UNIVERSITA’ DI PISA
FACOLTA’ DI MEDICINA E CHIRURGIA
Dipartimento di Medicina della Procreazione e dell’Età EvolutivaDivisione di Ginecologia e Ostetricia “P. Fioretti” Direttore: Prof. Andrea Riccardo Genazzani
Tesi di Dottorato
IL RUOLO DELL’ISTEROSCOPIA OFFICE E
DELL’ENDOTOSSINA BATTERICA
NELLA DIAGNOSI DELL’ENDOMETRITE
CRONICA
NELLE PAZIENTI INFERTILI
Candidata: Relatore: Gersia Araujo Viana Chiar.mo Prof. A. R. Genazzani
Ringraziamenti
Giunta al termine di questo lavoro ringrazio tutte le persone che mi sono state vicine e hanno permesso e incoraggiato la realizzazione di questa tesi:
Prof. Andrea Genazzani per l’opportunità di intraprendere questo percorso al quale esprimo grande ammirazione e rispetto.
Dr. Vito Cela per avermi incoraggiato ad eseguire questa ricerca
con disponibilità e prontezza nei chiarimenti e suggerimenti e per avermi guidato durante tutto questo percorso formativo.
Prof. Paolo Artini per gli insegnamenti e gli incoraggiamenti che
hanno contribuito alla mia crescita nel campo professionale.
Ai colleghi della procreazione medicalmente assistita per l'accoglienza e collaborazione indispensabili alla conclusione di questo lavoro, specialmente le due Marie.
Un ringraziamento speciale a Carlo, per essermi stato sempre vicino, appoggiandomi ed aiutandomi con pazienza e amore ed un bacio affettuoso a nostro figlio Tiago che con il suo sorriso illumina la nostra vita.
Alla mia famiglia per il suo continuo supporto, in particolare ai miei genitori che mi hanno insegnato ad avere fede.
INDICE
Capitolo 1
INTRODUZIONE ...pag. 1
Capitolo 2
L’ENDOMETRIO
...pag. 2
2.1 Generalità ...pag. 2 2.2 Alterazioni cicliche...pag. 2 2.3 Alterazioni infiammatorie ...pag. 6Capitolo 3
ENDOMETRITE CRONICA
...pag. 8
3.1 Microbiologia del tratto genitale ...pag. 8 3.2 Endotossina batterica ...pag. 10 3.3 Aspetti clinici ...pag. 11 3.4 Trattamento...pag. 12
Capitolo 4
ISTEROSCOPIA OFFICE
...pag. 14
4.1 Generalità ...pag. 14 4.2 Criteri diagnostici di endometrite cronica ...pag. 16
Capitolo 5
ISTOLOGIA
...pag. 18
5.2 Criteri diagnostici di endometrite cronica ...pag. 20
Capitolo 6
PARTE SPERIMENTALE
...pag. 21
6.1 Scopo dello studio ...pag. 21 6.2 Materiali e metodi ...pag. 21 6.2.1 Selezione delle pazienti ...pag. 21 6.2.2 Prelievo e stoccaggio dei campioni di sangue
mestruale e lavaggio endometriale...pag. 22 6.2.3 Isteroscopia Office...pag. 23 6.2.4 Biopsia endometriale ...pag. 25 6.3 Risultati. ...pag. 25
6.3.1. Incidenza dell’endometrite cronica nelle pazienti
infertili ...pag. 25 6.3.2. Valutazione dei valori di endotossina batterica...pag. 27 6.3.3 Valutazione istologica ...pag. 28 6.3.4 Valutazione isteroscopica post-terapia...pag. 29
Capitolo 7
DISCUSSIONE
...pag. 30
7.1 Endometrite cronica nelle pazienti infertili ...pag. 30 7.2 Conclusioni ...pag. 31 7.2 Prospettive ...pag. 33
Capitolo 1
INTRODUZIONE
L'infezione del tratto genitale superiore rimane ancora una importante causa di morbilità femminile essendo responsabile di sequele a lungo termine rappresentate da: infezioni ripetute, infertilità, gravidanza extra-uterina, aborto, parto pre-termine e dolore pelvico cronico (1).
L'endometrio, luogo di impianto e sviluppo embrionario, è biologicamente protetto da infezioni esogene. D'altra parte, una colonizzazione endometriale patologica può avvenire quando batteri provenienti dal tratto genitale inferiore ascendono come risultato di strumentazione uterina, aborti, parti e cerviciti, determinando un processo infiammatorio a livello endometriale, che può interferire con la capacità riproduttiva della donna (2-3).
L'esame diretto della cavità uterina tramite isteroscopia si è rivelato efficace nell'identificare un quadro di endometrite cronica e quando associato alla biopsia endometriale aumenta la sua sensibilità. Il dosaggio dell'endotossina batterica per valutare la carica batterica a livello endometriale è stato proposto, ma la sua utilità deve essere ancora confermata (3-26).
L'importanza di questa infezione endometriale subclinica sta nella sua probabile riduzione della fertilità femminile: è stato suggerito che l'endometrite cronica possa influenzare negativamente l'impianto embrionario e l'esito di gravidanze per la possibile azione dei prodotti microbici sulla recettività endometriale (4)
Capitolo 2
L' ENDOMETRIO
2.1 Generalità
L'endometrio, di origine mesodermica, embriologicamente mulleriana, ha la sua superficie rivestita da epitelio ghiandolare con capacità di mostrare differenze di tipo proliferativo o secretivo, dipendendo dallo stimolo ormonale. Per questo durante il periodo pre-puberale, così come in post menopausa o dopo castrazione ovarica, la mucosa deve presentarsi inattiva.
La mucosa endometriale ha un torrente vascolare abbondante, originato dalle arterie radiali miometriali, che si ramificano in arteriole nella parte più superficiale formando una rete. Il ritorno venoso avviene attraverso le vene endometriali. In accordo con la fase del ciclo le arteriole possono presentare alterazioni di volume (fini o spesse), di forma (rette od a spirale), ed aspetto (contratte o dilatate). E' utile segnalare che le arterie miometriali sono provviste di membrana elastica, che contribuisce alla stenosi e necrosi ischemica durante il periodo mestruale. Lo strato elastico è assente nelle arteriole dell'endometrio funzionale.
