UNIVERSITÀ DI PISA
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Tesi di Laurea
Valutazione del profilo farmacocinetico di luteolina,
finalizzato allo sviluppo di formulazioni innovative,
atte a migliorare la biodisponibilità del flavone
Relatori:
Dott. Vincenzo Calderone Dott. Silvio Chericoni Dott.ssa Lara Testai
Candidato:
Eleonora Lucchesi
Sommario
1. INTRODUZIONE
11.1 Flavonoidi 1
1.1.1 Aspetti generali 1
1.1.2 Attività dei flavonoidi 4 1.1.3 Assorbimento, metabolismo ed escrezione dei
flavonoidi 8
1.1.4 Luteolina 13
1.2 Fitosomi 19
1.2.1 Proprietà dei fitosomi 19 1.2.2 Struttura dei fitosomi 22 1.2.3 Tecnologia dei fitosomi 23 1.2.4 Differenze tra fitosomi e liposomi 25
2. SCOPO DELLA RICERCA
273. MATERIALI E METODI
293.1 Sperimentazione in vivo 29
3.1.1 Animali 29
3.1.2 Procedura chirurgica 31
3.1.3 Esperimento 33
3.2 Tecnica gas-cromatografica con detector massa
(GC/MS) 34
3.2.2 La spettrometria di massa 35
3.3 Metodica utilizzata 40
3.4 Solventi e sostanze utilizzate 41
3.5 Strumentazione 42
3.6 Retta di taratura 43
4. RISULTATI E DISCUSSIONE 45
4.1 Risultati 45
4.2 Determinazione di luteolina nel sangue intero di
ratto 48
4.3 Risultati farmacocinetici 52
4.3.1 Somministrazione endovenosa 52 4.3.2 Somministrazione orale 54
Abstract
I flavonoidi sono un vasto gruppo di sostanze polifenoliche di origine vegetale, che assumiamo quotidianamente con la dieta. Hanno una struttura chimica costituita da 15 atomi di carbonio e possono essere legati a zuccheri oppure in forma agliconica. Mentre i primi devono subire idrolisi del legame glucosidico per poter essere assorbiti, i secondi passano direttamente nell’intestino tenue.
L’interesse nei confronti dei flavonoidi è cresciuto negli ultimi
anni grazie alle numerose proprietà che essi presentano, di cui la più nota è quella antiossidante.
Tuttavia, il principale problema che presentano queste sostanze è l’intenso metabolismo di primo passaggio epatico che
subiscono e, allo scopo di migliorarne la biodisponibilità, sono state sviluppate formulazioni innovative, basate sull’impiego di macromolecole in grado di incorporare i flavonoidi con fosfolipidi: i fitosomi.
Quest’ultimi hanno la funzione di proteggere i flavonoidi dalle secrezioni digestive e dai batteri intestinali ed aumentarne l’assorbimento, limitare l’impatto del metabolismo di primo
passaggio epatico e, dunque, migliorarne la biodisponibilità orale.
In questo lavoro di tesi è stata studiata la farmacocinetica del flavone luteolina, al fine di ottimizzare tutte le metodiche sperimentali necessarie per il futuro studio di formulazioni innovative di questo flavonoide.
Gli esperimenti sono stati condotti su ratti Wistar Kyoto albini a cui è stata somministrata luteolina sia per via endovenosa che orale.
Durante un tempo di 4 ore di esperimento sono stati prelevati campioni di sangue a tempi stabiliti e, su questi , è stata fatta un’analisi con la tecnica gas-cromatografica.
Per quanto riguarda la somministrazione endovenosa si osserva una rapida cinetica di eliminazione data da una probabile estesa biotrasformazione.
Considerando i dati della luteolina assunta per os, viene messa in evidenza una bassa biodisponibilità orale.
La metodica sviluppata sarà dunque utilizzata in futuro, per lo sviluppo di formulazioni innovative di luteolina.
1
Capitolo 1
Introduzione
1.1 Flavonoidi
1.1.1 Aspetti generali
I flavonoidi sono un vasto gruppo di composti polifenolici, a basso peso molecolare. Essi sono metaboliti secondari di molte piante presenti nella dieta, la cui assunzione quotidiana è nell’ordine di 200-1000mg (Kuhnau, 1976).
I flavonoidi sono responsabili delle principali caratteristiche organolettiche di cibi e bevande derivanti da piante e contribuiscono alle proprietà nutritive di frutta e verdura (De Groot e Raven, 1998).
Possiamo trovarli all’interno di noci, semi, fiori, radici, cortecce, cacao, caffè, vino e tè (Hollman e Katan, 1999; Middleton et al., 2000; Manach et al., 2004) .
2 I flavonoidi vennero scoperti per la prima volta nel 1930, quando Szent-Gyorgyi isolò una nuova sostanza dalle arance: inizialmente si pensava facesse parte di una classe di vitamine e venne chiamata vitamina P. In seguito divenne chiaro che questa sostanza fosse un flavonoide, la rutina, e ad oggi sono state identificate più di 4000 varietà di sostanze con struttura chimica simile (Middleton,1998).
I flavonoidi hanno un nucleo comune di 15 atomi di carbonio, (Figura1.1) costituito da due anelli aromatici (A e B), collegati da un etere ciclico (C) (Groenenboom et al., 2013).
Figura 1.1: struttura generale dei flavonoidi
Essi possono essere divisi in 6 classi: flavoni (luteolina, apigenina,baicalina), flavonoli (fisetina, kampferolo, quercetina, miricetina), flavanoni (esperetina, naringenina, calconi,
3 eriodictiolo), isoflavoni (daidzeina, genisteina), antocianine (cianidina, pelagronidina) e flavanoli (catechine, proantocianidine) (Manach et al., 2004).
Le molecole facenti parte di queste classi differiscono per il grado di ossidazione ed i sostituenti sull’anello C (Middleton, 1998).
Possiamo trovare i flavonoidi in forma di agliconi, oppure legati a zuccheri come β glucosidi (quercitina). Possono inoltre essere presenti come dimeri o polimeri (procianidine) oppure esterificati in strutture più complesse.
Nella maggior parte dei casi, nella stessa pianta, si trovano contemporaneamente vari tipi di flavonoidi, in relazione alla specie botanica, alla parte della pianta utilizzata ed alla tecnica estrattiva (Kumpulainen e Salonen, 1999; Skibola e Smith, 2000).
