Nano-biosensors for Salmonella DNA detection
Microcantilver-based DNA Hybridization Sensors for Salmonella Identification
Sensori di ibridazione di DNA basati su microcantilever per l’identificazione di Salmonella Patti Rossella1*, Bottero Maria Teresa1, Dalmasso Alessandra1, Grassi Ausilia1, Ferrante Ivan2, Santoro Karin2, Ciprianetti Niccolo’2, Ricciardi Carlo2
*Corresponding author. Tel: (+39) 011.6709219; Fax: (+39) 011.6709224; E-mail: rossella.patti@unito.it
1Dipartimento di Patologia Animale, Università degli Studi di Torino, Torino (IT) 2Dipartimento di Scienza Applicata e Tecnologia, Politecnico di Torino, Torino (IT). ABSTRACT
The detection of pathogenic microorganisms in foods remains a challenging since the safety of foodstuffs has to be ensured by the food producing companies. Conventional methods for the detection and identification of bacteria mainly rely on specific microbiological and biochemical identification. Biomolecular methods, are commonly used as a support for traditional techniques, thanks to their high sensitivity , specificity and not excessive costs. However,new methods like biosensors for example, can be an exciting alternative to the more traditional tecniques for the detection of pathogens in food. In this study we report Salmonella enterica serotype Enteritidis DNA detection through a novel class of label-free biosensors: microcantilevers (MCs). In general, MCs can operate as a microbalance and is used to detect the mass of the entities anchored to the cantilever surface using the decrease in the resonant frequency. We use DNA hybridization as model reaction system and for this reason, specific single stranded probe DNA of the pathogen and three different DNA targets (single-stranded complementary DNA, PCR product and serial dilutions of DNA extracted from S. Enteritidis strains) were applied. Two protocols were reported in order to allow the probe immobilization on cantilever surface: 1) MC surface was functionalized with 3-aminopropyltriethoxysilane and glutaraldehyde and an amino-modified DNA probe was used; 2) gold-coated sensors and thiolated DNA probes were used in order to generate a covalent bonding (Th-Au). For the first one, measures after hybridization with the PCR product showed related frequency shift 10 times higher than hybridization with complementary probe and detectable signals were obtained at the concentrations of 103 and 106 cfu / mL after hybridization with bacterial DNA. There are currently optimizations of the second protocol, where preliminary results have shown to be more uniform and therefore more precise within each of the three hybridizations.
RIASSUNTO
Salmonella enterica è responsabile di patologie gastroenteriche infettive a trasmissione alimentare nell’uomo. Attualmente i metodi convenzionali per la ricerca di microrganismi in matrici
alimentari basati sull’identificazione fenotipica e biochimica, sono stati affiancati da metodiche biomolecolari , più rapide e specifiche. Poiché la ricerca di metodi innovativi alternativi è in continua evoluzione, negli ultimi anni anche le nanotecnologie hanno trovato applicazione nel campo della diagnostica alimentare. In questo lavoro riportiamo lo sviluppo di un metodo per la ricerca di Salmonella enterica sierotipo Enteritidisattraverso una nuova classe di biosensori label-free: i microcantilevers (MCs). Seguendo come modello di reazione l’ibridazione del DNA, sono state utilizzate una sonda specifica di DNA del patogeno (probe) e tre differenti DNA target (DNA complementare alla sonda, prodotto di PCR e diluizioni seriali di DNA estratto da ceppi di S.