Il ciclo endometriale segue una seri de alterazioni morfologiche e fisiologiche, caratterizzate dalla proliferazione, differenziazione secretiva, degenerazione e rigenerazione sotto lo stimolo estrogenico e progestinico e dei suoi recettori (2).
2.2 Alterazioni cicliche
L'endometrio mostra un andamento ciclico in accordo con lo stimolo ormonale, in un periodo medio di 28 giorni. Lo studio delle variazioni morfologiche (macro e microscopiche)
dell'endometrio durante il ciclo è essenziale per documentare l'avvenuta ovulazione.
Datare la fase dell'endometrio, anche da parte di uno specialista, è estremamente difficile. La differenza di 1 o 2 giorni nella datazione dell'endometrio in rapporto al calendario ideale di 28 giorni è diffusamente accettata dagli specialisti.
Lo studio macroscopico deve utilizzare un modello ideale, immaginando che tutta la mucosa sia uniformemente sviluppata.
Fase Proliferativa: dopo il periodo mestruale, dal primo al
terzo giorno, avviene una prima fase di rigenerazione endometriale, dove le alterazioni morfologiche non sono sufficienti da permettere un efficace controllo, non consentendo una datazione accurata.
Nella fase dal quarto al settimo giorno, l'endometrio è sottile, con circa 0,2 cm di spessore, a superficie rugosa, che mostra punteggiature e minuscole placche gialle, espressione della fase rigenerativa diffusa, ricoprendo le aree eliminate dalla desquamazione mestruale. Microscopicamente si osserva la rigenerazione dell'epitelio che è costituito da cellule ghiandolari basse, con nucleo in posizione basale, rare mitosi, stroma compatto formato da cellule stellate o fusiformi con citoplasma scarso e arteriole sottili e strette.
Nella fase intermedia (dall'ottavo al decimo giorno) non si hanno residui del periodo mestruale, però l'endometrio è ancora sottile, con 0,25cm di spessore e la superficie comincia a divenire liscia. In questa fase già è possibile osservare rari orifizi ghiandolari di colore più chiaro della restante mucosa.
Microscopicamente, ghiandole sparse, con un inizio di allungamento si mostrano sia curve che dritte, presentando numerose mitosi, incluso lo stroma che ancora appare relativamente denso, con arteriole sottili, dritte e strette.
continua sottile, misurando circa 0,28cm di spessore, a superficie ancora liscia e brillante ed a colorazione roseo-gialla. Sono presenti strutture ghiandolari che si mostrano come punti bianchi e sparsi. Linee rossastre tipiche dei rami vascolari precoci possono essere reperite. Microscopicamente le ghiandole sono tortuose, ben distanziate, lunghe, alte, numerose e strette. I nuclei delle cellule ghiandolari sono in posizione basale con pseudo-stratificazione nucleare, potendosi osservare numerose mitosi. Lo stroma è moderatamente denso, con nuclei piccoli e citoplasma scarso. Le arteriole sono sottili, dritte e strette.
L'ovulazione avviene intorno al 14° giorno del ciclo mestruale, nello stesso momento è possibile notare per 36-48 ore variazioni dell'aspetto endometriale.
Fase Secretoria: nella fase secretoria iniziale dal 14° al 20°
giorno, possiamo osservare un endometrio ispessito, arrossato, spesso fino a 0,38cm, a superficie irregolare presentando dislivelli concavi fino alla formazione di mammellonature, dando perciò un aspetto di piccole elevazioni della mucosa.
Le ghiandole appaiono come macchie chiare, diffuse, di basso rilievo. I vasi capillari presentano una trama sottile. Microscopicamente abbiamo cambiamenti specie nelle strutture ghiandolari, che tendono ad avvicinarsi, allungarsi in forma lievemente tortuosa, mostrando cellule che cominciano ad essere colonnari. Il nucleo delle ghiandole si pone in posizione intermedia, appaiono vacuoli sub-nucleari che diventano superficiali. Nel 19° giorno non sono più presenti pseudostratificazioni e mitosi. Nel 20° giorno si raggiunge il massimo delle secrezioni intraluminali, con i nuclei che appaiono ovali. Lo stroma comincia ad essere molle, nuclei aumentano di volume, sorge un discreto edema interstiziale e le mitosi sono assenti, restando ancora leucociti sparsi. Le arteriole tendono a tornare più spesse, relativamente a
spirale e lievemente dilatate.
Nella fase secretoria intermedia (21° al 24° giorno) l'endometrio si presenta spesso, fino a 0,7cm e friabile, a superficie arrossata, irregolare con protuberanze accentuate, scanalata, polipoide e edematoso. La trama vascolare si mostra evidente tra gli sbocchi ghiandolari. Microscopicamente predominano i cambiamenti stromali, con l'apice dell'attività secretoria. Le ghiandole appaiono raggruppate, tortuose ed allungate, larghe e secretorie; lo stroma è molle con edema accentuato. La infiltrazione leucocitaria continua discreta e le arteriole si presentano ingrandite, spiraliformi e dilatate. Dopo la 21° giornata si osserva un edema stromale marcato, in 22° l'edema stromale raggiunge il massimo (i nuclei tornano nudi); in 23° giornata le arteriole spirali presentano alterazioni pre-deciduali e nel 24° giorno tornano le mitosi stromali e iniziano alterazioni predeciduali più marcate.
Nella fase secretoria finale (dal 24° al 28° giorno), osserviamo che l'endometrio si presenta ispessito, fino a 0,8cm, a superficie friabile, biancastra o grigiastra, ondulata, con emorragie submucose. I vasi si presentano collassati, così come le strutture ghiandolari (irregolari macchie chiare). Microscopicamente abbiamo le caratteristiche dell'inizio delle alterazioni predeciduali verso il 24°-25° giorno del ciclo, subito sotto l'epitelio superficiale inizia l'infiltrazione di leucociti e linfociti, ancora in quantità modesta. Le ghiandole sono ravvicinate, allungate, molto tortuose, numerose e larghe; i nuclei delle cellule ghiandolari ritornano in posizione basale; la secrezione è accentuata. Lo stroma è molle, non compatto, e l'edema è visibile e con reazione predeciduale. Si notano necrosi focali. Le arteriole sono grosse, spiraliformi e dilatate e in qualche punto determinano emorragie focali.
