associa ad una riduzione dei valori glicemici dovuta all’inibizione della gluconeogenesi epatica e alla induzione dell’uptake muscolare di glucosio GLUT4-mediato25, 26.
Il ruolo cardinale dell’adiposità viscerale nei processi di insulino-resistenza e nella induzione della sindrome metabolica è noto da tempo27, 28.
A livello del tessuto adiposo viscerale, il GH è noto attivare i processi di lipolisi ed ossidazione lipidica attraverso l’attivazione dell’idrolisi dei trigliceridi e l’inibizione della lipoprotein lipasi (LPL). L’attivazione di questi processi determina un aumento delle concentrazioni di acidi grassi liberi e glicerolo. Gli aumentati livelli di queste sostanze a livello portale, a loro, volta, sembrano esser implicati nell’induzione dell’insulino-resistenza epatica attraverso un meccanismo di fosforilazione serinica a carico delle molecole coinvolte nella trasduzione del segnale dell’insulina29.
Sebbene molte evidenze suggeriscano l’importanza degli effetti a livello del tessuto adiposo nella promozione dell’insulino-resistenza del soggetto acromegalico, le vie attraverso cui il GH esplica le sue azioni a livello del tessuto adiposo sono note solo in minima parte sebbene sia stato proposto un ruolo del GH nei fenomeni di up-regulation del recettore β3-adrenergico30, 31
FIGURA 2.2. Rappresentazione schematica degli effetto del GH sul metabolismo energetico. Il GH ha effetti
sul metabolismo energetico che coinvolgono sia il tessuto adiposo che il tessuto muscolare scheletrico ed il tessuto epatico. Nel complesso tali azioni rendono conto degli effetti controinsulari del GH.
12 Allo stesso modo, non vi sono dati al momento sul ruolo di livelli fisiologici di GH nel
modulare i fenomeni di resistenza insulinica a livello del tessuto adiposo e su un eventuale impatto del GH nel fenomeni di insulino-resistenza del tessuto adiposo osservati nell’obesità viscerale e nella sindrome metabolica.
Nel corso degli ultimi anni è stato dimostrato come p53 svolga un ruolo cardinale nell’induzione dei fenomeni di resistenza insulinica a livello del tessuto adiposo di un modello animale di obesità viscerale32. Successivi studi hanno confermato tale ipotesi
anche in altri tessuti quali il tessuto miocardio33 e l’endotelio34.
L’impatto del GH sui livelli di espressione di p53 ed una eventuale convergenza tra le due molecole nel mediare le condizioni di insulino-resistenza del tessuto adiposo non sono state indagate né in condizioni di eccesso di GH né in condizioni di obesità viscerale.
* * * * *
L’impatto della presenza del diabete mellito sulla prognosi dei pazienti acromegalici non è noto con precisione dal momento che i pochi studi che hanno valutato specificatamente tale parametro hanno dato risultati discordanti15-17, 35. Tuttavia, sulla
base dei dati ottenuti della popolazione generale, può esser speculato che anche nei soggetti affetti da acromegalia la presenza di un diabete mellito possa contribuire all’aumento del rischio di decesso36.
Allo stesso modo non è noto l’impatto dell’insulino-resistenza sulla prognosi dei soggetti affetti da acromegalia anche in virtù del contributo delle complicanze sistemiche legate, almeno in parte, alla resistenza insulinica27, 28.
L’impatto del trattamento chirurgico nel correggere le alterazioni del profilo glicemico e della resistenza insulinica del paziente acromegalico è dibattuto e riflette verosimilmente il grado di compromissione della funzione β-insulare al momento dell’intervento37.
Allo stesso modo, l’impatto delle varie tipologie di terapie mediche dell’acromegalia è ambito di discussione soprattutto per quanto concerne il trattamento con gli analoghi della somatostatina a lento rilascio.
13 Numerosi studi eseguiti su soggetti non acromegalici hanno documentato l’impatto
negativo degli analoghi della somatostatina sulla sensibilità insulinica e sul metabolismo glicemico38-40.
L’impatto di questa classe di farmaci sull’omeostasi del paziente acromegalico è di più difficile valutazione in relazione alla concomitante alla concomitante presenza di effetti protettivi (riduzione della secrezione del GH e del glucagone) e negativi (riduzione secrezione dell’insulina e dell’IGF1) sul profilo glicemico38, 41-44.
Gli effetti degli analoghi della somatostatina sul profilo glicometabolico del paziente acromegalico sono stati analizzati da uno studio di meta-analisi che ha preso in esame i risultati di 31 differenti studi45.
Tale studio non ha documentato la presenza di variazioni significative nei valori di glicemia basale (figura 2.3) o durante carico, o di HbA1c. Tuttavia, se si prendono in esame i singoli studi inseriti nella analisi, si può osservare la presenza di una ampia discordanza circa l’influenza degli analoghi della somatostatina sul metabolismo glicemico, suggerendo pertanto che la terapia con gli analoghi della somatostatina possa avere un impatto più rilevante sul metabolismo glicemico di un sottogruppo di pazienti acromegalici.
FIGURA 2.3. Risultato della metaanalisi sull’effetto degli analoghi della somatostatina a lento rilascio sulla glicemia a digiuno dei soggetti acromegalici. I singoli studi sono identificati dal nome del primo autore e
14 Inoltre, il ruolo del controllo biochimico dell’acromegalia sugli effetti metabolici degli
SSA non è stato valutato in maniera specifica. Tuttavia vi sono alcuni dati che suggeriscono un ruolo del mancato raggiungimento del controllo biochimico dell’acromegalia sul deterioramento dei parametri glicemici durante terapia con SSA46.
Il ruolo della terapia con l’antagonista recettoriale del GH, il pegvisomant, è stato oggetto di un numero limitato studi.
In accordo con il suo meccanismo di azione, il trattamento con il pegvisomant si associa ad una riduzione dei valori glicemici47-52 e ad un miglioramento della tolleranza
glicemica50-53. Tuttavia, gli effetti della terapia con pegvisomant sulla sensibilità
insulinica sono poco noti in quanto solo pochi studi, eseguiti su un numero limitato di pazienti, hanno suggerito una riduzione della insulino-resistenza periferica nei pazienti acromegalici47, 48, 52, 53. In particolar modo non è tuttora chiarito il ruolo del
blocco recettoriale del GH sul metabolismo lipidico e sui correlati fenomeni di resistenza insulinica a livello epatico47, 48.
Studi ulteriori sono necessari per chiarire l’impatto delle diverse terapie sul metabolismo glicemico del paziente acromegalico e sulla sensibilità insulinica.
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2.1 Scopo dello studio
Il presente elaborato vuole essere un percorso sugli effetti dell’eccesso del GH e delle sue terapie sul metabolismo glicemico e sulla mortalità dei pazienti affetti da acromegalia. In particolar modo il presente studio si prefigge i seguenti scopi primari:
Studiare il ruolo del GH nei processi di insulino-resistenza del tessuto adiposo in un modello animale di acromegalia ed in un modello di obesità indotta dalla dieta.
