7. PAZIENTI E METODI
7.1 Criteri di inclusione
Sono state inclusi pazienti con diagnosi istologica di carcinoma mammario con iperespressione di HER-2 consecutivamente trattate con chemioterapia neoadiuvante e trastuzumab dal 2009 al 2015 presso l’U.O. di Oncologia Medica ed il Centro Senologico dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana e di cui fossero disponibili i preparati istologici bioptici del campione tumorale e/o quelli ottenuti durante l’intervento.
7.2 Metodologia di laboratorio
Il sequenziamento dell’intero esoma tumorale è stato eseguito presso i laboratori della Fondazione Pisana per la Scienza - ONLUS e condotta su campioni di tessuto tumorale pre e post trattamento di pazienti sottoposte a chemioterapia neoadiuvante e trastuzumab dal 2009 al 2015 c/o la U.O. di Oncologia Medica dell’ Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa. L’analisi dell’esoma è stata effettuata alla luce dei potenziali meccanismi molecolari predittivi di risposta a trastuzumab.
7.2.1 Estrazione del DNA genomico dai campioni FFPE
L’estrazione del DNA genomico dai campioni tumorali analizzati fissati in formalina e inclusi in paraffina è stata ottenuta utilizzando il Maxwell® 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI) e il Maxwell® 16 Instrument (Promega, Madison, WI) configurato con il programma a basso volume di eluizione (LEV). Maxwell® 16 Instrument è un estrattore automatizzato di acidi nucleici che processa i campioni utilizzando particelle magnetiche. Si ottengono così buone quantità di DNA puro e disponibile per l’amplificazione. Avendo a disposizione le biopsie e il tumore primario dei pazienti, quattro sezioni da 5 µm dalle biopsia e due sezioni da 10 µm dal tumore primario prese da ogni campione in studio, sono state trattate con il protocollo di estrazione.
7.2.2 Analisi dell’intero esoma dai campioni FFPE
Preparazione della libreria per ExomeTarget Seq: l’analisi dell’esoma è stata realizzata utilizzando lo Ion ProtonTM Sequencer (Ion Torrent), partendo da 1 µg di DNA genomico privo di RNA e purificato con il sistema Agencourt AMPure XP Reagent (Beckman Coulter, Indianapolis, IN). Per ottenere la giusta quantità di DNA dai tessuti analizzati è stato necessario eseguire la amplificazione dell'intero genoma di ogni campione (Whole Genome Amplification) usando il kit GenomePlex® Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Infatti questo metodo permette di generare un amplificazione di circa 500 volte del DNA genomico. Dopo l’amplificazione il DNA genomico ottenuto da ogni campione è stato frammentato per 3 minuti a 37 °C tramite Ion Shear Plus Reagents (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Una volta frammentato il DNA è stato controllato con il sistema Agilent 2100 Bioanalyzer
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) tramite il kit Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) per verificare la dimensione dei frammenti. Si è proceduto poi con il legame degli adattatori e con la selezione delle dimensioni della libreria utilizzando il gel E-Gel SizeSelect 2% Agarose (Life Technologies, Grand Island, NY) con il fine di ottenere una libreria costituita da frammenti di DNA di circa 250 bp. Il DNA selezionato a seconda delle dimensioni è stato quindi amplificato attraverso la Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies, Grand Island, NY) e successivamente è stato purificato. La qualità e la quantità della libreria amplificata è stata verificata con lo strumento Agilent 2100 Bioanalyzer tramite il kit Agilent High Sensitivity DNA. A questo punto sulla libreria di DNA amplificata e selezionata in base alle dimensioni (per un totale di 500 ng) è stato effettuato il cosiddetto enrichment esomico, ovvero una reazione per eliminare le sequenze introniche ed avere così una libreria costituita esclusivamente da sequenze esoniche. L'enrichment esomico prevede quindi una reazione di ibridazione seguita dal recupero del DNA esomico e dalla sua successiva amplificazione. La libreria esomica ottenuta è stata nuovamente analizzata