Stress cellulare nelle cellule FRTL-5: possibile esistenza di un meccanismo di regolazione della captazione dello iodio non mediato dal TSH

PREMESSA

Durante questi tre anni di dottorato ho avuto l’opportunità di occuparmi di due diversi settori di studio:

Studio dei geni implicati nell’insorgenza dell’obesità umana
Studio della risposta delle cellule tiroidee allo stress cellulare

Per quanto riguarda il primo settore di ricerca sono stati presi in esame diversi geni implicati nell’insorgenza dell’obesità umana.

a) Analisi del recettore melanocortinico 4 (MC4-R)

Sono stati reclutati 120 pazienti obesi con indice di massa 35 e 60 controlli normopeso con indice di massa corporea compreso tra 18.5 e 28.8, che sono stati sottoposti ad analisi genetica del recettore melanocortinico 4 (MC4-R).

Il DNA genomico estratto dai leucociti di sangue periferico, è stato amplificato mediante reazione a catena della polimerasi

(PCR). I prodotti della reazione di sequenza sono stati analizzati mediante sequenziamento automatico. I risultati del nostro studio hanno portato all’identificazione di due polimorfismi già descritti in letteratura (dei quali uno è stato riscontrato anche in due controlli normopeso) e a due mutazioni delle quali una già descritta in eterozigosi composta ma mai studiata funzionalmente (Ser30Phe), l’altra mai descritta (Glu308Lys). Le due mutazioni sono state studiate dal punto di vista funzionale mediante inserimento dei recettori mutati in un opportuno vettore di espressione eucariotico e successiva trasfezione in cellule di rene di scimmia (COS-7). Le cellule trasfettate sono state esposte a concentrazioni crescenti di alpha-MSH (ligando fisiologico del recettore melanocortinico 4) e di AGRP (antagonista endogeno del recettore melanocortinico 4) ed è stata valutata la produzione di cAMP mediante dosaggio radioimmunologico (RIA). Successivamente è stata valutata la capacità di legame dei recettori mutati (rispetto al recettore nativo) sia con l’alpha-MSH

I risultati ottenuti dallo studio funzionale hanno messo in evidenza sia una netta diminuzione della produzione di cAMP che della capacità di legare sia l’alpha-MSH che l’AGRP da parte del recettore mutato Glu308Lys rispetto al recettore nativo. Per quanto riguarda il recettore portatore della mutazione Ser30Phe, i valori di cAMP prodotto e la capacità di legame rispettivamente con l’alpha-MSH e l’AGRP sono risultati sovrapponibili a quelli ottenuti eseguendo gli esperimenti sulle cellule trasfettate con il recettore nativo.

b) Analisi molecolare del gene della Pro-opiomelanocortina Tra i geni implicati nella regolazione del peso corporeo, troviamo il gene della opiomelanocortina (POMC). La Pro-opiomelanocortina è un pro-ormone che subisce un taglio ad opera dell’enzima Proconvertasi originando MSH, beta-MSH ed altri peptidi tra cui la beta-endorfina. Recentemente è stata individuata una mutazione a carico di questo gene in

di taglio tra beta-MSH e beta-endorfina creando una proteina di fusione che pur legando il recettore melanocortinico 4 in modo pressoché normale, ha una ridottissima capacità di attivarlo in vitro. Basandoci su queste informazioni, abbiamo sottoposto ad analisi genetica del gene POMC, 200 pazienti obesi e 20 soggetti sani, normopeso, utilizzati come controllo. I risultati ottenuti non hanno messo in luce alcuna mutazione nei pazienti sottoposti ad analisi genetica del gene POMC. I risultati di questo studio sono stati presentati a diversi Congressi Nazionali.

c) Analisi del gene GPR7

Il gene codificante per il recettore GPR7 è espresso a livello del nucleo ventro mediale e del nucleo arcuato dell’ipotalamo oltre che in alcuni distretti periferici. Si tratta di un gene a singolo esone localizzato sul cromosoma 10 che codifica per un recettore accoppiato alle proteine G i cui ligandi endogeni sono rappresentati dai neuropeptidi W e B. Studi condotti su modelli

fenotipo obeso (Targeted disruption of GPR7, the endogenous

receptor for neuropeptides B and W, leads to metabolic defects and adult-onset obesity.Ishii M, Fei H, Friedman JM. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 2;100(18):10540-5. Epub 2003 Aug 18). Sono stati reclutati 150 pazienti obesi con indice di massa

corporea 35 e 50 controlli normopeso con indice di massa corporea compreso tra 18.5 e 28.8, che sono stati sottoposti ad analisi genetica del recettore GPR7, previo consenso informato. Il DNA genomico estratto dai leucociti di sangue periferico, è stato amplificato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). I prodotti della reazione di sequenza sono stati analizzati mediante sequenziamento automatico.

I risultati del nostro studio hanno portato all’identificazione di una variante genetica mai descritta in letteratura (Tyr135Phe) riscontrata nella forma omozigote con una frequenza dell’1,3%, nella forma eterozigote con una frequenza pari al 12%. La mutazione è stata successivamente valutata dal punto

melanofori. I recettori mutato e nativo sono stati inseriti in un opportuno vettore di espressione eucariotica (pcDNA3) e trasfettati transitoriamente in melanofori di X.Laevis. Le cellule trasfettate sono state sottoposte a stimolo con dosi crescenti di NPB (ligando fisiologico di GPR7) ed è stata valutata l’aggregazione dei pigmenti nei melanofori conseguente all’attivazione della subunità Gai dovuta al legame GPR7-NPB. I risultati ottenuti non hanno messo in luce differenze significative nell’aggregazione dei pigmenti indotta indipendentemente dai due recettori.

d) Analisi del gene GPR8

Il gene codificante per il recettore GPR8 è espresso prevalentemente a livello della corteccia frontale. Si tratta di un gene a singolo esone localizzato sul cromosoma 20 che codifica per un recettore accoppiato alle proteine G i cui ligandi endogeni sono rappresentati, come per GPR7, dai neuropeptidi W e B.

corporea 35 e 50 controlli normopeso con indice di massa corporea compreso tra 18.5 e 28.8, che sono stati sottoposti ad analisi genetica del recettore GPR8, previo consenso informato. Il DNA genomico estratto dai leucociti di sangue periferico, è stato amplificato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). I prodotti della reazione di sequenza sono stati analizzati mediante sequenziamento automatico. I risultati del nostro studio hanno portato all’identificazione di una nuova variante genetica (Ala73Val) riscontrata solo nel gruppo dei pazienti obesi con una frequenza del 2%. La mutazione è statta valutata dal punto funzionale mediante saggio di aggregazione dei pigmenti nei melanofori.

I risultati scientifici ottenuti da questi studi sono stati presentati ai seguenti Congressi:

1. II° Congresso della Società italiana dell'Obesità (SIO) Montecatini Terme 5-10 Maggio 2004

3. XXVI Giornate Endocrinologiche Pisane. Pisa, 8-10 giugno 2006

4. III° Congresso della Società italiana dell'Obesità (SIO) Milano, 13-16 giugno 2006

E’ stato inoltre pubblicato il seguente lavoro:

SANTINI F; MAFFEI M; CECCARINI G; PELOSINI C; SCARTABELLI G; ROSELLINI V; CHIELLINI C; MARSILI A; LISI S; TONACCHERA M; AGRETTI P; CHIOVATO L; MAMMOLI C.; VITTI P; PINCHERA A. (2004)

Genetic screening for melanocortin-4 receptor mutations in a cohort of Italian obese patients: description and functional characterization of a novel mutation. 2004 Feb;89(2):904-8. JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM vol. 89 pp. 904-908

Per motivi pratici è stato scelto il secondo argomento di ricerca (studio della risposta delle cellule tiroidee allo stress cellulare) per la stesura e la discussione di questa tesi di dottorato, il cui titolo sarà: “ “SSTTRREESSSS CCEELLLLUULLAARREE NNEELLLLEE CCEELLLLUULLEE FFRRTTLL--55:: P POOSSSSIIBBIILLEE EESSIISSTTEENNZZAA DDII UUNN MMEECCCCAANNIISSMMOO DDII R REEGGOOLLAAZZIIOONNEE DDEELLLLAA CCAAPPTTAAZZIIOONNEE DDEELLLLOO IIOODDIIOO N NOONNMMEEDDIIAATTOODDAALLTTSSHH””

Gli abstracts dei congressi ed il lavoro che è stato pubblicato sono allegati a questa tesi dopo la bibliografia.