Esplorare il possibile ruolo del GH nei fenomeni di resistenza insulinica p53-mediati a livello del tessuto adiposo dell’animale acromegalico e di quello con obesità indotta dalla dieta.
Valutare gli effetti delle diverse tipologie di terapia medica per l’acromegalia (SSA, SSA+PEG, PEG) sul metabolismo glicemico in una coorte di pazienti acromegalici seguiti continuativamente dal Dipartimento di Endocrinologia dell’Università di Pisa e trattati con terapia medica.
Determinare il rischio di mortalità in un’ampia casistica di pazienti acromegalici seguita consecutivamente presso i Dipartimenti di Endocrinologia dell’Università di Pisa e dell’Università di Napoli
Comparare l’impatto dei diversi approcci terapeutici all’acromegalia sulla mortalità di questi pazienti.
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3 - MATERIALI E METODI
3.1 - Ruolo del GH nei fenomeni di insulino-resistenza p53-mediati a livello del tessuto adiposo; risultati dai modelli animali di acromegalia e di obesità indotta dalla dieta.3.1.1 Animali impiegati
Il protocollo di studio è stato approvato in maniera preventiva dal comitato etico per la sperimentazione animale dell’Università di Pisa.
Tutte le procedure sono state condotte in accordo con le linee guida proposte dal National Health Institute sull’utilizzo degli animali da laboratorio54. In particolare, gli
animali impiegati nello studio sono stati collocati in un ambiente confortevole per la durata dello studio (temperatura: 20°C; umidità: 45-55%; 12 ore di esposizione alla luce al giorno; apporto idrico libero). La dieta degli animali differiva in relazione al singolo gruppo di appartenenza.
Nello studio sono stati utilizzati tre gruppi di topi adulti C57BL/6J × CBA di sesso maschile:
Topi Magri (LEAN). Come gruppo di controllo sono stati utilizzati topi
alimentati con dieta standard normocalorica (proteine 18.5%, grassi 5.5%, fibre 4.5%, polvere 6.0%).
Topi Acromegalici (ACRO). Come modello animale di acromegalia sono stati
utilizzati topi transgenici bGH-MT caratterizzati per una iperespressione della sequenza codificante del gene bovino del GH sotto il controllo del promotore della metallotioneina 55, 56. Questo gruppo di animali è stato alimentato con una
dieta normocalorica standard per tutta la durata dello studio. Prima dell’inizio dello studio, l’iperespressione del bGH è stata confermata mediante analisi PCR56.
Topi con obesità indotta dalla dieta (OBE). Come gruppo di animali con obesità
indotta dalla dieta sono stati utilizzati topi alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (proteine 23%, grassi 34%, fibre 5.0%, polvere 5.5%) per 60 giorni57.
17 TABELLA 3.1. Caratteristiche degli animali utilizzati nello studio
LEAN LEAN+PEG OBE OBE+PEG ACRO ACRO+PEG
Peso corporeo (gr) 26.6±1.1‡ 24.9±1.5 37.1±2.4‡ 35.5±5.6 45.5±3.8‡ 43.1±1.3
Glicemia (mg/dL) 125±12* 123±11 145±19* 135±17 138±23 129±24
Insulinemia (pM) 141±36‡ 135±29 1642±586‡ 1283±373 2337±551‡ 835±162‡
IGF1 (ng/mL) 130±15‡ 108±22 165±32* 123±23* 499±129†‡ 217±92† I risultati sono espresso come media ± SD - *P < 0.05. † P < 0.005 . ‡ P < 0.0005
In ciascun esperimento sono stati utilizzati varie serie di animali, ciascuna composta da 5-8 topi per ciascun gruppo di studio (LEAN,OBE,ACRO). Le caratteristiche principali
degli animali impiegati nello studio sono riportate nella tabella 3.1. 3.1.2 Trattamenti
I tre gruppi di animali in studio (LEAN,OBE, ACRO) sono stati inoltre suddivisi sulla
base dei trattamenti farmacologici proposti in:
Animali a cui non è stato somministrato alcun trattamento farmacologico;
Animali trattati con pegvisomant (0.1 mg per iniezione sottocutanea) per 15 giorni; Animali trattati con un inibitore di p53 (pifitrina, 0.1 mg per iniezione
intraperitoneale) per 10 giorni.
L’efficacia del pegvisomant è stata valutata attraverso la misurazione delle concentrazioni di IGF1 prima ed al termine del trattamento farmacologico56 mentre gli
effetti della somministrazione della pifitrina sono stati vagliati controllati attraverso la determinazione della espressione proteica di p21, una molecola effettrice di p53, a livello degli estratti tissutali ottenuti al momento del sacrificio58.
3.1.3 Assays, test di tolleranza insulinica e glicemica
I livelli sierici di IGF-I sono stati valutati mediante metodica RIA (Diagnostic System Laboratories; sensibilità 21 ng/mL; coefficienti di variabilità intra- ed inter-assay: 12% e 9%). I livelli sierici di insulina sono stati misurati mediante metodica ELISA (Mercodia AB; sensibilità 0.2 ng/mL, coefficienti di variabilità intra- ed inter-assay: 3.2% e 6%). Gli animali sono stati sottoposti ad un test di tolleranza insulinica (insulin tolerance test, ITT) e ad un test di tolleranza glicemica intraperitoneale (i.p. glucose tolerance test, IPGTT) rispettivamente 3 giorni prima ed il giorno antecedente il sacrificio.
I due test sono stati eseguiti secondo le indicazioni presenti in letteratura59. In
18 U/Kg (di peso corporeo) di insulina umana (Actrapid) all’interno della cavità peritoneale degli animali mentre l’IPGTT è stato eseguito dopo un periodo di digiuno di 6 ore somministrando 1 gr/kg-1 (di peso corporeo) di glucosio all’interno del
peritoneo dell’animale. Per entrambi i test i campionamenti ematici per il dosaggio dei valori glicemici (Abbott) sono stati ottenuti dalla vena centrale della coda ai tempi 0’, +15’, +30’, +60’, +120’ minuti60.
3.1.4 Sacrificio degli animali e prelievo dei tessuti
Successivamente all’esecuzione dei test dinamici, gli animali sono stati sacrificati mediante la somministrazione di una dose letale di pentobarbital.
Gli organi interni degli animali sono stati quindi immediatamente isolati, posti in azoto liquido e quindi conservati alla temperatura di -80° C fino alle esecuzioni delle successive valutazioni. Ai fini del nostro studio, sono stati campionati il tessuti muscolare liscio, i parenchima epatico e renale ed il tessuto adiposo bianco.
Nei gruppi di animali non sottoposti a trattamenti farmacologici sono stati inoltre ottenuti degli espianti di tessuto adiposo bianco utilizzati per lo studio ex vivo dell’uptake del glucosio.