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1.1.2 Attività dei flavonoidi
“Nutraceutico” è un termine coniato nel 1979 da Stephen DeFelice (DeFelice, 1992) ed è definito come “alimento o parti di esso che forniscono benefici medici, tra cui la prevenzione e la cura di malattie”.
Un prodotto nutraceutico è quindi un qualsiasi estratto alimentare non tossico di cui siano stati comprovati benefici sia per la cura che per la prevenzione di malattie (Dillard e German, 2000).
Nelle piante, i principali costituenti attivi come nutraceutici sono i flavonoidi e, recentemente, è incrementato l’interesse nei confronti delle potenzialità terapeutiche di queste sostanze (Pourmorad et al, 2006; Kumar e Pandey, 2012).
La principale proprietà riconosciuta ai flavonoidi è l’attività antiossidante: sono detti ‘radical scavenger’ (‘spazzini di radicali’) nel senso che riducono la concentrazione di radicali liberi.
I radicali liberi ed in particolare i ROS (specie reattive dell’ossigeno) possono essere prodotti durante il fisiologico metabolismo dell’ossigeno o a causa di danni esogeni (De
5 Groot, 1994; Grace, 1994) e sono responsabili della maggior parte delle malattie umane.
I flavonoidi agiscono da antiossidanti grazie alla configurazione, alla sostituzione e al numero totale di ossidrili presenti sulla molecola e, riducono così l’incidenza di molte malattie (Kelly et al., 2002; Pandey et al., 2012).
Le varie molecole, appartenenti a classi di flavonoidi diverse, mostrano molteplici attività.
Un grande numero di flavonoidi, come esperidina, apigenina, luteolina e quercetina mostrano attività antinfiammatoria, in quanto inibiscono la via lipossigenasica e quella ciclossigenasica (Kim et al., 1998; Jachak, 2001).
Alcuni flavonoidi, come apigenina, naringenina e luteolina, agiscono a livello cardiovascolare, oltre ad avere un effetto cardioprotettivo prevengono le disfunzioni endoteliali, date da uno squilibrio tra fattori vasocostrittori e rilascianti, a favore di quest’ultimi (Iijima e Aviram, 2001; Bernatova et al., 2002).
Di conseguenza, il consumo di queste sostanze ritarda la comparsa di aterosclerosi, la formazione di trombi nelle arterie
6 e l’ipertensione (Jayakody et al., 1985; Hertag et al. 1993; Hertog et al., 1993).
Apigenina, naringenina, quercetina, rutina e catechina mostrano attività epatoprotettiva antiulcera, ed antidiabetica (Tapas et al., 2008; Alarcon et al.,1994; Carlo et al.,1993; Vessal et al., 2003).
È stato osservato che frutta e verdura contenenti flavonoidi, hanno un’azione chemio preventiva: la quercetina è infatti associata alla diminuzione dell’incidenza del cancro alla prostata, allo stomaco, ai polmoni ed al seno.
Apigenina, galangina, flavoni, glucosidi flavonolici, isoflavoni, flavononi e calconi mostrano attività antibatterica, infatti, i flavonoidi vengono sintetizzati dalle piante in risposta ad un’infezione microbica, di conseguenza non deve impressionarci il mantenimento di questa attività anche in vitro (Mishra et al., 2013 A; Mishra et al., 2013 B; Mishra et al., 2011; Pandey et al., 2010; Cushnie e Lamb, 2005).
Infine ai flavonoidi sono state riconosciute proprietà antivirali sin dagli anni 40, ma solo recentemente sono stati fatti tentativi per modificarli sinteticamente, così da incrementarne l’attività (Selway, 1986).
7 In particolare, Gerdin e Srensso hanno dimostrato che i flavonoli sono più attivi, rispetto ai flavoni ed ai flavononi, nell’inibizione selettiva di HIV 1 ed HIV 2 (Gerdin e Srensso,
8
1.1.3 Assorbimento, metabolismo ed escrezione dei
flavonoidi
L’assorbimento dei flavonoidi presenti nella dieta dipende dalle
proprietà fisico-chimiche di questi, come la grandezza molecolare, la configurazione, la lipofilicità, la solubilità e la pKa.
I flavonoidi possono essere assorbiti direttamente nell’intestino tenue o giungere fino al colon per essere poi assorbiti.
La differente via dipende dalla struttura dei flavonoidi, che può essere sia glicosidica che agliconica (Figura 1.2). La maggior parte dei flavonoidi è presente nelle piante legata ad uno zucchero, come β-glicoside.
9 Attraverso l’uso di modelli di assorbimento in vitro, su cellule Caco-2 monostratificate, è stato osservato che gli agliconi penetrano molto più facilmente la membrana intestinale, rispetto ai glicosidi (Zuo et al., 2006).
I flavonoidi glicosilati, per essere assorbiti dall’intestino tenue possono seguire due vie: la prima consiste nel passaggio della membrana intestinale grazie co-trasportatore glucosio/Na+ dipendente; la seconda consta dall’idrolisi del legame glicosidico e trasformazione del flavonoide glicosilato in aglicone (Hollman et al.; 1999).
A dimostrazione di ciò, molti studi hanno documentato la presenza di β-glicosidasi, nell’epitelio dell’intestino tenue, che idrolizzano il legame del flavonoide con lo zucchero (Ioku et al., 1998; Day et al., 1998).
È stato inoltre osservato che l’enzima lattasi- flourizina –idrolasi (LPH), una β-glicosidasi presente sulla membrana esterna dell’orletto a spazzola dell’intestino tenue, può idrolizzare il legame β-glicosidico e, l’aglicone liberato, può essere assorbito attraverso diffusione passiva dalle cellule endoteliali enterali (Day et al., 2000; Day et al., 2003).
10 I flavonoidi glicosilati, che non sono substrato dell’enzima LPH, vengono trasportati attraverso il colon, dove i batteri rompono sia il legame glucosidico che l’aglicone appena formato (Scheline 1973).
Dal momento che la capienza del colon è minore rispetto a quella dell’intestino tenue, l’assorbimento di glicosidi in questo
distretto sarà di bassa entità.
