Uso di glicosidasi esogene in mosti e vini ed attività enzimatiche collaterali

G. NICOLINI

- F. MATTIVI

- G. VERSINI

USO DI GLICOSIDASI

ESOGEN,E

IN MOSIII E VINI

ED ATTIVITA ENZIMATI'GHE

COLLATERALI

Estratto da:

"Rivista di Viticoltura e di Enologia" Anno XLVII - N. 1/ 1994

Uso di glicosidasi

esogene in mosti e vini ed attività

enzimati-che collaterali

tJse of exogenous

gtycosidases

in musts

and wines

and enzymic

side

activities

G. Nicolini, F. Mattivi, G. Versini

lstituto Agrario di S. Michele aiA - Via E. Mach, 1 - 38010 S. Michele a/A - Trento - ltalia (ricevuto il 07.01.94, accettato il 27.01.94)

Riassunto

Gli effetti

dell'uso,

in mosti

e vini bianchi

e rossi,

di sei preparazioni

enzimatiche

spe-rimentali

e commerciali

di dichiarata

attività

pectolitica

e glicosidasica

sono

stati

saggiati

relativamente

alla presenza

di attivita

collaterali

a carico

del corredo

polifenolico'

Sono

state

rrscontrate

rilevanti

attivita

esterasiche

nei confronti

degli

esteri

cinnamici

con

libe-razione

dei corrispondenti

acidi in forma libera

in quantità

elevata

(fino

a 60 mg/L) ed

inusuale.

euando i trattamenti

enzimatici

sono stati effettuati

sui vini rossi,

in diversi

casi si

sono registrate

perdite

selettive

di antociani

in forma

libera

con riduzione

anche

notevo-le dell'intensità

colorante

ed evoluzione

della

tinta

verso

valort

numericamente

piu

eleva-ti, tipici

di vini meno giovani,

Lo stesso

comportamento

non si e notato

nei pochi casi

in cui itrattamenti

sonó

stati

effettuati

sui mosti.

Le antocianine

p-cumarate

sono risultate

essere

substrato

dell'attività

collaterale

esterasica

con formazione

di acido p-cumarico

libero.

La presenza

di un composto

incognito

incolore

a scheletro

flavonoide

di

degra-dazione

delle

antocianine

potrebbe

aiutare

a spiegare

gli incrementi

dei dati dei

flavo-noidi non antocianici

talvolta

osservati.

Summary

Six experimental

and commercial

enzymic

preparations

with pectolytic

and glycosidic

actrvities

were used in red and white musts

or wines,

The effects

on the polyphenolic

content

of wines

were investigated.

Some consequences

of esterase

side activities

on

cinnamic

esters

were found,

The content

of the free cinnamic

acids actually

increased,

often remarkably

up to unusual

values

(up to 60 mg/L)'

When

enzymes

were used

in red wines - but not in red musts

- marked

and

selec-tive losses

of free anthocyanins

were found in several

cases,

with great decreasing

in

colour

intensity

and corresponding

increase

of hue towards

higher

values

as for longer

aged wines.

Àn effective

esterase

side activity

on p-coumarate

anthocyanins

causing

thé formation

of free p-coumaric

acid was demonstrated

by performing

the reaction

on

a pure

fraction

of anthocyanins

in a model

wine

solution.

A new colourless

flavonoid

com-pound,

whose

structure

is not yet ascertained,

appears

as a consequence

of the

antho-cyanins

degradation.

Parole

chiave:

vino,

enzimi,

glicosidasi,

antociani,

derivati

cinnamici.

Key words: wine, enzymes, gtycosidase, anthocyanins,

cinnamic derivatives'

Introduzione

L'evoluzione

avvenuta

negli

ultimi

anni nel campo

della

biotecnologia

delle

prepa-razioni

enzimatiche

sta concrelizzandosi

in sempre

maggiori

possibilita

di pratica

appli-cazione

anche nel settore

enologico.

In particolare

un grande

interesse

esiste

attualmente

attorno

allapossibilita

tecnica

di liberare

per via enzimatica

i composti

aromatici

dai loro

precursori

glicosidati

al fine di esaltare

le caratteristiche

olfattive

_{dei vini [Grossman}

et

al., 1987;

Grossman

et Rapp,

.1988;

Cordonnier

et al., 1989;

Gunata

et al., 1989;

Canal

Llauberes,

1990;

Grossmann

et al., 1990;

Gunata

et al., 1990;

Abbott

et al,, 1991

;

Bayo-nove et al., 1992;

Nicolini

et al,,

'1993a1,

caratteristiche

che ne costituiscono

indiscutibit-mente uno dei più importanti

aspetti

della qualità.

Meno enfalizzale

sono invece

le informazioni

relative

alle

conseguenze

delle

possi-bili attivita

collaterali

che tali preparazioni

enzimatiche

possono

presentare,

attività

lega-te al livello

di purificazione

ed alla

specificità

di substrato

dei singoli

enzimi

presenti

nelle

formulazioni

soerimentali

o commerciali.

Nel presente

lavoro

si riportano

alcune

evidenze

dell'esistenza

delle suddette

af

tivita collaterali,

con particolare

attenzione

alle conseguenze

sul corredo

antociani-co e sul antociani-complesso

dei derivati

idrossicinnamici.

Gli effetti

sul corredo

terpenico

e

quelli sul profilo sensoriale

sono già stati oggetto di una specifica

_{nota [Nicolini}

et

a l , , 1

9 9 3 b ] .

Materiali e metodi

Nel corso

del quadriennio

1990-1993

presso

la Cantina

di Microvinificazione

dell'l-stituto

Agrario

di S. Michele

a/4, sono state

condotte

diverse

esperienze

di utilizzo

di

preparazioni

enzimatiche

ad attivita

dichiarata

pectolitica

e glicosidasica,

sia

sperimen-tali che commerciali.

