Università degli Studi di Pisa
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Magistrale in Scienze della Nutrizione Umana
TESI DI LAUREA
POLIFENOLI ISOLATI DALL’OLIO EXTRA-VERGINE DI
OLIVA MODULANO L’ESPRESSIONE DI
MICRORNA CORRELATI AL PROCESSO
INFIAMMATORIO IN UN MODELLO IN VITRO DI
ADIPOCITI
Relatore
Prof.ssa Paola Nieri
Candidata
Federica Bertolotti
Correlatori
Prof.ssa Sara Carpi
Dott.ssa Beatrice Polini
2 RIASSUNTO
L’infiammazione cronica di basso grado è una caratteristica dell’obesità, e rappresen-ta un fattore critico per l’inizio, la propagazione e lo sviluppo di disordini merappresen-tabolici e stati patologici cronici, come patologie cardiovascolari, neoplastiche e neuro-degenerative, a cui può potenzialmente far seguito un elevato rischio di compromis-sione della qualità e dell’aspettativa di vita. Le abitudini alimentari possono avere un grande impatto sulla salute umana anche grazie all’influenza sui meccanismi epige-netici, ivi inclusi i microRNA (miRNA), modulatori post-trascrizionali dell’espressione genica, che nell’obesità sono stati associati a varie condizioni fisio-logiche e fisiopatofisio-logiche, tra cui infiammazione, stress ossidativo, adipogenesi, se-gnale insulinico, apoptosi e angiogenesi. L’olio extra-vergine di oliva (EVOO) rap-presenta la principale fonte lipidica della dieta mediterranea. Grazie all’apporto di a-cidi grassi monoinsaturi e di polifenoli, esso vanta importanti proprietà nutraceutiche anti-infiammatorie e antiossidanti, con un effetto protettivo verso il rischio di morta-lità e l’incidenza di patologie non trasmissibili.
Obiettivo della tesi: valutazione degli effetti del trattamento con i polifenoli
oleocan-tale, oleaceina e idrossitirosolo, estratti dall’EVOO, sui livelli di espressione di miR-155-5p, miR-34a e let-7c in adipociti umani infiammati e in esosomi isolati dal sur-natante.
Procedura sperimentale: isolamento degli esosomi dal mezzo di coltura condizionato
- estrazione dell’RNA totale, inclusi miRNA, da adipociti e da esosomi - retrotrascri-zione di miRNA e loro successiva quantificaretrotrascri-zione mediante real-time qPCR.
Risultati: il trattamento con i polifenoli modula negativamente l’espressione di
miR-155-5p e di miR-34a, e positivamente l’espressione di let-7c, sia negli adipociti che negli esosomi isolati dal surnatante, contrastando l’effetto indotto dallo stimolo pro-infiammatorio.
Conclusioni: i polifenoli oggetto di studio risultano in grado di modulare il processo
infiammatorio nel “modello di obesità” testato, attraverso la regolazione dei livelli di espressione di miR-155-5p, miR-34a e let-7c. Questo dato, evidenziando come parte del ruolo anti-infiammatorio dei polifenoli in esame, isolati dall’EVOO, sia mediata dalla loro capacità di indurre modulazioni a livello epigenetico, si inserisce a pieno in
3
quella emergente nuova branca di studio che è l’epigenetica nutrizionale o nutriepi-genetica.
4
INDICE
1.
INTRODUZIONE ... 9
1.1
Obesità: eziologia e patologie correlate ... 9
1.2
Il
tessuto
adiposo:
infiammazione
e
disfunzione
nei
soggetti obesi... 10
1.2.1
Caratteristiche e funzioni del tessuto adiposo ... 10
1.2.2
Il tessuto adiposo come “organo endocrino” ... 12
1.2.3
La disfunzione del tessuto adiposo ... 13
1.2.4
L’infiammazione e l’espansione del tessuto adiposo ... 14
1.3
MicroRNA ... 16
1.3.1
Che cosa sono i microRNA ... 16
1.3.2
La biogenesi dei microRNA ... 17
1.3.3
Il funzionamento dei microRNA ... 20
1.4
MicroRNA esosomiali ... 20
1.4.1
Gli esosomi: una classe di vescicole extracellulari ... 20
1.4.2
I microRNA extracellulari: microRNA esosomiali ... 22
1.4.3
MicroRNA esosomiali secreti da adipociti ... 24
1.5
MicroRNA e infiammazione ... 24
1.6
La dieta mediterranea e gli effetti benefici dell’olio extra-vergine
d’oliva ... 33
1.7
I polifenoli dell’olio extra-vergine d’oliva ... 35
1.7.1
Proprietà anti-infiammatorie dei polifenoli dell’olio extra-
vergine d’oliva ... 35
5
1.7.2
Oleocantale,
oleaceina,
idrossitirosolo
e
ruolo
nell’infiammazione ... 36
2.
INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE E
SCOPO DEL LAVORO ... 41
3.
MATERIALI E METODI ... 42
3.1
Scheda di trattamento ... 42
3.2
Isolamento di esosomi dal mezzo di coltura ... 43
3.3
Estrazione dell’RNA totale, inclusi microRNA, da adipociti e
da esosomi isolati dal mezzo di coltura ... 44
3.4
Retrotrascrizione di microRNA ... 50
3.5
Real-Time PCR quantitativa (qPCR) ... 53
3.6
Analisi statistica ... 57
4.
RISULTATI E DISCUSSIONE ... 58
4.1
Composti fenolici isolati dall’olio extra-vergine d’oliva modulano
i livelli di miR-155-5p negli adipociti e negli esosomi isolati dal
surnatante ... 58
4.2
Composti fenolici isolati dall’olio extra-vergine d’oliva modulano
i livelli di miR-34a-5p negli adipociti e negli esosomi isolati dal
surnatante ... 61
4.3
Composti fenolici isolati dall’olio extra-vergine d’oliva modulano
i livelli di let-7c-5p negli adipociti e negli esosomi isolati dal
surnatante ... 64
6
5.
CONCLUSIONI ... 66
6.
BIBLIOGRAFIA ... 67
7 INDICE DELLE FIGURE
Figura 1: Modello di sviluppo della disfunzione del tessuto adiposo (Blüher, 2013). ... 13 Figura 2: Meccanismi molecolari alla base dell’infiammazione del tessuto adiposo (Suganami & Ogawa, 2010). ... 16 Figura 3: Biosintesi dei microRNA (Derghal, Djelloul, Trouslard, & Mounien, 2016). ... 19 Figura 4: Produzione e secrezione di esosomi e di microvescicole (Lo Cicero et al., 2015). ... 22 Figura 5: NF-kB modula l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo e nella progressione dell'infiammazione (Liu et al., 2017). ... 26 Figura 6: Struttura chimica di composti polifenolici dell'olio extra-vergine d’oliva (Francisco et al., 2019). ... 37 Figura 7: Estrazione dell'RNA totale da cellule o tessuti mediante miRNeasy Mini Kit (miRneasy Mini Handbook 12/2014). ... 46 Figura 8: Utilizzi del miScript II RT Kit (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 51 Figura 9: Conversione selettiva di miRNA maturi in cDNA in miScript HiSpec Buffer (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 51 Figura 10: Livello soglia e valore Ct su una curva di amplificazione di real-time qPCR
(https://2wordspm.files.wordpress.com/2019/05/pcr.png?w=671&h=438&crop=1).53 Figura 11: Livelli di espressione del miR-155-5p, estratto da adipociti (A) e da esosomi isolati dal surnantante (B), in adipociti umani SGBS di controllo (ctrl),
trattati con stimolo pro-infiammatorio (TNF-) e pre-trattati con polifenoli quali
oleocantale (OC), oleaceina (OA) o idrossitirosolo (HT). *** p< 0,001, **p<0.01. 59 Figura 12: Livelli di espressione del miR-34a-5p, estratto da adipociti (A) e da esosomi isolati dal surnantante (B), in adipociti umani SGBS di controllo (ctrl),
trattati con stimolo pro-infiammatorio (TNF-) e pre-trattati con polifenoli quali
oleocantale (OC), oleaceina (OA) o idrossitirosolo (HT). *p< 0,05, **p<0.01. ... 62 Figura 13: Livelli di espressione del let-7c-5p, estratto da adipociti (A) e da esosomi isolati dal surnantante (B), in adipociti umani SGBS di controllo (ctrl), trattati con
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stimolo pro-infiammatorio (TNF-) e pre-trattati con polifenoli quali oleocantale
(OC), oleaceina (OA) o idrossitirosolo (HT). ***p< 0,001, **p<0.01. ... 65
INDICE DELLE TABELLE
Tabella 1: Classificazione di sovrappeso e obesità nei soggetti adulti in base al BMI - Linee guida di NIH e WHO (Barness et al., 2007). ... 9 Tabella 2: Contenuto del miRNeasy Mini Kit (miRneasy Mini Handbook 12/2014). ... 45 Tabella 3: Diluizioni per miScript Serum/plasma Spike-In Control (miRNeasy Serum/Plasma Handbook 02/2012)... 47 Tabella 4: Contenuto del miScript II RT Kit (miScript PCR System Handbook). .... 50 Tabella 5: Componenti per la reazione di retrotrascrizione (miScript PCR System Handbook). ... 52 Tabella 6: miScript Primer Assay (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 54 Tabella 7: miScript SYBR Green PCR Kit (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 54 Tabella 8: Configurazione della reazione per real-time PCR (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 55 Tabella 9: Programmazione del termociclatore per l’esecuzione della real-time PCR (miScript PCR System Handbook 10/2011). ... 56
9
1. INTRODUZIONE
1.1 Obesità: eziologia e patologie correlate
L’obesità è una patologia cronica caratterizzata da un accumulo eccessivo o anomalo di tessuto adiposo, che può influire negativamente sullo stato di salute, causando un incremento della morbilità e della mortalità dei pazienti affetti (World Health Orga-nization, 2000). Rappresenta uno dei più rilevanti problemi di salute pubblica a livel-lo mondiale, anche nei Paesi in via di sviluppo. Negli studi epidemiolivel-logici, l’obesità viene frequentemente definita ricorrendo all’indice di massa corporea (IMC o BMI),
ovvero il rapporto tra il peso (kg) e il quadrato dell’altezza ( della persona. Sulla
base dei criteri stabiliti dall’Ordine Mondiale della Sanità, un BMI superiore o
ugua-le a 25 kg/ indica sovrappeso, mentre un BMI superiore o uguale a 30 kg/
in-dica obesità (Tabella 1) (Vucenik & Stains, 2012).