Pertanto in sequenza incontriamo nel 24°-25° giorno, l'aumento di una infiltrazione leuco-linfocitaria diffusa. Nel 26°, lo stroma deciduale comincia ad essere confluente. Nel 27°-28°
giorno, i linfociti sono più numerosi ed appaiono i plasmociti. I lembi dello stroma deciduale divengono confluenti, con necrosi focale. La fine della fasi secretoria arriva al massimo presentandosi le ghiandole tortuose e seghettate. La vacuolizzazione citoplasmatica è variabile e la secrezione intraluminale irregolare.
Fase Mestruale: nella fase mestruale (dal primo al terzo
giorno del ciclo) l'endometrio appare disintegrato, potendo essere sanguinante e friabile con accumuli grigiastri o ancora nudo. Negli ultimi giorni già iniziano a livello del segmento profondo aree di rigenerazione, sebbene con la presenza di emorragia diffusa.
La emorragia mestruale è controllata dalla vasocostrizione delle arterie basali nell'area profonda desepitelizzata e dell'arterie radiali e arcuate del miometrio. La rapida desepitelizzazione della parte profonda riduce considerevolmente la perdita di sangue mestruale. Le arterie dello strato funzionale non hanno tessuto elastico e conseguentemente non si contraggono.
Nel secondo e terzo giorno, lo strato funzionale si separa dall'area profonda, inizialmente nella parte fundica dell'utero e lentamente si estende fino all'istmo, come si può osservare all'isteroscopia. Microscopicamente osserviamo degenerazione e necrosi diffusa ghiandolare ed infiltrato stromale leucolinfocitario e moderatamente plasmocitario, emorragia con trombi di fibrina nei piccoli vasi, lacune emorragiche e stroma dissociato (2).
2.3 Alterazioni infiammatorie
I processi infiammatori a carico della mucosa del corpo dell'utero, detti endometriti, hanno quasi sempre una eziologia batterica. La mucosa endometriale infiammata è congesta, iperemica, con un notevole edema delle strutture stromali. Si possono verificare fenomeni necrotici, emorragici o trombotici; un
esame al microscopio rivela edema stromale della mucosa superficiale, aumento della densità stromale con infiltrato leucocitario tra entrambi ghiandole ed stroma, e presenza di plasma cellule tra la sostanza dello stroma. Una delle situazioni nelle quali più comunemente si instaura una endometrite è il periodo del puerperio o del post-aborto. In particolare in quest’ultima situazione è facile che sulla mucosa cruentata dall’intervento possano insediarsi germi patogeni di varia natura. Un altro tipo relativamente frequente di endometrite è quella che caratterizza le donne anziane, detta appunto endometrite senile (2-18).
Capitolo 3
ENDOMETRITE CRONICA
3.1 Microbiologia del tratto genitale
Alfred Doderlein (1892) ha scoperto che la flora vaginale è normalmente rappresentata da lattobacilli, che sono i responsabili per la riduzione del pH attraverso la metabolizzazione del glicogeno delle cellule squamose a acido lattico.
Una varietà di organismi possono essere coltivate dalla vagina di donne asintomatiche come da sintomatiche. Valutazioni batteriologiche di campioni vaginali sono quindi più difficile di interpretare in relazione a quelli ottenute da campioni endometriali dove si aspetta una condizione di sterilità. Tamponi vaginali sono frequentemente ottenuti nella pratica clinica, mentre campioni endometriali sono utilizzati solamente per fine di ricerca. La presenza di batteri a livello endometriale può essere associato ad infertilità (8).
Nonostante estensive investigazioni, il significato dei vari tipi di batteri trovati in vagina rimane controverso (9). Esiste una associazione tra colonizzazione cervicale da U. urealyticum ed endometrite cronica (10). Microorganismi possono essere presenti nell'endometrio quando l'esame colturale cervicale è negativo (11). Da un'altra parte, istopatologia e microbiologia endometriale sono state valutate in donne con vaginosi batterica sintomatica ma senza evidenza clinica di malattia infiammatoria pelvica (12).
La cavità endometriale è frequentemente invasa da microorganismi e infezione o infiammazione endometriale subclinica può avere un ruolo nel fallimento dell'impianto dopo
Fecondazione in vitro, nell'aborto spontaneo e nella gravidanza pretermine (13).
In molte casi di endometrite cronica, un agente patogeno causale non può essere isolato e la infiammazione è considerata aspecifica (4).
Considerando che donne con vaginosi batterica sono più propense ad avere quadro istologico di endometrite, si presume che un cambiamento della flora microbica del tratto genitale inferiore predispone alla ascensione intrauterina di infezioni/infiammazioni nelle pazienti non gravide (13).
Eckert et al. conclusero che pazienti sottoposti a cicli di fecondazione in vitro con vaginosi batterica e bassa concentrazione di perossido di idrogeno produttore di lattobacilli avevano una riduzione del tasso di concepimento e un tasso aumentato di aborto spontaneo precoce (14). Salim et al. riportarono una associazione tra fallimento in cicli di procreazione medicalmente assistita e colonizzazione batterica della cervice uterina (15).
Contrariamente, altri autori hanno concluso che la ricerca di vaginosi batterica con l'obbiettivo di migliorare i risultati in cicli di IVF non era giustificato (16).
Un recente studio ha dimostrato un caso di gravidanza a termine in donna con endometrite cronica confermata istologicamente e suggerisce che sia rivalutato l'impatto della infiammazione endometriale cronica in pazienti infertili (4).
Gli agenti etiologici possibilmente coinvolti nella endometrite cronica sono: streptococchi, stafilococchi, colibacilli, enterococchi, Chlamydia, Ureaplasma, gonococco e bacillo di Koch. Colonizzazione dell' endometrio da batteri gram-negativi o da altri microrganismi è possibilmente associata con fallimento dei cicli di fecondazione in vitro per un disordine di impianto o induzione di aborto (17).
3.2 Endotossina batterica
Endotossina batterica è un componete lipopolisaccaride della membrana cellulare di batteri gram negativi e viene rilasciata dopo autolisi naturale o rottura artificiale della cellula batterica. E' stabilito che l'endotossina eserciti un effetto biologico dannoso in varie fasi della riproduzione umana. La sua presenza in mezzi di coltura di IVF è considerata una potenziale causa di fallimento in cicli di IVF-ET: bassa fertilizzazione delle uova, bassa qualità delle uova fertilizzate, e riduzione del tasso di gravidanza (3).