Tali preparazioni

sono state

utilizzate

su masse

omogenee

(150 L)

di mosti

bianchi

chiarificati

oppure

rossi

pigiadiraspati;

in altri

casi iltrattamento

enzimati-co è stato

effettuato

su minori

quantità

di vino filtrato

sterile,

sempre

contro

un testimone

non trattato

(T). I trattamenti

sui mosti,

sia bianchi

che rossi,

sono stati

effettuati

concomi-tantemente

all'inoculo

dei lieviti

selezionati;

quelli

con la formulazione

enzimatica

siglata

P92 sono

stati

invece

eseguiti

al travaso

di fine

fermentazione

su vini di produzione

indu-striale.

Per le varietà

rosse

la fase di macerazione

delle

vinacce

è durata

7 giorni,

alla

fine

dei quali il vino fiore e stato

unito

al vino ottenuto

dalla pressatura

soffice

delle

vinacce

stesse,

Si sono ulilizzati

i dosaggi

consigliati

a seconda

dei casi dai rivenditori

o dai

produt-tori delle

formulazioni

enzimatiche,

le quali

verranno

da qui in avanti

riportate

con la

se-guente

segnatura:

R : formulazione

pectolitica

commerciale,

1990;

C : formulazione

oectolitico-cellulasica

commerciale.

-1990:

P : formulazione

sperimentale

polverulenta,

1991;

L : formulazione

sperimentale

liquida,

1991

;

P92 : formulazione

sperimentale

polverulenla,

1992;

P93 : formulazione

pectolitico-Elicosidasica

commerciale

polverulenta,

1993,

I composti

polifenolici

sono stati

analizzati

secondo

le metodiche

messe

a punto

dalla

scuola

_{di Asti [Di Stefano}

et Guidoni,

1989;

Di Stefano

et al., 1989]

secondo

le modalità

riportate

in Mattivi

et al.,

_[1991],

Gli indici

di Glories

_[1984]

sono

stati

valutati

con le

modi-fiche

apportate

da Di Stefano

e Cravero

_[1989].

I derivati

idrossicinnamici

sono

stati

lizzati per H,P.L.C, dopo iniezione diretta e rilevazione UV (diode array) a 320nm, appli-c a n d o i m e t o d i s t r u m e n t a l i g i a r i p o r t a t i i n N i c o l i n i _{e t a l . [.1991],} G l i a c i d i id r o s s i c i n n a m i c i in forma esterificata sono stati espressi in riferimento ai corrispondenti acidi liberi.

Intensità colorante e tonalita dei vini rossi sono state misurate secondo il metodo u s u a l e r i p o r t a t o n e l l a G . U . C E E L 2 7 2 d e l 3 o t t o b r e 1 9 9 0 . ll d o s a g g i o d e l l e s i n g o l e a n t o -c i a n i n e li b e r e è s t a t o -c o n d o t t o in H , P . L . C . p e r i n i e z i o n e d i r e t t a , q u a n t i f i c a n d o l e c o m e malvidina-3- monoglucoside e con le condizioni strumentali _{gia riportate [Castia et al,,}

1 e e 2 l ,

Per verificare l'effetto della formulazione P93 sulle antocianine e stato condotto un trattamento (7 giorni, 20o C, 109/hL) anche su una soluzione sintetica ottenuta nel se-guente modo: da un estratto metanolico degli antociani delle bucce di uva della varietà Merlot - tramite il passaggio su cartuccia Sep-Pak C 1B nelle condizioni specificate da Piergiovanni et Volonterio _[1980] - e stata ottenuta una frazione ricca di antociani este-rificati e priva degli acidi cinnamici. L'estratto così purificato e stato portato a secco ed ulilizzalo per ottenere una soluzione simil-vino a 10 gradi alcoolici, 5 g/L di acido tartari-c o , p H 3 , 6 e d a n t o tartari-c i a n i 1 4 7 . 9 m g / L .

Risultati e discussione

Variazioni a carico del colore deÌ vini bianchi

Su 14 partite omogenee di mosti o di vini appartenenti a 7 differenti varieta a bacca bianca sono stati effettuati i diversi trattamenti enzimatici riportati in fig. 1. Nelle tesi enzi-m a t e e enzi-m e r g e u n a l e g g e r a t e n d e n z a a l l ' i n c r e m e n t o d e l l ' i n d i c e d e i p o l i f e n o l i t o t a l i e d e l -l'assorbanzaa420nm rispetto alle vinificazioni testimone. Nei casi deitrattamenti sui mosti defecati staticamente a freddo senza I'ausilio di chiarificanti - ed anche per i trattamenti con la formulazione P92 a fine fermentazione - si puo ipolizzare che I'attivita enzimati-ca possa essersi espletata sul particellato feccioso piu fine, mentre appare abbastanza difficile trovare giustificazioni soddisfacenti per gli incrementi misurati per alcuni dei trat-tamenti effettuati sui vini filtrati,

Gli incrementi dell'intensità colorante freouentemente riscontrati parrebbero confer-m a r e le p e r p l e s s i t a p a r z i a l m e n t e g i a e s p r e s s e _{[ N i c o l i n i} e t a l . , 1 9 9 3 a ] s u p o s s i b i l i i m b r u -nimenti i quali, a nostro avviso, potrebbero essere collegati a fenomeni di autossidazio-ne di alcuautossidazio-ne frazioni fenoliche posteriormente al trattamento enzimatico, Non sono per altro da escludersi a priori anche imbrunimenti di origine ossidasica come risultato di attivita collaterali del trattamento stesso. Le variazioni misurate sono comunoue abba-stanza limitate e - almeno in buona parte dei casi - di relativa rilevanza tecnologica; alla luce dei dati disponibili la formulazione L sembrerebbe comunque determinare i mag-g i o r i in c r e m e n t i ,

Variazioni a carico del colore dei vini rossi (a) Trattamenti sui mosti

Itrattamenti effettuati su mosti rossi in presenza delle vinacce (tab. 1) hanno fatto registrare incrementi del 22-560/o per le diverse frazioni polifenoliche in Moscato rosa. Andamenti non altrettanto chiari sono emersi per Teroldego, nel quale comunque si so-no riscontrati aumenti del '1 4-240/o rispettivamente per i parametri polifenolitotali e proan-tocianidine a basso peso molecolare; una tendenza ad un leggero incremento sembra emergere anche per il contenuto antocianico.