3.1.5 Estratti tissutali e preparazione del RNA
Gli estratti tissutali sono stati ottenuti mediante omogenizzazione dei campioni tissutale mediante l’utilizzo di un buffer litico standard [Tris HCl (pH 7.5), 50 nM; NaCl 150 mM; sodium deoxycholate, 0.25%; Nonidet P-40 1%; inibitore della proteasi]56. Dopo
incubazione in ghiaccio per 30 minuti e centrifugazione, i sovranatanti sono stati isolati e quindi conservati a -80° C.
I livelli di espressione proteica sono stati misurati mediante saggio di Bradford utilizzando il reagente Bio-Rad della (Bio-Rad Laboratories).
Le molecole di RNA sono state isolate utilizzando il metodo TRIzol (InvitrogenI utilizzando il protocollo fornito dal produttore. Una valutazione della qualità dell’isolamento è stata eseguita mediante utilizzo del metodo RNA 6000 Nano LabChip assay (Agilent Technologies) con lo strumento analitico Agilent 2100 (Agilent Technologies).
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3.1.6 Studio dell’uptake del glucosio negli espianti di tessuto adiposo bianco
I livelli di uptake del glucosio negli espianti di tessuto adiposo sono stati valutati ex vivo secondo il protocollo riportato in letteratura60.
Nello specifico, gli espianti, preventivamente isolati del tessuto connettivo e vascolare visualizzabile, sono stati posti in incubazione (Krebs-Ringer HEPES, pH 7.4; 1.2 mM CaCl2, 2% BSA, temperatura: 37° C) per 10 minuti con l’aggiunta di 2-desossiglucosio 0.2 M e di [3H]-2-desossiglucosio (2 µCi/mL). Successivamente il tessuto isolato è stato
dissolto in NaOH 1 N e sodium dodecyl solfato 0.1% alla temperatura di 50°C per 2 ore e ne è stata valutata la radioattività residua mediante l’utilizzo di un β-counter (Beckman)60. Al fine di valutare il ruolo di p53 e del GH sul fenomeno di uptake del
desossiglucosio, lo stesso protocollo è stato inoltre eseguito incubando gli espianti in presenza o in assenza di pifitrina (1 µM) o di pegvisomant (100 nM) per 4 ore in un buffer di incubazione. I risultati dell’esperimento sono espresse in pM di 2-desosiglucosio/mg di peso.
3.1.7 Anticorpi utilizzati nello studio
Nello studio sono stati utilizzati i seguenti anticorpi:
Santa Cruz Biotechnology: anticorpo policlonale di coniglio anti p53 (sc-6243); anticorpo anti p44/42 (sc-94); anticorpo anti-GLUT4 (sc-7938); anticorpo anti p-AKT1 (sc-7985-R); anticorpo anti SREBP-1 (sc-366); anticorpo anti SOC-3 (sc-9023); anticorpo anti STAT-1 (sc-464); anticorpo anti TIGAR (sc-67273); anticorpi anti p-21 397); anticorpo policlonale di capra anti-esochinasi II (sc-6521); anticorpo monoclonale di topo anti-actina (sc-8432); anticorpo anti AKT1 5298); anticorpo anti MDM2 murino 925); anticorpo anti p38 (sc-7972); anticorpo anti fosfo-p38 (sc-7973); anticorpo anti STAT5b (sc-1656); anticorpo anti STAT3 (sc-8019);
Cell Signaling Technology: anticorpi policlonali di coniglio anti fosfo-p53 (9284S); anticorpi anti-SOCS1 (3950S); anticorpi anti-SOCS2 (2779S)
Bio-Rad Laboratories: anticorpi di coniglio anti capra, anticorpi di capra anti coniglio; anticorpi secondari anti IgG di topo coniugati con perossidasi di rafano.
20
2.1.8 Western Blot
La valutazione dei livelli di espressione proteica sugli omogenati tissutali è stata eseguita mediante metodica Western Blot. In particolare, gli omogenati degli estratti proteici tissutali (e gli omogenati derivati dal processo di immunoprecipitazione) sono stati separati in relazione alle loro dimensioni molecolari utilizzando un gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato al 12% e quindi trasferiti su una membrana di nitrocellulosa trattata con soluzione di rosso Ponceau (utilizzata per verificare la quantità proteica in ciascun pozzetto e definire l’area di lavoro).
Le proteine trasferite sono state quindi incubate overnight a 4° C in un buffer costituito al 50% da Tris-Buffered saline [200 mM Tris HCl (pH 7.6) e NaCl 1.4 M] e al 50% da Tris-buffered saline arricchito con Tween 20 allo 0.05%.
Le membrane sono state quindi incubate con uno specifico anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un lavaggio con un buffer salino, un anticorpo secondario IgG coniugato con la perossidasi di rafano è stato aggiunto per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche positive sono state rilevate mediante misurazione dell’incremento della chemioluminescenza.
Infine le membrane sono state incubate alla temperatura di 70°C per 10 minuti con un buffer di strippaggio e quindi rivalutate utilizzando un anticorpo primario verso l’actina β. I film sono stati scansionati con un densitometro (Bio-Rad Life Science) e l’intensità della bande è stata valutata utilizzando un software dedicato (Interfocus GmbH). Al fine di correggere eventuali errori nel processo di caricamento, il valore ottenuto in ciascun esperimento è stato normalizzato dividendo il valore di espressione osservato per la proteina in esame per quello ottenuto con la actina β. I dati ottenuti sono espressi in termini di unità arbitrarie e rappresentano il rapporto tra l’intensità della banda relativa alla proteina in studio e la corrispondente banda della actina β.
2.1.9 Immunoprecipitazione
I test di immunoprecipitazione di p53 sono state eseguite secondo il seguente protocollo. 500 µg di estratti tissutali sono stati incubati overnight a 4° C con 5 µg di un anticorpo anti-p53. Gli estratti sono stati quindi incubati in rotazione con una
21 sospensione di n-protein A-Sep-harose per 3 ore alla temperatura di 4 °C (rapporto 1:1). Successivamente il sopranatante è stato rimosso mediante centrifugazione ed il materiale residuo è stato lavato per 3 volte con un buffer specifico per immunoprecipitazione (Tris HCl, 50 nM, pH 8; NaCl, 150 nM; Nonidet P-40, 1%; sodium deoxycholate, 0.5%). Gli immunocomplessi sono stati quindi dissociati mettendo a bollire a 95% la miscela in un buffer proteico (SDS-PAGE) e quindi analizzata mediante metodica Western Blot, utilizzando un anticorpo anti MDM2.
2.1.10 Immunoistochimica
Le analisi immunoistochimiche sono state eseguite su sezioni di tessuto adiposo secondo le indicazioni presenti in letteratura61. In particolare, sezioni dello spessore di
5 µm sono state deparaffinizzate mediante xylene e quindi reidratate con lavaggi successivi con etanolo.
Le sezioni sono state quindi trattate con perossido di idrogeno (1%) in metanolo al fine di inattivare l’attività perossidasica endogena e poste in microonde per 10 minuti in un buffer di citrato 10 nM (pH 6) al fine di smascherare gli antigeni. I siti di legame non specifici sono stati quindi inibiti mediante incubazione con albumina di siero bovino al 5%.