Per quanto riguarda l’intenso metabolismo che subiscono i flavonoidi, assunti per via orale, fegato ed intestino ne sono i principali responsabili.
La maggior parte delle ricerche si sono concentrate sul metabolismo intestinale ed è stato osservato che la principale reazione di biotrasformazione che subiscono i flavonoidi è la glucuronidazione mediata da UDP-glucurosil-trasferasi. È stato fatto, per esempio, uno studio sull’assunzione, per via orale, di kampferolo nell’uomo, ed è stato osservato che la sostanza
viene metabolizzata e la ritroviamo nel sangue come 3-O-glucuronide (Chen et al.,2005).
Per quanto riguarda il metabolismo a livello epatico, sono presenti un minor numero di studi, che però concordano sul
11 fatto che i flavonoidi subiscano reazioni di glucuronidazione anche a questo livello (Chen et al., 2005).
I flavonoidi possono inoltre subire reazioni di O-metilazione, solfatazione e biotrasformazione in composti fenolici più piccoli (Bravo, 1998).
Tutte queste reazioni metaboliche, fanno sì che non si trovino flavonoidi liberi, sottoforma di agliconi, in sangue o urine, ad eccezione delle catechine (Hollman, 2004).
Sia i flavonoidi che vengono secreti attraverso la bile nell’intestino crasso sia quelli che non possono essere assorbiti dall’intestino tenue vengono portati al colon e qui, sono degradati dalla microflora, che rompe la struttura ad anello (Figura 1.3).
12
Figura 1.3: metabolismo dei flavonoidi
La biodisponibilità dei flavonoidi glicosilati varia in relazione alla loro porzione zuccherina. All’interno delle varie sottoclassi gli isoflavoni sono quelli con maggiore biodisponibilità (Spencer, 2000).
13
1.1.4 Luteolina
Figura 1.4: struttura luteolina
La luteolina (3’,4’,5,7-tetraidrossiflavone) (Figura1.4) è un flavonoide appartenente alla sottoclasse dei flavoni. Essa è estratta dalla Perilla frutescens: qui è presente sia nei semi, in forma agliconica, che nelle foglie, in forma glicosidica. Possiamo inoltre trovare la luteolina glicosilata in una vastissima gamma di specie vegetali, in particolare, nel pepe verde, nella camomilla e nel tè (Shimoi et al., 1998; Kim et al., 2003; Lopez-Lazaro M,2009)
Fin dall’antichità questo flavone veniva usato nella medicina cinese per le sue innumerevoli proprietà farmacologiche e, ad oggi, numerosi studi ne hanno dimostrato i numerosi effetti terapeutici.
14 Molti studi epidemiologici hanno stimato la possibile associazione tra un elevato consumo di luteolina ed il rischio di sviluppare malattie croniche, dimostrando una significante riduzione dell’incidenza di quest’ultime (Lopez-Lazaro, 2009).
Tra le varie proprietà farmacologiche attribuite alla luteolina, è stata dimostrata una marcata capacità antiossidante, antibatterica ed anticancerogenica (Seelinger et al., 2008; Lopez-Lazaro, 2009).
A livello dell’apparato cardiovascolare è stato osservato che questo flavone può prevenirne le complicazioni ed avere un’attività cardioprotettiva, abbassando la pressione sanguigna e riducendo i livelli di colesterolo (Park et al. 2007; Seelinger et al., 2008; Lopez-Lazaro, 2009). Calderone et al. hanno dimostrato che la luteolina ha un effetto vasodilatante sull’aorta toracica di ratto (Calderone et al., 2004) e Qi et al. ne hanno evidenziato la capacità di attenuare l’apoptosi cellulare in seguito a danno da ischemia e riperfusione in cardiomiociti di ratto adulto (Qi et al.,2011).
L’attività antinfiammatoria della luteolina è stata osservata in
15 l’infiammazione cronica ed acuta, sia per via topica che per via orale (Cholbi et al., 1991; Robak et al., 1988).
Una proprietà farmacologica fondamentale, riconosciuta a questo flavone, è quella antitumorale: è stato infatti dimostrato che, anche a bassi dosaggi, ha un’intensa attività, in quanto agisce andando ad arrestare il ciclo vitale delle cellule cancerogene, portandole a morte (Horinaka et al., 2005; Ju et al., 2007).
Per quanto riguarda l’assorbimento della luteolina, possiamo osservare che, come tutti i flavonoidi, se essa è nella forma agliconica, viene assorbita nell’intestino tenue attraverso diffusione passiva, mentre la forma glicosidica deve prima essere idrolizzata ad aglicone dalla microflora intestinale o dall’enzima LPH (Shimoi et al., 1998; Sesink et al ., 2003; Kottra and Daniel, 2007; Lu et al., 2010).
I dati relativi alla farmacocinetica di luteolina sono contraddittori e, gli studi del gruppo di Jiang H. e Zeng S., hanno fornito indicazioni preliminari riguardo ai principali parametri cinetici di questo flavone. Essi hanno infatti effettuato ricerche sul fiore di Chrysanthemum morifolium Ramat. contenente i flavonoidi luteolina ed apigenina glicosilati. Questi ultimi, dopo la
16 somministrazione orale nel ratto di un estratto del fiore, sono idrolizzati velocemente nei loro corrispondenti agliconici a livello dell’intestino tenue (Chen et al., 2007; Chen et al., 2012).
Osservando le curve concentrazione plasmatica vs tempo relative sia alla somministrazione endovenosa che a quella orale dei due flavonoidi, si evince che la luteolina viene metabolizzata molto più velocemente rispetto all’apigenina, e ciò comporta che la sua concentrazione sia significativamente più bassa. I dati della somministrazione orale mostrano un rapido assorbimento della luteolina, anche se quantitativamente minore rispetto all’apigenina, ed una sua lenta escrezione; infatti una completa eliminazione si registra dopo circa 72 ore. Dopo somministrazione orale, la curva relativa alla concentrazione plasmatica vs tempo per entrambi i flavonoidi, presenta due picchi, che indicano un probabile riassorbimento dei due flavonoidi o a livello del circolo enteroepatico oppure nelle parti terminali dell’intestino tenue o del colon (Chen et al., 2007; Chen et al., 2012).