RIASSUNTO

L’esposizione di cellule a stress fisici o chimici determina un danno più o meno grave che può causare alterazioni funzionali e/o morte cellulare. La risposta cellulare a tali stress coinvolge meccanismi molecolari che permettono il recupero di una normale funzione. In questo lavoro abbiamo studiato gli effetti di stress fisici e chimici su una linea differenziata di cellule tiroidee di ratto (FRTL-5) valutando l’influenza di tali agenti su una funzione tiroidea specifica quale è la captazione dello iodio.

Le cellule FRTL-5 sono state esposte ai seguenti trattamenti: a) heat shock (43°C per 15-30 min), b) shock osmotico (NaCl 0.5 M per 30 min e sorbitolo 0.4 M per 20 min), c) shock ossidativo (perossido di idrogeno 50 µM per 20 minuti), d) trattamento con sostanze chimiche (anisomicina 10 µg/ml per 30 min, vanadato di sodio 1 mM per 20 min, arsenite di sodio 200 µM per 20 min). La vitalità

sottoposto le cellule alle varie condizioni di stress, veniva testata la loro capacità di captare lo iodio a vari intervalli di tempo. Veniva inoltre studiata l’attivazione delle MAP chinasi tramite Westwrn Blotting utilizzando anticorpi specifici per la firma fosforilata di JNK, ERK e p-38.

I saggi di captazione dello iodio dopo trattamento con heat shock, hanno evidenziato una riduzione della captazione dello iodio del 20% circa dopo heat shock di 15 minuti, e pari al 40% dopo heat shock di 30 minuti, rispetto alla captazione delle cellule non trattate. Dopo le altre condizioni di stress utilizzate, i trattamenti con anisomicina, arsenite e vanadato mostravano una captazione dello iodio del tutto sovrapponibile a quella delle cellule non trattate, mentre lo stress osmotico mostrava una riduzione della captazione, di circa il 35% per l’NaCl e del 20% per il sorbitolo. L’ H2O2

utilizzata alla concentrazione di 500 µM, riduceva la captazione dello iodio del 60% ma in questo caso le cellule non erano capaci di recuperare ed andavano incontro a morte. Il trattamento con

concentrazioni più basse di H2O2, 100 e 50 µM, indicava una

riduzione della captazione rispettivamente del 40 e del 20% circa con un parziale e completo recupero di tale capacità. Lo studio dell’attivazione delle MAPKs, in seguito al trattamento con heat shock, mostrava una rapida fosforilazione di JNK, che risultava tempo-dipendente e questa chinasi è stata studiata anche per le altre condizioni di stress. L’attivazione di JNK, mentre non si verificava nel caso dell’anisomicina, del vanadato e dell’arsenite (almeno alle condizioni da noi utilizzate), mostrava una rapida fosforilazione dopo il trettamento con heat shock, con H2O2, con NaCl e in minor

misura con sorbitolo.

Per studiare il meccanismo responsabile della riduzione della captazione abbiamo studiato l’espressione del NIS, che si riduce nelle prime 12 ore successive allo stress, aumentare tra 12 e 48 ore per poi tornare a normalizzarsi intorno alle 72 ore. In conclusione in questo lavoro abbiamo dimostrato come l’esposizione di cellule tiroidee differenziate a condizioni di shock termico, osmotico o

ossidativo determini una transitoria riduzione di una funzione specifica della tiroide quale è la capacitá di captare lo iodio. Tale fenomeno è verosimilmente in relazione alla riduzione dell’espressione del NIS, si associa all’ attivazione di meccanismi intracellulari regolati dall’ attivazione di JNK ed è indipendente dal TSH. In vivo questo meccanismo potrebbe essere responsabile dell’effetto “stunning”, definito come la ridotta captazione del radioiodio (131I) che si verifica in un normale tessuto tiroideo o nel cancro tiroideo differenziato, dopo somministrazione diagnostica di

INTRODUZIONE

Durante la loro vita le cellule sono esposte a molteplici cambiamenti chimico-fisici del microambiente (temperatura, pH, pressione osmotica) e variazioni nell’apporto di elementi nutritivi. La capacità della cellula di rispondere a tali condizioni di stress è essenziale per il mantenimento dell’omeostasi. Le condizioni di stress cellulare, che possono essere endogene o esogene, includono infezioni patogene, agenti chimici, privazione di nutrienti e perfino la normale differenziazione cellulare. Tra le condizioni di stress che sono state maggiormente studiate sono compresi lo stress osmotico, lo stress termico (1), lo stress da metalli pesanti (2), da radiazioni ionizzanti (3), lo stress barico (4), lo stress ossidativo (5) e ipossia/ischemia (6). Molti tipi di stresses ambientali possono causare cambiamenti della conformazione tridimensionale delle proteine influenzandone la loro struttura e funzione. Dalla

letteratura emergono alcuni aspetti comuni ad ogni forma di stress cellulare ed i seguenti punti sono di particolare rilevanza:

1) La risposta allo stress cellulare è una reazione a fluttuazioni di parametri extracellulari che danneggiano la struttura e la funzione di macromolecole (lipidi, proteine e acidi nucleici). 2) Al fine di ristabilizzare l’omeostasi cellulare è necessaria una

rapida e efficace risposta allo stress.

3) La risposta cellulare a tale condizione comprende la attivazione di un set di proteine (ad esempio le heat shock protein) la cui struttura e funzione è altamente conservata nel corso dell’evoluzione.

4) Le risposte cellulari a stresses multipli sono sinergiche, e la pre-esposizione ad uno di essi induce una transitoria stress-resistenza o una cross-tolleranza ad altre forme di stress.

Le cellule rispondono a tutti i tipi di stress attivando quattro meccanismi di base, ognuno dei quali favorisce la stabilizzazione

condizioni avverse, conservando energia metabolica necessaria per adattamenti omeostatici.

Questi quattro meccanismi e la loro transitoria attivazione possono essere visti come il punto cruciale della risposta allo stress cellulare e consistono in:

1) controllo dei punti del ciclo cellulare che portano all’arresto della crescita, G1/S (7), G2/M (8) e meccanismi di controllo

translazionale (9);

2) induzione dei chaperoni molecolari (HSPs) e di proteine stabilizzatrici; i chaperoni sono comunemente attivati dalla loro induzione (10) o mediante una modificazione post-traslazionale, come la fosforilazione di HSP28 via MAPchinasi (11);

3) attivazione di meccanismi per stabilizzare e riparare gli acidi nucleici e la cromatina che includono la via p53 (12) e la via NF-kB (13);

4) rimozione delle macromolecole danneggiate prodotte durante lo “stress”. Questo aspetto della risposta allo stress è esemplificato dalla via ubiquitina/proteosoma (14).

Questi meccanismi sembrano essere interconnessi tramite una comune via di segnalazione ed il loro principale compito è quello di mantenere l’integrità genomica e macromolecolare durante le condizioni di stress.