Le sezioni sono state incubate con un anticorpo primario anti-p53 diluito a 1:100 (rabbit polyclonal antibody, anti p-53, FL-393; Santa Cruz Biotechnology) per 12 ore a 4°C e successivamente incubate in presenza di un anticorpo secondario legato alla biotina (diluizione 1:500) per 30 minuti a temperatura ambiente per 30 minuti. Infine le sezioni sono state incubate con un complesso avidina-biotina (Vector Laboratories, Inc) per ulteriori 30 minuti. L’attività immuno-perossidasica residua è stata quindi stimolata utilizzando il 3,3’-diaminobenizidine tetrahydrochloride allo 0.5% (Sigma-Aldrich Corp). Infine le sezioni sono state colorate con ematossilina, deidratate e montate sui vetrini. I controlli negativi sono stati ottenuti sostituendo gli anticorpi anti p53 con immunoglobuline di ratto.
2.1.11 Real time PCR quantitativa
La valutazione della espressione del mRNA è stata eseguita mediante real-time PCR quantitativa. In particolare, 1 µg di mRNA ottenuto dal tessuto adiposo bianco è stato retrotrascritto in cDNA mediante l’utilizzo di una trascrittasi inversa (superscript III,
22 Invitrogen) e di un esamero random (pd(N)6, GE Healthcare). 5 mcL del cDNA sono stati quindi posti in soluzione con il TaqMan universal PCR 2 master mix (Applied Biosystems) e con una miscela di primer e sonde commerciale (TAqMan gene expression assays; Applied Byosystems) e quindi amplificati per 40 cicli secondo le indicazioni presenti in letteratura62.
Sono stati utilizzati i seguenti assays: Mm 01731287_m1 per il p53 e Mm 00446973_m1 per la TATA-box binding protein. I livelli di espressione genica relativa sono stati quantificati utilizzando lo strumento analitico ABI 7700. L’espressione genica è stata riportata in unità arbitrarie e normalizzata in confronto al gene TBP per compensare le differenze nel carico del cDNA.
2.1.12 Analisi statistica
Tutti i risultati sono riportati come media ± SD. Le differenze osservate nei risultati tra i diversi gruppi in studio sono state valutate attraverso analisi ANOVA; le differenze tra le curve delle concentrazioni dell’insulina o del glucosio durante IPGTT o ITT sono state valutate mediante analisi ANOVA per misure ripetute; le differenze tra 2 gruppi sono state valutate mediante test di Tukey. Valori di P < 0.05 sono stati utilizzati per identificare la significatività statistica.
3.2 Effetti delle terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico
3.2.1 Pazienti arruolati
Lo scopo dello studio era di valutare l’impatto delle diverse terapie mediche dell’acromegalia sul metabolismo glicemico.
A tal fine sono stati presi in esame 62 soggetti affetti da acromegalia, giunti consecutivamente all’attenzione del Nostro Dipartimento dal Dicembre 2006 al Dicembre 2010 e sottoposti a terapia medica con analoghi della somatostatina (SSA). Sono stati studiati sia pazienti in trattamento medico primario (soggetti con prima diagnosi di acromegalia ed in cui il trattamento chirurgico era controindicato) sia soggetti che indirizzati al trattamento con SSA per una persistenza postchirurgica di malattia.
23 Dodici pazienti sono stati esclusi dallo studio per la presenza di alterazioni della funzione epatica (2 soggetti), renale (1 soggetti) o poiché eseguivano una terapia ipoglicemizzante al momento della diagnosi di acromegalia.
Alcuni soggetti con alterata tolleranza glicemica (n=25) o diabete mellito (n=5) e trattati unicamente con terapia dietetica sono stati inclusi nello studio. Nessuno dei pazienti valutati nel corso dello studio ha assunto antidiabetici orali o terapia insulinica durante il periodo di osservazione.
Al termine della selezione dei pazienti, 50 soggetti sono stati considerati arruolabili per lo studio. Tra questi, 31 pazienti erano affetti da una acromegalia di prima diagnosi mentre i restanti 19 soggetti presentavano una persistenza biochimica di malattia dopo un adenomectomia per via transfenoidale. Le caratteristiche cliniche e biochimiche dei pazienti sono riportate nella tabella 3.2.
3.2.2 Diagnosi di acromegalia, definizione del controllo biochimico di malattia e funzione ipofisaria In tutti i soggetti inclusi nello studio la diagnosi di acromegalia è stata posta in accordo con i criteri clinici e biochimici attualmente riconosciuti dalle consensus internazionali sulla diagnosi di acromegalia63, 64.
TABELLA 3.2. Caratteristiche cliniche e biochimiche dei pazienti (n=50) al momento dell’arruolamento nello studio Valore
Età (anni) 47.81 ±1.76
Sesso Femminile 27 (54.0)
BMI (kg/m2) 28.41 ±0.61
Macroadenoma 32 (64.0)
Ritardo stimato della diagnosi di acromegalia (mesi) 107.47 ±11.24
Ipopituitarismo 10 (20.0) Ipogonadismo 1 (2.0) Ipogonadismo+Ipotiroidismo 4 (8.0) Iposurrenalismo 1 (2.0) Ipotiroidismo 2 (4.0) Panipopituitarismo 2 (4.0) Growth hormone (μg/L) 12.16 ±2.13 IGF1- index 2.80 ±0.17 Adenomectomia 19 (38.0)
Stato di tolleranza glicemica
Normale tolleranza glicemica (NGT) 22 (44.0)
Alterata glicemia a digiuno (IFG) 4 (8.0)
Alterata tolleranza glicemica (IGT) 17 (34.0)
IFG + IGT 2 (4.0)
Diabete mellito di tipo 2 (DM) 5 (10.0)
I dati qualitativi sono espressi come numero assoluto e percentuale del totale; I parametri quantitativi come media ± SEM; BMI: body mass index (kg/m2); IGF1-index: rapporto tra i valori osservati di IGF1 ed il limite superiore di normalità per età.
24 I valori di IGF1 sono stati utilizzati per valutare l’adeguatezza della terapia nel controllo
biochimico di malattia durante lo studio in accordo con la usuale pratica clinica63, 64.
Allo scopo di normalizzare i valore dell’IGF1 in relazione alle differenti classi di età, è stato determinato il valore dell’IGF1-index ottenuto attraverso il rapporto tra il valore osservato di IGF1 ed il limite superiore di normalità per età. Valori di IGF1-index ≤1 sono stati impiegati per definire un controllo biochimico di malattia ottimale in accordo con la letteratura65.
In tutti i soggetti inclusi nello studio, la restante funzione ipofisaria è stata valutata al momento dell’inclusione nello studio e periodicamente durante il follow-up.
Come illustrato nelle tabelle 3.2 e 3.3, 10 soggetti hanno presentato almeno un deficit a carico delle restanti tropine ipofisarie al momento della diagnosi che è stato adeguatamente corretto prima della valutazione del profilo glicemico basale. In particolare, 8 pazienti hanno necessitato un trattamento sostitutivo con L-T4, 3 pazienti hanno ricevuto terapia sostitutiva con glucocorticoidi (2 soggetti trattati con cortone acetato ed 1 con idrocortisone), 5 soggetti di sesso maschile hanno ricevuto terapia con testosterone e 2 donne terapia estro-progestinica a scopo sostitutivo.