A dimostrazione dell’elevata biotrasformazione che subisce la luteolina, studi recenti hanno scoperto che questo flavone è un buon substrato dell’enzima catecol-O-metil-trasferasi (COMT): i
17 due metaboliti metilati a livello del nucleo catecolico della luteolina, il crisoeriolo (4’, 5, 7- triidrossi-3’-metossiflavone) e la diosmetina (3’, 5, 7- triidrossi-4’-metossiflavone), sono stati
infatti identificati nel plasma di ratto, in seguito alla somministrazione endovenosa all’animale di luteolina (Chen et al.,2011).
Crisoeriolo e diosmetina non solo hanno molte proprietà biologiche simili alla luteolina, sono infatti antiossidanti ed antinfiammatori, ma hanno anche un effetto benefico sull’osteoporosi (Bui et al., 2009; Hsu e Kuo, 2008).
Esistono pochi dati riguardanti la metabolizzazione di luteolina nell’uomo e, in uno studio sperimentale del 2013, sono state messe in evidenza le differenze presenti inter-specie per quanto riguarda la biodisponibilità del flavone (Li et al., 2013).
Nella sperimentazione di Li et al. viene ipotizzato un possibile profilo farmacocinetico nell’uomo del flavone, estrapolando i
dati ottenuti da studi su ratti, cani e maiali nani, procedendo con lo “scaling method”: tecnica per la predizione di parametri farmacocinetici in una specie da dati derivanti da una specie diversa usando equazioni allometriche che, in questo caso,
18 mettono in relazione il metabolismo dell’animale ed il suo peso corporeo (Li et al., 2013).
A conferma della differente metabolizzazione di luteolina nella diverse specie, i dati hanno evidenziato che, dopo 48 ore dalla somministrazione, l’unico animale in cui è ancora presente il flavone nel sangue è il ratto, mentre scompare dopo 24 ore nei maiali nani e dopo 12 ore nei cani e nell’uomo.
Ciò concorda col fatto che le COMT hanno massima attività nell’uomo e minima nel ratto (Mannisto e Kaakkola, 1999).
Per la sua struttura polifenolica, la luteolina è anche un buon substrato per la glucuronidazione e per la solfatazione ad opera della mucosa intestinale o del fegato (Shimoi et al., 1998).
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1.2 Fitosomi
1.2.1 Proprietà dei fitosomi
Le preparazioni medicinali a base di piante o parti di esse sono state usate nella medicina popolare sin dai tempi più antichi e, ad oggi, la fitoterapia è diffusa nella maggior parte delle popolazioni (Cott, 1995).
Durante gli ultimi secoli, studi chimici e farmacologici si sono concentrati su molti estratti vegetali, così da dimostrarne le proprietà benefiche.
In particolare, le ultime ricerche hanno focalizzato la loro attenzione sulla biodisponibilità dei fitocostiutenti ed è stato osservato che, perché essi siano ben assorbiti, è necessario un equilibrio tra l’idrofilicità (per la dissoluzione nei fluidi gastrointestinali) e la lipofilicità (per il passaggio delle membrane lipidiche).
La maggior parte delle sostanze di origine vegetale hanno una buona solubilità in acqua, ma sono scarsamente assorbite sia a causa delle loro dimensioni, incompatibili con un processo di
20 diffusione passiva, sia per la loro scarsa lipofilicità (Manach et al., 2004).
Essendo scarsa la capacità dei fitocostituenti di attraversare le membrane lipidiche, anche la loro biodisponibilità sarà di bassa entità.
Per ovviare a questo problema sono stati sviluppati complessi molecolari detti fitosomi.
I fitosomi (‘fito’: pianta; ‘somi’: simili alle cellule) sono una tecnologia che ha lo scopo di migliorare l’assorbimento e la biodisponibilità dei fitocomposti, incorporandoli in fosfolipidi, così da produrre complessi molecolari compatibili con le membrane lipidiche (Bombardelli et al., 1989; Mauri et al., 2001; Kidd e Head, 2005; Rossi et al., 2009).
I fitosomi proteggono gli estratti vegetali dalla distruzione ad opera delle secrezioni digestive e dei batteri intestinali. Questi complessi molecolari sono inoltre in grado di spostarsi da un ambiente idrofobico ad uno idrofilico: passano infatti dalle membrane degli enterociti al sangue (Manach et al., 2004).
E’ stato dimostrato, tramite studi farmacocinetici e farmacodinamici, su animali e sull’uomo, che i fitosomi
21 migliorano la biodisponibilità rispetto ai derivati vegetali non complessati (Franco et al., 1998).
Molti estratti vegetali standardizzati sono già disponibili in commercio, in forma di fitosomi (Figura 1.5)
Nome commerciale Fitocostituenti complessati con fosfolipidi Indicazioni
Escin β-sitosterol Phytosome® Escina β-sitosterolo dal frutto dell’ippocastano Anti-edema Siliphos® Silibina dai semi di cardo mariano Protezione epaocitci Silymarin Phytosome® Silimarina dai semi di cardo mariano Antiepatotossico Meriva™ Curcuminoidi dal rizoma della curcuma
Virtiva®
Ginkgo flavoni glicosidi, ginkgo lidi, bilobalidi dalle foglie di Ginkgo biloba
Vasoattivo
Ginkgoselect® Phytosome®
Ginkgo flavoni glicosidi, ginkgo lidi, bilobalidi dalle foglie di Ginkgo biloba
Vasoattivo
Ginselect® Phytosome® Ginsenoidi dal rizoma di Panax ginseng
Migliora l’elasticità della pelle, adattogenico Leucoselect® Phytosome® Polifenoli dai semi dell’uva Antiossidante Centella Phytosome® Triterpeni dalle foglie di Centella asiatica Cicatrizzante 18 β-glycyrrhentinic acid
Phytosome®
Acido 18 β-glicirretico dal rizoma della liquirizia Lenitivo Crataegus Phytosome® Vitexina-2-O-ramnoside dai fiori di Biancospino Antiossidante Ginkgo biloba Dimeric Flavonoids
Phytosome®
Flavonoidi dimerici dalle foglie di Ginkgo biloba Lipolitico, vasoattivo Ginkgo biloba Terpenes
Phytosome®
Ginkgolidi e bilobalidi dalle foglie di Ginkgo Biloba Calmante Sericoside Phytosome® Sericoside dalla corteccia di Terminalia sericea Antirughe
Greenselect® Phytosome® Polifenoli dalle foglie di Tè verde
Prevenzione dei danni tIssutali causati dai radicali liberi e controllo del peso Visnadex®
Visnadina dell’infiorescenza ad ombrella dell’ Amni Visnaga
Vasoattivo
PA2 Phytosome® Proantocianidina A2 dalla corteccia di ippocastano
Antirughe, protegge dai raggi UV
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1.2.2 Struttura dei fitosomi
I fitosomi sono anche detti ‘sistema di rilascio fitolipidico’ e rappresentano un collegamento tra i sistemi di rilascio tradizionali e quelli di nuova generazione.