Uno dei principali bersagli cellulari dello stress è il reticolo endoplasmatico (RE) che rappresenta il sito di sintesi, di ripiegamento e di modificazione delle proteine secretorie. Alterazioni relativamente modeste dell’efficienza del processo che regola il raggiungimento della corretta conformazione proteica determina l’accumulo o la degradazione delle proteine che non acquisiscono la corretta struttura tridimensionale.

Il RE contiene delle molecole che rilevano la presenza di proteine “non-piegate” (unfolded) o non correttamente conformazionate (misfolded) e danno inizio a cambiamenti dell’espressione genica.

La risposta alle proteine “non-piegate” (Unfolded Protein Response: UPR) è una reazione cellulare adattativa che mantiene l’omeostasi del reticolo endoplasmatico perturbato dall’accumulo di proteine con una errata sruttura tridimensionale (15) (16;17).

L’UPR consiste in un’induzione della trascrizione di geni che potenziano la capacità del RE di determinare una corretta conformazione delle proteine (chaperoni molecolari ed enzimi di ripiegamento proteico) e in una riduzione della trascrizione di proteine “non-essenziali” in modo da ridurre il carico di proteine sul RE.

Meccanismi molecolari implicati nello stress cellulare

I sensori dello stress del RE sono rappresentati da tre proteine transmembrana del reticolo stesso:

1) la chinasi e endoribonucleasi IRE1

2) la PERK (Pancreatic Endoplasmic Reticulum Kinase) 3) il fattore di trascrizione ATF6

Nel caso di IRE1 e pERK, che possiedono entrambi domini citoplasmatici serina/treonina chinasi, lo stress del RE induce una omodimerizzazione del dominio luminale che determina l’autofosforilazione e l’attivazione di queste molecole. Inoltre, l’accumulo di proteine “unfolded” nel lume del RE porta ad un transito di ATF6 all’apparato di Golgi dove viene tagliato da proteasi che danno origine a un dominio citoplasmatico libero che agisce come fattore di trascrizione attivo (18) (19-21).

Gli effetti combinati dell’attivazione di queste molecole determinano una “up-regulation” dei geni che codificano per le proteine secretorie come i chaperoni e quelle implicate nella degradazione proteica, ed una “down-regulation” della sintesi di proteine non essenziali alla sopravvivenza cellulare, riducendo il flusso di proteine nascenti all’interno del RE.

Stress cellulare e MAP chinasi: UPR e Attivazione delle

proteine JNK chinasi

Le MAPchinasi o MAPKs (mitogen-activated protein kinases) costituiscono una superfamiglia di proteine chinasi che giocano un ruolo chiave tra i meccanismi di risposta allo stress (22). La loro funzione e regolazione è stata conservata durante l’evoluzione da organismi unicellulari come il lievito della birra a organismi complessi incluso l’uomo (23). L’attività delle MAPKs è regolata da una sequenza di attivazione di chinasi che in ultima analisi risultano nella fosforilazione di 3 chinasi terminali: p-38, JNKs (c-Jun NH2

-terminal kinases) ed ERKs (extracellular signal-regulated kinases). Le MAPKs fosforilano specifiche serine e treonine di proteine target e regolano attività cellulari come l’espressione genica, la mitosi, il movimento, il metabolismo e la morte cellulare programmata (24). Una relazione particolare esiste UPR e attivazione di JNKs, che vengono anche dette SAPKs (Stress-activated protein Kinases).

Le JNKs regolano l’espressione genica tramite la fosforilazione e l’attivazione di fattori di trascrizione come c-Jun e ATF2 o regolando la stabilità dell’mRNA. Gli attivatori “a monte” del segnale JNK sono organizzati in una cascata di chinasi, ma esistono poche informazioni su come segnali prossimali sono accoppiati all’attivazione di questa cascata di chinasi.

Il legame meglio caratterizzato è quello tra i recettori per i fattori di necrosi tumorale (TNF) e l’attivazione delle JNKs. Questo legame dipende dal reclutamento di proteine adattatrici conosciute come TRAFs, che si legano alla parte citosolica dei recettori TNF, risultando essenziali nella trasmissione del segnale.

Ciò è dimostrato dal fatto che delezioni del gene TRAF bloccano l’attivazione di JNK mediata dal TNFα. Le TRAFs attivano le chinasi prossimali per iniziare quella cascata che culmina nella fosforilazione e attivazione di JNK.

Fig. 2. Rappresentazione schematica della cascata di chinasi che stanno a monte dell’attivazione di JNK e attivazione diretta tramite TRAF2.

I meccanismi dell’attivazione TRAF-dipendente delle chinasi prossimali nella cascata di chinasi non sono completamente conosciute, ma la funzione di TRAF dipende dall’integrità del dominio NH2-terminale. Nel lievito IRE1p, il prodotto del gene

IRE1, serve per la trasduzione dei segnali di stress dal RE determinato da una “Unfolded protein responce” (Fig 2).

Nei mammiferi sono stati identificati due omologhi dell’IRE1p: IRE1α e IRE1β, che sono correlati a proteine chinasi transmembrana del RE e sembrano essere sensibili allo stress del RE attraverso i loro domini luminali conservati. La trasduzione del segnale è associata con l’oligomerizzazione e la fosforilazione della porzione citosolica di IRE1p, e l’aumento dell’attività chinasica della proteina.

Fig 3. Schema del legame tra chaperoni (Bip), dimerizzazione di IRE1 e reclutamento di TRAF2 per l’attivazione di JNK.

Data la loro capacità di trasdurre il segnale di stress attraverso la membrana del RE e la loro somiglianza ai classici recettori transmembrana, è stato ipotizzato che le IRE1 possano anche contribuire all’attivazione delle JNKs durante lo stress.

L’attivazione di JNK da parte di segnali endogeni, iniziata nel RE, continua con una via simile a quella innescata dai recettori di superficie in risposta ai segnali extracellulari (25).

Effetti fisiopatologici dello stress del RE

a) UPR ed insulino resistenza

Lo stress del RE e la UPR sono stati coinvolti nei meccanismi patogenetici di alcune condizioni patologiche che hanno una enorme rilevanza clinica. Recentemente è stato dimostrato che tali meccanismi sono coinvolti nella patogenesi della insulino-resistenza nei soggetti obesi.

A tal proposito Ozcan e i suoi collaboratori hanno ipotizzato che il sito di produzione delle proteine nelle cellule dei mammiferi, il RE, è un importante sensore dello stress metabolico che può rendere l’insulina meno capace a mantenere l’omeostasi di glucosio. Recenti studi hanno identificato la c-Jun aminoterminale chinasi (JNK) come un nuovo membro della famiglia delle serine-chinasi che inibiscono il segnale dell’insulina. JNK è attivata dagli acidi grassi liberi, dalle citochine infiammatorie e dal fattore di necrosi tumorale TNFα. La successiva scoperta che l’obesità aumenta l’attività di JNK nei tessuti che rispondono all’insulina come il grasso, il muscolo scheletrico e il fegato, ha indirizzato ad un potenziale legame tra l’infiammazione ed il segnale di desensibilizzazione dell’insulina. Questo è dimostrato dal fatto che delezioni di JNK1 nel topo prevengono l’obesità indotta dalla fosforilazione della serina dell’IRS1 epatica e proteggono gli animali dall’insulino-resistenza (26). Per capire meglio l’obesità associata agli eventi legati a JNK1, Ozcan e coll. hanno scoperto che l’attivazione di

Fig. 4. Anche nel caso dell’insulino-resistenza esistono legami tra stress del RE (indotto da stress metabolico ed infiammatorio), l’ UPR e l’attivazione di JNK.