4 7

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o t o J o E C\,l o) o N o $ o o o @ o O x ( \ t c o o c \ l s f $

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f F F 2 2 2 c É c r t r o o o o

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$H;n

nn

Fig. 1 : Polifenoli totali ed assorbanza a 420nm (1Omm) nei vini bianchi; enzimaggio sui mosti (.) o sui vini. Fig, 1 : Total polyphenols and adsorbances at 420nm (11mm) in white wines; enzymes used in musts (.)

or in wtnes.

Legenda:

Varietà/Varieties: CH = Chardonnay, TRAM : Traminer aromatico/Gewurztraminer, NOS = Nosiola,

RIES = Riesling renanolRhine Riesling, GARG: Garganega, S.B. : Sauvignon blanc, PROS: Prosecco, M.R. : Moscato rosaifrose Muscat (varietà rossa/red variety), TER: Teroldego (varietà rossalred varie-ty), LFF = Lambrusco a foglia frastagliata (varietà rossa/red variety).

TrattamentilTreatmenfs: T:testimoneltest wine, P:enzima in polvere formulazione sperimentale

199111991 experimental powder enzyme, L:enzima liquido formulazione sperimentale 1991 11991 ex-perimental liquid enzyme, P92: enzima in polvere formulazione sperimenlale 199211992 experimental powder enzyme, P93:enzima pectolitico-glicosidasico commerciale 1993/7993 commercial powder pectolitic-glycosidase, Q : pectolitico-cellulosolitico commerciale 1990/ 1990 commercial pectinase-cellulase,

R: pectolitico commerciale 199011990 commercial pectolytic enzyme.

Polifenof i/Phenolics (mg/L): ANT.LIB. = antociani liberi, malv. lfree anthocyanins; ANT.TOT. : antocian totali, malv. ltotal anthocyanins; ANT.ACIL. : antociani acetilati, malv.lanthocyanins (acetic esfer$; ANT

PCUM.:antociani p-cumarati, malv.lanthocyanins(p-coumaricesters); PF.TOT.=polifenolitotali, (+)callto-tal polyphenols; PROANTOC. : proantocianidine totali, cian.itotal proanthocyanidins; VANILL. = proanto-cianidine reattive alla vanillina, (+) cat.lproanthocyanidins react. vanillin', FLAV.NON ANTOC.:flavonoid. non antocianici (+) cat.

Caratteristiche cromalichelColour characterlstics: LC.: Intensità colorantelcolour intensity, o.d.

420 + 520 + 620 nm, 10 mm; TINTA=hue, o.d.420 nml520 nm; dALo/o:contributo 0/o _{alla do 520}

nm dato dagli antociani liberi/o/o of o.d. 520 nm related to free anthocyanins; dTAo/o: idem dagli antocia-ni decolorabili da SOzlidem to anthocyanins decolorable by SOz; df Afo/o= idem dagli antociani non de-colorabili daSOzlidem to anthocyanins undecolorable by SO2.

h q ; t q C F ; l : J F J J J

" i n

= i = F F F F

g F F - F

È E E È " i c i c i E c i c i c i_{o ) o o )} o o o )

+ + + + + +

É . E E E d E F F F

Tabella 1 : Polifenoli e caratteristiche del colore nei vini rossi '198'1 ; enzimaggio sui mosti (Legenda: vedi f i s . 1 ) .

Table 1: Phenolics and colour characteristics in the 1991 red wines; enzymes used in the musts (Le-genda: see fig. 1).

V I N O PF. TOT. VANILL.

mg/L + cat. mg/L + cat

ANT. TOT. ANT, LIB.

mg/L malv. mgil malv,

t . c .

TINTA M . R . - T M . R . - P M . R . - L 1 370 1 7 1 1 1725 760 1 086 1 1 8 5 246 279 300 121 1 3 1 1 2 7 5 . 1 9 0 . 7 3 2 7 . 0 0 0 . 7 0 3 7,35 0.689 T E R , . T TER.-P TER.-L 1296 ' 1 3 6 1 14V3 574 672 709 846 7 4 5 907 452 442 498 9 . 9 0 0 . 5 8 9 9 . 3 4 0 . 6 1 3 1 1 . 6 8 0 . 5 9 7

(b) Trattamenti

sui vini

I trattamenti

effettuati

su 6 diverse

masse

di vino di differente

età e di tre varieta

(tab.

2) hanno

fatto invece

registrare

variazioni

nel contenuto

polifenolico

di verso

diametral-mente

opposto

a quello

dei trattamenti

sui mosti.

ll dato che emerge

su tutti,

anche

per

la pratica

rilevanza

che riveste,

è quello degli antociani

che hanno mostrato

pesanti

va-riazioni

negative

imputabili

principalmente

alle rilevanti

perdite

(fino

al 900/o)

delle

forme

libere.

Al di là di tali

variazioni

a carico

degli

antociani,

comunque,

il quadro

polifenolico

non sembra

modificato

né in modo marcato

né univoco

tra le diverse

tesi.