Questa nuova tecnologia permette di incorporare estratti standardizzati di piante o fitocostituenti solubili in acqua all’interno di fosfolipidi, così da formare un complesso molecolare compatibile con i lipidi.
I fosfolipidi sono piccole molecole lipidiche in cui due molecole di acido grasso sono legate con un legame estereo al primo ed al secondo atomo di carbonio del glicerolo, mentre il terzo lega un gruppo fosfato (Citernesi e Sciacchitano, 1995).
Il fosfolipide più usato per complessare composti polifenolici, come i flavonoidi, è la fosfatidilcolina.
23
1.2.3 Tecnologia dei fitosomi
I costituenti solubili in acqua (flavonoidi e terpenoidi) degli estratti vegetali, legano la fosfatidilcolina. Una quantità stechiometrica di questo fosfolipide reagisce con l’estratto standard in un solvente non polare e si ha così la formazione del fitosoma.
La fosfatidilcolina funge quindi da trasportatore della molecola polifenolica attraverso le membrane biologiche, così da aumentarne biodisponibilità.
La fosfatidilcolina (Figura 1.6) è una molecola bifunzionale, in quanto ha una parte lipofila (fosfatidil) ed una idrofila (colina).
24 La struttura dei fitosomi è quindi così composta: la colina lega i flavonoidi solubili in acqua tramite legami ad idrogeno, ed insieme formano il ‘corpo’, mentre la parte idrofobica, costituita dagli acidi grassi, forma la ‘coda’ e va a costituire un involucro, con struttura micellare, che racchiude la componente idrofila (Bombardelli et al., 2009; Bombardelli, 1994).
25
1.2.4 Differenze tra fitosomi e liposomi
Numerosi studi su fitosomi dimostrano che essi sono maggiormente assorbiti ed hanno una biodisonibilità superiore rispetto ai liposomi.
Le principali differenze sono:
Proprietà Fitosoma Liposoma Referenza
Legami
E’ un’unità di poche
molecole legate insieme E’ un aggregato costituito da molte molecole fosfolipidiche che racchiudono le molecole fitoattive
senza legami specifici con queste Pandey, 2010 Biodisponibilità ed assorbimento Ha maggior biodisponibilità ed assorbimento Ha biodisponibilità ed assorbimento minori rispetto ai fitosomi Amin et al., 2012 Disposizione delle molecole La fosfatidilcolina ed un unico fitocostituente sono presenti in rapporto 1:1 o 2:1 in base alla sostanza
Centinaia e migliaia di molecole di fosfatidilcolina circondano il fitocostituente solubile in acqua Sharma, 2010
26 Graficamente possiamo mettere a confronto le due strutture, in questo modo (Figura1.7):
Figura 1.7: Maggiori differenze tra liposomi e fitosomi. L’organizzazione molecolare dei liposomi (segmento superiore) versus molti fitosomi individuali (segmento inferiore).
27
Capitolo 2
Scopo della ricerca
L’interesse nei confronti dei flavonoidi è cresciuto negli ultimi anni grazie alle numerose proprietà che essi presentano, di cui la più nota è quella antiossidante.
Dai dati presenti in letteratura si evince che il principale problema che presentano i flavonoidi e, in particolar modo la luteolina, è la scarsa biodisponibilità data da un intenso metabolismo di primo passaggio epatico e dalle biotrasformazioni a carico del corredo enzimatico intestinale.
In questo lavoro di tesi è stata studiata la farmacocinetica del flavone luteolina, al fine di ottimizzare tutte le metodiche sperimentali necessarie a migliorare la biodisponibilità dei flavonoidi, tramite l’utilizzo di formulazioni innovative che permettano il superamento della barriera metabolica rappresentata da intestino e fegato
In particolare questa sperimentazione è stata finalizzata a valutare il profilo farmacocinetico di luteolina nel sangue di
28 ratto, in seguito a somministrazione parenterale endovenosa ed a somministrazione orale.
29
Capitolo 3
Materiali e metodi
3.1 Sperimentazione in vivo
3.1.1 Animali
Figura 3.1: Ratto albino Wistar Kyoto
Sono stati utilizzati ratti albini del ceppo Wistar Kyoto (Figura 3.1) del peso compreso tra 350-500g e di sesso maschile. Gli animali sono stati allevati in gabbie di dimensioni appropriate, in cui godevano di libertà di movimento, con libero accesso ad acqua e cibo ed esposti a cicli alternati di luce/buio di 12 ore.
30 La sperimentazione è stata condotta in conformità alla normativa comunitaria (Direttiva CEE 86-609) ed alla normativa italiana (D.L. n° 116/92).
31
3.1.2 Procedura chirurgica
La procedura chirurgica prevede che gli animali vengano anestetizzati con pentobarbitale sodico 70mg/kg i.p. e operati al fine di provvedere all’incannulazione della trachea e dell’arteria carotide e, quando richiesto dal protocollo sperimentale, la vena giugulare.
La canula tracheale è collegata ad una pompa di ventilazione (Basile MOD. 7025) ed i parametri utilizzati per la ventilazione sono qui sotto citati:
70 atti respiratori/minuto
1 ml di aria/100g di peso corporeo dell’animale, per atto respiratorio.
L’incannulazione dell’arteria carotide viene allestita allo scopo
di effettuare i prelievi di sangue in determinati periodi di tempo, somministrare la soluzione fisiologica, il citrato di sodio 3,8% p/v, quale agente anticoagulante. Per il mantenimento dell’anestesia, quando richiesto, viene somministrato pentobarbitale 10mg/kg.