Ozcan et al. ipotizzano che l’obesità possa imporre uno sforzo al macchinario del RE, innescando una risposta che attiva JNK e danneggia il pathway di risposta dell’insulina. Essi hanno trovato che i marker di stress del RE, insieme a JNK attivato, erano marcatamente elevati nel tessuto adiposo e nel fegato di topi con

In colture di cellule di fegato, lo stress del RE indotto farmacologicamente causa un aumento dell’attivazione di JNK e la fosforilazione della serina di IRS1, mentre il trattamento con inibitori di JNK bloccano questi eventi indotti dallo stress. L’obesità è associata con stress metabolici ed infiammatori i cui effetti combinati aumentano il danno all’omeostasi di glucosio. L’obesità è uno stato in cui i segnali molecolari lanciati dal RE alterato, contribuiscono a compromettere l’azione insulinica. Se i danni al RE indotti dall’obessità derivano dal sovraccarico cronico di lipidi, dalle pressioni anaboliche di iperinsulinemia, dai segnali indotti dalle citochine, da una disfunzione mitocondriale, altri danni fisiopatologici devono ancora essere studiati. Un aspetto interessante di questo quadro è che gli enzimi responsabili del processamento dell’eccesso di lipidi includono diverse proteine di membrana che risiedono nel RE, e questo organello può spiegare i disturbi tissutali associati al diabete (26). Questi meccanismi implicati nell’insulino-resistenza confermano le ipotesi sul legame

che esiste tra stress del RE e attivazione delle JNKs tramite la via IRE-TRAF.

b) stress cellulare e danno ischemico

L’esposizione a stress cellulare e la conseguente attivazione della via delle MAPKs è stata dimostrata anche in condizioni patologiche quali l’ischemia miocardica o cerebrale. L’esposizione del cervello a stimoli sub-letali può proteggere da successivi danni cerebrali. Tra i trattamenti che sembrano indurre una tolleranza al danno cerebrale, troviamo l’ipertermia (27), breve ischemia sub-letale (28-30), e l’esposizione a inibitori metabolici (31). Gli specifici meccanismi molecolari implicati nello sviluppo della tolleranza al danno ischemico non sono ancora chiari ma recentemente è stato attribuito al sistema delle MAPKs un ruolo chiave nell’induzione della tolleranza al danno ischemico nel cuore (32;33) e nel cervello (34-36).

inizialmente una risposta compensatoria, sembra essere anche un fattore di predizione di danno cardiaco. A livello molecolare, gli stimoli inviati dal danno attivano i circuiti regolatori endocrino paracrino e autocrino che influenzano direttamente l’ipertrofia dei miociti cardiaci, in parte attraverso il legame a recettori di membrana accoppiati alle proteine G e a recettori tirosina chinasi. Questi recettori di membrana attivano vie intermedie di trasduzione del segnale all’interno del citoplasma come quello delle MAPKs e della proteina chinasi C (PKC) che modificano direttamente la regolazione di fattori di trascrizione promuovendo alterazioni nell’espressione genica cardiaca. Il patway ERK 1/2 rappresenta un importante regolatore dell’ipertrofia cardiaca e della sopravvivenza dei miociti (37). Le specie di ossigeno reattivo (ROS) invece hanno un ruolo importante nella patogenesi dell’aterosclerosi e di diversi danni cardiovascolari. Le ROS causano un danno ossidativo alle cellule endoteliali con conseguente crescita e rimodellamento cardiaco che è associato ad ipertensione, aterosclerosi ed

attivano la cascata delle MAPKs e che esse rappresentano un sensore dello stress ossidativo. Certi antiossidanti (flavonoidi) inibiscono l’angiotensina II stimolata da JNK e anche l’ipertrofia. La vitamina C ed un analogo della vitamina E invece, inibiscono la crescita delle cellule vascolari. Quindi il trattamento con antiossidanti provoca un’inibizione delle MAPKs che può essere sfruttata come strategia terapeutica (38). Nel SNC invece, JNK ha un ruolo importante nella regolazione dell’apoptosi neuronale, mentre il segnale p-38 sembra avere diverse funzioni, che vanno al di là del controllo della morte e della sopravvivenza cellulare (39). Nel cervello neonatale di ratto l’ipossia, 24 ore prima del danno ischemico, conferisce una significante neuroprotezione. Molti studi dimostrano che l’induzione della tolleranza al danno ischemico, sia nel cuore che nel cervello, dipende dall’attivazione delle MAPKs. L’ipossia nei neuroni di ratto induce la fosforilazione di ERK 1/2 suggerendo che essa contribuisce alla tolleranza, preservando in parte l’integrità vascolare e neuronale (40) .

Per quanto riguarda la ghiandola tiroidea, esistono pochi studi sulla relazione tra agenti che portano a stress cellulare e induzione di apoptosi.

Ricordiamo prima la fisiologia e le funzioni di questa ghiandola.

Fisiologia della ghiandola tiroidea

La tiroide è una ghiandola endocrina costituita da due lobi, riuniti anteriormente ed in basso da un istmo. Istologicamente, il tessuto tiroideo è costituito da follicoli tiroidei sferoidali, ognuno di essi composto da un singolo strato di cellule epiteliali dette tireociti. Essi riversano gli ormoni secreti nel lume dei follicoli, dove vengono conservati in un complesso proteico iodato chiamato tireoglobulina (Tg), che costituisce la sostanza colloide.

Fig. 5 Struttura del follicolo tiroideo

Quando sono stimolate, le cellule follicolari diventano cilindriche e i follicoli vengono svuotati della colloide determinando la quasi scomparsa del lume del follicolo; quando sono inibite le cellule follicolari diventano piatte e la colloide si accumula nel lume del follicolo, che risulta così aumentato.

I tireociti presentano una evidente polarizzazione morfologica: il polo apicale è ricco di microvilli ed è orientato verso il lume follicolare; il nucleo è dislocato nel versante basale della cellula ed è

circondato da una rete di cisterne del reticolo endoplasmatico rugoso; il complesso di Golgi è disposto tra il nucleo e l’apice; nella membrana basale sono dislocate le pompe. Tra queste molto importante è la pompa sodio / iodio (NIS) che è una glicoproteina di membrana situata nella porzione basolaterale della cellula follicolare tiroidea, responsabile dell’accumulo attivo di iodio all’interno della tiroide, un punto critico nella biosintesi degli ormoni tiroidei. Lo iodio è un costituente essenziale degli ormoni tiroidei (T3 – T4) ed un adeguato rifornimento per la ghiandola è cruciale per un’adeguata funzionalità del NIS e della tiroide. La proteina NIS è capace di concentrare lo iodio nel citosol di un fattore 20-40 rispetto al plasma, e questo accumulo contro gradiente elettrochimico è stimolato dal TSH per il trasporto dello iodio all’interno della cellula follicolare. Vicino al polo apicale della cellula vi sono vescicole esocitiche (gocciole secretorie) e vescicole endocitiche (gocciole di colloide) formate dall’invaginazione di parte della membrana luminale. Il lume follicolare è il sito di

il 3% dei residui aminoacidici della Tg è rappresentato da tirosina e, di questi, il 20% è iodato in seguito ad un processo post-traduzionale di iodazione ossidativa catalizzato dall’enzima tireoperossidasi (TPO).

In seguito alla stimolazione da parte dell’ormone tireostimolante o tireotropo (TSH), si avviano una serie di processi che portano alla liberazione in circolo degli ormoni tiroidei: 3, 5, 3’, 5’- tetraiodotironina (T4 o tiroxina) e, in misura minore, 3,5, 3’-

triiodotironina (T3). La T3 e la T4 sono tironine iodate: esse

contengono un anello fenolico, legato con legame etereo alla tirosina, e da 1 a 4 atomi di iodio. La T3 rappresenta l’ormone

tiroideo biologicamente attivo ed esso viene prodotto in parte nelle cellule dei tessuti bersaglio a partire dalla T4 per azione dell’enzima

deiodasi localizzato a livello del reticolo endoplasmatico. La tiroide contiene grosse quantità di T4 e T3 incorporate nella tireoglobulina,

la sola proteina all’interno della quale avviene la formazione e l’immagazzinamento dei due ormoni. Grazie a queste riserve, la T3 e

sintesi di nuovo ormone. Un adeguato apporto di iodio è essenziale per una normale funzione tiroidea. L’introduzione di iodio varia notevolmente in funzione del suo contenuto nei cibi e nell’acqua.