Tabella 2: Corredo polifenolico (mg/L) dei vini rossi; enzimaggio sui vini ed analisi dopo due mesi da trattamento (Legenda: vedi fig, 1t x2: doppia dose; o = analisi dopo un anno dal trattamento enzimatico)

Table 2: Potyphenotic content (mg/L) of the red wines; enzymic treatments in the wines and analyses two months later. (Legenda: seefig. 1;x2:double dose; o:analysis one year late).

V I N O wine A N T . L I B . ANT. TOT. P F . TOT. P R O ANTOC. V A N I L L . M . R . . T M . R , - L M . R . - L x 2 60 43 26 1 6 6 149 1 3 0 1226 1201 1209 1 1 7 4 1 1 9 2 1197 444 419 432 T E R 1 . - T T E R 1 . - L T E R r . - L x 2 483 231 1 7 6 226 ,t1 20 1 1 1 7 1 1 3 4 1137 1 1 7 4 1232 1267 366 416 433 L F F 1 . - T L F F ] . - L L F F I . - L x 2 120 49 ' 1 6 210 1 1 3 78 660 669 660 660 573 567 182 1 8 0 1 9 5 LFF2,-T LFF2.-L LFFz.-L x2 1 8 9 50 48 769 742 7tr,A e e a 202 164 1467 1424 1376 ' 1 _{1 9 1} '1 ₁₆₈ 1197 L F F 3 . - T o L F F 3 . - P o L F F g . - L o L F F 3 . - R o 598 489 416 364 4 1 zó 23 1 4 140 6 1 6 1 43 424 356 2 7 1 281 1 1 3 1 2 7 1 0 0 84 T E R 2 , - T o T E R z . - L o 1 8 1 1.47 429 4 1 5 1221 1 200 1296 '1 ₁₉₆ 437₄₄₄

Le variazioni più rilevanti a livello delle frazioni tanniche, espresse attraverso la mi-sura delle proantocianidine totali, si sono registrate in uno dei vini della varietà Lambru-sco a foglia frastagliata (LFF3). In tale vino - carallerizzato tra l'altro dal quadro polife-nolico quantitativamente più povero tra quelli presenti in tab, 2 - ci sono state riduzioni anche det 34-360/0, com'è nel caso rispettivamente della tesi trattata con la formulazione c o m m e r c i a l e R e d i n q u e l l o d e l l a fo r m u l a z i o n e s p e r i m e n t a l e L .

L'attività enzimatica si e esplicata piuttosto rapidamente sia nel caso di vini enzimati d o p o u n a n n o d a l l ' i m b o t t i g l i a m e n t o ( M R , T E R 1 , L F F I ) - o s s i a in u n c o n t e s t o p o l i f e n o l i -co gia ragionevolmente stabilizzato - che nel caso di vini giovani (LFFr) se si pensa c h e g i à d o p o c i r c a u n a d e c i n a d i g i o r n i a 1 5 o C e r a n o b e n p e r c e p i b i l i a l l ' o c c h i o l e d i f f e -renze di intensità colorante e le precipitazioni colorate indotte dai trattamenti, I vini siglati LFFg e TER2 - a differenza degli altri che sono stati analizzali a due mesi dal trattamento enzimatico - sono stati oggetto di analisi 12 mesi dopo il trattamento. Essi non sembra-no evidenziare comportamenti diversi ed ulteriori evoluzioni rispetto a quelli già segnalati.

ll calo dei contenuti antocianici si e ripercosso in modo conseguente sulle caratteri-s t i c h e c r o m a t i c h e d e i v i n i r o s s i (t a b . 3 ) . C o n l ' e c c e z i o n e d e l T e r o l d e g o T E R 2 , I ' i n t e n s i t à c o l o r a n t e d e i v i n i e n z i m a t i h a s u b i t o d e l l e d i m i n u z i o n i a n c h e m o l t o c o n s i s t e n t i e t a l i d a portare, nel caso del Lambrusco LFFg, a valori quasi da vino rosato, La tonalita si e spo-stata di conseg uenza verso valori numericamente più elevati - corrispondenti a

colora-Tabella 3: Caratteristiche cromatiche ed indici di Glories dei vini rossi; enzimaggio sui vini ed analisi do-po due mesi dal trattamento (Legenda: vedi fig. 1: x2: doppiadosei o: analisi dopo un anno dal trattamento enzimatico).

Tab. 3: Colour characteristics and Glories' indexes in the red wines; enzymic treatments in the wines and analyses two months later (Legenda: as in fig. 1; x2 = double dose; o : analysis one year late).