Tabella 1: Classificazione di sovrappeso e obesità nei soggetti adulti in base al BMI - Linee guida di NIH e WHO (Barness et al., 2007).
In un contesto di fattori ambientali, sociali e genetici, la causa più frequente di au-mento ponderale patologico risulta essere uno squilibrio a lungo termine tra introito calorico, elevato, e dispendio energetico, ridotto, tendenzialmente imputabili ad abi-tudini alimentari scorrette piuttosto che ad uno stile di vita sedentario. Talvolta, que-sto squilibrio è indipendente dalla volontà del soggetto, e dovuto a vere e proprie condizioni patologiche (lesioni neurologiche, endocrinopatie e sindromi, ad esempio la sindrome di Prader-Labhart-Willi o di Alstrom), in presenza delle quali si verifica una compromissione dei sistemi che regolano il comportamento alimentare e/o la spesa energetica (Barness et al., 2007). Obesità e sovrappeso rappresentano a loro volta il principale fattore di rischio per l’insorgenza di molteplici patologie croniche,
BMI (kg/ ) Stato del peso
25-29.9 Sovrappeso
30-34.9 Obesità lieve
35-39.9 Obesità moderata
40-49.9 Obesità severa
10
non trasmissibili: patologie cardiovascolari (CVD, ad esempio ictus e infarto) (Ba-stien et al., 2014), respiratorie (apnea ostruttiva del sonno) (Lavie et al., 2007), neo-plastiche, metaboliche (resistenza insulinica - IR, diabete mellito di tipo 2 - T2DM), osteoartriti e disordini muscolo-scheletrici, steatosi epatica, colelitiasi, disturbi psico-logici e psicosociali (Vucenik & Stains, 2012). L’obesità gioca altresì un ruolo cen-trale nello sviluppo della sindrome metabolica, condizione che si caratterizza per la presenza di molteplici anomalie (obesità, T2DM, dislipidemia, ipertensione, disfun-zione endoteliale) (Barness et al., 2007). Alla luce di ciò, l’obesità ha inconfutabil-mente un impatto negativo su qualità e aspettativa di vita. Nella loro Systematic
Re-view e Meta-analisi, Flegal e colleghi confermano l’esistenza di una correlazione
di-retta tra obesità e mortalità: i soggetti con forte sovrappeso e obesi hanno tenden-zialmente una prospettiva di sopravvivenza minore, rispetto ai controlli normopeso (Flegal et al., 2013).
L’accumulo cronico di tessuto adiposo, oltre a determinare una serie di cambiamenti metabolici sfavorevoli, influenza negativamente i sistemi che modulano la risposta infiammatoria (Mathieu et al., 2009; Bastien et al., 2014).
1.2 Il tessuto adiposo: infiammazione e disfunzione nei soggetti obesi
1.2.1
Caratteristiche e funzioni del tessuto adiposo
Il tessuto adiposo è un tessuto connettivale dotato di una propria e discreta anatomia, di specifici supporti nervosi e vascolari, di una complessa citologia e di un’elevata plasticità fisiologica. Contribuisce a molti dei bisogni cruciali di sopravvivenza di un organismo: termogenesi, lattazione, risposta immunitaria e metabolismo. Si compone di vari tipi cellulari: pre-adipociti, adipociti, fibroblasti, macrofagi e altri. L’adipocita, principale cellula parenchimale presente in questo tessuto, esiste fonda-mentalmente in due tipologie, distinguibili, in termini di morfologia e di fisiologia, in adipocita bianco e adipocita bruno. Alcuni gruppi di ricerca hanno individuato un terzo tipo di adipocita, chiamato beige o “brite”, con caratteristiche intermedie. L’adipocita bianco è sferico, contiene una singola, grossa goccia lipidica, che occupa quasi il 90% del volume cellulare, ed un nucleo compresso. L’adipocita bruno
pre-11
senta una forma poligonale, un nucleo rotondeggiante, numerose gocce lipidiche ci-toplasmatiche e un’abbondante quantità di mitocondri; questi ultimi esprimono la proteina termogenina (UCP1 - uncoupling protein 1), la quale disaccoppia la fosfori-lazione ossidativa dalla sintesi di adenosina trifosfato (ATP), a favore di una produ-zione di calore. L’adipocita bianco accumula energia per le esigenze metaboliche dell’organismo, mentre l’adipocita bruno brucia gli acidi grassi per la termogenesi (Cinti, 2012).
Il tipo predominante di tessuto adiposo, comunemente chiamato “grasso” nei mam-miferi, è il tessuto adiposo bianco (WAT - white adipose tissue). I più grandi depositi di WAT si trovano nei compartimenti sottocutaneo e viscerale. Esso provvede allo stoccaggio dei trigliceridi esogeni, introdotti con l’alimentazione, ed endogeni, sinte-tizzati all’interno dell’organismo. Durante i pasti, si verifica un innalzamento della glicemia, della lipidemia e dell’insulinemia, il che stimola la lipogenesi, ovvero la sintesi, con successivo accumulo, di trigliceridi, al livello del WAT e del fegato. Al contrario, l’ipoglicemia e l’ipoinsulinemia, durante il digiuno, stimolano la glicoge-nolisi epatica e la lipolisi, attraverso l’attivazione del sistema nervoso simpatico e l’aumentato rilascio di glucagone, epinefrina e glucocorticoidi. In queste circostanze, il glucosio viene destinato al metabolismo degli organi vitali, primo tra tutti il cervel-lo, mentre gli acidi grassi, rilasciati dal WAT, vengono parzialmente ossidati da fega-to e muscoli per ricavare substrati energetici da destinare alla chefega-togenesi: i risultanti corpi chetonici rappresentano infatti carburante energetico alternativo sia per il cer-vello che per gli organi periferici (Ahima, 2006).
Il WAT rappresenta pertanto il sito preferenziale di deposito energetico in condizioni di surplus calorico, in quanto l’organismo vi può efficientemente attingere per soddi-sfare la richiesta di energia in momenti di particolare necessità (fame, digiuno pro-lungato, esercizio fisico intenso ecc.) (Bluher, 2016).
12
1.2.2
Il tessuto adiposo come “organo endocrino”
La classica percezione del tessuto adiposo come riserva di acidi grassi è stata tuttavia superata. L’evidenza scientifica dimostra che esso può essere funzionalmente equipa-rato ad un organo endocrino. Oltre ad avere un ruolo prominente nel metabolismo energetico, gli adipociti e le altre cellule del tessuto adiposo secernono molecole a-venti una funzione regolatoria, quali ormoni peptidici (adipochine), lipidi bioattivi (lipochine) e molecole di RNA. Le adipochine, in particolare, intervengono nella re-golazione di svariati processi biologici: risposta immunitaria (adipsina, fattore del complemento D, proteina stimolante l’acilazione - ASP), appetito e sazietà (leptina, adiponectina), distribuzione dell’adipe, sensibilità e secrezione insulinica (leptina, adiponectina, fattore di crescita dei fibroblasti 21 - FGF21), spesa energetica, in-fiammazione (interleuchina-1β/IL-1β, interleuchina-6/IL-6, fattore di necrosi tumora-le-α/TNF-α, proteina chemioattrattante i monociti-1/MCP-1), pressione sanguigna (angiotensinogeno), emostasi (inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1/PAI-1) e funzione endoteliale (fattore di crescita dell’endotelio vascolare/VEGF). Contribui-scono a modulare l’adipogenesi (proliferazione e differenziamento dei pre-adipociti in adipociti maturi), la migrazione delle cellule immunitarie all’interno del tessuto adiposo e il metabolismo degli adipociti, espletando la loro azione in modo autocri-no, paracrino o endocrino: hanno infatti significativi effetti sistemici a livello di vari organi bersaglio, tra cui cervello, fegato, muscolo, endotelio, cuore, cute e pancreas (Blüher, 2013; Blüher & Mantzoros, 2015; Scheja & Heeren, 2019).