L'effetto biologico dell'endotossina sta nella sua capacità di indurre nella cellula ospite la produzione di citochine pro-infiammatorie come fattore di necrosi tumorale e interleuchine-1 (22-23).
Endotossine sono invariabilmente legate a batteri gram negativi, anche se gli organismi non sono patogeni. La attività biologica delle endotossine è legata al lipopolisaccaride. La tossicità è associata al componete lipidico mentre il componete polisaccaride è associato all'induzione della risposta immunologica (24).
Il ruolo dell'endotossina batterica nelle pazienti infertili è stato studiato da Kamiyama et al. (3) che ha eseguito prelievo di sangue mestruale in 38 donne sottoposte a IVF-ET per il dosaggio qualitativo e quantitativo dell'endotossina batterica e i risultati hanno dimostrato che le pazienti che avevano un livello di endotossina batterica nel sangue mestruale inferiore a 200pg/mL presentavano un percentuale di gravidanza migliore in relazione a quelle con dosaggio più alto. Questo studio è limitato considerando il ridotto numero di pazienti coinvolte e la assenza di informazioni in relazione alla qualità delle embrioni trasferiti, fattore decisamente importante nei risultati di gravidanze.
3.3 Aspetti clinici
Una infiammazione endometriale cronica è frequentemente asintomatica o accompagnata da sintomi aspecifici come: dolore pelvico, irregolarità mestruale, dispareunia e leucorrea. Diversamente dalla forma acuta, non esiste una associazione con quadro di salpingiti e la presentazione clinica è molto blanda , con assenza di febbre o alterazioni a livello di laboratorio.
Il sanguinamento uterino anomalo è il principale sintomo che disturba le pazienti, però in molte casi la diagnosi viene eseguita dopo iniziato il percorso di indagine per infertilità (5).
Può rappresentare l'evoluzione di una forma acuta o essere clinicamente primitiva. In questo ultimo caso, esiste la possibilità di ascensione del processo infettivo determinando un quadro di salpingite.
La carenza di reperti clinici e di laboratorio con alta sensibilità e specificità rendono difficile la diagnosi e trattamento precoce della endometrite, particolarmente quelle non associate a un quadro di malattia infiammatoria pelvica.
L'importanza di questa infezione endometriale subclinica sta nella sua probabile interferenza nella capacità riproduttiva della donna, visto che un endometrio patologicamente colonizzato è sede di un processo infiammatorio cronico creando condizioni avverse all'impianto ed allo sviluppo embrionario.
E' stato suggerito che la possibile azione di prodotti microbici nella ricettività endometriale in pazienti con endometrite cronica interferisca con l' impianto ed aumenti il rischio di aborto spontaneo e di gravidanza pre-termine (6). Un recente studio ha dimostrato una incidenza di 30% di endometrite cronica, confermata istologicamente, in donne infertili con storia di fallimenti ripetuti di impianto dopo fecondazione in vitro (7).
Al contrario, un caso di gravidanza a termine in donna con endometrite cronica confermata istologicamente, è stato
dimostrato, suggerendo che sia rivalutato l'impatto della infiammazione endometriale cronica in pazienti infertili (4).
3.4 Trattamento
Il trattamento delle endometriti può potenzialmente fermare l'infezione prima che questa abbia la possibilità di danneggiare le tube provocando infertilità.
Una riduzione di endometriti confermata istologicamente con una terapia antibiotica anche tra quelle infezioni che non includono chlamydia e gonorrea, suggerisce che anche una bassa concentrazione di batteri nell'endometrio può causare endometrite nella popolazione (1).
La terapia antibiotica in caso di infertilità associata con infezione specifica dell'endometrio o della cervice ha richiamato fino ad oggi una relativa scarsa attenzione. Anche gli studi pubblicati nella letteratura dimostrano scarso interesse sulle infezioni sub cliniche come possibili cause di infertilità.
Le infezioni del canale cervicale sono state implicate come cause di infertilità e la doxiciclina ha dimostrato di essere attiva nel ridurre le infezioni del muco cervicale (52).
Dopo tale terapia entro quattro mesi in un gruppo di 13 pazienti con infertilità sine causa da più di un anno, si sono avute quattro gravidanze.
Un probabile effetto benefico è stato trovato nelle coppie con un partner sottoposto a terapia con doxiciclina perchè affetto da infezione con Mycoplasma, ma questi dati sono ancora incerti e non completamente comprovati. (53-54)
In un altro studio, tetraciclina (500 mg quattro volte/die) sono state somministrate ad entrambi i partners per 2 settimane se la cultura endocervicale di Micoplasma eseguita al momento del test post coitale risultava positiva (56).
del 42%, comparato con il 32% nelle coppie non trattate, sebbene questo dato non sia statisticamente significativo. Altri hanno somministrato oxitetraciclina in presenza di Micoplasma, alle pazienti ed ai partners per 10 giorni. Se le culture endometriali risultavano positive dopo tre mesi di terapia, questa era ripetute a più alte dosi e più a lungo. Alla fine della sperimentazione furono ottenute 43 gravidanze in un gruppo di 58 pazienti (71%) che sono state seguite per un anno dopo trattamento (55-56).
Un recente studio ha valutato l'associazione tra endometrite e fallimento ripetuto di impianto in cicli di IVF ma non ha evidenziato differenze in termine di gravidanze quando queste pazienti venivano sottoposte a antibioticoterapia nel ciclo successivo (7).
Capitolo 4
ISTEROSCOPIA OFFICE
4.1 Generalità
L'isteroscopia diagnostica deve essere un esame di routine tale da non richiedere alcuna premedicazione, solo alcuni centri praticavano una mezza ampolla di atropina sub linguale per prevenire reazioni vagali, ma al momento attuale tale terapia è stata abbandonata.
L'esame senza anestesia né dilatazione del canale cervicale offre il massimo di innocuità e di ripetibilità in modo da ridurre al minimo il disagio della paziente.
La scelta del momento di esecuzione varia a seconda il tipo di paziente: nelle donne in età fertile il momento più favorevole è nella prima metà del ciclo mestruale, tra il 6° ed il 10° giorno. In questo periodo l'istmo è ipotonico ed il suo superamento più facile.