V I N O wine

d . o . l . C . T I N T A d A L 5 2 0 n m * * * h u e

dTA dTAT dAL o/o dTA o/o dTAT o/o

M . R . - T M . R . - L M . R . - L x 2 2 , 3 1 4 . 7 2 0 . 8 5 3 0 . 2 3 2 : 5 4 . 4 7 0 , 8 8 8 0 . 1 3 2.05 4.36 0.932 0.07 0 . 8 4 1 0 . 0 5 3 . 6 3 6 . 4 0.95 6.2 49.6 44.2 0 . 8 7 3 . 4 5 4 . 0 4 2 . 6 | . z + 1 . O 7 1 . 1 1 T E R 1 . - T T E R 1 . - L T E R I . - L x 2 4 . 4 5 8 . 8 9 0 . 7 3 9 0 . 8 4 2 . 0 1 3 . 3 0 7 . 0 3 0 . 8 4 8 0 . 0 7 1 . 7 2 3 . 0 4 6 . 6 4 0 . 8 9 5 0 . 0 4 1 . 5 5 1 .6 0 1 8 . 9 4 5 . 2 3 5 . 9 1 . 5 1 2 . 1 5 2 . 1 4 5 . 8 1 . 4 4 1 . 4 5 1 . 1 4 7 . 5 L F F r , - T L F F 1 . - L L F F r . - L x 2 2 j 2 4 . 1 8 0 . 8 1 1 0 . 4 5 1 .4 4 3 . 2 0 1 .0 4 2 0 . 1 3 1 .1 9 2 . 8 2 1 .1 7 6 0 . 0 4 1.05 0.62 21.1 49.7 29.2 0 . 7 3 0 . 5 8 9 . 0 . 5 1 . 0 4 0 . 0 0 . 5 8 0 . 5 7 3 . 6 4 8 . 9 4 7 . 5 L F F 2 . - T L F F 2 , - L LFFz.-L x2 3 . 3 2 6 . 4 0 0 . 7 7 0 0 . 6 1 2 . 4 1 5 . 3 0 1 . 0 0 4 0 . 1 1 2 . 0 9 4 . 7 7 1 . 0 8 1 0 . 1 1 1 . 9 9 0 . 7 2 1 8 . 3 6 0 . 0 2 1 . 7 1 . 5 9 0 . 7 1 4 . 7 6 6 . 0 2 9 . 3 1 . 2 4 0 . 6 9 5 . 5 6 1 . 7 3 2 . 8 L F F 3 . - T o I F F ^ - P O I E t r I O L - r | 3 . - L L F F 3 . - R o 2 . 5 5 5 . 1 2 0 . 7 6 1 . 8 1 0 . 8 4 1 . 9 2 0 , 5 9 1 . 4 8 0 . 7 7 6 0 . 1 5 1 ,3 5 1 1 7 1 0 . 0 6 0 . 3 0 1 . 0 6 0 0 . 0 8 0 . 4 0 1 . 2 3 3 0 . 0 4 0 . 2 4 5.9 52.9 41.2 8.3 39.1 52.6 9 , 9 4 7 . 2 4 2 . 9 7.3 40.7 52,0 0 . 4 0 0 . 3 6 0 . 3 1 T E R 2 . - T o T F R " - I O 4 . 3 6 9 . 8 5 5.00 10.22 0 . 7 6 4 0 5 8 2 . 1 3 0 . 7 8 0 0 . 4 7 2 . 4 1 1 . 6 5 1 3 . 3 4 8 9 3 7 . 8 2 . 1 2 9 . 3 4 8 . 3 4 2 . 4

zioni meno vivaci e più tendenti al mattone rispetto ai vini testimone - così come acca-de normalmente per il colore dei vini a stadio evolutivo più avanzato,

ll calo degli antociani liberi ha fatto sì che il colore rosso residuo, misurato a 520nm, abbia un aumentato apporto percentuale delle frazioni antocianiche combinate con i tan-nini (dTAo/0, dTATo/o), similmente a quanto avviene nel corso dell'invecchiamento, Gli indici di Glories, espressione dello stato di combinazione del colore, in alcuni casi hanno evidenziato perdite concomitanti anche di parte delle frazioni antocianiche combinate (dTA, dTAT), specialmente in LFF3.

L ' i n s i e m e d e g l i in d e s i d e r a t i e f f e t t i c o l l a t e r a l i s u l q u a d r o p o l i f e n o l i c o q u i evidenziati c i i n d u c o n o a g u a r d a r e c o n o c c h i o critico all'impiego d e g l i a t t u a l i p r e p a r a t i e n z i m a t i c i quando il trattamento sia effettuato a livello di vini rossi.

Variazioni a carico dei derivati cinnamici (a) Trattamenti sui mosti

L'attivita enzimatica si e manifestata con importanti incrementi degli acidi in forma libera (fig. 2) - in particolare caffeico e p-cumarico - che spesso sopravanzano le for-1OO"/"

I estent/""ter forms ffi tterRt/fr"e forms

Fig. 2: Ripartizione percentuale dei derivati cinnamici nei vini; trattamento enzimatico sui mosti (Legen-da: vedi fig. 1 ; ESTERI : ac. caftarico + ac. cutaricoglucoside + ac. cutarico + 2-S-glutationil- cafta-rico (G.R.P.)+ ac. fertarico; LIBERI : ac. caffeico + ac. p-cumarico + ac,ferulico).

Fig 2: Percentage of ester forms and free acids on the total cinnamic derivatives of wines; enzymic treat-ment in musts (Legenda: see fig. 1 ; Ester forms: caftaric ac. + glucoside coutaric ac. + coutaric ac.+2-S-glutathionylcaftaric ac. (G.R.P.)+fertaric ac.; free forms:caffeic ac.+p-coumaric ac. +ferulic ac.).

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me esterificate. I contenuti assoluti (fig, 3) rilevati dopo il trattamento enzimatico in Rie-sling renano (60.95 mg/L) ed in Moscato rosa (42.15 mg/L) sono decisamente più ele-vati dei valori solitamente riportati in bibliografia _[Castino et Di Stefano, 1976; Gomez-C o r d o v e s e t G i l , 1 9 8 4 ; Gomez-C h e y n i e r e t a l . , 1 9 8 6 ; D i S t e f a n o e t G a r c i a - M o r u n o , 1 9 8 6 ; S o -m e r s e t a l . , 1 9 8 7 ; N i c o l i n i e t a l . , ' 1 9 9 1 1 .

Nel caso specifico delle due preparazioni enzimatiche difigg. 2-31'enzima P ha mo-strato un'attività esterasica su caftarico e p-cutarico piu marcata che su fertarico, arri-v a n d o a d i d r o l i z z a r e - per il 50o/o n e i r o s s i e q u a s i c o m p l e t a m e n t e n e i b i a n c h i - i d u e esteri tartarici. L'enzima L sembrerebbe avere minor attività esterasica, ma maggiore g l i c o s i d a s i c a , r i s p e t t o _{a P [Nicolini} e t a l , , 1 9 9 3 a ] .