Sebbene sia universalmente accettato che l’obesità contribuisce al rischio di svilup-pare T2DM, dislipidemia, infiammazione cronica subclinica, CVD e altre compli-canze, sono le differenze individuali (composizione corporea, distribuzione della massa grassa, funzione del tessuto adiposo) ad aumentare la predisposizione all’insorgenza di tali comorbidità. Si osserva che gli individui con obesità periferica, ad esempio con accumulo di grasso sottocutaneo, hanno un rischio minore o nullo di presentare le complicanze mediche associate all’obesità rispetto ai soggetti con obe-sità centrale o viscerale (Blüher, 2013).
13
1.2.3
La disfunzione del tessuto adiposo
La disfunzione del tessuto adiposo può occorrere in condizioni di bilancio energetico positivo cronico in pazienti con una ridotta capacità di espansione del grasso sottocu-taneo (Figura 1). Si è infatti dimostrato che questo è maggiormente in grado di e-spandere la propria rete capillare rispetto all’adipe viscerale. Con l’accumulo del grasso, questa capacità diminuisce: la ridotta angiogenesi al livello del grasso sotto-cutaneo correla con l’IR, il che suggerisce un suo potenziale contributo alla patoge-nesi di malattie metaboliche in genere (Gealekman et al., 2011). L’incapacità di ac-cumulare le calorie in eccesso nel tessuto adiposo sottocutaneo porta ad un accumulo di grasso al livello dei depositi viscerali e di siti ectopici, primi tra tutti fegato e mu-scolo scheletrico (Stefan, 2008). Conseguentemente, si attivano meccanismi respon-sabili, in ultima istanza, della disfunzione del tessuto adiposo: ipertrofia degli adipo-citi, ipossia tissutale, stress ossidativo tissutale, autofagia, apoptosi, maggiore infil-trazione di cellule immunitarie, cambiamenti nell’espressione genica tissutale ed in-fiammazione.
14
In questo contesto, la secrezione di adipochine risulta significativamente sbilanciata verso un modello pro-infiammatorio, aterogenico e diabetogenico, il che verosimil-mente stabilisce un legame tra la disfunzione del tessuto adiposo e l’insorgenza di IR e CVD (Van Gaal et al., 2006; Blüher, 2013).
1.2.4
L’infiammazione e l’espansione del tessuto adiposo
L’infiammazione cronica del WAT è strettamente correlata all’obesità (Bluher, 2016). Nonostante questo, non tutti gli individui con obesità sviluppano un’infiammazione tissutale rilevante. I pazienti con obesità insulino-resistente pre-sentano un maggior numero di macrofagi nell’adipe viscerale rispetto ai pazienti con obesità insulino-sensibile: ciò suggerisce che l’associazione tra infiammazione tissu-tale e IR non è primariamente legata alla massa grassa totissu-tale o al BMI, bensì all’infiammazione del tessuto adiposo viscerale (Klöting et al., 2010; Bluher, 2016). Un eccessivo introito calorico favorisce in primo luogo l’accumulo di lipidi e l’ipertrofia degli adipociti. Quest’ultima dà inizio ad uno stato di stress cellulare, che a sua volta induce l’attivazione di chinasi, ad esempio JNK (Jun N-terminal kinase), e fattori di trascrizione, ad esempio NF-kB (Nuclear Factor k chain transcription in
B cells), rispettivamente impegnati nella fosforilazione di proteine e in eventi
trascri-zionali (Bluher, 2016). NF-kB è uno dei principali protagonisti del processo infiam-matorio. Appartiene ad una famiglia di fattori di trascrizione inducibili, i quali vanno a regolare l’espressione di molteplici geni, inclusi geni codificanti chemochine, cito-chine e molecole di adesione endoteliale, coinvolti in vari processi di risposta immu-nitaria e infiammatoria (Liu et al., 2017). NF-kB è noto essere implicato nell’insorgenza e nella progressione di malattie metaboliche connesse ad infiamma-zione e disfuninfiamma-zione del tessuto adiposo (Baker et al., 2011). In risposta ai cambia-menti a carico dell’espressione genica, adipociti, cellule endoteliali ed immunitarie, presenti nel tessuto adiposo, iniziano a produrre citochine pro-infiammatorie, mole-cole di adesione endoteliale, mediatori pro-aterogenici e chemiotattici (IL-6, TNF-α, IL-1β, MCP-1, PAI-1, progranulina, camerina e altri), mentre la produzione e secre-zione di mediatori anti-infiammatori ed insulino-sensibilizzanti (adiponectina, inter-leuchina-10/IL-10) percettibilmente diminuisce (Figura 2). Molecole chemioattrat-tanti legano integrine e recettori di chemochine su monociti per stimolarne la
migra-15
zione dal circolo ematico verso il tessuto adiposo, dove si differenziano in macrofagi. La proliferazione in loco dei macrofagi, e la loro successiva migrazione all’esterno del tessuto adiposo, contribuiscono al mantenimento dell’infiammazione tissutale sia locale che sistemica, in quanto anch’essi producono e secernono i medesimi mediato-ri pro-infiammatomediato-ri: i macrofagi infatti sviluppano un fenotipo pro-infiammatomediato-rio (M1), idoneo a produrre fattori che sollecitano lo stato infiammatorio metabolico cronico e l’IR (Lumeng et al., 2007; Haase et al., 2014; Bluher, 2016). Gli adipociti, ipertrofici, rilasciano una maggiore quantità di acidi grassi saturi (SFA), i quali si le-gano al Toll Like Receptor-4 (TLR-4), espresso sui macrofagi, inducendo l'attivazio-ne di NF-kB (Suganami et al., 2007; Hajer et al., 2008). In risposta, i macrofagi pro-ducono una maggiore quantità di TNF-α, il quale attiva gli adipociti umani in vitro, modulando in positivo l'espressione di varie proteine, ad esempio ICAM-1 (molecola di adesione cellulare intercellulare-1), IL-6, MCP-1 (Permana et al., 2006; Hajer et al., 2008). ICAM-1 e MCP-1 stimolano ulteriormente l’extravasazione dei monociti verso il tessuto adiposo e la loro differenziazione in macrofagi. Questo loop paracri-no, che coinvolge SFA da adipociti e TNF-α da macrofagi, evolve verso un vero e proprio circolo vizioso, che conduce all’infiammazione di entrambi i tipi cellulari. In aggiunta, gli adipociti ipertrofici producono una minore quantità di adiponectina, la quale, in condizioni fisiologiche, inibisce l’attività di NF-kB TLR-indotta. Per assi-curare un adeguato apporto di nutrienti e ossigeno, nonché il trasporto di SFA e adi-pochine, è obbligatoria un’estensione della microcircolazione. L’adipogenesi e l’angiogenesi sono due processi strettamente correlati durante l’espansione del tessu-to adiposo. In occasione dell’ipertrofia adipocitaria, uno statessu-to di ipoperfusione può infatti determinare ipossia tissutale. Di conseguenza, aumenta l’espressione di fattori di trascrizione ipossia-indotti, i quali potenziano l’espressione di fattori pro-angiogenici (VEGF, PAI-1). Questi inibiscono la trascrizione del gene dell’adiponectina, come dimostrato nei topi obesi, nei quali si osservano una dimi-nuita attività di PPAR-γ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), una ridotta stabilità dell’mRNA dell’adiponectina e una riduzione dei suoi livelli circo-lanti (Hajer et al., 2008).
16
Lo sviluppo dell’adiposità ha pertanto luogo a partire da un esteso rimodellamento del tessuto adiposo, e dipende dall’interazione coordinata tra ipertrofia ed iperplasia (aumento del numero di adipociti) (Ortega et al., 2010; Hepler & Gupta, 2017). Per comprendere meglio questo fenomeno, molti studi si sono focalizzati sui regolatori che modulano la proliferazione e la differenziazione dei pre-adipociti. Entrambi i processi sono strettamente controllati, in positivo e in negativo, da una combinazione di fattori di trascrizione; tra questi, emergono i microRNA (Ortega et al., 2010).
1.3 MicroRNA
1.3.1
Che cosa sono i microRNA
I microRNA (miRNA) costituiscono una classe di piccole molecole di RNA non-codificanti proteine, aventi sequenze lunghe circa 22 nucleotidi, altamente conserva-te. Regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale in duplice modo: pos-sono sopprimere la sintesi proteica inibendo la traduzione dell’RNA messaggero
Figura 2: Meccanismi molecolari alla base dell’infiammazione del tessuto adi-poso (Suganami & Ogawa, 2010).