Durante il follow-up l’adeguatezza del trattamento proposto è stata rivalutata periodicamente in accordo con la corrente pratica clinica. Nessun soggetto ha presentato nuovi difetti adenoipofisari nel periodo di osservazione dello studio.
3.2.3 Disegno dello studio
Il disegno del presente studio storico-prospettico è riportato nella figura 3.1.
In primo luogo va sottolineato come, sebbene una parte dei dati sia stata raccolta in maniera retrospettiva (i dati alla diagnosi e durante la terapia con SSA per alcuni pazienti), tutti i soggetti sono stati seguiti in maniera continuativa sulla base di un protocollo clinico standardizzato proposto già da molti anni a tutti i soggetti acromegalici riferiti al Nostro Istituto. Tale considerazione permette pertanto di considerare prospettica la raccolta dei dati osservati.
Lo studio è stato preventivamente approvato dal Comitato etico dell’Università di Pisa ed i dati sono stati raccolti e conservati garantendo l’anonimato di tutti i soggetti.
25 Durante il periodo di indagine, i pazienti arruolati sono stati sottoposti a valutazione clinica e biochimica a cadenza semestrale ed in tale occasione l’adeguatezza della terapia proposta è stata rivalutata al fine di ottenere un adeguato controllo biochimico di malattia.
In accordo con la letteratura precedente, la terapia con SSA (Octreotide LAR o Lanreotide Autogel) è stata proposta come terapia medica di prima linea del paziente acromegalico2, 21. Al fine di ottenere il controllo biochimico di malattia, la dose del SSA
è stata adeguata a cadenza semestrale sino a raggiungere dosi massime prescrivibili del farmaco (Octreotide LAR 30 mg ogni 28 gg; Lanreotide Autogel 120 mg ogni 28 giorni). Nei soggetti che non hanno raggiunto il controllo biochimico di malattia con dosi massimali di SSA è stato introdotto l’antagonista recettoriale del GH (Pegvisomant, PEG, dose iniziale di 10 mg/die s.c, in aggiunta all’antagonista recettoriale del GH (SSA+PEG, n=31). La posologia del PEG è stata quindi rivalutata trimestralmente al fine di ottenere un controllo biochimico stabile di malattia (almeno due determinazioni di IGF1-index nei limiti della norma).
Una volta ottenuto uno stabile controllo biochimico di malattia con la terapia combinata con SSA+PEG, la terapia con SSA è stata sospesa e proseguita unicamente terapia con pegvisomant (PEG).
FIGURA 3.1. Disegno dello studio. Le cartelle cliniche di 62 pazienti consecutivi affetti da acromegalia ed
indirizzati al trattamento con analoghi della somatostatina (SSA) sono state analizzate. 12 pazienti sono stati esclusi preventivamente dallo studio. I rimanenti 50 pazienti sono stati stratificati sulla base del controllo biochimico di malattia durante SSA. Nei pazienti con mancato controllo di malattia durante la terapia con SSA (SSAun-contr) è stato introdotto l’antagonista recettoriale del GH in aggiunta all’SSA (SSA+PEG). Una volta ottenuto un controllo stabile di malattia, la terapia con SSA è stata sospesa in un gruppo di pazienti che hanno proseguito un trattamento unicamente con pegvisomant (PEG). Al termine dello studio 13 pazienti erano ancora in terapia combinata al termine dello studio. I numeri sono riferiti al numero dei soggetti inclusi in ciascun gruppo di trattamento.
26 Nel sottogruppo di pazienti che hanno proseguito il PEG in mono-trattamento (n=18) la posologia del farmaco è stata rivalutata a cadenza trimestrale per garantire il mantenimento del controllo biochimico di malattia.
Al termine dello studio una porzione di pazienti (n=13) era in terapia combinata con analoghi della somatostatina e pegvisomant.
Sulla scorta di quanto detto sinora, nello studio sono identificabili i seguenti gruppi:
Nessuna terapia medica (n=50):
Terapia medica con analoghi della somatostatina (SSAALL, n=50);
Terapia medica con SSA ed ottimale controllo biochimico di malattia (SSACONTROLLED, n= 19);
Terapia medica con SSA con inadeguato controllo di malattia (SSAUNCONTROLLED,
n= 31):
Terapia medica combinata (SSA+PEG) e con adeguato controllo biochimico di malattia (SSA+PEG; n=31);
Terapia con pegvisomant e con adeguato controllo biochimico di malattia (PEG; n=18).
Il numero dei pazienti sottoposti a terapia con octreotide e lanreotide era similare. In particolare, l’octreotide LAR è stato proposto in 26 dei soggetti mentre il lanreotide è stato utilizzato in 24 pazienti.
Tra i pazienti trattati con octreotide LAR, l’acromegalia è risultata controllata in 10 pazienti (dose media dell’octreotide ±S.E.M.: 25.0 ±17.0 mg/28 gg) mentre non risultava controllata in 16 pazienti (dose media dell’octreotide ±S.E.M.: 28.8 ± 0.7 mg/28 gg, P= 0.0372 vs. pazienti controllati).
Tra i pazienti trattati con lanreotide Autogel, l’acromegalia è risultata controllata in 9 pazienti (dose media del lanreotide±S.E.M.: 120.0 ± 0.0 mg/28 gg) mentre non risultava controllata in 15 pazienti (dose media del lanreotide±S.E.M.: 120.0 ± 0.0 mg/28 gg, P= 1 vs. pazienti controllati).
E’ inoltre interessante sottolineare come le dosi del PEG utili per il mantenimento di un adeguato controllo biochimico di malattia non variassero tra il gruppo SSA+PEG
27 ed il gruppo PEG (dose media del pegvisomant±S.E.M: SSA+PEG: 16.9±1.7 mg/die; PEG: 18.9±1.7 mg/die; P = 0.3101).
Nell’analisi dei dati raccolte sono stati utilizzati i dati ottenute dalle valutazioni del profilo glicemico eseguite a distanza di almeno 12 mesi dall’introduzione del SSA e a distanza di almeno 6 mesi dall’ultima modifica del regime terapeutico.
3.2.4 Valutazione del profilo glicemico a digiuno
Al fine di valutare il profilo glicemico dei pazienti acromegalici durante le diverse terapie sono stati raccolti i dati relativi ai seguenti parametri:
Glicemia a digiuno Insulinemia a digiuno HbA1c%
In aggiunta, i pazienti sono stati sottoposti ad un test di tolleranza glicemica orale (oral glucose tolerance test, OGTT) con esecuzione di campionamenti ematici per glicemia ed insulinemia ai tempi 0’, +30’, +60’, +90’, +120’ min.