Queste attivita idrolitiche collaterali - per altro già evidenziate fin dal 1976 da Casti-no e Di StefaCasti-no _[op,cit.] in formulazioni pectolitiche commerciali - possono comportare importanti, e per lo più non positive, conseguenze chimico-sensoriali, Gli acidi p-cumarico e ferulico liberi costituiscono infatti substrato per la produzione di fenoli volatili da parte d e i l i e v i t i _{[ A l b a g n a c ,} 1 9 7 5 ; D u b o u r d i e u e t a l . , 1 9 8 9 ; C h a t o n n e t e t a l . , 1 9 9 2 ; G r a n d o e t al., 1 9931 - con risultati sensorialmente positivi solo limitataménte a specifici _vini [Versi-n i , 1 9 8 5 ; A u r i c h e t a l , , 1 9 8 7 1 - m e [Versi-n t r e I' a c i d o c a f f e i c o p u o determinare u n a m a g g i o r e s u s c e t t i b i l i t à a l l ' i m b r u n i m e n t o a u t o - o s s i d a t i v o d u r a n t e l' i n v e c c h i a m e n t o _{[ C i l l i e r s} e t S i n -g l e t o n , 1 9 9 0 ; C i l l i e r s e t S i n g l e t o n , 1 9 9 1 1 .

Contenuto di acidi cinnamici liberi (mg/L) nei vini; trattamento enzimatico sui mosti (Legenda: vedi fig. "1).

Content of free cinnamic acids (mg/L) in wines; enzymic treatment in musts (Legenda: see fig. 1).

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(b) Trattamenti

sui vini

Gli incrementi

dei singoli

acidi

liberi

nel caso

deltrattamento

dei vini

(fig.

4) non

con-traddicono

in linea

generale

quanto

gia rilevato

per i trattamenti

sui mosti.

Tuttavia

nei

vini delle

varietà

bianche

Garganega

e Prosecco

l'attivita

delle

formulazioni

enzimatiche

provate

si è manifestata

in modo molto

più limitato.

Va fatto

rilevare

comunque

che i vini

testimone

delle

varietà

in questione

si caratterizzavano

per i più bassi

contenuti

(-3-6

mg/L)

di derivati

cinnamici

totali

tra quelli

di tutti i vini analizzali

nel presente

lavoro,

Nel caso

delTraminer

(fig.4),

anch'esso

su contenuti

piuttosto

bassi,

si puo osservare

come gia

il vino testimone

avesse

una quota

di acidi in forma libera

superiore

al530/o

e che valori

elevati

di tali frazioni

(450/o)

si erano registrati

anche nel Traminer

testimone

di fig. 5. Tali

percentuali

sono ancor maggiori

di quelle

già elevate

(38-320/o)

riportate

da Grando

et

al. [1993]

sempre

per la stessa

varieta.

Valori

elevati

e non usuali

di acidi liberi

in termini

percentuali

(43o/o),

su valori

assoluti

delle

forme

libere

di 16,5 mg/L, erano

stati

registrati

anche per la vinificazione

testimone

di uno dei due Chardonnay

di fig, 2.

Praticamente

nulla

e risultata

invece

l'attività

dell'enzimaL

a carico

dei derivati

cin-namici

nel caso del vino rosso

della

varietà

Teroldego

(fig,

_{), Tale enzima,Ira}

i due

pro-vati a livello

di mosto

(figg,

2-3),

aveva

già mostrato

una minor

attivita

sia - seppur

in

modo limitato

- su una differente

massa

della

stessa

varietà

Teroldego

sia - in modo

piu evidente - nel caso del Moscato rosa.

Fig. 4: Ripartizione percentuale deiderivaticinnamici, suddivisitraforme libere ed esterificate (mg/L C.A.E.), e contenuto dei singoli acidi liberi (mg/L) nei vini; trattamento enzimatico sui vini. (Legenda: vedi f i s s . 1 - 2 ) .

Fig. 4: Percentage of ester forms and free acids on the total cinnamic derivatives of wines (as mg/L C.A.E) and content of the single free acids (mg/L) in the wines; enzymic treatment in wines. (Legenda: see figg. 1-2). @ o ) E (o o @ o o ò s

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60

40

20

Fig. 5: Ripartizione percentuale dei derivati cinnamici, suddivisi tra forme libere ed esterificate (mgil C.A.E.), e contenuto dei singoli acidi liberi (mg/L) nei vini; trattamento enzimatico a dosaggio crescente sui vini (Legenda: vedi figg. '1-2).

Fig. 5: Percentage of ester forms and free acids on the total cinnamic derivatives of wines (as mg/L C.A.E) and content of the single f ree acids (mg/L) in the wines; increasing doses of the enzymic prepara-tion in wines (Legenda: see figg. 1-2).

I trattamenti effettuati sui vini con la formulazione enzimatica P92 a diversi dosaggi (fig. 5) indicano chiaramente che gia la dose minima prevista ha esplicato - a carico delle forme esterificate dei derivati cinnamici ed in ambedue i vini monovarietali - circa il 900/o della attività idrolitica ottenibile con la massima dose prevista di enzima.