17
(mRNA), oppure possono promuovere la degradazione dell’mRNA stesso, il che si traduce in un silenziamento dell’espressione genica (Urbich et al., 2008). I miRNA sono stati individuati per la prima volta nel 1993, quando Lee e colleghi scoprirono che il gene lin-4, controllore del tempo di sviluppo delle larve di Caenorhabditis
ele-gans, codificava per due piccole molecole di RNA (22 e 61 nucleotidi circa), anziché
per una proteina: questi, sfruttando una complementarietà di sequenza, erano in gra-do di modulare negativamente l’espressione della proteina LIN-14, diminuengra-done i livelli fin dal primo stadio larvale (R. C. Lee et al., 1993). La ricerca ha quindi rivol-to ai miRNA un’attenzione crescente nel momenrivol-to in cui sono stati individuati in al-tre specie animali, inclusi i mammiferi (Lagos-Quintana, 2001), ed è stato scoperto il loro ruolo nelle patologie umane (Calin et al., 2002).
1.3.2
La biogenesi dei microRNA
La trascrizione dei miRNA dipende sia dalla localizzazione delle loro sequenze geni-che, sia dal gene ospite. Le sequenze geniche possono essere situate all’interno di in-troni di geni codificanti o non-codificanti, oppure all’interno di esoni (Urbich et al., 2008). Si stima che circa il 50% dei miRNA, espressi nel genoma umano, sia trascrit-to da geni non-codificanti, e che la percentuale restante sia trascritta da geni localiz-zati in introni di geni codificanti (Ardekani & Naeini, 2010). In aggiunta, i miRNA che possiedono un promotore genico proprio sono espressi in maniera indipendente, mentre i miRNA organizzati in clusters condividono la stessa regolazione trascrizio-nale (Urbich et al., 2008). Si è tuttavia dimostrato che i geni dei miRNA hanno mol-teplici siti di inizio trascrizione (Ozsolak et al., 2008), e che i promotori dei miRNA intronici sono talvolta distinti da quelli dei geni ospitanti (Monteys et al., 2010; Ha & Kim, 2014).
La trascrizione di queste molecole è effettuata da una RNA Polimerasi II (Figura 3), e controllata, in positivo o in negativo, da fattori di trascrizione RNA Polimerasi II-associati (proteina tumorale 53/p53, MYC/v-myc avian myelocytomatosis viral
onco-gene homolog, ZEB1 e ZEB2/Zinc finger E-box-binding homeobox 1 e 2 e altri) e da
meccanismi epigenetici (metilazione del DNA, modificazione istonica) (Ha & Kim, 2014). Il miRNA primario (pri-miRNA) è un lungo trascritto che contiene una
strut-18
tura a stem-loop (33-35 paia di basi) a doppio filamento, nella quale è incorporata la sequenza del miRNA maturo. Il pri-miRNA è sottoposto a vari step di maturazione (Y. Lee, 2002), in cui intervengono due endonucleasi appartenenti alla famiglia delle RNasi III, Drosha e Dicer, le quali operano selettivamente solo su RNA a doppio fi-lamento (ds-RNA) (Ha & Kim, 2014). Nel nucleo, il pri-miRNA viene processato da un complesso detto “microprocessore”, formato da Drosha e dal suo cofattore essen-ziale DGCR8 (anche chiamato Pasha in Drosophila melanogaster). Drosha taglia il pri-miRNA in modo tale da liberare una piccola molecola di RNA (circa 65 nucleoti-di) a forma di tornante, chiamato pre-miRNA (Yoontae Lee et al., 2003; Ha & Kim, 2014). Questo viene esportato nel citosol, dove la sua maturazione può essere ultima-ta. La proteina esportina 5 (EXP5) forma un complesso di trasporto con la proteina nucleare RAN (RAs-related Nuclear protein), legata ad una molecola di GTP, e il pre-miRNA a livello della membrana nucleare (Bohnsack, 2004; Ha & Kim, 2014). Avvenuta la traslocazione, la molecola di GTP è idrolizzata, il complesso si disas-sembla e il pre-miRNA viene rilasciato nel citosol per essere ulteriormente processa-to da Dicer. Dicer effettua il taglio in prossimità del loop terminale, e libera un picco-lo ds-RNA/RNA duplex (circa 22 coppie di basi) (Grishok et al., 2001; Ha & Kim, 2014). La direzionalità del filamento del miRNA determina il nome del miRNA ma-turo: il filamento 5p e il filamento 3p hanno origine rispettivamente dall’estremità 5’ e 3’ della forcina del pre-miRNA. Per espletare la propria funzione regolatoria in termini di silenziamento genico post-trascrizionale, il miRNA duplex si associa ad una proteina appartenente alla famiglia delle Argonauta (Ago1-4 nell’essere umano): entrambi i filamenti possono essere caricarti sulle proteine AGO, in una maniera ATP-dipendente. Per ogni miRNA, la proporzione di caricamento 5p-3p varia in base al tipo cellulare o all’ambiente cellulare: in alcuni casi si ha una proporzione equa, in altri predomina uno dei due filamenti. La selezione del filamento “guida” dipende dalla stabilità termodinamica e dal nucleotide in posizione 1 all’estremità 5’ del duplex. Generalmente, la scelta ricade sul filamento con la minore stabilità o la pre-senza di un uracile (U) all’estremità 5’. Il filamento non caricato, detto filamento “passeggero”, viene srotolato dal filamento guida mediante meccanismi basati sul grado di complementarietà. L’associazione duplex-AGO dà origine al precursore del complesso di silenziamento RNA-indotto (pre-RISC). Nel momento in cui il filamen-to passeggero viene degradafilamen-to da una nucleasi, si ottiene il RISC maturo (miRISC), il
19
quale contiene al suo interno un miRNA funzionale a singolo filamento (O’Brien et al., 2018). Si è tuttavia dimostrato che molti filamenti passeggeri, anziché essere de-gradati, hanno accesso ai complessi di silenziamento e modulano l’espressione di va-ri target (Okamura et al., 2008).
Il RISC guida il miRNA verso l’mRNA target. Il grado di complementarietà miR-NA-mRNA stabilisce lo step successivo: (1) degradazione del bersaglio in caso di e-levato grado di complementarietà, (2) repressione traduzionale in caso di basso grado di complementarietà (Lewis et al., 2003; Urbich et al., 2008).
Figura 3: Biosintesi dei microRNA (Derghal, Djelloul, Trouslard, & Mounien, 2016).
20
1.3.3
Il funzionamento dei microRNA
I bersagli di un singolo miRNA possono essere predetti individuando nella regione 3’ UTR (untraslated region) dell’mRNA target una sequenza di 6-8 nucleotidi in grado di appaiarsi alla regione 5’ del miRNA (Friedman et al., 2008). Tuttavia, è stato di-mostrato che l’interazione può potenzialmente avvenire ovunque lungo il filamento del messaggero (Landrier et al., 2019). Essendo questa sequenza molto corta e alta-mente conservata, ogni singolo miRNA vanta centinaia di bersagli: nel complesso, questa classe di molecole interviene nella modulazione di un ampio range di geni codificanti proteine nell’essere umano (Friedman et al., 2008; Jonas & Izaurralde, 2015). Pertanto, i miRNA negli animali sono coinvolti in svariati processi di svilup-po, quali metabolismo, crescita, proliferazione e differenziazione cellulare, apoptosi, differenziamento muscolare, morfogenesi cerebrale e altri (Ardekani & Naeini, 2010). Considerando l’importanza dei miRNA nella regolazione genica, soprattutto nell’ambito dei processi di sviluppo, e la loro numerosità (nel genoma umano sono stati identificati circa 1500 miRNA), non sorprende la scoperta di un loro potenziale coinvolgimento nelle patologie umane. Sono molti i lavori scientifici che descrivono l’associazione tra un’alterata espressione di miRNA e l’insorgenza di malattie anche clinicamente molto rilevanti (cardiovascolari, neoplastiche, infiammatorie, autoim-muni, neuro-evolutive e altre) (Hesse & Arenz, 2014).
1.4 MicroRNA esosomiali
1.4.1
Gli esosomi: una classe di vescicole extracellulari
Le cellule possono secernere vari tipi di vescicole extracellulari (EVs) delimitate da membrana: si tratta di un sistema altamente conservato, finalizzato, in taluni casi, alla comunicazione intercellulare (cell-to-cell). Le EVs sono classificate, in base alla loro dimensione e biogenesi, in: esosomi, microvescicole e corpi apoptotici (Lo Cicero et al., 2015; Kim et al., 2017). Sono state individuate in fluidi corporei facilmente ac-cessibili (sangue, saliva, urina), il che le rende interessanti e rilevanti fonti di bio-marcatori diagnostici e prognostici (Gupta et al., 2010; Michael et al., 2010; Kim et al., 2017). Possono trasportare vari tipi di molecole (acidi nucleici, lipidi bioattivi,
21
proteine), le quali, grazie alla presenza della membrana, risultano protette dall’ambiente circostante (attacco di nucleasi e proteasi, fluttuazioni di pH e di osmo-larità, e altri fattori ambientali) (Cheng et al., 2014; Kim et al., 2017).