La mucosa endometriale nella fase proliferativa si presta ad una migliore osservazione endoscopica rispetto a quella secretiva, le cui modificazioni morfologiche ed in particolare l'abbondante presenza di muco cervicale e secreto endometriale possono a volte ostacolare la visione dei dettagli. Nella fase proliferativa del ciclo si evita, inoltre, il rischio di una gravidanza iniziale inaspettata.
In caso di urgenza od in pazienti che fanno uso di contraccettivi orali, il periodo del ciclo è poco importante. Alcune circostanze particolari fanno preferire la seconda fase del ciclo, per esempio la necessità di una diagnosi di iperplasia dell'endometrio deve essere effettuata in fase secretiva quando le caratteristiche endometriali enfatizzano questa patologia (42-48).
L'esame isteroscopico si è molto semplificato rispetto agli inizi della metodica: abbandonati per una semplice diagnostica gli strumenti di diametro esterno di 5 mm, vengono attualmente usati micro telescopi di 2,9 mm con camicie diagnostiche di 3,2mm. Anche lo speculum e la pinza di Pozzi con la quale si eseguiva una trazione sul labbro anteriore del collo, sono stati sostituiti dalla tecnica di ingresso in vaginoscopia con la quale arrivati al fornice posteriore e riconosciuta la portio con l'OUE, la progressione all'interno del canale cervicale avviene sfruttando la dilatazione provocata dalla soluzione fisiologica, che già da tempo ha sostituito la CO2 come mezzo di distensione.
Quest'ultimo cambiamento ha permesso, oltre a sfruttare il maggior potere di distensione del mezzo liquido, di avere la possibilità di convertire l'esame diagnostico in operativo (office hysteroscopy/see and treat) senza bisogno di cambiare strumento o mezzo di distensione, infatti la formazione di bolle in presenza di gas rendevano eventuali interventi assai difficoltosi.
Questa opportunità che per molte micropatologie endocavitarie evitano alla paziente l'ingresso in sala operatoria e la immediata risoluzione del problema organico hanno sfumato il confine tra l'isteroscopia diagnostica e chirurgica, le quali in mani esperte possono trasformarsi una nell'altra.
Questi progressi tecnici nella realizzazione dell'esame, anche se non hanno significatamente migliorato il tasso già basso di isteroscopie non realizzabili senza anestesia, la percentuale è sempre stabile sul 3% dei casi, hanno ridotto sensibilmente il disconfort legato al precedente esame più invasivo, a volte solo l'introduzione dello speculo provoca una reazione fastidiosa di dolore nella paziente.
Inoltre non essendo il collo uterino sottoposto a trazioni, abbiamo registrato praticamente la scomparsa delle reazioni vagali e l'assenza completa alla fine dell'intervento del dolore scapolare
destro che ha accompagnato sempre l'esecuzione dell'isteroscopia con CO2 per la compressione del nervo frenico a livello della sua uscita dal diaframma, ora con l'uso del mezzo liquido tutto questo appartiene al passato (43-44).
4.2 Criteri diagnostici di endometrite cronica
Endometrite cronica è una condizione subclinica difficile da identificare utilizzando metodi non invasivi (25).
L'isteroscopia permette l'ispezione della superficie endometriale e la individuazione di segni di infiammazioni. Dalla isteroscopia convenzionale con CO2, l'endometrite cronica è caratterizzata per la presenza di aree endometriale arrossite con punti bianchi centrali localizzati o dispersi nella cavità, presentando un tipico “aspetto a fragola”.
Comunque, aree di endometrio rosso può essere dovuto a rotture vascolari a causa dello impiego del CO2, azioni ormonali, ipertensione, malattie immunologiche e altre cause.
Recentemente, l'utilizzo di soluzione salina come mezzo di distensione della cavità uterina è diventato più popolare che il classico CO2, in quanto non ha effetto sul micro circolo endometriale, permette una migliore distensione ed il lavaggio continuo della cavità uterina permette il galleggiamento di escrescenze endometriali.
Utilizzando l'isteroscopia con mezzo di distensione liquido, sono stati stabiliti come criteri per la diagnosi di endometrite cronica: edema stromale, iperemia focale o diffusa e presenza di micropolipi (inferiore a 1mm) (5).
Questi ultimi sono piccoli, vascolarizzati e coperti dall'endometrio e rappresentano probabilmente l'espressione di una forte e attiva reazione endometriale e rilascio massivo di interleuchine e fattori di crescita come conseguenza del processo infiammatorio che determina fenomeni proliferativi ghiandolari acquistando la mucosa forme in rilevo macroscopicamente evidenti
(21-25).
E' stata descritta una accuratezza diagnostica del 93,4% quando l' isteroscopia con mezzo di distensione liquido dimostrava un 'associazione di iperemia, edema e micropolipi, confermando l'attendibilità di questo esame in valutare quadri di endometrite cronica (5).
Capitolo 5
ISTOLOGIA
5.1 Processi infiammatori endometriali
Biopsie endometriali presentano una utilità comprovata nella diagnosi di processi infiammatori intrauterini (4). Microscopicamente osserviamo aree con infiltrato infiammatorio misto, emorragie, fibrosi irregolare, necrosi focale, congestione ed edema. La presenza di detriti cellulari nel lume delle ghiandole non è patognomonico di infezione, dovendo esistere compromissione dello stroma (2).
Linfociti, inclusive cellule natural killer e linfoidi aggregati, sono una componente normale dell'endometrio, e polimorfi sono caratteristici delle fasi premestruale e mestruale. La presenza di plasma cellula è il criterio più fortemente legato alla diagnosi di endometrite, anche se questi sono frequentemente associati alla presenza di altre cellule infiammatorie, entrambe acute e croniche, e possono essere la componente minore di questi infiltrati infiammatorie cellulare. Nella endometrite, l’infiltrato cellulare infiammatorio è focale e plasma cellule si presentano appena sotto la superficie ghiandolare dove sono facilmente identificati. Altre caratteristiche morfologiche che allertano il patologo per la possibile presenza di una endometrite includano un endometrio che presenta disturbi di maturazione – per esempio: aree focali che sono discordanti con il ciclo, edema stromale e, caratteristicamente, una alterazione cellulare fusiforme dello stroma specialmente intorno alle ghiandole. Un grado di complessità architetturale e atipia citologica può essere presente se
l'infiltrato cellulare infiammatorio è accentuato, risultando in una diagnosi erronea di iperplasia o carcinoma. Problemi nel riconoscimento delle plasma cellule possono occorrere specialmente quando il materiale istologico è scarso. Cellule stromali endometriali possono avere una apparenza simil plasmocitaria con nuclei eccentrici ed il patologo può credere che siano plasma cellule classiche. Deve essere sottolineato che in assenza di altre caratteristiche morfologiche di endometrite, una ricerca esagerata di plamacellule non è giustificata.