Su bstrati dell' attivita esterasica

Nel 1993 si è ulilizzata una formulazione pectolitico-glicosidasica commerciale (P93) su quattro vini rossi delle varieta Teroldego e Lambrusco a foglia frastagliata al fine di c o n f e r m a r e i r i s u l t a t i o t t e n u t i i n p r e c e d e n z a e p e r s e g u i r e , t r a m i t e H , P , L . C . , i c o m p o s t i f e n o l i c i m o n o m e r i c i p r i n c i p a l i ( a n t o c i a n i n e e d a c i d i c i n n a m i c i ) . I r i s u l t a t i , r i p o r t a t i i n t a b . 4, confermano il generale abbattimento di tutte le forme antocianiche libere e la libera-zione degli acidi cinnamici dai loro corrispondenti esteri tartarici. Più in dettaglio, si os-serva la scomparsa totale delle antocianine p-cumarate, contro un minore benehé fortis-s i m o c a l o d e l l e a n t o c i a n i n e a c e t i l a t e e l i b e r e .

O s s e r v a n d o i l b i l a n c i o d e g l i a c i d i c i n n a m i c i s i v e d e c h e p a r a l l e l a m e n t e a l l a s c o m -parsa degli esteri tartarici si manifesta la formazione delle forme libere; nel caso

dell'aci-1 0 0

%

80

20

25

m g / L

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do caffeico la resa è sempre inferiore al 10Oo/o mentre, al contrario, la form azione di aci-d o p - c u m a r i c o l i b e r o s u p e r a n e t t a m e n t e q u e l l a o t t e n i b i l e d a l l ' i d r o l i s i d e i p r e c u r s o r i t a r t a -r i c i , m e t t e n d o i n l u c e la s u a f o r m a z i o n e a n c h e p e r i d r o l i s i d e l l e a n t o c i a n i n e p - c u m a r a t e , L ' e c c e s s o d i a c i d o p - c u m a r i c o f o r m a t o e m a g g i o r e a n c h e d i q u e l l o ri c a v a b i l e d a l l e a n -tocianine monomere p-cumarate presenti nel vino, facendo quindi supporre che esso venga liberato anche dai pigmenti antocianici a maggior peso molecolare, a loro volta substrati dell'attivita esterasica. In vini derivanti da uve povere di antocianine p-cumarate

- come nel caso del Lambrusco a foglia frastagliata - tale fatto e secondario, mentre in varietà come il Teroldego le antocianine possono essere una fonte primaria di acido p-cumarico. La degradazione delle antocianine p-cumarate è stata confermata nella ri-petizione del trattamento enzimatico effettuata sulla soluzione sintetica descritta nei ma-t e r i a l i e m e t o d i (f i g . 6 ) , I n q u e s t a s o l u z i o n e l a r i m o z i o n e d e l l e a n t o c i a n i n e è a n c o r a p i u marcata che rispetto ai vini. La resa in acido p-cumarico (tab, 4) e pari a circa un terzo della quantita di antocianine p-cumarate.

4 3 f tr E :l (f E 4 3 ? a T A

a

t a 1 5 T l m e ( m i n . )

Fig. 6: Analisi degli antociani liberi (sinistra) e degli acidi idrossicinnamici (destra) in una soluzione sinteti-ca simil-vino prima (test) e dopo (enz) enzimaggio (Legenda: '1 : delfinidina-3- monoglucoside, 2 = cianidina-3-monoglucoside; 3: petunidina-3-monoglucoside; 4 = peonidina-3-monoglucoside; 5 : m a l v i d i n a - 3 - m o n o g l u c o s i d e ; 6 , 7 , 8 , 9 , 1 O : 1 , 2 , 3 , 4 , S - a c i l a t i ; 1 1 , 1 3 , 1 4 , 1 5 = 1 , 2 , 3 , 4 + S - p - c u m a r a t i , 12=antociano incognito; a:prodotto di degradazione incognito; b:acido p-cumarico).

Fig 6: Chromatographic separations of free anthocyanins (left) and hydroxycinnamic acids (right) of a sinthetic solution before (test) and after (enz) treatment with enzyme P93 (Legenda: 1 :delphinidine-3 -monoglucoside; _{2 - cyanidine-S-monoglucoside; 3: petunidine-3-monoglucoside; 4:} peonidine-S-m o n o g l u c o s i d e ; 5 : peonidine-S-m a l v i d i n e - 3 - peonidine-S-m o n o g l u c o s i d e ; 6 , 7 , 8 , 9 , 1 0 : 1 ,2 , 3 , 4 , 5 - a c e t i c e s t e r ;

11,13,14,15:1,2,3,4+5-p-coumaric ester; 12:unknown anthocyanin; a:reaction product, unk-nown; b : p-coumaric acid).

Sui cromatogrammi relativi alla separazione degli antociani nei vini e nella soluzione sintetica, quest'ultimo riportato in fig. 6, dopo trattamento enzimatico non è stata riscon-trata la presenza di prodotti di degradazione delle antocianine, in particolare non vi sono t r a c c e d i a g l i c o n i . A l c o n t r a r i o , n e l c r o m a t o g r a m m a d e g l i a c i d i c i n n a m i c i d e l l a s o l u z i o n e sintetica compare anche un picco incognito che e probabilmente un composto interme-dio, quantitativamente importante, di degradazione delle antocianine. Esso presenta (fig. 7) uno spettro UV con massimo di assorbanza intorno a2B9 nm ed una assorbanza mi-n o r e a 3 2 0 mi-n m , u mi-n p r o f i l o s p e t t r a l e a n a l o g o a q u e l l o d e i d i i d r o f l a v o n o l i , d e i f l a v a n o n i e dei diidrocalconi e polarita elevata, vicina a quella dell'acido ferulil{artarico. Questo com-posto non era presente nei corrispondenti cromatogrammi dei vini rossi enzimati, per i q u a l i e r a i n t e r c o r s o u n p e r i o d o p i u l u n g o tr a I ' e n z i m a g g i o e l ' a n a l i s i , L a f o r m a z i o n e e I'ulteriore evoluzione di composti con queste caratteristiche, appartenenti alla famiglia dei flavonoidi non antocianici, potrebbe spiegare gli andamenti contrapposti dei para-metri antocianici in calo e del dato dei flavonoidi non antocianici in crescita (tab. 4) e merita ulteriori approfondimenti.