Gli esosomi sono vescicole extracellulari di origine endosomiale, aventi un diametro
di circa 0.04-0.15 m e pertanto rilevabili solo mediante microscopia elettronica.
Corrispondono alle vescicole intraluminali (ILVs) di corpi/endosomi multivescicolari intracellulari (MVBs/MVEs): si formano all’interno di MVBs per invaginazione del-la membrana delimitante, con conseguente sequestro di una piccodel-la porzione di cito-sol, e vengono rilasciati in maniera esocitotica, previa fusione dei MVBs con la membrana plasmatica (Figura 4) (Lo Cicero et al., 2015; Kim et al., 2017). Appaio-no con una caratteristica morfologia cup-shaped dopo colorazione negativa, oppure come vescicole rotondeggianti ben delimitate in seguito ad osservazione mediante microscopia a trasmissione e crioelettronica. La loro identificazione è agevolata, ol-tre che dalla morfologia, anche da un corredo unico di lipidi e proteine. Come conse-guenza della loro origine, quasi tutti gli esosomi contengono vari tipi di proteine: proteine coinvolte nel trasporto e nella fusione di membrana (Rab-GTPasi, annessi-ne, flotillin), nella biogenesi di MVBs (alix e TSG101 - Tumor susceptibility gene
101), nei processi che richiedono proteine dello shock termico (Hsp70 e 90 - heat shock protein 70 e 90), integrine e tetraspanine (CD63, CD9, CD81, CD82 - cluster
di differenziazione 63, 9, 81, 82). Sebbene alcune delle proteine menzionate siano fi-siologicamente abbondanti nella cellula, altre rivestono il ruolo di veri e propri mar-catori proteici esosomiali (alix, flotillin, TSG101, CD63), essendone gli esosomi par-ticolarmente arricchiti. Accanto alla frazione proteica, negli esosomi si rileva anche un’importante quantità di lipidi, quali colesterolo, sfingolipidi, ceramide e glicerofo-sfolipidi. Ai fini della formazione delle ILVs, si ha la segregazione laterale di mole-cole sul lato interno della membrana dell’endosoma, alla quale fanno seguito la for-mazione e il rilascio di un germoglio vescicolare nel lume endosomiale. È largamen-te apprezzato il coinvolgimento di ESCRT (Endosomal Sorting Complex Responsible
for Transport), sebbene alcuni studi dimostrino l’arruolamento di molecole diverse
(ceramide e tetraspanine), e quindi una formazione esosomiale ESCRT-indipendente. Sono stati proposti anche altri meccanismi biogenetici degli esosomi, i quali preve-dono la formazione vescicolare direttamente a livello di specifici domini di
membra-22
na plasmatica, definiti da alcuni autori “domini di tipo endosomiale” (Booth et al., 2006; Simons & Raposo, 2009). Gli esosomi possono essere potenzialmente rilasciati da quasi tutti i tipi cellulari (linfociti T e B, cellule dendritiche, epiteliali, tumorali, reticolociti, mastociti), e possono destinare il contenuto che trasportano a cellule ri-ceventi sia vicine (trasferimento orizzontale) che distanti, ricorrendo a differenti meccanismi di interazione: (1) interazione con un recettore di membrana, (2) fusione con la membrana della cellula bersaglio, (3) internalizzazione mediante endocitosi (Valadi et al., 2007).
1.4.2
I microRNA extracellulari: microRNA esosomiali
Il trasferimento orizzontale di miRNA secreti da cellule rappresenta una forma alter-nativa di comunicazione cell-to-cell, annoverabile tra altri meccanismi già noti (con-tatto mediante adesione, giunzioni cellulari, messaggeri solubili). Si tratta di un mec-canismo di recente scoperta, con cui una cellula donatrice è potenzialmente in grado di influenzare l’espressione genica di una cellula ricevente, modificandone il fenoti-po. I miRNA extracellulari sono stati rilevati nei fluidi corporei umani (circolo ema-tico periferico, urina, saliva, latte) in concentrazioni, tavolta, significativamente alte-Figura 4: Produzione e secrezione di esosomi e di microvescicole (Lo Cicero et al., 2015).
23
rate in un ampio range di condizioni patologiche, inclusi alcuni tipi di cancro, diabe-te, CVD e lesioni tissutali (epatiche, cerebrali). Sebbene la fonte di queste molecole circolanti non sia nota, sono stati suggeriti tre possibili eventi: (1) rilascio passivo da cellule, conseguente alla rottura della membrana plasmatica a causa di lesione tissu-tale, infiammazione cronica, apoptosi o necrosi, oppure rilascio da cellule con una breve emivita (piastrine); (2) secrezione attiva, richiedente energia, attraverso micro-vescicole, rilasciate da quasi tutti i tipi cellulari in condizioni sia fisiologiche che pa-tologiche; (3) secrezione attiva che non prevede l’impiego di microvescicole, bensì di RNbingind proteins (RBP), ad esempio HDL (high-density lipoproteins) e A-GO2 (proteina Argonauta 2). Il legame con le RBP e l’incorporazione all’interno di EVs proteggono i miRNA dall’attacco di nucleasi extracellulari, rendendoli estre-mamente stabili (Turchinovich et al., 2011; X. Chen et al., 2012). Sulla base dell’evidenza scientifica, l’impacchettamento di specifiche popolazioni di miRNA sembra essere un processo non casuale, ma anzi selettivo. È ad esempio verosimile che alcuni componenti del RISC, quali GW182 (Glycine-Tryptophan Protein Of 182
KDa) e AGO2, essendo stati rilevati negli esosomi, siano coinvolti in questo evento.
Inoltre, un pathway ceramide-dipendente controlla l’incorporazione dei miRNA negli esosomi, impedendo l’impacchettamento nelle HDL. I miRNA secreti in EVs posso-no essere introdotti nella cellula bersaglio mediante internalizzazione della microve-scicola per endocitosi, fagocitosi o fusione diretta con la membrana plasmatica, men-tre i miRNA circolanti associati a RBP vengono incorporati previa interazione con uno specifico recettore di membrana. Avvenuta l’internalizzazione, i miRNA agisco-no nella cellula ricevente come molecole fisiologicamente funzionali, ed effettuaagisco-no il silenziamento genico attraverso lo stesso meccanismo dei miRNA endogeni: dal momento che più miRNA possono essere incorporati in una sola volta, più bersagli genici possono essere modulati contemporaneamente (X. Chen et al., 2012).
Data la crescente evidenza derivante da EVs in un contesto di patologie tumorali ed altri processi, il raggio d’azione dei miRNA secreti in microvescicole è stato esteso a possibili funzioni autonome, non cellulari, e a meccanismi d’azione di silenziamento genico differenti da quello canonico. Ad esempio, alcuni miRNA extracellulari, tra cui let-7b, hanno effetti su vie di segnalazione mediate dal Toll-like receptor-7
(TLR-24
7), e, attraverso l’attivazione di questo recettore, promuovono depolarizzazione neu-ronale o risposta infiammatoria (Fabbri et al., 2012; Iftikhar & Carney, 2016).
1.4.3
MicroRNA esosomiali secreti da adipociti
Qualsiasi deposito di tessuto adiposo è un’importante fonte di miRNA esosomiali circolanti, nel topo come nell’uomo: questi miRNA possono regolare l’espressione genica e il metabolismo anche in tessuti distanti, funzionando come una nuova classe di adipochine. Essendo un prodotto del tessuto adiposo, i loro livelli circolanti sono soggetti a fluttuazioni, anche rilevanti, in caso di stati patologici in cui si riscontrino un’alterazione della massa grassa (obesità, lipodistrofia) oppure un’alterata distribu-zione e fundistribu-zione dell’adipe (diabete, invecchiamento). Anche i miRNA esosomiali tessuto adiposo-derivati funzionano come “molecole segnale” nella comunicazione
cell-to-cell. Con questa strategia, il tessuto adiposo può modulare l’espressione di
geni situati in altri organi (ad esempio si è dimostrato che miRNA secreti dal tessuto adiposo hanno effetto sui livelli di FGF21, coinvolto nell’omeostasi del glucosio), predisponendo l’insorgenza di stati patologici (Thomou et al., 2017).