Plasma cellule stromali possono essere occasionalmente trovati in endometrio normale, e, in questo caso, la diagnosi di endometrite non è corretta. Plasma cellule possono essere presenti nello stroma di polipi endometriali ed anche in associazione con patologie maligne endometriali. Una variante della endometrite, chiamata “endometrite focale necrotizzante”, è stata descritta ed è caratterizzata da un infiltrato cellulare infiammatorio che include linfociti, neutrofili ed istiociti senza plasmacellule. Endometrite granulomatosa aumenta la possibilità di sarcoidosi, tubercolosi e altre malattie granulomatose (19).
Sharon et al. hanno dimostrato che plasmacellule sono presenti nell'endometrio di donne sane e che il riscontro di queste cellule isolate e poco numerose non significa la presenza di infiammazione del tratto genitale superiore (20).
Syndecan-1 è un marcatore di superficie cellulare che è espresso nella membrana cellulare di plasma cellule. E' largamente utilizzato per identificare plasma cellula in citometria di flusso. E' un membro della famiglia di superficie cellulare proteoglicana che controlla la adesione cellula-cellula, adesione cellula-matrix extracellulare, migrazione e proliferazione cellulare (18).
Investigazioni istologiche hanno dimostrato che micropolipi che sono alterazioni della superficie endometriale caratterizzata per
la presenza di piccoli polipi di misura inferiore a 1mm sono costituiti da piccole escrescenze vascolarizzate coperte da endometrio. Lo stroma dei micropolipi sono caratterizzati dall'accumoli di cellule infiammatorie (linfociti, plasma cellule o granulocitici eosinofili ) assieme a cellule stromali normali intorno a piccoli vasi e strutture ghiandolari (21).
Nella fase finale del ciclo notiamo la reazione infiammatoria diffusa per la presenza di degenerazione dello stroma e necrosi spontanee. In questa occasione osserviamo leucociti polimorfonucleati con fagocitosi, linfociti, plasma cellule ed istiociti. Non è raccomandabile la realizzazione di una biopsia per la diagnosi di endometrite cronica, in presenza di questo quadro (2).
5.2 Criteri diagnostici di endometrite cronica
Endometrite cronica è una entità istopatologica che frequentemente presenta edema stromale della mucosa superficiale, aumento della densità stromale con infiltrato leucocitario tra entrambi ghiandole ed stroma, e presenza di plasma cellule tra la sostanza dello stroma. La diagnosi di endometrite cronica può essere sospettata quando esiste una maturazione non sincronica tra ghiandola e stroma. Molti ricercatori considerano la presenza di plasma cellule nello stroma endometriale come principale criterio per la diagnosi di endometrite cronica (18).
Capitolo 6
PARTE SPERIMENTALE
6.1 Scopo dello studio
Lo scopo del nostro studio è stato identificare donne infertili con quadro isteroscopico compatibile con endometrite cronica e valutare la risposta endometriale dopo terapia antibiotica.
Un ulteriore obiettivo, come già eseguito da altri autori, è stato valutare la risposta biologica del dosaggio dell'endotossina batterica nel sangue mestruale e nel lavaggio endometriale di pazienti con infiammazione cronica dell’endometrio. A completamento della ricerca, è stata inoltre valutata la risposta istologica di campioni ottenuti attraverso biopsia endometriale eseguita subito dopo l'isteroscopia.
6.2 Materiali e metodi
6.2.1 Selezione delle pazienti
Per questo studio sono state reclutate 100 donne tra quelle afferenti al nostro Centro di Procreazione Medicalmente Assistita (PMA) in attesa di sottoporsi a tecniche di fecondazione in vitro di secondo livello. Tutte le pazienti hanno eseguito preventivamente a un esame isteroscopico.
I criteri di inclusione dello studio sono: eta' inferiore a 42 anni
valore di FSH inferiore a 12
assenza di patologia endocavitaria organica concomitante
non aver assunto antibiotici nei 30 giorni precedenti l'esame isteroscopico.
Data l'importanza di tale ricerca per le possibili ripercussioni pratiche, visto che potrebbe influenzare positivamente i risultati delle pazienti che si sottopongono a questo tipo di trattamento, sono stati dati criteri di selezione tali da avere un campione il più possibile omogeneo su cui lavorare, al fine di eseguire uno studio prospettico ed assicurare così una più alta precisione diagnostica.
6.2.2 Prelievo e stoccaggio dei campioni di sangue mestruale e lavaggio endometriale
E' stato eseguito un prelievo di sangue mestruale a tutte le paziente, entro il 3° giorno del ciclo, immediatamente prima del controllo ecografico basale. Mediante apposizione di speculum, è stato introdotto attraverso il canale cervicale un catetere uretrale Nelaton in PVC n° 10 collegato a siringa da 20 ml per l'aspirazione manuale del sangue mestruale. Il materiale ottenuto è stato trasferito in apposita provetta endotossina free, centrifugato a 3500 rpm per 10 minuti e il sovra-natante aspirato e trasferito in altro contenitore, sempre endotossina free. I campioni sono stati congelati a una temperatura di -20°C, rendendoli idonei ad una corretta conservazione ed un successivo dosaggio qualitativo e quantitativo dell'endotossina batterica.
In fase proliferativa avanzata, tra il 7° e 10° giorno del ciclo, prima dell'esecuzione dell'isteroscopia per evitare qualunque possibile fattore di contaminazione legato all'introduzione dell'isteroscopio, abbiamo eseguito un lavaggio endocavitario, allo scopo di rivalutare la carica batterica in una diversa fase del ciclo. A tal fine è stato utilizzato un catetere per isterosonografia H/S (Cooper Surgical), iniettando e riaspirando 5 ml di soluzione fisiologica sterile successivamente trasferita in una provetta
endotossina free, congelato ed inviato all'Istituto di Microbiologia dell'Università di Pisa.