2 8 9 1 B 1 6 L 4 L 2 :l G

É

I B A E A 4 A ? 4

\l

2 2 5 A 3 A A 3 5 A 4 A A N a v e I c n q t h ( n m )

Fig. 7: Spettro ultravioletto del composto "a" di fig. 6. Fig. 7: UV-spectrum of the compound "a" of fig. 6.

Conclusioni

La casistica

di esperienze

qui riportate

ha evidenziato

che alcune

delle

preparazioni

enzimatiche

pectolitico-glicosidasiche

commerciali

e sperimentali

ulilizzale

sono in

gra-do di modificare

diversi

parametri

legati

al corredo

polifenolico

dei vini,

ln conseguenza

dei trattamenti

enzimatici

effettuati

sui mosti

o vini bianchi

si e

regi-strata

una tendenza,

non del tutto

spiegabile,

all'incremento

dell'intensità

colorante

e

del-l'indice

dei polifenoli

totali;

tuttavia

le variazionisono

apparse,

nella

maggioranza

dei

ca-si, di limitata

rilevanza

tecnologica.

Di ben maggior

rilevanza

invece

le variazioni

indotte

nel corredo

polifenolico

dei

vi-ni rossi

nei quali i diversi

trattamenti

enzimatici,

qualora

eseguiti

sui vini, hanno

determi-nato

perdite

anche

consistenti

principalmente

a carico

delle

frazioni

antocianiche

libere.

E' stata

evidenziata

la degradazione

delle

antocianine

p-cumarate

con liberazione

di acido

p-cumarico.

L'esistenza

di possibili

differenze

varietali

nella

reattivita

ai trattamenti

enzi-matici

e stata

messa

in relazione

al contenuto

di antociani

p-cumarati.

La presenza

di

un composto

incognito

derivato

dalla degradazione

delle

antocianine

- con spettro

UV

comune

ai compostiflavonoidi

aventi

un ossigeno

chetonico

in posizione

4 e con gli

ato-mi di carbonio

in posizione

2 e 3 saturi - potrebbe

aiutare

a spiegare

gli incrementi

dei flavonoidi

non antocianici

registrati

in alcuni

casi.

I trattamenti

sui mosti

in presenza

delle vinacce,

a differenza

di quanto

osservato

per i trattamenti

sui vini, si sono tradotti

in variazioni

positive

del contenuto

antocianico

e polifenolico,

almeno

alla luce dei limitati

casi analizzati.

A riguardo

si puo formulare

l'ipotesi

che la dichiarata

attivita

pectolitica

degli

enzimi

ulilizzali

- esplicandosi

sulle

vi-nacce nel favorire

I'estrazione

dei pigmenti

colorati

- sia stata in grado di

controbilan-ciare

o sopravanzare

le perdite

che contemporaneamente

o successivamente

erano

in-dotte

da altre

attivita

enzimatiche

collaterali;

altra

ipotesi

e che I'attivita

a carico

degli

an-tociani

sia in qualche

modo irreversibilmente

inibita

a livello

di mosto.

Variazioni

conseguenti

ai trattamenti

enzimatici

si sono registrate

anche

a carico

der

derivati

cinnamici

con incrementi

degli

acidi

in forma

libera,

p-cumarico

e caffeico

in

par-ticolare.

In diversi

casi gli acidi cinnamici

liberi

sono arrivati

a rappresentare

oltre il 50

o/o

_{e fino al900/o}

_{dei cinnamici}

_totali,

_facendo

_registrare

_valori

_complessivi

_anche

supe-riori ai 60 mg/L. Gli incrementi,

in particolare,

dell'acido

caffeico

libero

fanno sorgere

alcune

perplessità

relativamente

a possibilifenomeni

di imbrunimento

accentuato

nelcorso

dell'invecchiamento,

legati

alle

trasformazioni

auto-ossidative

cui tale composto

va

facil-mente

incontro,

L'incremento

delle

frazioni

libere

degli

altri

derivati

cinnamici

- che in

fermentazione

possono

essere

substrato

di decarbossilazione

a fenoli

volatili

*

suggeri-sce I'uso

in tale

fase

della

vinificazione

o nel corso

delle

rifermentazioni

di lieviti

a

caratte-re Pof(-), ossia

incapaci

di decarbossilare

gli acidi cinnamici

succitati

_[Meaden

et

Tay-lor, 19911,

per quei mosti

bianchi

o vini base

spumante

che fossero

stati

trattati

con

enzi-mi ad elevata

attivita

collaterale

esterasica,

Un'accurata

scelta

del ceppo di lievito

ed

una precisa

gestione

dei mosti-lievito

d'avviamento

permettono

infatti

di limitare

o

co-munque

gestire

_[Dubourdieu

et al,, 1989;

Chatonnet

et al,

, 1992;

Dugelay

et al., 1992;

Grando

et al,, 1993]

laformazione

deifenoli

volatili,

consentendo

contemporaneamente

il manifestarsi

di quelle

interessanti

potenzialita

che gli enzimi

glicosidasici

hanno

mo-strato

di possedere

a livello

di liberazione

di sostanze

volatili

di rilevanza

sensoriale

[Ni-colini

et al., 1 993b1.

L'inibizione

esercitata

dalle

frazioni

polifenoliche

poco polimerizzate

dei mosti

rossi

sulla

cinnamato-decarbossilasi

dei lieviti

_[Dubourdieu

et al,,

'1989]

- con

conseguente

insignificante

produzione

di vinil-

fenoli - consente,

nella

fermentazione

in rosso,

un uso non problematico

delle

formulazioni

enzimatiche

glicosidasiche

indagate.

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