Sulla base dei valori osservati, i pazienti sono stati quindi classificati ad ogni valutazione secondo le indicazioni suggerite dalla American Diabetes Association 66 come segue:
Soggetti con normale tolleranza glicemica;
Soggetti con aumentato rischio di diabete mellito (alterata tolleranza glicemica, alterata glicemia a digiuno, valori di HbA1c% compresi tra 5.7 e 6.4%);
Soggetti con diabete mellito conclamato.
La resistenza insulinica basale è stata valutata mediante l’indice HOMA2-IR (homeostasis model assessment of insulin resistance), un indice indiretto che è stato dimostrato essere in grado di correlare adeguatamente con la stima della resistenza insulinica ottenuta durante clamp euglicemico67, 68.
La funzione β cellulare è stata valutata mediante indice HOMA-β (Homeostasis model of deficient β-cell function). L’adeguatezza di tale indice è stata dimostrata mediante valutazione di correlazione sia con le stime della funzione β-cellulare ottenute durante clamp euglicemico sia con quello ottenuto durante il test di tolleranza glicemica endovenoso67.
28 I due parametri ora descritti (HOMA2-IR e HOMA-β) sono stati calcolati mediante l’utilizzo di uno specifico software (HOMA-2 calculator, version 2.2.; http://ww.dtu.ox.uk/homacalculator/index.php).
Una versione semplificata del Disposition Index (DI) è stata calcolata come il rapporto tra il valore di HOMA-β e quello dell’HOMA2-IR secondo le indicazioni presenti in letteratura69.
La sensibilità insulinica è stata stimata utilizzando il QUICK-index (determinato secondo le indicazioni presenti in letteratura70) e l’indice di Matsuda (Insulin sensitivity
Index, ISI) calcolato a partire dai valori di insulinemia e glicemia osservati durante l’OGTT71.
3.2.5 Determinazione delle aree sotto la curva dell’OGTT
La valutazione integrata dei valori di glicemia ed insulinemia durante OGTT è stata eseguita mediante determinazione delle aree sotto la curva profilo glicemico (AUCGLU)
ed insulinemico (AUCINS) calcolati utilizzando il metodo del trapezoide descritto da
Tai72. Il rapporto AUCINS/GLU, un indicatore della secrezione insulinica, è stato inoltre
calcolato73.
Infine, al fine di valutare la risposta insulinica precoce durante OGTT, sono stati determinati i valori dell’insulinogenic index [insulinogenic index: (Ins30-Ins0)/(glu30-glu0)]74.
3.2.6 Assays
Le concentrazioni sieriche di GH sono state valutate utilizzando una metodica immunologica a chemioluminescenza (Liason hGH, Diasorin, SpA, Saluggia, Italia) calibrata contro IS 98/574. La sensibilità di tale metodica è 0.05 µg/L e i coefficienti di variazione intra ed inter assay sono rispettivamente 4.1 e 7.3%. I valori di normalità del GH con tale metodica sono 0.05-5 µg/L.
Le concentrazioni sieriche dell’IGF1 sono state misurate mediante una metodica RIA automatizzata (DIAsource ImmunoAssay S.A., Nivelles, Belgio) che prevede l’esecuzione di una estrazione con etanolo ed acido. I valori di normalità per l’IGF1 , che derivano da un precedente studio eseguito su oltre 800 soggetti, sono i seguenti: 20-29 anni: 151-504 µg/L; 30-39 anni: 120-383 µg/L; 40-49 anni: 101-314 µg/L; 50-59
29 anni: 88-269 µg/L; 60-69 anni: 78-237 µg/L; 70-79 anni: 70-212 µg/L75. Al fine di
confrontare i valori di IGF1 osservati nelle diverse classi di età è stato determinato il valore dell’IGF1-index (rapporto tra il valore osservato di IGF1 e il limite superiore della norma per classe di età).
I valori sierici di insulina sono stati misurati mediante una metodica IRMA (DIAsource Immunoassays S.A.). La sensibilità del dosaggio è 1.0 µUI/mL; i coefficienti di variazione intra ed interassay della metodica sono 2.1 e 6.5% per valori bassi di insulinemia (6-14 µUI/mL) e 1.5 e 6.1% per valori superiori (52-200 µUI/mL).
I valori di glicemia ed HbA1c sono stati analizzati mediante le metodiche standard. I valori di normalità della glicemia sono 74-100 mg/dL mentre è considerata normale una HbA1c% < a 5.7%.
Al momento della diagnosi tutti i soggetti sono stati sottoposti ad RMN della regione sellare. Durante il follow-up l’esame è stato ripetuto a cadenza annuale per valutare la presenza di eventuali variazioni dimensionali della lesione sellare.
3.2.7 Analisi statistica
I dati quantitativi sono riportati come media±S.E.M. mentre i dati qualitativi sono espressi in termini percentuali.
Le differenze nei parametri osservati alla diagnosi, nei pazienti controllati o meno con SSA, sono state analizzate mediante analisi della varianza (ANOVA).
Le differenze osservate tra terapia con SSA e valutazione basale e tra i diversi gruppi di trattamento (Δ(SSAall)-(basal), Δ(SSA+PEG)-(SSAun-contr), Δ(PEG)-(SSA+PEG)] sono
state analizzate mediante analisi della varianza (ANOVA) per coppie appaiate.
La comparazione tra i pazienti controllati e non controllati con SSA per le differenze osservate rispetto ai valori basali (Δ(SSAcontr)-(basal); Δ(SSAun-contr)-(basal)) è stata
eseguita mediante analisi della varianza (ANOVA).
Il confronto tra le differenze osservate nei valori osservati durante i trattamenti ed i corrispondenti valori basali è stata eseguita mediante analisi della varianza (ANOVA). In particolare, tale metodica è stata utilizzata nelle seguenti comparazioni: tra i diversi gruppi di trattamento e i corrispondenti valori basali per i seguenti confronti Δ (SSAcontr
30 –basal) vs. Δ(SSA+PEG-basal); Δ )SSAcontr–basal) vs. Δ (PEG-basal);
Δ(SSA+PEG-basal) vs Δ(PEG-Δ(SSA+PEG-basal).
Il confronto tra la prevalenza delle alterazioni del metabolismo glicemico nei vari gruppi di studio è stata eseguita mediante test di McNemar.
Valori di P < 0.05 sono stati utilizzati per indicare la significatività statistica. L’analisi statistica è stata eseguita mediante il software SPSS v.13.0.
TABELLA 3.3. Confronto dei valori basali osservati nei pazienti controllati (SSACONTR) o meno (SSAUN-CONT) con SSA.