Tutti i prelievi di sangue mestruale e di lavaggio della cavità uterina, conservati in appositi contenitori endotossina free, sono stati conservati. L'endotossina batterica è stata dosata solamente nelle 15 pazienti che presentavano un quadro isteroscopico di endometrite cronica. Questi campioni sono stati esaminati nel laboratorio dell'Istituto di Microbiologia della Università di Pisa, che ringraziamo sentitamente per l'attiva e stimolante collaborazione, in particolare la Prof. Emilia Ghelardi.
I campioni biologici sono stati saggiati in duplicato e diluiti 1:10 e 1:100 e il dosaggio dell'endotossina è stato eseguito utilizzando il Pyrochrome Kit, metodo endpoint dopo incubazione per 1h a 37°C. Valori entro 0,250UI/ml viene fissata dai colleghi biologi come una risposta che rientra nella fisiologia per quanto riguarda la carica batterica.
6.2.3 Isteroscopia Office
L'esplorazione della cavità uterina veniva eseguita tramite esame isteroscopico, previa vaginoscopia, utilizzando micro telescopi di 2,9 mm con camicie diagnostiche di 3,2 mm. Una accurata valutazione della superficie endometriale ci ha permesso di identificare i casi di sospetta endometrite, considerando i criteri precedentemente descritti: iperemie focali o diffuse, edema stromale e presenza di micropolipi. Quando 2 di questi criteri erano evidenti, abbiamo elaborato un sospetto di endometrite. La presenza inoltre di aderenze intracavitarie sono state considerate risultato di processo flogistico endometriale.
Dopo l'isteroscopia, è stato evidenziato un quadro macroscopico compatibile con endometrite in 15 pazienti. Le caratteristiche di questo gruppo di pazienti sono mostrate nella tabella 1.
Pazienti Età Infertilità Causa gravidanza (aa)Tempo ricerca tentativi PMAPrecedenti GravidanzaPrecedente DGK 41 maschile 3 2 ICSI no GA 36 inspiegata 2 3 IUI no LG 41 età 2 no si DS 39 tubarico 2 no geu FA 36 maschile 6 no no TIV 28 tubarico 3 no no FE 37 maschile 3 no no PE 32 tubarico 2 1 FIVET no AH 29 tubarico 3 no no BM 28 tubarico 3 no no JE 34 inspiegata 4 no no VE 40 maschile 3 2 ICSI no ASJ 41 maschile 2 no no CC 38 inspiegata 2 no no NM 34 maschile 2 1 ICSI no
Tab. 1 – Caratteristiche delle pazienti con quadro isteroscopico compatibile con endometrite cronica.
Una volta individuate le pazienti con quadro isteroscopico di endometrite cronica, sono state immediatamente sottoposte a trattamento antibiotico orale con Doxiciclina 200mg/die per 10 giorni per ciclo per tre mesi, associato a ovuli vaginali di metronidazolo. Al termine della terapia è stata eseguita un’isteroscopia di controllo al fine di valutare l’aspetto
endometriale post-terapia.
6.2.4 Biopsia endometriale
L'esame bioptico orientato è stato effettuato solamente nei casi in cui l'isteroscopia diagnostica ha evidenziato un quadro di endometrite cronica in base agli aspetti patognomonici macroscopici precedentemente descritti. L’esame istologico ci ha permesso di distinguere anche eventuali quadri disfunzionali o patologie ormono-dipendenti. Con questo scopo, è stato utilizzato il sistema di aspirazione endometriale a vacuo (Biogyn) e i campioni così prelevati sono stati inviati al Laboratorio di Anatomia Patologica, che ringraziamo la collaborazione.
6.3 Risultati
6.3.1. Incidenza dell’endometrite cronica nelle pazienti infertili
Dopo accurata valutazione sono state individuate 15 pazienti con quadro isteroscopico suggestivo di endometrite. Le caratteristiche isteroscopiche riscontrate sono mostrate nella tabella 2.
Tab. 2 – Segni isteroscopici di endometrite cronica.
Iperemia:100%, edema: 73,3%; micropolipi: 46,6%; aderenze: 13,3%.
Abbiamo riscontrato in tutte le paziente una iperemia focale o diffusa, edema stromale nel 73,3% dei casi, micropolipi nel 43,3% e presenza di aderenze endocavitarie nel 13,3%.
Pazienti Iperemia Edema Micropolipi Aderenze
DGK X X GA X X X LG X X X DS X X FA X X TIV X X FE X X PE X X AH X X X BM X X X JE X X VE X X ASJ X X CC X X NM X X X
6.3.2. Valutazione dei valori di endotossina batterica
Tutte le pazienti con quadro isteroscopico di endometrite presentavano nel sangue mestruale valori suggestivi di infezione, in quanto abbiamo rilevato valori da 0,33 ui/ml a 0,85 ui/ml (range 0,55 ui/ml).
In relazione ai campioni ottenuti con il lavaggio della cavità uterina nella prima fase del ciclo, il livello di endotossina batterica ha sempre presentato valori nei limiti della norma, cioè entro 0,25 ui/ml, il nostro range si stabilizza infatti intorno a 0,17 ui/ml apparentemente senza segni di infezione in atto (Grafico 1).
6.3.3. Valutazione istologica
Un infiltrato infiammatorio compatibile con l'endometrite è stato riscontrato in 7 casi. In 3 campioni non è stato possibile eseguire l’esame istologico, in quanto il materiale prelevato non era sufficiente per la diagnosi e in 5 casi la risposta è risultata negativa. Dopo terapia antibiotica, 3 pazienti presentavano ancora segni istologici di infiammazione (Tab. 3, Grafico 2).
Endometrite Materiale scarso Istologico nella norma Pre-terapia Post-terapia Pre-terapia Post-terapia Pre-terapia Post-terapia
7 3 3 1 5 11
Tab. 3 – Risposta istologica pre e post-terapia antibiotica.
pre-terapia
endometrite
materiale
scarso
nella
norma
post-terapia
endometrite
materiale
scarso
nella
norma
Grafico 2 – Percentuali risposta istologica pre e post-terapia antibiotica.