con il sistema Agilent 2100 Bioanalyzer tramite il kit Agilent High Sensitivity DNA ed è stata determinata la diluizione richiesta per la preparazione del campione per il sequenziamento. Preparazione dei campioni per il sequenziamento: la libreria di DNA ottenuta non può essere sequenziata direttamente ma sono richiesti alcuni passaggi di amplificazione ottenibili attraverso la PCR in emulsione del sistema Ion OneTouch 2 (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY). Durante questa reazione di amplificazione viene aggiunta alla libreria una mix di microsfere metalliche, Ion PI Ion Sphere (ISPs), che sono in grado di legare sulla loro superficie il DNA che viene mano a mano amplificato durante la reazione di PCR. Il principio di tale metodica consiste nell'effettuare una emulsione della mix di reazione con olio per fare si che, idealmente, ogni singola molecola di DNA della libreria sia contenuta all'interno di una micella ottenuta dall'emulsione assieme alla mix di reazione. Alla fine di questa reazione, otterremo ISPs aventi sulla sua superficie molteplici copie di una singola molecola di DNA della libreria. Tali ISP vengono chiamate ISP Monoclonali. Per effettuare tale reazione la libreria di DNA è stata diluita 10pM, poi la soluzione amplificata contenente la libreria è stata preparata e caricata sul filtro Ion PI Plus Reaction Filter Assembly (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY). Il filtro è stato istallato sul sistema Ion OneTouch 2 e la corsa è andata avanti tutta la notte. Il giorno seguente sono state recuperate le Particelle Ion PI Ion Sphere (ISPs) e sono state misurate con il kit Ion Sphere Quality Control Assay (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY) tramite il fluorimetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) aggiornato con il firmware V3.10. Questo controllo viene effettuato a seguito di ogni reazione One Touch per verificare la qualità della nostra libreria ibridata sulle ISPs. Qualora il valore di qualità delle ISPs abbia una percentuale di tra il 10% e il 25% è possibile continuare con la tecnica. Durante la reazione di PCR in emulsione può capitare che alcune particelle non si ibridino al DNA (No Template) o che si leghino a poche molecole (Low Quality ISPs). Tali particelle possono influire pesantemente sulla qualità di sequenziamento della nostra libreria abbassando la qualità di campione da analizzare. Per poterle rimuovere è stato
utilizzato il sistema Ion OneTouch ES Instrument (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY), che utilizza biglie magnetiche per isolare le particelle ISPs Monoclonali.
Sequenziamento tramite Ion Proton: per sequenziale i nostri campioni è stato utilizzato il kit Ion PI Sequencing 200 (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY). Il sequenziatore Ion Proton (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY) è stato sottoposto a lavaggi e inizializzato secondo il protocollo. Il campione di ISPs arricchito è stato preparato per il sequenziamento aggiungendovi dei primers di sequenziamento. Alla fine di questo processo il campione è stato caricato sul chip di sequenziamento, Ion PI V1 (Ion Torrent, Life Technologies, Grand Island, NY) che è stato preparato e calibrato precedetemente per il caricamento. Il chip è stato quindi posizionato all'interno del sequenziatore Ion Proton e la corsa è stata avviata, dopo opportuna programmazione realizzata grazie ai tools presenti sul Torrent Server collegato alla macchina.
Analisi esomica tramite il software Torrent: i campioni caricati sullo Ion Proton (Life Technologies) vengono processati all’interno del Torrent Server. La suite inclusa effettua l’allineamento delle reads contro il genoma umano con l’allineatore TMAP. Le varianti (SNV, delezioni ed inserzioni) vengono rilevate grazie ad un plugin chiamato Torrent Variant Caller (TVC), i cui parametri possono essere ampiamente modificabili per avere maggiore sensibilità o specificità. Le varianti vengono poi filtrate usando il software Enlis Genome Research (Enlis, LCC).