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Enteritidis). L'immobilizzazione della sonda sulla superficie dei sensori è stata ottenuta applicando due protocolli: 1) la superficie del MC è stata funzionalizzata con 3-amminopropiltrietossisilano e glutaraldeide ed è stata disegnata una sonda amminata; 2) sono stati utilizzati MC ricoperti d’oro e sonda tiolata al fine di generare un legame covalente (Th-Au). Le misure sono state rilevate tramite un sistema di lettura a leva ottica in grado di valutare la variazione dell’ampiezza di oscillazione del MC in funzione della frequenza di risonanza che è inversamente proporzionale alla massa
immobilizzata. Con il primo protocollo, le misure dopo ibridazione tra sonda e prodotto di PCR hanno mostrato un forte segnale con variazioni relative di frequenza 10 volte maggiori rispetto all'ibridazione con sonda complementare. Segnali rilevabili si sono ottenuti alle concentrazioni di 103 e 106 cfu/ml in seguito all'ibridazione con DNA batterico. Attualmente sono in corso le
ottimizzazioni delle misure con il secondo protocollo, dove test preliminari hanno dimostrato in relazione alle singole prove di ibridazione, maggiore uniformità nei risultati e quindi maggior precisione nella misura.
KEYWORDS - Biosensor, Microcantilever, Pathogen detection, Salmonella enterica.
CORPO DEL TESTO
Salmonella enterica è uno dei più comuni agenti zoonotici responsabile di patologie gastroenteriche infettive a trasmissione alimentare nell’uomo. Di solito il decorso è breve e senza necessità di trattamento medico, ma in fasce di popolazione a rischio (neonati e immunodepressi) può
svilupparsi in una forma più grave (CDC, 2010). Normalmente, sono necessarie 107-109 cellule per scatenare la patologia, ma sono stati riportati focolai di infezioni causati da un numero
significativamente inferiore di cellule (Piknova et al., 2005). Il rilevamento di Salmonella negli alimenti e la determinazione del livello di contaminazione possono quindi rivelarsi strumenti importanti per valutare i potenziali rischi connessi al consumo di alimenti contaminati e prevenire l'insorgenza di infezioni correlate. I metodi convenzionali per la ricerca di microrganismi in matrici alimentari basati principalmente sull’identificazione fenotipica e biochimica, sono stati attualmente affiancati da metodiche biomolecolari caratterizzate da elevata specificità, sensibilità e rapidità di analisi. Ciò nonostante, la ricerca di metodi rapidi alternativi è in continua evoluzione e negli ultimi anni un interesse sempre maggiore è stato rivolto all’uso di biosensori per l’identificazione di biomolecole. Recentemente è stato dimostrato che i biosensori basati su microcantilever (MC), piccole travi oscillanti di dimensioni microscopiche, sono in grado di interagire con biomolecole e agenti patogeni, e di rilevarne la presenza anche a basse concentrazioni (103 cfu/mL) (Ricciardi et al., 2010).
La presente ricerca, ha previsto l'ottimizzazione di microcantilever in silicio di forma rettangolare la cui superficie è stata funzionalizzata al fine di consentire l’immobilizzazione di una sonda oligonucleotidica specifica per Salmonella enterica sierotipo Enteritidis precedentemente disegnate per un protocollo in Real Time PCR (Piknova et al; 2005). Sono state testate tre tipologie differenti di molecole target: oligonucleotidi complementari alla sonda (contro sonda), amplicone contenente la regione complementare alla sonda (Piknova et al; 2005), DNA estratto mediante bollitura da concentrazioni batteriche scalari (101-108 cfu/mL) di ceppi di S. Enteritidis precedentemente coltivati in BHI (Brain Heart Infusion) a 37°C overnight.
I biosensori a microcantilever possono essere considerati come microbilance a due principali modalità di funzionamento: modo statico e modo dinamico. Nella prima modalità i biosensori sono funzionalizzati solo su una superficie, quindi l’adsorbimento delle molecole provoca una
deflessione del sensore dovuta all’instaurarsi di uno stress superficiale a causa della variazione delle forze intermolecolari. Nella seconda modalità, entrambe le superfici del biosensore sono
biologicamente recettive e vengono poste in vibrazione grazie ad un attuatore piezoelettrico,
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oscillando in base alla forzante a cui sono sottoposti. I microcantilever, in base alla massa e alla costante elastica, sono caratterizzati da una specifica frequenza di risonanza alla quale l’ampiezza di oscillazione è massima. Una volta effettuato il binding, l’aumento di massa del biosensore
determina una diminuzione della frequenza di risonanza. Lo shift di frequenza permette quindi di quantificare la quantità di molecola target immobilizzata sulla superficie (Johnson, Mutharashan, 2012). Tramite un sistema di lettura a leva ottica (simile ai commerciali sistemi di lettura dei DVD) è stata quindi valutata la variazione dell’ampiezza di oscillazione del cantilever in funzione della frequenza, individuando in particolare il valore di frequenza, inversamente proporzionale alla massa immobilizzata, in corrispondenza del quale si è verificata la risonanza.