46.6% 20% 33.3% 6.6% 20% 73.3%
6.3.4. Valutazione isteroscopia post-terapia
Dopo 3 mesi di terapia il controllo isteroscopico ha evidenziato in 9 pazienti (60%) una completa scomparsa del quadro macroscopico compatibile con l'endometrite ed in 4 pazienti un miglioramento ben evidenziabile all'esame endoscopico (26% ). Solo in 2 casi (14%) non sono state osservate variazioni di rilievo (Tab. 4).
Nella norma Miglioramento Persistenza endometrite
9 4 2
60 % 26.6 % 13.3 %
Capitolo 7
DISCUSSIONE
7.1 Endometrite cronica nelle pazienti infertili
Dopo accurata valutazione sono state selezionate per entrare nella nostra casistica 15 pazienti con quadro isteroscopico suggestivo di endometrite.
Già questo primo risultato ci invita a soffermarci sulla alta percentuale (15%) di endometrite cronica diagnosticata sotto visione diretta, che induce a ritenere che questo tipo di patologia sia stato per troppo tempo sottovalutato dagli endoscopisti sia per la somiglianza con quadri disfunzionali, sia per l'obbiettiva mancanza di una chiara sintomatologia legata alla forma cronica.
Dobbiamo sottolineare come l'isteroscopista senza alcuna indicazione specifica dei colleghi che si occupano di PMA è portato a non soffermarsi su un quadro che necessita di una attenzione particolare per la sua diagnosi, visto che solo ultimamente i legami tra endometrio ed impianto hanno creato un interesse ed un'esperienza nuova nel settore.
Questo primo dato, confermato anche dai risultati della letteratura, ad una prima lettura enfatizza la validita' della diagnosi isteroscopica di endometrite cronica ed giustifica l'inizio di una precoce terapia antibiotica, per risolvere al più presto il problema della paziente e permetterle di accedere rapidamente alle tecniche di PMA.
I risultati ottenuti in questa prima fase, anche clinicamente ci sono parsi significativi, infatti dopo 3 mesi di terapia, il controllo isteroscopico ha evidenziato in 9 pazienti (60%) una completa scomparsa del quadro macroscopico ed in 4 pazienti un miglioramento ben evidenziabile all'esame endoscopico (26% ): solo in 2 casi (14%) non sono state osservate variazioni di rilievo (Tab. 4).
La valutazione della carica batterica endometriale è sembrato un elemento importante di screening per una patologia così subdola. Valori entro 0,250 UI/ml viene fissata dai colleghi biologi come una risposta che rientra nella fisiologia per quanto riguarda la carica batterica. Questo dato ci ha permesso una importante comparazione con i risultati dei nostri prelievi su sangue mestruale e sul lavaggio endometriale nella prima fase del ciclo: tutte le nostre pazienti con quadro isteroscopico suggestivo di endometrite presentavano nel sangue mestruale valori suggestivi di infezione: da 0,33 ui/ml a 0,85 ui/ml (range 0,55 ui/ml).
Partendo da questi primi dati il nostro iniziale entusiasmo è andato via via stemperandosi all’arrivo dei risultati relativi ai prelievi della endotossina batterica, effettuati con il lavaggio della cavità uterina nella prima fase del ciclo. I nostri risultati hanno infatti evidenziato come il lavaggio endometriale abbia sempre in tutti i casi mostrato valori nei limiti della norma, cioè entro 0,25 ui/ml (range intorno a 0,17 ui/ml) apparentemente senza segni di infezione in atto.
Altro problema in questo senso sono le risposte istologiche correlate alle nostre pazienti: un vero infiltrato infiammatorio è stato riscontrato solamente in 7 casi. Tre campioni presentano materiale insufficiente per la diagnosi e in 5 la risposta è risultata negativa.
7.2 Conclusioni
Non siamo in grado di dare conclusioni definitive a queste problematiche, che anzi ci stimolano a continuare la ricerca in questo campo e specialmente a seguire con grande attenzione l'outcome gravidico di queste pazienti, in rapporto al gruppo di controllo che al momento attuale è troppo ridotto per consentirci una qualche comparazione.
Possiamo avanzare alcune considerazioni da approfondire e sviluppare, dato che la complessità di questa ricerca si sta rivelando con l'allargarsi del nostro campo d'azione: il primo dato di fatto è come il quadro endometriale, che non appare normale e mostra significative caratteristiche macroscopiche, nella maggior parte dei casi (oltre l'80%) dopo tre cicli di terapia antibiotica torni nella norma, non mostrando più le peculiarità sopra accennate.
Un secondo punto importante è come il prelievo di sangue mestruale, durante la completa distruzione dell'endometrio, mostri la presenza costante di valori di endotossina batterica elevati e suggestivi di infezione.
Al contrario il lavaggio della cavità uterina in periodo ricostruttivo endometriale, in assenza di infezione acuta, non riesce a fornirci un tasso elevato di endotossina proprio perché siamo di fronte ad una forma cronica, che non presenta le caratteristiche dell'acuta, né da un punto di vista clinico, né sintomatologico, né macroscopico.
Legata a questa ipotesi è la negatività della biopsia endometriale in 5 casi, ritenuta da molti endoscopisti la sola diagnosi di certezza in presenza di endometrite. Anche questa convinzione, fino a poco tempo fa, ha lasciato trascurata la diagnosi diretta confidando solo nella risposta dell'esame istologico.
In queste pazienti invece il patologo che si basa per una tale diagnosi sull'infiltrato leuco-linfocitario dello stroma, in mancanza di questo, essendo l'affezione cronica, non può dare che una
risposta negativa o al massimo dubbia, riconfermando come il valore dell'isteroscopia diagnostica, in tutte le pazienti, ma soprattutto in quelle che entrano in un programma di PMA, sia da considerarsi il gold standard per la cavità uterina.
7.3 Prospettive
Verificata l'incidenza dell’endometrite cronica nelle pazienti infertili, stabilito un protocollo di trattamento, ci si propone, in prospettiva, continuando la ricerca, di confrontare l'outcome gravidico del gruppo trattato con quelle pazienti non sottoposte a terapia pur mostrando segni endoscopici di infezione cronica endometriale.
La valutazione del ruolo della endotossina batterica come mezzo di screening di un quadro di infezione endometriale cronica, potrebbe rappresentare un importante supporto clinico in vista di un miglioramento del tasso di impianto, dello sviluppo embrionario e dell'outcome gravidico.
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