Lo iodio introdotto con la dieta viene assorbito rapidamente e distribuito nel liquido extracellulare. Tale compartimento riceve non solo lo iodio assunto con la dieta, ma anche quello che viene liberato dalla tiroide e quello proveniente dalla deiodazione periferica delle iodotironine. Gli ioduri abbandonano questo compartimento seguendo due vie principali: trasportati nella tiroide ed escreti nelle urine. Gli ioduri sono trasportati all’interno delle cellule follicolari tiroidee contro un gradiente elettrochimico dopodichè si diffondono rapidamente nel lume follicolare. Il trasporto degli ioduri è un punto focale dell’ormonogenesi tiroidea, dal momento che per diffusione dal liquido extracellulare non si possono ottenere quantità di ioduri sufficienti a mantenere la normale sintesi della T3 e della T4.

pompa sodio/iodio (Fig 6), induce la biosintesi del NIS de novo e modula la sua emivita (approssimativamente di 5 giorni). Inoltre è stato dimostrato che è richiesto il TSH per il reclutamento o il mantenimento di NIS sulla membrana plasmatici (41).

ATP 2 K+ 3 Na+ NIS TSHr ATP cAMP TSH T P O TG Na+ Na+ I -I -I - Na+ I -TG T_{3 T} 4 MIT DIT TG T_{3 T} 4 MIT DIT T₃ T₄ I - _Na+ I2

Fig. 6. Rappresentazione schematica della pompa Sodio/Iodio regolata dal legame del TSH al suo recettore.

Stress del RE e Tiroide

E’ riportato in letteratura che basse concentrazioni di H2O2 inducono

apoptosi in colture cellulari a monostrato di tireociti di maiale (42) e che un eccesso di iodio porta ad apoptosi le cellule tiroidee attraverso un meccanismo che induce stress ossidativi (43). E’ stato anche dimostrato che il TSH gioca un ruolo importante nella regolazione dell’apoptosi indotta dai raggi UV in colture di cellule tiroidee differenziate (44).

L’alterazione dell’omeostasi del RE, indotta farmacologicamente in linee cellulari di tiroide di ratto (FRTL-5), blocca la Tg nel reticolo stesso. Questo evento è segnalato anche fuori dal RE e risulta in una attivazione delle JNKs e del fattore nucleare k B (NF-kB) in risposta allo stress. NF-kB a sua volta attiva TRAF2 (45).

Le cellule tiroidee umane, esposte in vitro a radiazioni gamma, mostrano una ridotta espressione della tireoperossidasi (46),

indicando che l’esposizione a condizioni stressanti può danneggiare specifiche funzioni tiroidee.

SCOPO DELLA RICERCA

Scopo di questa ricerca è stato valutare quali sono i meccanismi implicati nella risposta cellulare tiroidea allo stress.

E’ possibile ipotizzare che, come già dimostrato per il cuore e per il tessuto nervoso, le condizioni di stress cellulare possono “spengere” funzioni tiroidee specifiche, come la captazione dello iodio, a favore del sistema più strettamente collegato alla sopravvivenza cellulare. Il fenomeno di ridotta captazione del radioiodio (131I), detto effetto “stunning”, descritto sia in vivo (47) che in vitro (48), si verifica in un normale tessuto tiroideo o nel cancro tiroideo differenziato, dopo somministrazione diagnostica di 131I. I meccanismi tramite i quali avviene questo fenomeno sono ad oggi sconosciuti, ma è possibile ipotizzare che appartengano ad un sistema di risposta allo stress simile a quello precedentemente descritto. E’ possibile ipotizzare

di stress cellulare che a sua volta potrebbe modulare alcune funzioni tiroidee specifiche quali la captazione dello iodio.

In questo studio abbiamo quindi voluto valutare la risposta delle cellule tiroidee a condizioni di stress cellulare ed in particolar modo i possibili effetti di stress chimici e/o fisici su funzioni tiroidee specifiche come la captazione dello iodio.

A questo scopo è stata utilizzata una linea di cellule tiroidee di ratto (FRTL-5) come modello per mantenere in vitro specifiche funzioni tiroidee come la crescita TSH dipendente, l’attività dell’adenilato ciclasi, la captazione dello iodio e l’espressione di specifici geni tiroidei come la Tireoglobulina (Tg), la Tireoperossidasi (TPO) ed il NIS (Na-iodide symporter) (49-52).

Le cellule FRTL-5 rappresentano un modello ideale per studiare gli effetti dello stress cellulare su una specifica funzione tiroidea, come la capacità di captare lo iodio.

In questa linea cellulare sono state prese in esame inoltre l’attivazione del sistema delle MAPKs e l’espressione del NIS dopo

MATERIALI E METODI

Colture cellulari e condizioni di stress cellulare

Le cellule FRTL-5 sono state messe in coltura come descritto in letteratura (53). Le cellule erano seminate e fatte crescere in mezzo 6H, Coon’s modificato da mezzo di Ham F12, supplementato con il 5% di siero bovino, gentamicina (50 µg/mL), e un mix di ormoni costituito da insulina (10 µg/mL), idrocortisone (0,36 ng/mL), transferrina (5µg/mL), somatostatina (10 ng/mL), glicil-L-Istidil-L-lisina acetato (2 ng/mL) e TSH (1 mU/mL).

Le FRTL-5 erano mantenute a 37°C in incubatore al 5% di CO2, e

al 90% di umidità. Per testare varie condizioni stressanti le cellule erano seminate ad una concentrazione di 10 x 104 cellule/pozzetto in piastre Petri. Dopo essere state mantenute 4 giorni in 6H, le cellule

mM, KH2PO4 2 mM ,pH 7.4) e successivamente erano trattate con uno dei diversi stimuli che seguono: heat shock (43°C per 30 min), NaCl (0.5 M per 30 min), sorbitolo (0.4 M per 20 min), perossido d’idrogeno (50, 100 o 500 µM per 20 min), anisomicina (10 µg/ml per 30 min), vanadato di sodio (1 mM per 20 min), arsenite di sodio (200 µM per 20 min). Dopo le condizioni di stress le cellule erano nuovamente lavate con PBS e incubate ancora in mezzo 6H fino al momento del saggio di captazione del 125I. La vitalità cellulare era determinata tramite esclusione del colorante Trypan Blue allo 0.2% e le cellule erano contate mediante un emocitometro.

Saggio di captazione dello iodio

Le cellule FRTL-5 venivano seminate in piastre da 24 pozzetti ad una densità di 100.000 cellule/pozzetto in mezzo Coon’s completo. Dopo aver sottoposto le cellule alle varie condizioni di stress, veniva testata la loro capacità di captare lo iodio a vari intervalli di tempo, incubandole per 45 minuti a 37° C in 500 µl di buffer A contenente HBSS (Hanks' balanced salt solution), lo 0.5% di BSA, 10 mM di HEPES, e 100 000 c.p.m. di Na125I (0.1 mCi) con pH 7.4. Dopo l’incubazione, le cellule sono state lavate velocemente con 2 ml di buffer A (senza Na125I) freddo, e lisate con 1 ml di NaOH 0.1 M. La radioattività di ogni pozzetto è stata contata usando un γ-counter. I risultati sono stati espressi come percentuale di captazione per pozzetto rispetto al controllo ed ogni campione era ripetuto in triplicato.