La sperimentazione animale ha richiesto la somministrazione di luteolina attraverso diverse vie.
32 La somministrazione orale
,
tramite gavaggio, consiste nell’inserimento di una sonda gastrica attraverso la bocca del ratto. La somministrazione endovenosa è eseguita incannulando la vena giugulare.
Se la somministrazione è endovenosa, il farmaco viene disciolto in dimetilsolfossido (DMSO), se invece la luteolina è somministrata per gavaggio, essa viene discolta in carbossimetilcellulosa 1% p/v.
Tutte le soluzioni vengono preparate in modo che la dose somministrata all’animale sia 10 mg/kg.
33
3.1.3 Esperimento
Gli animali vengono tenuti a digiuno per le 24 ore precedenti l’inizio dell’esperimento e, una volta eseguita la procedura chirurgica descritta in precedenza, si attende un periodo di stabilizzazione di 15 minuti. Dopo ciò sono stati eseguiti i prelievi di sangue (100 µl) in cui si andranno a ricercare le concentrazioni di luteolina.
I prelievi sono eseguiti prima della somministrazione del farmaco in esame (basale) e ai seguenti tempi: 5, 10, 15, 35 minuti, 1, 2, 4 ore dopo la somministrazione di luteolina.
Ad ogni campione prelevato vengono aggiunti 200µl di una soluzione di acetonitrile contenente il 10 ng/ml di standard interno (S.I.), l’esperetina. L’acetonitrile ha la funzione di
deproteinizzare il sangue.
Una volta prelevati tutti i campioni, essi vengono centrifugati a 20°C per 1 minuto a 10.000 rpm ed il surnatante così ottenuto, viene prelevato ed analizzato tramite gas-cromatografia.
34
3.2 Tecnica gas-cromatografica con detector di massa
(GC/MS)
3.2.1 Gas cromatografia
La cromatografia in fase gassosa (GC) è una tecnica cromatografica di elevata efficacia che consente la separazione delle sostanze in base a proprietà chimico-fisiche quali temperatura di ebollizione, polarità e dimensioni delle molecole.
L’analisi gas cromatografica è condotta utilizzando una fase stazionaria solida o liquida (adsorbita su un supporto siliceo) ed un gas inerte (generalmente elio o azoto) quale fase mobile di trasporto.
L’introduzione della miscela in una colonna cromatografica
richiede necessariamente la vaporizzazione del campione in esame.
Nel caso in cui tali sostanze non siano sufficientemente volatili, risulta necessario, prima dell’introduzione del campione nel gas cromatografo, procedere ad una reazione di derivatizzazione
35 tale da modificare la polarità delle molecole, aumentandone la volatilità.
La tecnica di iniezione che è stata utilizzata è detta ‘a caldo’ e prevede che il campione sia iniettato, mediante l’utilizzo di una siringa, all’interno di un ‘liner’ di quarzo posto ad una temperatura solitamente compresa fra 200 e 300°C, necessaria per la istantanea vaporizzazione del campione stesso.
36
3.2.2 La spettrometria di massa
L’analisi mediante tecniche di Spettrometria di Massa consente di misurare il rapporto massa su carica (m/z) dei frammenti che si vengono a creare dalla frammentazione dell’analita e quindi di poter ricavare informazioni utili per il riconoscimento della sostanza in esame.
Un requisito necessario per il funzionamento di uno spettrometro di massa è dato dalla generazione di ioni in fase gassosa della sostanza da esaminare.
I metodi di acquisizione che si possono scegliere nella spettrometria di massa sono diversi a seconda del tipo di analisi da effettuare (qualitativa o quantitativa), della specificità e della sensibilità.
Indagini qualitative, rivolte all’identificazione e all’individuazione di sostanze incognite, rendono indispensabile la modalità di acquisizione full-scan, al fine di ottenere una serie di informazioni strutturali relative ad una molecola incognita.
I dati di uno spettro di massa full-scan di una sostanza, derivano dall’acquisizione del segnale relativo a tutti gli ioni
37 generati nella camera di ionizzazione dalla sostanza stessa, nel range di valori di m/z selezionato per l’analisi.
Si ottiene quindi un quadro completo di informazioni che ci permette di poter risalire all’identificazione della molecola, grazie anche all’impiego di librerie di spettri di massa.
Nel caso si vogliano effettuare analisi volte alla determinazione quantitativa di specifiche sostanze, si associa alla tecnica precedentemente descritta quella che prevede una Scansione di Ioni Selezionati (Selected Ion Monitoring, SIM).
In questo caso si selezionano soltanto pochi ioni (generalmente tre) che siano caratteristici del composto da analizzare, ottenendo così una diminuzione del rumore di fondo e, di conseguenza, un aumento del rapporto segnale/rumore, il quale a sua volta comporta un deciso aumento della sensibilità analitica.
I dati acquisiti in un’analisi GC/MS consistono in una serie di
spettri di massa registrati sequenzialmente.
Per generare queste informazioni, lo spettrometro scandisce l’intervallo di massa selezionato in maniera ripetitiva durante il corso della cromatografia.
38 L’abbondanza dei vari ioni in ogni spettro può essere sommata e, questa somma, riportata sequenzialmente in un diagramma in funzione del tempo, fornisce il cromatogramma della corrente ionica totale (TIC: Total Ion Current), il cui aspetto è del tutto analogo a quello ottenuto mediante un qualsiasi rivelatore convenzionale.
La sostanza che siamo andati ad analizzare è la luteolina, utilizzando per la sua quantificazione uno standard interno costituito dall’esperetina (Figura 3.1), precedentemente aggiunto, nella quantità richiesta, alla soluzione di acetonitrile utilizzata per la deproteinizzazione del campione plasmatico.
39 Per poter procede all’analisi GC-MS, dai campioni, trattati come precedentemente descritto, viene eliminato l’acetonitrile presente, mediante flusso di azoto e sono portandoli a secco.
Vengono successivamente derivatizzati con 50 µl di BSTFA (N, O, bistrimetilsililtrifluoroacetoamide) w/1% TMCS (Figura 3.2) mantenendoli a 70°C per 30 minuti in blocco riscaldato.