1.5 MicroRNA e infiammazione
Molti studi hanno evidenziato un’associazione tra i miRNA e il processo infiammato-rio nelle malattie metaboliche. Durante questo fenomeno, geni codificanti proteine possono essere regolati a livello trascrizionale da miRNA la cui trascrizione può es-sere indotta dall’infiammazione stessa. I miRNA diventano rapidamente attivi, in quanto non necessitano di essere tradotti o traslocati nel nucleo per effettuare la re-pressione dei target. Alcune proteine, tra cui quelle coinvolte nella risposta infiam-matoria, possono regolare l’espressione dei miRNA. A loro volta, i miRNA possono modulare svariati meccanismi coinvolti nell’inizio e nella risoluzione di tale risposta, ad esempio stress ossidativo, attivazione macrofagica, adipogenesi e altri (Quintanil-ha et al., 2017). I miRNA sono espressi nelle cellule immunitarie, e, poiché modula-no l’espressione di proteine coinvolte nella regolazione del processo infiammatorio, influenzano inevitabilmente l’entità della risposta infiammatoria stessa. I TLRs, e-spressi dalle cellule del sistema immunitario (macrofagi, cellule dendritiche), nonché
25
da altre cellule “sentinella” (cellule epiteliali), hanno un importante ruolo nell’individuazione degli organismi patogeni e nell’esordio della risposta infiamma-toria. Una disregolazione del processo TLR-mediato è un tratto caratteristico di pato-logie infiammatorie e autoimmuni: alcuni miRNA risultano essere coinvolti nella re-golazione di vie di segnalazione intracellulare attivate dal TLR (ad esempio i
pa-thways di NF-kB e di MAPK/mitogen-activated protein kinase) e di vie
dell’immunità innata (O’Neill et al., 2011). In seguito all’esposizione a stimoli in-fiammatori, nelle cellule immunitarie si attivano segnali indirizzati al nucleo, il che porta a dinamici cambiamenti trascrizionali. Questo fenomeno culmina con la up/down-regolazione di centinaia di geni coinvolti nella risposta immunitaria: viene modulata l’espressione sia di geni codificanti proteine, sia di miRNA. Sebbene i cambiamenti a carico dell’espressione dei miRNA durante l’infiammazione siano controllati a livello trascrizionale, si può sostenere, sulla base dell’evidenza scientifi-ca, che anche alcune proteine regolatorie, coinvolte nella biogenesi dei miRNA, sia-no interessate dal processo infiammatorio (p53, Smad - Small mother against
deca-pentaplegic, KSRP/K-homology splicing regulatory protein, Dicer): è pertanto
vero-simile presupporre un loro coinvolgimento in caso di alterata espressione dei miRNA (Ryan M. O’Connell et al., 2012).
Recentemente si è scoperto che molti miRNA partecipano alla regolazione dello svi-luppo e del metabolismo del tessuto adiposo, della secrezione e dell’azione insulini-ca, per cui un loro squilibrio gioca un ruolo importante nello sviluppo di obesità e di complicanze mediche ad essa associate. In qualità di modulatori post-trascrizionali dell’espressione genica, infatti, i miRNA possono regolare l’espressione di citochine (TNF-α, IL-6 e altre) e chemochine (MCP-1 e altre) pro-infiammatorie prodotte dal tessuto adiposo. Di conseguenza, un’alterata espressione di miRNA è correlabile ad un’alterata espressione di mediatori pro-infiammatori tessuto adiposo-derivati, con complicanze a livello sistemico (Karkeni et al., 2016; Landrier et al., 2019).
Nonostante siano molti i miRNA presenti nel tessuto adiposo, solo l’espressione di alcuni risulta essere alterata nei soggetti obesi (Arner & Kulyté, 2015). Tra questi, troviamo miR-155 (Karkeni et al., 2016), miR-34a (Lavery et al., 2016) e let-7
26
(Hsieh et al., 2015), i quali risultano essere coinvolti nella risposta infiammatoria e collegati al pathway di NF-kB.
NF-kB identifica una famiglia di fattori di trascrizione che regola numerosi geni coinvolti in molteplici processi della risposta immunitaria e infiammatoria (Figura 5).
La famiglia si compone di 5 membri strutturalmente imparentati: kB1 (p50), NF-kB2 (p52), RelA (p65), RelB e c-Rel, il quale media la trascrizione dei geni target at-traverso il legame a kB enhancer, specifico elemento del DNA. In condizioni fisio-logiche, NF-kB è sequestrato nel citoplasma da inibitori, inclusi i membri della fami-glia di IkB. L’attivazione di NF-kB coinvolge due principali vie di segnalazione in-tracellulare: una canonica e una non-canonica (o alternativa), entrambe importanti per regolare la risposta infiammatoria e immunitaria. La via canonica risponde alla stimolazione di recettori di citochine, di cellule T (TCR) e B (BCR), della superfa-miglia di TNF (TNFR), e alla stimolazione di PRRs (pattern-recognition receptors,
nei mammiferi, ad esempio TLRs). Il principale meccanismo dell’attivazione
canoni-ca di NF-kB è la degradazione inducibile di IkBα (inibitore), mediante fosforilazione sito-specifica da parte della chinasi IKK (IkB kinase), formata da 2 subunità
cataliti-Figura 5: NF-kB modula l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo e nella progressione dell'infiammazione (Liu et al., 2017).
27
che (IKKα e IKKβ) e da una subunità regolatoria (IKKγ). IKK può essere attivata da citochine, fattori di crescita, mitogeni, componenti microbici, agenti stressori. Nel momento in cui IkBα viene fosforilata, subisce degradazione ubiquitina-dipendente nel proteasoma, il che favorisce la rapida e transiente traslocazione nucleare di NF-kB, in particolare dei dimeri p50/RelA e p50/c-Rel. La via di attivazione non-canonica di NF-kB, al contrario, risponde selettivamente ad uno specifico gruppo di stimoli (ligandi di un sottogruppo di TNFR, ad esempio RANK - receptor activator
of nuclear factor κ B, CD40 - cluster di differenziazione 40, BAFFR/B-cell activa-ting factor receptor). Una molecola di segnalazione centrale in questo pathway è
NIK (NF-kB-inducing kinase): NIK attiva IKKα e coopera funzionalmente con essa per mediare la fosforilazione di p100 (precursore di p52), la quale, a sua volta, indu-ce l’ubiquitinazione e il proindu-cessamento della proteina stessa. Tale proindu-cessamento in-clude la degradazione della struttura C-terminale IkB-simile di p100, con conseguen-te generazione di p52 e traslocazione nucleare del dimero non-canonico p52/RelB (T. Liu et al., 2017).
I miRNA oggetto di studio sono stati strettamente correlati all’infiammazione obesi-tà-associata in vitro (Karkeni et al., 2016), nell’animale in vivo (Zhuang et al., 2012) e in trials clinici (Arner & Kulyté, 2015).
MiR-155-5p nell’infiammazione
MiR-155 è un miRNA multifunzionale, coinvolto in numerosi processi biologici, in-clusi ematopoiesi, infiammazione e immunità. Deriva dalla trascrizione del gene MIR155HG/BIC (B-cell Integration Cluster), localizzato sul cromosoma 21, alta-mente espresso in organi linfoidi (timo e milza) (Faraoni et al., 2009). MiR-155 è sta-to uno dei primi miRNA individuati in un contessta-to infiammasta-torio, dove risulta essere up-regolato da NF-kB. In sede di risposta immunitaria innata, l’interazione di un TLR con il suo ligando attiva una cascata di segnali intracellulari, tra cui i segnali MyD88 (myeloid differentiation protein 88)- e TRIF (TIR-domain-containing
adap-ter-inducing interferon-β)-mediati. La via di MyD88 risulta nell’attivazione
trasczionale di geni infiammatori, mentre la via di TRIF risulta nell’attivazione della ri-sposta mediata da interferoni (IFNs). Entrambi i pathways attivano NF-kB. MiR-155
28
è un target diretto di IFN-β, ed è up-regolato da svariati ligandi di TLR, attraverso entrambe le vie di segnalazione menzionate (R. M. O’Connell et al., 2007; Ryan M. O’Connell et al., 2012). Di conseguenza, se in condizioni omeostatiche l’espressione del miRNA nelle cellule immunitarie è relativamente bassa, dopo l’attivazione cellu-lare essa è implementata da una varietà di stimoli (agonisti del TLR, citochine pro-infiammatorie, antigeni, mitogeni). L’espressione del gene BIC aumenta nelle cellule B attivate in caso di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL), tumore legato all’attivazione costitutiva di NF-kB. Al contrario, l’inibizione dell’attività di IKK, la presenza di proteina chinasi C (PKC) e di altri inibitori di NF-kB si traducono in una minore espressione di BIC. Alcuni lavori hanno anche ragionato sul coinvolgimento di AP-1 (activator protein 1) nel controllo dell’espressione di miR-155 nelle cellule sia mieloidi che linfoidi: si conferma un ruolo essenziale di NF-kB nel reclutamento di AP-1 per la massima attivazione genica (Boldin & Baltimore, 2012).