Studio delle forme attiva e inattiva delle MAPKs

Le cellule FRTL-5 erano esposte agli stimuli stressanti come descritto e 20 minuti dopo lo stress venivano incubate in ghiaccio per 30 minuti in un tampone di lisi (TRIS-HCl pH 6,8 50 mM, glycerol 10%, SDS 2,5 %, DTT 10 mM) contenente un inibitore delle proteasi (Complete mini EDTA free tablets, Roche, Basel, Switzerland). I campioni erano centrifugati a 6300 g per rimuovere i nuclei e i detriti cellulari, dopodichè 50 µl di lisato cellulare venivano risospesi in tampone

Laemmli non riducente e processati tramite la tecnica di SDS-PAGE. Dopo elettroforesi, i gel erano trasferiti su membrane di nitrocellulosa che venivano poi incubate anticorpi con anti MAPKs. Le frazioni totali di queste proteine erano rilevate tramite Western blotting utilizzando gli anticorpi anti-p38 7972), anti-ERK (sc-94) e anti-NK (sc-7345), mentre le forme attive, proteine fosforilate, erano rilevate utilizzando anticorpi anti p-p38 (sc-7975), anti p-ERK

(sc-7976) e anti p-JNK (sc-6254). Tutti gli anticorpi usati sono della Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California USA). Come controllo positivo dell’attivazione delle chinasi venivano utilizzati fibrobasti di topo, le cellule NIH 3T3 sottoposte ad heat shock..

Estrazione dell’ RNA totale, trattamento con DNAsi e

trascrizione inversa

L’RNA totale era isolato direttamente da colture di cellule FRTL-5 utilizzando Rneasy Mini Kit (Qiagen) come da protocollo. Il DNA contaminante era rimosso incubando l’RNA per 30 minuti a 37° C con 10 U di dessossiribonucleasi (Dnase 10 U/µl, Roche) in presenza di un inibitore delle ribonucleasi (Invitrigen). La qualità dell’RNA estratto era controllata tramite elettroforesi su gel di agarosio e le bande dell’ RNA, 18S e 28S, erano visualizzate grazie al bromuro di etidio sotto illuminazione a raggi ultravioletti.

Un microgrammo di RNA totale era retro-trascritto per 1 ora a 42° C in un volume di reazione di 20 µl utilizzando 200 unità di Superscript II Rnase H-reverse transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) in presenza di un mix di esameri random1.5 µM (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), DTT 0.01 M e dNTP 1 mM.

Determinazione dei livelli di mRNA di NIS tramite

real-time PCR

Oligonucleotidi primers and TaqMan probes erano disegnati usando il programma Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). Per evitare l’amplificazione del DNA genomico contaminante, veniva effettuato un trattamento dell’RNA con Dnasi come descritto sopra. La sequenza nucleotidica dei primers per r-NIS (rat-NIS) ed il probe sono state acquistate da Applied Biosystems. La reazione di PCR quantitativa era effettuata in piastre da reazione ottica da 96 pozzetti utilizzando un cDNA equivalente a 0.5 ng dell’RNA totale per ogni

campione, in un volume finale di reazione di 50 µl usando la TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) secondo protocollo.

La reazione di PCR quantitativa veniva sviluppata nel termociclizzatore ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA). Le condizioni dei cicli di amplificazione comprendevano un’iniziale denaturazione a 95° C per 10 minuti e 40 cicli del secondo step di PCR, comprendevano 15 secondi di denaturazione a 95° C e 1 minuto di annealing-elongation a 60° C, utilizzando il protocollo standard. I campioni erano analizzati in triplicato e la variazione era minore dell’1%. Per minimizzare gli errori provenienti dalla variazione della quantità di RNA di partenza presente nei vari campioni, veniva amplificato anche l’RNA per β-actina (espressione genica di controllo), per normalizzare i valori di RNA per NIS.

I primers e il probe per β-actina erano acquistati da Applied Biosystems, Foster City, CA. I risultati normalizzati, erano espressi

come rapporto dell’epressione del NIS nelle cellule trattate con heat shock verso le cellule non trattate.

Studio della proliferazione cellulare

La proliferazione cellulare è stata valutata tramite ELISA, un metodo colorimetrico per quantificare la proliferazione cellulare, basato sull’incorporazione della Bromo-deossi-Uridina (BrdU) durante la sintesi del DNA delle cellule che stanno proliferando (kit commerciale Roche). Ogni campione era ripetuto in triplicato e i risultati erano espressi come assorbanza, che risultava direttamente proporzionale alla quantità di BrdU incorporata.

RISULTATI

Effetti dello shock termico sulla captazione del

I

In primo luogo è stato valutato l’effetto di una condizione di stress specifica quale è lo shock termico (heat shock) sulla capacità di captare lo iodio da parte delle cellule FRTL-5. I saggi di captazione del 125I sono stati eseguiti dopo incubazione delle cellule alla temperatura di 43° C per 15 o 30 minuti. Nelle cellule trattate, 48 ore dopo lo shock termico si evidenziava una riduzione della captazione dello iodio, rispetto alle cellule non trattate, pari a circa il 20% dopo 15 minuti, e 40% dopo 30 minuti. (Fig. 7). In entrambe queste condizioni la captazione dello iodio ritornava a valori simili a quella osservata nelle cellule di controllo circa 96 ore dopo l’esposizione allo stress. Durante tutta la durata dell’esperimento, la

vitalitá cellulare, valutata mediante colorazione con Trypan Blue, non veniva influenzata dall’ esposizione allo stress cellulare.

Fig 7. Captazione del 125I, espressa in %, da parte delle FRTL-5 non trattate e dopo 15’ o 30’ di heat shoch a 43° C.

20 40 60 80 100 120 12h 24h 48h 72h 96 120 NT HS 15' HS 30'

Effetti dello shock termico sull’attivazione delle

MAPchinasi

Dopo aver verificato che l’heat shock può influenzare la capacità di captare lo iodio da parte delle cellule FRTL-5, abbiamo valutato gli effetti di tale condizione sull’ attivazione delle vie di risposta cellulare agli stress ed in particolar modo abbiamo studiato il pattern di attivazione della MAPK in queste condizioni (Fig 8).

1 2 3 4

Fig 8. Espressione delle forme inattive (ERK, JNK e p-38), attive (p-ERK, p-JNK e p-p38) e della β-actina dopo heat shock. 1) NIH 3T3 heat shock 2) L5 non trattate 3) L5 heat shock 15’ 4) L5 heat shock 30’ .

p-JNK

JNK

β-actina

ERK

p-ERK

p-p38

p-38

In particolare dopo heat shock era possible dimostrare una rapida fosforilazione delle JNKs e soprattutto della isoforma JNK2 (l’isoforma di 56 kD). La fosforilazione risultava più intensa dopo l’esposizione allo shock termico per 30 minuti rispetto a quello di 15 minuti, dimostrando che l’attivazione di JNK da parte dell’heat shock è dipendente dalla intensità dello stress a cui sono esposte le cellule. Le chinasi ERK e p-38 risultatvano fosforilate giá in condizioni basali e l’esposizione ad heat shock non aveva un significativo effetto sulla loro attivazione (Fig 8).

Effetti di altri tipi di stress cellulare sull’attivazione di

JNK

La fosforilazione di JNK è stata valutata dopo l’esposizione delle cellule FRTL-5 ad altre condizioni di stress fisico o chimico. In particolare è stato valutato l’effetto dello shock osmotico (NaCl 0.5

ossidativo (perossido d’idrogeno 500 µM per 20 min), da agenti chimici (anisomicina 10 µg/ml per 30 min, vanadato di sodio 1 mM per 20 min, arsenite di sodio 200 µM per 20 min). I risultati di tale esperimento sono riportati nella Fig 9. Era evidente una fosforilazione di JNK 2, dopo stress ossidativo indotto con H2O2, ed

un’ attivazione di JNK più debole dopo stress osmotico indotto con NaCl o sorbitolo. L’isoforma JNK 1 risultava fosforilata in tutte le condizioni esaminate.