BASAL EVALUATION
SSACONTR SSAUN-CONTR P
Età, anni 50.83 ± 2.62 46.47 ± 2.33 0.2212
Sesso Femminile 11 (57.9 ) 16 (51.6) 0.6649
BMI 28.39 ± 1.00 28.45 ± 0.81 0.9626
Macroadenoma 10 (52.6) 22 (70.9) 0.1918
Ritardo stimato nella diagnosi (mesi) 101.4 ± 11.24 118.0 ± 25.41 0.4813
Adenomectomia Transfenoidale 6 (31.6) 13 (41.9) 0.4614
GH (μg/L) 15.24 ± 4.77 10.04 ± 2.05 0.3282
IGF1 index 2.85 ± 0.34 2.78 ± 0.19 0.7667
Glicemia a dlgiuno (mg/dL) 93.89 ± 3.01 92.50 ± 1.66 0.6892
Insulinemia a digiuno (μU/mL) 11.21 ± 2.77 15.41 ± 2.95 0.3053
HbA1c, % 6.04 ± 0.16 6.29 ± 0.14 0.2656 HOMA2-IR 1.42 ± 0.34 1.93 ± 0.35 0.3002 HOMA-β 107.87 ± 17.23 135.44 ± 17.17 0.2644 Disposition Index 88.40 ± 7.33 87.89 ± 6.49 0.9586 QUICK index 0.345 ± 0.008 0.339 ± 0.008 0.6207 OGTT glicemia a 0’, mg/dL 87.22 ± 3.93 93.80 ± 2.14 0.1531 OGTT glicemia a 120’, mg/dL 151.83 ± 9.94 132.53 ± 8.92 0.1563
OGTT AUCGLU, mg/dLx120 min 19093 ± 962 17530 ± 698 0.1974
OGTT AUCINS, μU/mLx120 min 7561 ± 1454 9330 ± 1074 0.3372
AUCINS/ AUCGLU 0.40 ± 0.06 0.55 ± 0.07 0.1179
Matsuda index (ISI) 4.69 ± 0.48 3.75 ± 0.45 0.1656
Insulinogenic index 0.62 ± 0.14 0.97 ± 0.23 0.2008
Stato di tolleranza glicemica,
Normale tolleranza glicemica (NGT) 5 (26.3) 17 (54.8) 0.0453* Alterata glicemia a digiuno (IFG) 2 (10.5) 1 (3.2) 0.2999
Alterata tolleranza glicemica (IGT) 10 (52.6) 8 (25.8) 0.0560
IFG + IGT 1 (5.3) 1 (3.2) 0.7250 Diabete mellito (DM) 1 (5.3) 4 (12.9) 0.3619 Ipopituitarismo 4 (21.1) 6 (19.4) 0.8845 Ipogonadismo 1 (5.3) 0 (0.0) 0.1606 Ipogonadismo + Ipotiroidismo 1 (5.3) 3 (9.7) 0.5659 Iposurrenalismo 1 (5.3) 0 (0.0) 0.1606 Ipotiroidismo 1 (5.3) 1 (3.2) 0.7250 Panipopituitarismo 0 (0.0) 2 (6.5) 0.1612
BMI: body mass index (kg/m2); IGF1-index: il rapporto tra i valori misurati di IGF1 ed il limite superiore di normalità per età; AUCglu: area sotto la curva glicemica durante OGTT; AUCglu: area sotto la curva insulinica durante OGTT; AUCglu/AUCglu: rapporto tra le due AUC. I dati quantitativi sono esposti come media ±S.E.M.; i dati qualitativi come numero totale e percentuali.
31
3.3 Impatto della terapia medica con analoghi della somatostatina sulla
mortalità dei soggetti acromegalici. Studio su una ampia coorte di soggetti acromegalici
3.3.1 Disegno dello studio e pazienti arruolati
Al fine di valutare l’impatto della terapia medica con gli analoghi della somatostatina sulla mortalità dei soggetti affetti da acromegalia è stato eseguito uno studio retrospettivo su una ampia casistica di pazienti acromegalici riferiti consecutivamente al Dipartimento di Endocrinologia e Metabolismo dell’Università di Pisa e al Dipartimento di Endocrinologia dell’Università Federico II° di Napoli dal 1 gennaio 1966 al 31 dicembre 2009.
Lo studio è stato preventivamente approvato dai comitati etici delle due Università ed è stato eseguito garantendo l’anonimato dei soggetti esaminati e in accordo con le indicazioni sulla corretta esecuzione degli studi epidemiologici (Strengthening the Reporting of
Observational studies in Epidemiology, STROBE statement).
Nel complesso sono stati inclusi nello studio 438 pazienti di cui 218 soggetti provenivano dalla casistica dell’Università di Pisa (137 donne e 81 maschi, età media alla diagnosi di acromegalia 46.07±12.68 anni) e 220 pazienti dalla casistica dell’Università Federico II° di Napoli (112 donne e 108 maschi, età media alla diagnosi 43.08 ± 13.35 anni).
Trentasette pazienti affetti da acromegalia (18 della casistica toscana e 19 della casistica campana) sono stati esclusi dallo studio per la non completezza dei dati clinici.
Ciascun soggetto incluso nello studio è stato assistito in maniera continuativa da uno due centri coinvolti nello studio attraverso valutazioni periodiche eseguite tanto in regime ambulatoriale o di ricovero (day Hospital o ricovero ordinario) a cadenza solitamente semestrale.
In numero dei decessi e le cause dei decessi sono state indagate attraverso una revisione retrospettiva delle cartelle cliniche dei pazienti. Inoltre, successivamente alla data
32 censoria del 31 dicembre 2009, i pazienti sono stati sottoposti ad una intervista
telefonica da parte di un medico del centro per verificarne lo stato di salute.
Le cause dei decessi sono state valutate mediante valutazione delle cartelle cliniche dei pazienti e mediante valutazione delle cause del decesso riportate nel certificato di morte. Dal momento che tutti i decessi osservati sono avvenuti nella decade 1999-2009, il tasso di mortalità della coorte in studio è stato confrontato con quello stimato dall’Istituto Italiano di Statistica (ISTAT) per la popolazione italiana nel periodo corrispondente (tavole di mortalità ISTAT http://www.istat.it).
3.3.2 Diagnosi di acromegalia, valutazione dell’attività di malattia
In entrambi i Centri la diagnosi di acromegalia viene posta sulla base della presenza delle stigmate cliniche della malattia in associazione ai criteri di laboratorio riconosciuti dalle consensus internazionali sulla diagnosi dell’acromegalia63, 64.
Allo stesso modo, la definizione di remissione di malattia (dopo intervento chirurgico radicale) e di controllo biochimico di malattia sono condivise dai due Istituti e rispecchiano le indicazioni poste dalle attuali linee internazionali di consenso 63, 64.
Il ritardo stimato nella diagnosi dell’acromegalia è espresso in anni e rappresenta una stima eseguita dal medico dell’intervallo di tempo intercorso tra la comparsa dei sintomi e la diagnosi dell’acromegalia.
3.3.3 Gruppi di trattamento
Durante il periodo dello studio le modalità di approccio terapeutico del paziente acromegalico ha subito delle variazioni. Ad esempio, la terapia radiante esterna è stata utilizzata in circa il 30% dei soggetti in cui la diagnosi di acromegalia è stata posta negli anni ’70 ma solo nel 2% dei soggetti in cui la diagnosi di acromegalia è stata posta nel corso dell’ultima decade.
A partire dal 1990, le percentuali di soggetti trattati con terapia chirurgica o terapia medica primaria sono similari mentre negli anni 80 la maggior parte dei soggetti è stata indirizzata immediatamente al trattamento chirurgico.