MiR-155 silenzia l’espressione di due modulatori negativi di NF-kB, SHIP1 (Src
homology 2-containing inositol phosphatase-1) e SOCS1 (Suppressor of cytokine si-gnaling 1), il che conduce ad un’aumentata attivazione di AKT (proteina chinasi B) e
IFN, protagonisti di pathways ampiamente coinvolti nella mediazione di sopravvi-venza, crescita e migrazione cellulare, nonché nella risposta antivirale. In assenza del miRNA, l’espressione di SHIP1 e SOCS1 aumenta. Topi miR-155 knocked-out (KO) risultano immunodeficienti, mentre topi che over-esprimono il miRNA sviluppano infiammazione cronica, simile ad una mieloproliferazione, e, in taluni casi, tumori ematopoietici. Alcuni contesti infiammatori in cui si ha un’aumentata espressione del miRNA sono: sclerosi multipla, artrite reumatoide, dermatite atopica, patologie in-fiammatorie intestinali, nefropatia da IgA, endotossiemia, infezione batterica, disor-dini mieloproliferativi (Ryan M. O’Connell et al., 2012).
MiR-155-5p risulta essere down-regolato nel plasma di pazienti con malattia coronarica aterosclerotica. Esperimenti funzionali in vitro mostrano che una sua up-regolazione inibisce l’aberrante proliferazione, migrazione e invasione di VSMCs (Vascular smooth muscle cells) e HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells), regolatori essenziali dell’aterosclerosi. Il suo potenziale target sembra essere AKT1, che svolge un importante ruolo nella proliferazione e migrazione delle cellule
29
endoteliali nella parete vascolare, nella regolazione della permeabilità vascolare e dell'angiogenesi (L. Chen et al., 2019). Il coinvolgimento del miRNA nella patogenesi dell’aterosclerosi è suggerito anche dalla sua capacità di reprimere Bcl-6
(B-cell lymphoma 6), regolatore negativo di NF-kB, esacerbando l’infiammazione
macrofagica ampiamente coinvolta nella formazione della placca aterosclerotica
(Na-zari-Jahantigh et al., 2012). Alti livelli di miR-155-5p si rilevano in macrofagi e in monociti sinoviali in modelli clinici e sperimentali di artrite reumatoide (RA). Il miRNA modula la produzione di metalloproteinasi da parte di fibroblasti sinoviali in pazienti con RA, ed è un regolatore cruciale per l’attivazione pro-infiammatoria di cellule mieloidi e artrite antigene-guidata. La sua sovra-espressione in macrofagi CD68+ della membrana sinoviale e in cellule CD14+ del fluido sinoviale è associata ad una minore espressione di SHIP1, inibitore di vari pathways infiammatori. Ne consegue un’aumentata espressione di citochine e chemochine pro-infiammatorie fortemente coinvolte nella sinovite (TNF-α, IL-6, IL-1β, interleuchina-8/IL-8) (M. Kurowska-Stolarska et al., 2011). Nella neuro-infiammazione metanfetamina (METH)-indotta, dove METH provoca una diminuzione dei livelli del miR-155-5p in cellule microgliali (BV2), si osserva una sovra-espressione del target Peli (Pellion) 1, adattatore implicato nella regolazione del segnale di TLR in cellule dell’immunità innata. Peli1 promuove l’attivazione di MAPK e NF-kB, incrementando l’espressione di citochine pro-infiammatorie. La sovra-espressione del miRNA me-diante trasfezione cellulare con miR-155-5p mimic risulta efficace nell’attenuare in modo significativo l’up-regolazione di Peli1 e la secrezione di citochine pro-infiammatorie indotte da METH (G. Yu et al., 2019). MiR-155-5p è un promettente candidato per la protezione dall’obesità. Topi miR-155-5p KO di sesso femminile mostrano un miglioramento della spesa energetica, con minore accumulo di WAT e minore aumento ponderale, e una minore ipertrofia ed infiammazione degli adipociti bianchi. Gli adipociti mantengono un’elevata espressione di geni coinvolti nell’adipogenesi bruna, nella lipolisi, nel rilascio di energia e nell’omeostasi cellula-re. Tra i target del miRNA anche IRS1 (insulin-receptor substrate 1), GLUT-4
(glu-cose transporter type 4), Fasn (codifica per acido grasso sintasi), leptina e
adiponectina, geni adipogenici e insulino-sensibilizzanti (Gaudet et al., 2016). MiR-155 regola in senso negativo l’infiammazione Helicobacter pylori-indotta in linea cellulare di cancro gastrico umano (AGS), mediante down-regolazione
post-30
trascrizionale di MyD88 e IL-1R (interleukin-1 receptor) (Tang et al., 2010). Nell’infiammazione allergica, IL-10 potenzia l’attivazione dei mastociti (MC) ed e-sacerba l’anafilassi mediante un processo Stat3 (Signal transducer and activator of
transcription 3)- e miR-155-dipendente. Il miRNA modula l’espressione di SOCS1,
regolatore negativo del segnale mastocitico, i cui livelli risultano essere elevati in MC miR-155-KO (Qayum et al., 2016).
MiR-34a nell’infiammazione
MiR-34a appartiene alla famiglia di miR-34, ed è codificato dal gene MIR34A, situa-to sul cromosoma 1. MiR-34a è un potente e nositua-to oncosoppressore, ed espleta la sua azione mediante repressione di fattori di crescita e oncogeni (Y. Ma et al., 2013). L’analisi bioinformatica rivela che NF-kB è potenzialmente in grado di legarsi a nu-merosi siti localizzati nel promotore genico del miRNA. In una linea cellulare di cancro esofageo squamoso (EC109), l’espressione del miRNA aumenta in seguito al-la trasfezione cellual-lare con un vettore di espressione di p65 rispetto al controllo, non trasfettato. Inoltre, bloccando l’attività endogena di NF-kB trasfettando le cellule con IkBα mutata, refrattaria alla degradazione fosforilazione-mediata, si osserva una gnificativa minore traslocazione nucleare di p65, accompagnata da un’altrettanto si-gnificativa ridotta espressione del miRNA (Li et al., 2012). Il miRNA sembra essere disregolato in caso di obesità, dal momento che, in pazienti con T2DM e un
BMI ≥ 25 kg/ , si riscontra un aumento dei suoi trascritti sierici rispetto a pazienti
con eccesso ponderale sani. Alcuni studi hanno individuato una correlazione tra l’aumento del BMI e l’espressione di miR-34a in WAT sottocutaneo in vivo, nonché un aumento dei trascritti durante la differenziazione degli adipociti sottocutanei in
vitro. Questo miRNA è stato positivamente associato alla distruzione di cellule
β-pancreatiche primarie e di linee cellulari, in seguito a stimolazione infiammatoria, con conseguente deplezione insulinica dovuta all’inibizione di VAMP2
(vesicle-associated membrane protein 2). Il suo coinvolgimento nell’infiammazione è stato
ipotizzato anche a seguito di una sua minore espressione in linee cellulari di macro-fagi LPS (lipopolisaccaride)-stimolate, e ad una riduzione miRNA-correlata dell’espressione di IL-6 e di TNF-α. (Lavery et al., 2016). A questo proposito è
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del miRNA in macrofagi murini LPS-stimolati sembra avere un risvolto anti-infiammatorio, come evidenziato dalla minore produzione di citochine pro-infiammatorie. Questo effetto sembra essere parzialmente dovuto al silenziamento di
Notch1 (Notch receptor 1), target di miR-34a, il quale andrebbe altrimenti a potenziare
il segnale di NF-kB, esacerando la risposta infiammatoria macrofagica (Jiang et al., 2012). Il miRNA risulta essere significativamente correlato con parametri di adiposi-tà, ed è up-regolato in colture di pre-adipociti di soggetti obesi anche durante la
diffe-renziazione (Ortega et al., 2010). L’espressione del miRNA aumenta nel grasso
visce-rale con lo sviluppo di obesità, ed è intimamente associata a IR e infiammazione. Inoltre, il miRNA guida la polarizzazione dei macrofagi in senso pro-infiammatorio, modulando l’espressione di KLF4 (Kruppel-like factor 4) (Pan et al., 2019). In pazienti con retinopa-tia diabetica si osservano una minore espressione di SIRT1 (Silent information regula-tor 1), che risulta essere associato ad infiammazione e apoptosi, e una
sovra-espressione di miR-34a. SIRT1 è un target del miRNA: dal momento che SIRT1 può inibire infiammazione e apoptosi regolando i pathways di NF-kB ed ERK
(extracel-lular signal regulated kinase), una sua delezione miR-34a-mediata, in questo
partico-lare contesto patologico, comporta una maggiore attivazione di NF-kB e un
incre-mento della risposta infiammatoria (Tong et al., 2019).