Fig 9. Espressione della forma inattiva (JNK), attiva (p-JNK) e della β-actina dopo i seguenti trattamenti: 1) cellule non trattate 2) heat shock 3) H2O2 4) NaCl 5) Sorbitolo 6) Anisomicina 7)

Arsenite di sodio 8) Vanadato di sodio

p-JNK

JNK

β-actina

Effetti di altri tipi di stress cellulare sulla captazione del

_I

La capacitá di captare lo iodio da parte delle cellule FRTL-5 è stata valutata in tutte le condizioni in cui è stata studiata la fosforilazione di JNK. Il test di captazione dello iodio indicava che nel caso dei trattamenti con anisomicina, arsenite e vanadato la capacità di captare lo iodio era del tutto sovrapponibile a quella delle cellule non trattate.

Dopo 48 ore dallo stress le cellule esposte a shock osmotico mostravano invece una riduzione della captazione pari a circa il 35% per l’NaCl e al 20% per il sorbitolo. In entrambe queste condizioni la captazione dello iodio ritornava a valori simili a quella osservata nelle cellule di controllo circa 96 ore dopo l’esposizione allo stress. L’ H2O2 utilizzata alla concentrazione di 500 µM,

riduceva la captazione dello iodio del 60% ma in questo caso le cellule non erano capaci di recuperare una normale capacitá

iodocaptante (Fig. 10). In questa condizione si osservava un marcato aumento della mortalità delle cellule trattate.

Fig. 10. Captazione del 125I in cellule sottoposte ai seguenti stress cellulari: heat shock (43° C per 30 min), NaCl (0,5 M per 30 min), Sorbitolo (0,4 M per 20 min), H2O2 (500 µµµµM per 20 min),

Anisomicina (10 µµµµg/ml per 20 min), Vanadato di Sodio (1 mM per 20 min) e Arsenite di Sodio (10 mM per 20 min).

0 20 40 60 80 100 120 6h 12h 24h 48h 72h 96h non trattate Nacl Sorbitolo H2O2 Anisomicina Vanadato Arsenite heat shock

Per verificare se tale effetto “tossico” sulle FRTL-5 fosse determinato dall’utilizzo di una concentrazione troppo elevata di H2O2, il test di captazione del 125I è stato ripetuto utilizzando anche

concentrazioni più basse di H2O2 (100 e 50 µM). I risultati di tale

esperimento sono riassunti nella Fig 11. Alla concentrazione piú bassa di H2O2 (50 µM) si aveva una transitoria riduzione della

captazione del 125I. A concentrazioni piú elevate prevalevano gli effetti tossici sulle cellule FRTL-5.

Fig. 11. Captazione del 125I in cellule trattate con con varie

20 40 60 80 100 120 6h 12h 24h 48h 72h 96h non trattate H2O2 500 mcM H2O2 100 mcM H2O2 50 mcM

Studio dell’espressione del NIS tramite real time PCR

Per valutare il meccanismo coinvolto nella transitoria riduzione della captazione dello iodio dopo stress cellulare, abbiamo studiato l’espressione del mRNA del gene NIS mediante Real Time PCR, nelle cellule FRTL-5 esposte ad heat shock per 30 minuti, condizione in cui si verificava una più evidente riduzione della captazione dello iodio. In Fig 12 è riportata la percentuale di espressione di mRNA del NIS rispetto alle cellule non trattate. Nelle prime 12 ore dopo lo stress si verifica una riduzione dell’espressione del NIS pari a circa il 50% rispetto alle cellule non trattate. Successivamente l’espressione del NIS nelle cellule “stressate” tende ad aumentare raggiungendo valori pari a circa il 150% rispetto alle cellule di controllo, tra 12 e 48 ore. Dopo 72 ore i livelli di mRNA del NIS nelle cellule trattate tornano a valori simili a quelli osservati nelle cellule di controllo.

0 50 100 150 200 0 50 100 150 ore % E s p re s s io n e N IS

Fig. 12. Espressione del NIS in %. I risultati normalizzati, erano espressi come rapporto dell’epressione del NIS nelle cellule trattate con heat shock verso le cellule non trattate.

Effetti del trattamento con heat shock e con H

O

sulla

proliferazione cellulare

La proliferazione delle cellule FRTL-5, dopo esposizione a stress cellulare, è stata valuata mediante test di incorporazione della BrdU. La velocitá di proliferazione delle cellule esposte a heat shock per 30 minuti o ad H2O2 50 µM era simile a quella delle cellule non

trattate per le prime 48 ore. Successivamente le cellule esposte a stress presentavano un rallentamento della proliferazione cellulare rispetto alle cellule non trattate (Fig. 13).

Fig. 13. Velocità di proliferazione cellulare espressa in assorbanza, in cellule non trattate e in cellule trattate con heat

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 20 40 60 80 100 120 ore A s s o rb a n z a NT H2O2 heat shock

I risultati scientifici ottenuti da questi studi sono stati presentati ai seguenti Congressi:

1. XXV Giornate Endocrinologiche Pisane. Pisa, 3-5 giugno 2004

2. XXII Giornate Italiane della Tiroide. Salerno, 2-4 dicembre 2004

3. 31° Congresso Nazionale della Società Italiana di Endocrinologia. Genova, 4-7 maggio 2005 4. XXVI Giornate Endocrinologiche Pisane. Pisa, 8-10 giugno 2006

5. XXIV Giornate Italiane della Tiroide. Modena, 30 novembre, 1-2 dicembre 2006

Questo lavoro è stato inoltre spedito alla rivista internazionale J. Endocrinol. Invest. (“in submitted”)

DISCUSSIONE

In questo lavoro è stata studiata in vitro la risposta di cellule differenziate di tiroide di ratto (FRTL-5) a varie condizioni di stress, assumendo come parametro di funzione tiroidea specifica la capacità di captare lo iodio. La captazione di iodio da parte delle cellule tiroidee è uno step fondamentale nella sintesi degli ormoni tiroidei e condizioni capaci di alterare tale processo possono avere significanti effetti sulla funzione tiroidea.

I risultati ottenuti suggeriscono che le cellule tiroidee possono adattarsi a differenti condizioni di stress cellulare, come cambiamenti di pressione osmotica nel loro microambiente, shock termico o danni ossidativi. Durante tale periodo di adattamento, le cellule FRTL-5 mostrano una riduzione transitoria della capacità di captare lo iodio a partire da circa 24 dopo l’esposizione alla condizione di stress ed un completo recupero di questa funzione dopo 72-96 ore.

L’esposizione di cellule a condizioni di stress danneggia la struttura e la funzione di macromolecole (lipidi, proteine e acidi nucleici) essenziali alla sopravvivenza cellulare. La risposta cellulare comprende la attivazione di un set di proteine (tra queste le heat shock protein), la cui struttura e funzione è altamente conservata nel corso dell’evoluzione e ha il fine di mantenere l’integrità genomica e macromolecolare durante le condizioni di stress.

