AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNAVITRO DEL DNA““REAZIONE A CATENA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASIDELLA POLIMERASI(PCR)”(PCR)”

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AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN

VITRO DEL DNA VITRO DEL DNA

“REAZIONE A CATENA “REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI DELLA POLIMERASI

(PCR)”

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• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)

• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro

• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

PCR: reazione polimerasica a

catena

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ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA

REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

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IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO

VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO 2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL

FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

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PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi

termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

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PCR: amplificazione PCR: amplificazione

n.ro cicli 1

3 10 15 20 25 30

n.ro sequenze bersaglio 0

2 256 8192 262.144 8.388.608 268.435.456

La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers

Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10^-12g) allora ~1 g of DNA

potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in 30 cicli.

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PCR

VANTAGGI:

• Sensibilita’

• Rapidita’

• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)

• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione

• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato

• SVANTAGGI:

• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza

• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)

• Può sintetizzare frammenti relativamente corti

• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

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Esempi di utilizzo della PCR

• Su DNA:

– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR

DIAGNOSTICA

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”

• Su RNA messaggero (RT-PCR):

– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.

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PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme

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PCR/VNTR/STR in genetica forense PCR/VNTR/STR in genetica forense

Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine?

La tecnica PCR è utile, spesso

necessaria, per amplificare il DNA

estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.

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Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica

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Diagnosi genetica pre-impianto

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PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

• Estrazione dell’RNA

• Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)

• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa

AAAAAAAA 3’

5’

TTTTTTTT 5’

3’

mRNA cDNA

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PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:

PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)

AAAAAAAA 3’

5’

TTTTTTTT 5’

3’

mRNA cDNA

• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici

5’

3’

• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)

TTTTTTTT 5’

3’ ^5’ ^3’

AAAAAAAA 3’

5’

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La PCR non e’ una tecnica quantitativa

Number of molecules

Number of cycles

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PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale

• Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA

sintetizzata durante la reazione di amplificazione.

• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in

tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole

presenti in partenza

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Polymerase Chain Reaction: resa

• Resa teorica: 2ⁿ

P=(2)ⁿT Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)

Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza

Log[DNA]

N° cicli termici

Esponenziale Esponenziale

Lineare Lineare

Plateau Plateau

Prodotto Prodotto variabile variabile

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Polymerase Chain Reaction: plateau

Resa effettiva: effetto plateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:

Quantità dei primers

Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

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Soluzioni

• Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale

Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale

• Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR

• La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

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RT-PCR convenzionale RT-PCR convenzionale

Manual or Manual or automated automated

Reverse Reverse transcription transcription

PCRPCR reaction reaction Nested

Nested PCR reaction PCR reaction

GelGel

electrophoresis electrophoresis

DNADNA sequencing sequencing

Southern Southern

blotblot

Real-time RT-PCR Real-time RT-PCR

Reverse Reverse transcription transcription

PCR reaction PCR reaction Quantitative Quantitative

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Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale

durante la fase esponenziale della PCR,

quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR

tradizionale "end point"

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RT-PCR quantitativa

PlotPlotlinearelineare

Incremento di Incremento di fluorescenza fluorescenza

•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione

•Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

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Analisi tramite software

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•La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sul

legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,

sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti

per PCR Real-Time

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SYBR Green

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SYBR Green I

SYBR Green: principio

Utilizza una molecola

Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

lega al solco minore del DNA

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All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR Green

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SYBR Green SYBR Green

Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole

fluorescenti alla doppia elica.

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SYBR Green SYBR Green

Durante l’elongazione si verifica un

aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie

dell’amplicone

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SYBR green

• Metodica semplice

Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

• Non costosa

• Non-specifica

– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers

– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici

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