Let-7c nell’infiammazione
Let-7 è una famiglia di miRNA costituita da 12 membri, situati in loci genici che so-no frequentemente silenziati nei tumori umani (Iliopoulos et al., 2009). Let-7 è down-regolato da NF-kB, il quale può indurre la sintesi di Lin28, proteina che inibisce la processazione e maturazione del miRNA. Questo, a sua volta, può i-nibire l’espressione di citochine pro-infiammatorie direttamente, mediante appaia-mento alla regione 3’ UTR dell’mRNA, e indirettamente, mediante interazione con Ras, a cui segue una ridotta attività di NF-kB (Iliopoulos et al., 2009; Hoesel & Schmid, 2013). L’attivazione dell’oncoproteina Src media uno switch epigenetico da cellule del seno immortalizzate ad una linea stabilmente trasformata che forma mammosfere auto-rigeneranti, contenenti cellule tumorali staminali. Tale attivazione potenzia la risposta infiammatoria mediata da NF-kB, il quale attiva direttamente la trascrizione di Lin28, con una riduzione dei livelli di let-7 e un’esacerbazione dello stato infiammatorio (Iliopoulos et al., 2009). Nel momento in cui l’espressione di
let-32
7c diminuisce durante la fase infiammatoria della risposta immunitaria, si verificano un’aumentata espressione di citochine pro-infiammatorie e un potenziamento della risposta infiammatoria stessa. Al contrario, in un contesto infiammatorio come quello riscontrabile in caso di infiammazione allergica, un’aumentata espressione del miR-NA favorisce una riduzione dell’interleuchina-13 (IL-13), prodotta dai linfociti T
helper 2 (Th2), con conseguente miglioramento dello stato infiammatorio a carico
delle vie aeree (Ryan M. O’Connell et al., 2012). Let-7 è coinvolto nel metabolismo di lipidi e glucosio in più organi. La sua sovra-espressione globale e pancreas-specifica porta ad un’alterata tolleranza al glucosio e ad una ridotta secrezione insu-linica nel topo, nonché ad una riduzione della massa grassa e del peso corporeo. L’utilizzo di una sequenza in grado di antagonizzare il miRNA si dimostra utile per prevenire e trattare l’alterata tolleranza al glucosio in topi con obesità indotta dalla dieta, effetto dovuto, almeno in parte, ad un miglioramento della sensibilità insulini-ca nel fegato e nel muscolo, con un aumento della massa magra e muscolare, e pre-venzione della deposizione ectopica di grasso a livello epatico (Frost & Olson, 2011).
Studi recenti hanno dimostrato il ruolo anti-infiammatorio di let-7c in caso di COPD (malattia polmonare ostruttiva cronica), in cui, normalmente, i livelli del miRNA nei macrofagi alveolari risultano essere bassi. La sua over-espressione, in seguito a trasfe-zione cellulare con let-7c mimic, sopprime l’aumento LPS-indotto di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1β, IL-6), effetto dovuto all’inibizione del target Stat3, impor-tante mediatore della risposta infiammatoria (J.-H. Yu et al., 2016). In cellule staminali della polpa dentale e in tessuti della polpa dentale di ratto, opportunamente infiam-mati mediante LPS, un aumento di espressione di let-7c-5p, i cui livelli sono nor-malmente soppressi in caso di pulpite, si traduce in: maggiore proliferazione cellula-re, stimolazione del potenziale di differenziazione osteogenica, riduzione significati-va di citochine pro-infiammatorie (Yuan et al., 2019). Si dimostra altresì che let-7c stimola il fenotipo macrofagico M2, anti-infiammatorio, attraverso la modulazione negativa di PAK1 (p21-activated kinase 1), risultando protettivo verso l’obesità (Zhang et al., 2015). Let-7c gioca anche un importante ruolo nell’endometrite, dove sembra migliorare lo stato infiammatorio LPS-indotto, attenuando l'espressione di ci-tochine pro-infiammatorie attraverso l'inibizione dell'attivazione di NF-kB (Zhao et al., 2019). Esau e colleghi hanno riportato un incremento dell’espressione di let-7a e let-7c durante la differenziazione di adipociti umani (Esau et al., 2004). Risultati ana-loghi si riscontrano nel lavoro di Sun e colleghi, dove si osserva una up-regolazione
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di let-7 durante l’induzione dell’adipogenesi in pre-adipociti 3T3-L1, con una mag-giore espressione del miRNA negli adipociti maturi piuttosto che nei pre-adipociti, coerentemente con quanto osservato in WAT murino. I suoi livelli risultano aumentati anche durante la differenziazione insulino-indotta di cellule 3T3-F442A in adipociti. Un’introduzione ectopica del miRNA blocca la crescita cellulare ed inibisce comple-tamente la differenziazione terminale dei pre-adipociti, come confermato dall’accumulo lipidico e dalla minore espressione di marcatori dell’infiammazione (TNF-α, MCP-1), con un meccanismo che vede in parte coinvolto il target Hmga2
(High-mobility group AT-hook 2) (Sun et al., 2009).
1.6 La dieta mediterranea e gli effetti benefici dell’olio extra-vergine
d’oliva
La dieta mediterranea tradizionale è prevalentemente incentrata sul consumo di ali-menti di origine vegetale (frutta e vegetali freschi, frutta secca, olio d’oliva, cereali integrali, legumi), pesce, latticini a basso contenuto di grassi e carne magra. Questo tipo di alimentazione risulta essere protettivo verso un ampio range di patologie cro-niche (CVD, aterosclerosi, sindrome metabolica, neoplasie, diabete, obesità, malattie polmonari e neuro-degenerative) e sembra aumentare la longevità (Romagnolo & Selmin, 2016). Molti studi dimostrano che le proprietà benefiche più significative della dieta mediterranea derivano dall’intake congiunto di alimenti diversi, il che de-termina un effetto sinergico più potente rispetto a quello riscontrato con l’assunzione del singolo alimento (Viscogliosi et al., 2013). Tuttavia, la maggior parte degli studi si è focalizzata sui prodotti alimentari individuali (olio d’oliva, noci, pomodori, pesce e altri) per questioni di praticità (Widmer et al., 2013; Xaplanteris et al., 2012). Tra i costituenti alimentari responsabili degli effetti benefici della dieta mediterranea, si evidenziano acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e polinsaturi (PUFA), vitamine e fi-tochimici. I fitochimici, ivi inclusi polifenoli, carotenoidi e fitosteroli, sono sostanze chimiche vegetali bioattive e prive di valore nutrizionale, le cui proprietà anti-infiammatorie e antiossidanti sono ampiamente riconosciute (H.R. Vasanthi et al., 2012). I polifenoli sono i fitochimici più abbondanti in vegetali, frutta e olio vergine d’oliva, e, sulla base della loro struttura chimica, sono classificabili in: acidi fenolici, flavonoidi, stilbeni e curcuminoidi (Corella & Ordovás, 2014). I primi studi che
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scrivono l’associazione inversa tra dieta mediterranea e rischio cardiovascolare si so-no concentrati sull’olio d’oliva, che garantisce un elevato apporto di MUFA, in parti-colare acido oleico, e di polifenoli. L’elevato apporto di MUFA e il ridotto apporto di SFA spiegherebbero alcuni degli effetti protettivi di questo stile alimentare, non solo grazie ad una riduzione dell’aterogenicità del colesterolo LDL (low-density
lipopro-teins), ma anche grazie ad una modificazione ossidativa delle LDL stesse. È noto che
LDL arricchite in MUFA sono meno suscettibili all’ossidazione rispetto alle LDL ar-ricchite in PUFA (Schwingshackl & Hoffmann, 2012). I meccanismi protettivi dei MUFA dell’olio d’oliva sono stati gradualmente estesi, nell’essere umano, a: ridu-zione della pressione sanguigna, di fattori plasmatici pro-infiammatori e di marcatori di stress ossidativo; protezione verso il processo di invecchiamento vascolare (Marín et al., 2013). Nei soggetti con T2DM sono stati osservati un effetto ipoglicemizzante e una riduzione dei livelli di emoglobina glicosilata (Sales-Campos et al., 2013). Re-centi studi di intervento nella dieta con MUFA hanno riportato una differente espres-sione genica nel tessuto adiposo e nelle cellule mononucleate ematiche periferiche (PBMC) (Schwingshackl & Hoffmann, 2012). Un elevato intake di MUFA conduce ad un profilo di espressione genica anti-infiammatorio, a confronto con il consumo di una dieta ricca in SFA (van Dijk et al., 2009). In accordo con questi risultati, si è ri-scontrata una minore espressione di geni deputati alla fosforilazione ossidativa e una ridotta attivazione di processi correlati all’infiammazione nelle PBMC (van Dijk et al., 2012). Per quanto concerne l’apporto di fitochimici, molte ricerche, condotte sia su colture cellulari che in modelli animali, mostrano vari meccanismi d’azione po-tenzialmente attribuibili a queste sostanze, e con i quali si potrebbe spiegare il loro effetto protettivo verso le CVD. Tuttavia, l’evidenza scientifica nell’uomo è bassa per la maggior parte dei composti, ad eccezione dei polifenoli dell’olio d’oliva (Co-rella & Ordovás, 2014).
Il consumo di olio extra-vergine d’oliva (EVOO, 25-50 g/die), principale fonte lipi-dica della dieta mediterranea (Francisco et al., 2019), è stato associato ad una ridu-zione del rischio di mortalità e dell’incidenza di patologie non trasmissibili. I suoi polifenoli hanno spiccate proprietà antiossidanti, anti-infiammatorie, antimicrobiche e immunostimolanti (Tripoli et al., 2005). Studi epidemiologici suggeriscono che un elevato apporto di polifenoli è associato ad un ridotto rischio di patologie