Uno dei principali bersagli cellulari dello sress è il reticolo endoplasmatico (RE) che rappresenta il sito di sintesi, di ripiegamento e di modificazione delle proteine secretorie. Il RE contiene delle molecole che rilevano la presenza di proteine “non-piegate” (unfolded) o non correttamente conformazionate (misfolded) e danno inizio a cambiamenti dell’espressione genica. La risposta alle proteine “non-piegate” (Unfolded Protein Response: UPR) consiste in un’induzione della trascrizione di geni che potenziano la capacità del RE di determinare una corretta conformazione delle proteine (chaperoni molecolari ed enzimi di

proteine “non-essenziali” in modo da ridurre il carico di proteine sul RE. E’possibile ipotizzare che nelle cellule FRTL-5 lo shock termico, osmotico od ossidativo, determini la attivazione di meccanismi molecolari che permettono alle cellule di superare la condizione critica a cui sono esposte e che in tale situazione vengano ridotte funzioni non strettamente coinvolte nella sopravvivenza cellulare come la capacitá di captare lo iodio. E’stato dimostrato che in cellule FRTL-5, l’alterazione dell’omeostasi del RE, indotta farmacologicamente, blocca la sintesi di tireoglobulina. Inoltre, cellule tiroidee umane esposte in vitro a radiazioni gamma mostrano una ridotta espressione della tireoperossidasi (46), indicando che l’esposizione a condizioni stressanti può danneggiare specifiche funzioni tiroidee. E’ possibile ipotizzare che nelle stesse cellule, la riduzione transitoria della captazione dello iodio da noi osservata dopo lo stress cellulare, sia mediata da una riduzione dell’espressione della pompa sodio / iodio (NIS), che è una glicoproteina di membrana situata nella porzione basolaterale della

iodio all’interno della tiroide. Per confermare tale ipotesi abbiamo studiato l’espressione del mRNA del gene NIS nelle cellule esposte ad heat shock ed abbiamo verificato che si ha una rapida riduzione dell’espressione del gene NIS nelle prime 12 ore dopo lo stress. Successivamente, l’espressione del NIS nelle cellule “stressate” aumenta raggiungendo valori pari a circa il 150% rispetto alle cellule di controllo dopo 48 ore. Dopo 72 ore i livelli di mRNA del NIS nelle cellule trattate tornano a valori simili a quelli osservati nelle cellule di controllo. Le variazioni dell’espressione del mRNA del NIS precedono di circa 12-24 ore le variazioni della capacitá di captare lo iodio che si osserva nelle cellule esposte a stress cellulare e tale dato sembra confermare l’ipotesi che effettivamente nelle cellule tiroidee l’adattamento a condizioni “ambientali” difficili sia associato ad una transitoria riduzione di funzioni specifiche.

Nelle cellule esposte a stress cellulare, esiste una relazione particolare tra UPR e attivazione di JNKs, che vengono anche dette SAPKs (Stress-activated protein Kinases).

Gli attivatori “a monte” del segnale JNK sono organizzati in una cascata di chinasi ed il legame meglio caratterizzato è quello tra i recettori per i fattori di necrosi tumorale (TNF). Questo legame dipende dal reclutamento di proteine adattatrici conosciute come TRAFs, che si legano alla parte citosolica dei recettori TNF, risultando essenziali nella trasmissione del segnale. Le TRAFs attivano le chinasi prossimali iniziando una fosforilazione a cascata che culmina nella attivazione di JNK. E’stato dimostrato che TRAF puó essere anche attivata da IRE1, una proteina presente sulla membrana del RE che si attiva quando si accumulano nel RE proteine unfolded o misfolded (Fig 2). Attraverso TRAF dunque, fattori esogeni come il TNF o endogeni come la UPR determinano la attivazione della JNK. L’attivazione di JNK da parte di segnali endogeni, iniziata nel RE, continua con un “pathway” simile a quella innescata dai recettori di superficie in risposta ai segnali extracellulari (25). La interazione tra stress del RE e attivazione di JNK ha un ruolo rilevante nella comparsa di insulino resistenza nei

funzione a cui è esposto il RE degli adipociti nei soggetti obesi determini la attivazione di JNK e attraverso questa via l’ inattivazione del recettore insulinico.

Anche nella tiroide è stata dimostrata un’attivazione di JNK.

In seguito a stress del reticolo endoplasmatico indotto farmacologicamente, viene bloccata la Tg nel reticolo stesso e questo evento è segnalato anche fuori dal RE tramite l’attivazione di JNK (45). Non è nota invece l’attivazione della via delle JNKs in relazione a funzioni tiroidee specifiche.

In questo lavoro abbiamo dimostrato che anche nelle cellule FRTL-5 l’esposizione a shock termico, osmotico o ossidativi determina l’attivazione di JNK. In particolare abbiamo verificato che nel caso dell’heat shock l’intensitá della attivazione dei JNK é correlata alla durata del trattamento, risultando significativamente piú elevata nelle cellule incubate alla temperatura di 43° C per 30 minuti rispetto a quelle trattate per solo 15 minuti. È interessante osservare che anche l’entitá della riduzione della captazione dello iodio da

termico. Inoltre, l’incubazione delle cellule con alcuni agenti chimici (vanadato e arsenite di sodio e anisomicina) non ha alcun effetto sulla fosforilazione di JNK, almeno nelle nostre condizioni sperimentali, e non ha alcun effetto sulla captazione dello iodio, suggerendo quindi una possibile relazione tra i due eventi. Questi dati indicano che, analogamente a quanto osservato per l’insulino resistenza negli adipociti, la attivazione di JNK possa svolgere un ruolo chiave nella regolazione di funzioni specifiche nelle cellule tiroidee esposte a stress cellulari. I nostri dati indicano inoltre che l’ H2O2 induce una fosforilazione di JNK nelle cellule FRTL-5,

suggerendo che tale via può essere implicata nel complesso processo della difesa contro lo stress ossidativo.

Infine è da rilevare che, la velocitá di proliferazione delle cellule FRTL-5 esposte a heat shock per 30 minuti o ad H2O2 50 µM é

simile a quella delle cellule non trattate per le prime 48 ore e che successivamente le cellule esposte a stress presentano un rallentamento della proliferazione cellulare. Tale dato è in accordo

di stress sul controllo del ciclo cellulare che porta all’arresto della crescita in G1/S (7) o G2/M (8).

Tale dato conferma che le condizioni di stress utilizzate nelle nostre condizioni sperimentali sono sufficienti a determinare una risposta cellulare adeguata.

È interessante osservare che sia gli effetti sulla captazione dello iodio che quelli sulla proliferazione cellulare si verifichino a concentrazioni di TSH costante. Il TSH è il principale regolatore della funzione tiroidea in vivo ed in vitro e nelle cellule FRTL-5 la proliferazione cellulare e l’attivazione di funzioni specifiche come la captazione dello iodio sono strettamente dipendenti dalla presenza e dalla concentrazione del TSH. Nelle nostre condizioni sperimentali la presenza di TSH era necessaria affinché fosse attivo il meccanismo di captazione dello iodio da parte delle cellule FRTL-5, ma la sua concentrazione veniva mantenuta costante durante tutta la durata degli esperimenti. Nonostante ciò, le cellule esposte a stress cellulare presentavano variazioni della capacitá iodocaptante e

Questa osservazione suggerisce che in condizioni di stress altri fattori oltre al TSH possono avere un ruolo chiave nella regolazione della funzione e della crescita della tiroide.

CONCLUSIONI

In conclusione in questo lavoro abbiamo dimostrato come l’esposizione di cellule tiroidee differenziate a condizioni di shock termico, osmotico o ossidativo determini una transitoria riduzione di una funzione specifica della tiroide quale è la capacitá di captare lo iodio. Tale fenomeno, verosimilmente in relazione alla riduzione dell’espressione del NIS, si associa alla attivazione di meccanismi intracellulari regolati dalla attivazione di JNK ed è indipendente dal TSH. In vivo questo meccanismo potrebbe essere responsabile dell’effetto “stunning”, definito come la ridotta captazione del radioiodio (131I) che si verifica in un normale tessuto tiroideo o nel cancro tiroideo differenziato, dopo somministrazione diagnostica di

131_{I. E’ inoltre possibile che lo stesso meccanismo venga utilizzato}

da fattori come il TNF che, attraverso l’attivazione del pathway delle JNKs, possono modulare la crescita e la funzione tiroidea in

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