Sono state utilizzate due metodiche di funzionalizzazione chimica della superficie degli array di microcantilever: nella prima, l’immobilizzazione della sonda è stata realizzata modificando l’oligonucleotide all’estremità 5’ con un gruppo amminico su MC derivatizzati con gruppi aldeidici, in seguito alla reazione con APTES e GA (3-aminopropyltriethoxysilane e
glutaraldehyde). Nel secondo protocollo è stato sfruttato il legame Au-Th ottenuto utilizzando sonde modificate all’estremità 5’ con un gruppo tiolico. Successivamente ciascun cantilever è stato ricoperto con un sottile strato di titanio e oro (Thian et al., 2005). Ad ogni passaggio (ossidazione termica dei MC, funzionalizzazione chimica, immobilizzazione della sonda, incubazione con il target) sono state eseguite le misure in vuoto della rispettiva frequenza di risonanza.
Nel caso di cantilever con sonda amminata immobilizzata le prime misure effettuate hanno rilevato un forte segnale dopo incubazione con prodotti di PCR: le variazioni relative di frequenza
risultavano circa 10 volte maggiori rispetto alle incubazioni con la contro sonda. Le prove con gli estratti di DNA batterico mostrano segnali rilevabili alle concentrazioni di 103 e 106 cfu/mL, mentre per concentrazioni minori le variazioni di frequenza sono confrontabili col segnale dovuto al buffer di ibridazione senza DNA (blank). Proprio per cercare di diminuire il segnale dovuto al blank e migliorare la ripetibilità delle misure (ancora limitata), attualmente è in prova la chimica a base di sonde tiolate: i primi risultati mostrano un miglioramento nell’uniformità dei risultati e quindi nella precisione della misura.
In conclusione, le misure effettuate mostrano che i biosensori basati su microcantilever possono essere una promettente alternativa alle metodiche tradizionali e molecolari: i limiti di rilevabilità risultano paragonabili al protocollo proposto da Piknova et al. (2005). Particolare attenzione va posta sulla chimica di legame tra la sonda modificata e la superficie dei sensori: attualmente le misure effettuate sfruttando un legame Au-Th rispetto a GA-NH2 sembrano garantire una migliore uniformità di risultati.
BIBLIOGRAFIA
CDC (Centers for Disease Control and Prevention) 2010. National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases. On line
http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/salmonella_enteritidis/
Johnson B. N., Mutharasan R. Biosensing using dynamic-mode cantilever sensors: A review. 2012. Biosensors and Bioelectronics 32:1-18
Piknova L., Kaclikova E., Pangallo D., Polek B., Kuchta T. 2005. Quantification of Salmonella by 5’-nuclease real-time polymerase chain reaction targeted to fimC gene. Curr. Microbiol. 50:38-42. Ricciardi C., Canavese G., Castagna R., Digregorio G., Ferrante I., Marasso S.L., Ricci A.,
Alessandria V., Rantsiou K:, Cocolin. 2010. Online Portable Microcantilever Biosensors for Salmonella Enterica Serotype Enteritidis Detection. Food Bioprocess Technol. 3:956-960
Thian F., Hansen K.M., Ferrell T.L., Thundat T. Dynamic Microcantilever Sensors for Discerning Biomolecular Interactions. 2005. Anal. Chem. 77:1601-1606
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