La derivatizzazione del campione è necessaria affinchè vengano funzionalizzati gli idrogeni dei gruppi idrossilici (-OH) e carbossilici (-COOH) con gruppi trimetil-sililici.
In questo modo vengono eliminate completamente le componenti polari della molecola ed aumenta il peso molecolare della sostanza, ottenendo un cromatogramma ottimale ed uno spettro di massa più indicativo.
40
3.3 Metodica utilizzata
Le condizioni gas-cromatografiche e di spettrometria di massa utilizzate per queste analisi sono le seguenti:
Volume iniettato 2 µl.
Iniezione in modalità Splitless con iniettore a 250°C Temperatura iniziale: 100°C per 1 minuto
17°C/min. fino a 310°C 310°C per 2 minuti
Temperatura finale: 310°C per 2 minuti Transfer line 300°C
L’acquisizione è stata effettuata nel range di massa 390-565 m/z.
Gli ioni identificativi della luteolina sono: 399,471,559.
Lo ione per la quantificazione della luteolina (SIM o Mass Range) è: 559.
Gli ioni identificativi dell’esperetina sono: 296, 503, 518.
Lo ione per la quantificazione dell’esperetina (SIM o Mass Range) è 503.
41
3.4 Solventi e sostanze utilizzate
Acetonitrile (Riedel-de Haen- Germany). Esperetina (Extrasynthese-Genay)
Luteolina (Indena-Milano)
Carbossimetilcellulosa 1% p/v (gentilmente fornito dal laboratorio di Farmacologia Medica dell’Università di Pisa) DMSO (Sigma-Aldrich)
BSTFA w/1% TMCS (UCT, United Chemical
42
3.5 Strumentazione
Apparecchio per la respirazione (Ugo Basile).
Centrifuga Universal 32 (Euro Clone, Speed Master 14R cetrifughe).
Gas cromatografo Trace-GC con auto campionatore modello AS2000, rivelatore di massa Polaris-Q a trappola ionica e software gestionale Xcalibur (Thermo Finigann). Colonna Restek Rtx-5MS (15m x 025mm x 025µm).
Sistema di evaporazione sotto flusso di azoto (Reacti-vap con Reacti-Therm, Thermo).
43
3.6 Retta di taratura
Per conoscere la concentrazione di luteolina presente nel sangue ai vari prelievi è stata fatta una retta di taratura (col software GraphPad Prism) che esprime la capacità di ottenere risultati direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione.
Per costruire tale retta sono stati considerati cinque crescenti quantità di luteolina, pari a 2, 5, 10, 25, 50 ng.
Queste quantità sono state aggiunte a 100 µl di sangue intero ed addizionati di una quantità fissa di standard interno (esperetina) pari a 10 ng.
Si procede quindi con la metodica di deproteinizzazione, derivatizzazione ed analisi in GC/MS.
Analizzando il cromatogramma ottenuto si costruisce una retta di taratura per la luteolina in funzione delle aree ottenute.
In particolare sulle ordinate avremo il rapporto tra l’area dello
standard e quella del campione; in ascisse viene espresso il rapporto tra i ng di esperetina e quelli di luteolina.
44 La valutazione della linearità del metodo si basa sul calcolo del coefficiente di correlazione “r2” il quale dovrebbe risultare quanto più possibile tendente all’unità.
45
Capitolo 4
Risultati e discussione
4.1 Risultati
L’interesse nei confronti dei flavonoidi, e della luteolina in particolare, è cresciuto negli ultimi anni grazie alle molteplici proprietà farmacologiche che essi presentano.
I dati risultanti dai molteplici esperimenti condotti sulla farmacocinetica di luteolina sono molto dispersi tra loro, sia per la sperimentazione su modelli animali sia per quanto riguarda l’uomo. Ciò è dovuto ad un metabolismo particolarmente complesso del flavone ed alle differenze farmacocinetiche inter ed intra-specie.
In particolare, per quanto riguarda l’uomo, non ci sono studi sistematici e specifici volti a determinare con chiarezza i parametri farmacocinetici, ma si hanno solamente evidenze poco circostanziate.
46 Ad esempio Shimoi et al., 1998 attestano che la presenza di luteolina viene riscontrata nel plasma umano dopo l’assunzione del flavone, ma in questo studio v’è una totale mancanza di
aspetti quantitativi.
Tuttavia, per quanto riguarda la sperimentazione farmacocinetica fatta su animali, sono presenti numerosi dati, che mostrano un esteso metabolismo di primo passaggio da parte del fegato, e, prima ancora, da parte del corredo enzimatico intestinale, in base anche alle evidenti caratteristiche chimiche della luteolina (Mannach et al., 2004; Hollman 2004, Shimoi et al., 1998).
I flavonoidi in generale sono caratterizzati da avere una scarsa biodisponibilità legata alla presenza di gruppi fenolici che li espongo a reazioni, prevalentemente di tipo coniugativo; in particolare, il sistema catecolico della luteolina sembra renderla ancora più vulnerabile, perché la sottopone a biotrasformazione anche da parte delle COMT (Chen et al.,2011).
Per poter quantificare la reale azione di questi enzimi sulla metabolizzazione del flavone, Chen et al. hanno somministrato in modelli sperimentali animali, luteolina ed entacapone, quale inibitore delle COMT. I risultati mostrano un miglioramento della
47 biodisponibilità del flavone, ma non in modo marcato: ciò conferma il fatto che le reazioni metaboliche riguardanti la luteolina sono abbastanza complesse (Chen et al., 2011).
Pertanto sono necessarie strategie per superare il problema dell’intensa metabolizzazione e, una di queste è quella di elaborare delle formulazioni tecnologicamente avanzate, ad esempio fitosomi, in grado di fungere da “cavalli di Troia”, consentendo così al flavone di attraversare indenne la barriera metabolica rappresentata dall’intestino e dal fegato.
A tal fine, data l’ampia variabilità intra ed inter-specifica
riscontrata, si rende necessario lo sviluppo di un modello sperimentale adeguato ed in grado di dare risultati ripetibili.
48
4.2 Determinazione di luteolina nel sangue intero di
ratto
Il primo obiettivo di questa tesi è stato mettere a punto un protocollo operativo riguardante sia le tecniche estrattive che l’analisi cromatografica, così da poter processare i campioni di sangue intero ed ottenere una corretta valutazione quantitativa di luteolina.