Data la natura retrospettiva dello studio, la scelta terapeutica è stata indipendente dalle finalità dello studio ed è stata presa in relazione alle condizioni cliniche del paziente,
33 della sua volontà e delle tipologie di trattamento disponibili al momento della decisione
terapeutica.
Al fine di valutare l’impatto delle differenti terapie sulla mortalità, i pazienti acromegalici sono stati suddivisi nei seguenti gruppi:
Pazienti trattati con adenomectomia per via transfenoidale (n=124)
Pazienti trattati con adenomectomia per via transfenoidale seguita da terapia radiante e/o terapia con analoghi della somatostatina (N=151)
Pazienti trattati solo con terapia medica con SSA (n=88)
I restanti 75 pazienti non sono classificabili in maniera univoca in quanto sottoposti a varie combinazioni terapeutiche comprendenti due o più delle seguenti: terapia chirurgica, radioterapia esterna, radiochirurgia, terapia con dopamino-agonisti, terapia con analoghi della somatostatina a lento rilascio, pegvisomant).
3.3.4 Valutazione endocrinologica
I valori di GH ed IGF1 erano disponibili nella maggior parte dei soggetti sia al momento della diagnosi (GH: 97.2%, IGF1: 91.5%) che al momento dell’ultima visita (GH: 93.1%, IGF-1 e 90.9%).
Il valore mediano della distanza tra la data dell’ultima visita e la data censoria del 31 dicembre 2009 è risultato 5.9 mesi.
Al fine di correggere i valori di IGF1 per l’età dei soggetti e per le differenti metodiche di dosaggio utilizzate nel corso degli anni è stato scelto di utilizzare, come nel precedente studio, il valore di IGF1-index.
In un sottogruppo di soggetti (n=198) erano disponibili i valori di IGF1 per tutta la durata dello studio (eseguiti al massimo ogni 12 mesi). In questo sottogruppo di pazienti è stato pertanto possibile determinare il valore medio dell’IGF1-index per tutta la durata del follow-up del singolo paziente.
Tale dato è stato confrontato con il valore di IGF1-index osservato al momento dell’ultima visita mediante test di correlazione per coppie appaiate. Tale analisi ha permesso di documentare un’ottima correlazione tra il valore medio dell’IGF1-index ed il valore dell’IGF1-index dell’ultima valutazione (intra-class correlation 0.87, 95 C.I. 0.83-0.90, P = 0.000) indicando, pertanto, come il valore di IGF1-index osservato in
34 occasione dell’ultima valutazione rappresenti un buon parametro per valutare il
controllo biochimico di malattia anche in relazione al lungo periodo.
Negli anni ’80 le concentrazioni del GH sono state misurate utilizzando una metodica RIA (HGHK-2 RIA, Sorin Biomedica, Saluggia, Italia), mentre negli anni ’90 è stato utilizzato il HGH kit della Nichols (Nichols Institute, San Juan Capistrano, California, USA). A partire dal 2001 entrambi gli Istituti utilizzano una metodica automatizzata in chemioluminescenza (DiaSorin, Saluggia, Italia).
Le concentrazioni sieriche dell’IGF1 sono state misurate utilizzando una metodica IRMA (Nichols Institute Diagnostic) sino al 2005 e successivamente mediante una metodica RIA automatizzata (DiaSource, Immunoassays, Nivelles, Belgium).
L’ipopituitarismo è stato definito dalla presenza di almeno un deficit ormonale. In particolare la presenza di un iposurrenalismo centrale è stato identificato sulla base di una insufficiente risposta al test di stimolo con ACTH, la presenza di un ipotiroidismo centrale dal rilievo di valori di fT4 al di sotto del limite di normalità in presenza di valori ridotti od incongruamente normali di TSH, l’ipogonadismo centrale sulla presenza di valori ridotti di testosterone con gonadotropine normali o ridotte nel sesso maschile o dalla presenza di amenorrea in presenza di nella donna in età fertile e con valori normali di PRL. Nella donna in età menopausale l’ipogonadismo è stato identificato dalla presenza di gonadotropine ridotte.
Alla diagnosi e durante il follow-up soggetti che hanno presentato uno o più difetti a carico delle tropine ipofisarie sono stati sottoposti ad adeguata terapia sostitutiva non appena è stato evidenziato il difetto ormonale.
3.3.5 Valutazione delle co-morbilità e della gravità della malattia
Da molti anni i due Istituti che hanno preso parte allo studio presente hanno intrapreso dei programmi di screening allo scopo di identificare precocemente e trattare le complicanze sistemiche dell’acromegalia.
I protocolli utilizzati dai due Istituti sono similari e prevedono l’esecuzione delle seguenti valutazioni al momento della diagnosi dell’acromegalia: un esame colonscopico, un ecocardiogramma, una valutazione del profilo pressorio, una valutazione del profilo glicemico e lipidico, una valutazione delle complicanze
35 respiratorie (polisonnografia ed emogassanalisi) ed una ecografia completa dell’addome.
Nel corso del follow-up, inoltre, i pazienti sono stati sottoposti periodiche valutazioni di tali esami. In particolare le valutazioni cardiologiche, metaboliche, respiratorie e l’esame ecografico dell’addome sono state eseguite a cadenza circa annuale. L’esame colonscopico è stato ripetuto ogni 3-5 anni in relazione al controllo biochimico dell’acromegalia e dell’esito del precedente esame endoscopico.
Le diagnosi delle diverse comorbidità, eseguita al momento della diagnosi dell’acromegalia riflette i criteri utilizzati in cui è stata posta la diagnosi. Il profilo di rischio cardiovascolare alla diagnosi ed al termine del follow-up è stato retrospettivamente calcolato secondo le indicazioni fornite dall’ATP III27.
Non appena identificate, le varie comorbidità dell’acromegalia sono state trattate secondo gli protocolli accettati al momento della diagnosi. Durante il follow-up l’adeguatezza di tali trattamenti è stata periodicamente rivalutata
Lo stato fisico di ciascun paziente è stato valutato retrospettiva utilizzando i dati clinici e di laboratorio evidenziati al momento della diagnosi e riportati nelle cartelle cliniche dei pazienti. A tal scopo è stato utilizzato il sistema di stratificazione del rischio anestesiologico proposto dalla American Society of Anaeshesiologists (ASA) come segue:
ASA 1: Soggetto normale, in buona salute,
ASA 2: paziente con malattia sistemica da lieve a moderata, ASA 3: paziente con disturbo sistemico,
ASA 4: paziente con disturbo sistemico severo che pone il paziente in pericolo di vita,
ASA 5: paziente moribondo,
ASA 6: soggetto con diagnosi di morte cerebrale.
Al momento dell’esecuzione della analisi statistica, i soggetti identificati con un profilo di rischio ASA 1 e 2, sono stati raggruppati all’interno di un’unica categoria in relazione al basso profilo di rischio di decesso che accumuna le due classi76. Nessun paziente
incluso nello studio presentava un profilo di rischio ASA 5 al momento della diagnosi iniziale di acromegalia.