Al fine di riuscire ad avere un’estrazione del flavone dal sangue, facendo in modo che sia rapida, ripetibile e semplice, è stato utilizzato l’acetonitrile, il quale possiede capacità
deproteinizzante ed al contempo è un buon solvente nei confronti della luteolina.
Infatti, dopo aver centrifugato i campioni a temperatura ambiente a 10.000 rpm, per 1 minuto, è stato sufficiente riprendere il surnatante e farlo evaporare in corrente di azoto a circa 65°C.
Prima dell’iniezione in gas-massa si procede con la derivatizzazione del residuo mediante l’aggiunta di 50µl di BSTFA w/1% TMCS.
49 Per quanto riguarda la messa a punto delle condizioni analitiche GC/MS si è deciso di effettuare un’acquisizione in full scan, utilizzando un m/z 390-565, mentre la determinazione qualitativa è stata effettuata utilizzando gli ioni 296, 503, 518 per quanto riguarda l’esperetina (S.I., ione quantificatore 503) e gli ioni 399,471,559 per la luteolina (ione quantificatore 559).
Di seguito sono riportati tracciati cromatografici esplicativi di luteolina ed esperetina, con i relativi spettri di massa (Figura 4.1).
Figura 4.1: cromatogramma e spettro di massa relativo alla luteolina ed all’esperetina (S.I.)
50 L’analisi quantitativa è stata svolta utilizzando una retta di taratura eseguita su sangue intero di ratto contenente una concentrazione costante di standard interno, pari a 10ng/100µl e cinque diverse concentrazioni di luteolina nel range da 2ng/100µl a 50ng/100µl.
La valutazione della linearità del metodo è stata eseguita correlando il rapporto tra i nanogrammi di standard interno e quelli di luteolina vs il rapporto tra le aree di esperetina e quella del campione in esame.
Ottengo così dei risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione ed il calcolo del coefficiente di correzione mostra una buona linearità: i valori di r2 sono infatti pari a 0,966 (Fig. 4.2).
Figura 4.2: retta di taratura della luteolina
0 2 4 6 0 5 10 15 20 [ngSTD/ngcampione] A re a S T D/ A re a c a m p io n e
51 In via preliminare, disponiamo quindi di un approccio analitico su matrice biologica, in particolare sangue intero di ratto, in grado di assicurare molto bene la determinazione delle concentrazioni attese del flavone, dopo somministrazione endovenosa.
52
4.3 Risultati farmacocinetici
4.3.1 Somministrazione endovenosa
La somministrazione endovenosa di luteolina (Fig 4.3), alla dose di 10 mg/Kg ha portato alla rilevazione, dopo 5 minuti, di una concentrazione di circa 13µg/ml.
Le concentrazioni di luteolina si sono ridotte in modo estremamente rapido ed è possibile inquadrare una diminuzione almeno in due fasi:
la prima ha un’emivita molto veloce, con t ½ dell’ordine di pochi minuti;
la seconda inizia a circa 15 minuti dalla somministrazione, con concentrazioni di luteolina ridotte di circa l’80%,che presenta un’emivita di indicativamente 1,6h.
Per quanto riguarda gli altri principali parametri farmacocinetici che emergono dalla somministrazione endovenosa, osserviamo una AUC0 →∞ pari a 145 µg/ml/min ed un volume di distribuzione di circa 1,7 l/kg.
53 È interessante notare che la morfologia della curva concentrazione plasmatica vs tempo riscontrata in questo lavoro sperimentale è pressoché sovrapponibile a quanto in precedenza riscontrato da Chen et al., 2011.
Figura 4.3: curva concentrazione vs tempo della luteolina dopo somministrazione endovenosa. 0 10 20 30 40 50 60 0 2500 5000 7500 10000 12500 15000 min n g /m l lu te o lin a
54
4.3.2 Somministrazione orale
La somministrazione orale di luteolina, sempre alla dose di 10 mg/Kg, ha portato ad una rapida presenza del flavone nel circolo sistemico dell’animale, in particolare ad un primo picco a 15 minuti nell’ordine degli 0,24µg/ml.
Nella fase seguente a questo primo picco si osserva una transitoria flessione delle concentrazioni plasmatiche ed una successiva ricomparsa di un picco a 2 ore, nell’ordine dei 0,27µg/ml.
È da notare che, sebbene nei vari esperimenti sia presente un’enorme variabilità, che molto probabilmente riflette ampie differenze inter-individuali nell’assorbimento e/o nel metabolismo di primo passaggio, la presenza di questa “bifasicità” di andamento delle concentrazioni plasmatiche, dopo somministrazione orale, è riscontrabile anche in altri studi (Chen et al., 2012).
L’ AUC0 →∞ relativa alla somministrazione orale di luteolina è risultata essere circa di 60µg/ml/min.
Tale parametro consente di stimare una biodisponibilità orale del flavone pari al 40%, valore che non si discosta in modo
55 significativo da quanto osservato da altri autori, in studi analoghi sulla stessa specie (Chen et al, 2012).
Figura 4.4: curva concentrazione vs tempo della luteolina dopo somministrazione endovenosa 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 min n g /m l lu te o lin a
56 I parametri farmacocinetici ottenuti sia dalla somministrazione endovenosa che da quella orale, sono schematizzati nella seguente tabella: Parametro farmacocinetico Somministrazione endovenosa di lutolina (10 mg/kg) Somministrazione orale di luteolina (10mg/kg) AUC0 →∞ (ng/ml/min) 145231 60440 t ½ (h) 1,6 Vd (l/kg) 1,7 Cmax (ng/ml) 13369 (a 5 minuti) 274 Biodisponibilità 42%
Questa tesi di laurea rappresenta quindi un lavoro preliminare che comunque ha consentito di ottimizzare e quindi mettere a disposizione del laboratorio di farmacologia del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, un utile modello sperimentale
per gli studi più avanzati di farmacocinetica di luteolina e, più in generale, di flavonoidi.
La presente sperimentazione è finalizzata allo sviluppo di formulazioni innovative, atte a migliorare la biodisponibilità del flavone, quali ad esempio i fitosomi.
57
Capitolo 5
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