Fig. 1
Tutte le procedure farmacologiche sono state eseguite in
conformità alla normativa della Comunità Europea 86 – 609 concernente l’utilizzo degli animali da esperimento.
Al fine di evidenziare un possibile meccanismo d’azione vasorilasciante, i composti sono stati testati su anelli isolati di aorta toracica prelevata da ratti maschi, normotesi di ceppo Wistar (250 – 350 g)(Fig. 1).
I ratti sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale e
dissanguamento, previa leggera anestesia. In seguito ad incisione, la porzione toracica dell’aorta è stata rapidamente asportata e liberata dai
Lo strato endoteliale è stato asportato tramite un delicato raschiamento meccanico dalla parte interna dell’organo per mezzo di un ago da siringa. Il preparato è stato sezionato in anelli della lunghezza di 5 mm, ciascuno dei quali è stato alloggiato tramite appositi ganci metallici e sotto un precarico di 2 g, in un bagno per organi isolati del volume di 20 ml contenente una soluzione di Tyrode (composizione salina in mM :
NaCl 136,8, KCl 2,95, CaCl2 1,80, MgSO4 7 H2O 1,05, NaH2PO4 0,41,
NaHCO3 11,9, Glucosio 5,5), termostatato a 37 °C mentre nella soluzione
viene fatto continuamente gorgogliare Clioxicarb, una miscela di
O2 95 % e CO2 5 %.
Le variazioni tensiometriche sono state registrate attraverso un trasduttore isometrico (Grass FTO3)connesso ad un microdinamometro (Buxco Electronics).
Dopo un periodo di stabilizzazione di 60 minuti, la rimozione
dell’endotelio è stata accertata mediante somministrazione di acetilcolina (ACh)(10 mM)ai preparati precontratti con KCl (20 mM).
Un rilasciamento inferiore al 10 %, rapportato al livello massimo della contrazione KCl – indotta, è stato ritenuto indicativo di una mancanza dello strato endoteliale sufficientemente accettabile, mentre i preparati che hanno mostrato un rilasciamento maggiore o uguale al 10 % (che
comporta una presenza significativa dell’endotelio)sono stati scartati. Dopo 30 – 40 minuti dalla conferma della rimozione dell’ endotelio, i preparati aortici sono stati contratti mediante KCl (20 mM)e, al
raggiungimento del plateau, sono state somministrate concentrazioni crescenti, ciascuna tre volte superiore alla precedente, dei composti testati
Esperimenti preliminari hanno mostrato che la somministrazione di KCl (20 mM)induce una contrazione che permane in uno stato tonico stabile per almeno 40 minuti.
In un’altra serie di esperimenti, dopo la contrazione indotta con KCl (20 mM), sono stati aggiunti il cloruro di tetraetilammonio (TEA 10 mM), un bloccante non selettivo dei canali del potassio, e quando confermato il loro coinvolgimento, l’ Iberiotossina(IbTX 100 nM), un bloccante
selettivo dei canali BKCa; a ciò è seguita la somministrazione dei composti
selezionati.
Il composto di riferimento NS1619 (Sigma)è stato solubilizzato
(10 mM)in EtOH 95 % e successivamente è stato diluito in una soluzione di Tyrode.
L’ Acetilcolina cloruro (Sigma)è stata solubilizzata (100 nM)in EtOH 95 % e quindi diluita in acqua bidistillata mentre KCl e TEA sono stati
entrambi solubilizzati in soluzione di Tyrode.
Tutte le soluzioni sono state preparate immediatamente prima dell’esecuzione delle procedure farmacologiche sperimentali. La completa inefficacia delle sostanze utilizzate come veicoli è stata dimostrata attraverso esperimenti preliminari.
L’effetto vasorilasciante è stato valutato come massima risposta
vasorilasciante espressa come una percentuale (%)del tono contrattile indotto da KCl 20 mM.
Quando la concentrazione limite 0,1 mM (la più alta concentrazione somministrata)dei composti testati non ha raggiunto l’effetto massimo, il parametro di efficacia esprime la risposta vasorilasciante, espressa come percentuale (%)del tono contrattile indotto da KCl 20 mM, provocato da
Il parametro di potenza è stato espresso come pIC50, calcolato come
logaritmo negativo della concentrazione molare dei composti testati
necessaria a determinare la riduzione del 50 % del tono contrattile indotto da KCl 20 mM.
Il pIC50 non è stato determinato per quei composti che hanno mostrato un
parametro di efficacia minore del 60 %.
I parametri di potenza e di efficacia sono espressi come media + / - l’errore standard di 5 – 10 esperimenti.
Per l’analisi statistica è stato utilizzato il “test t” di Student; un livello di probabilità P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente
significativo.
I dati sperimentali sono stati analizzati mediante una procedura computerizzata (software : GraphPad Prism 3.0).
Sul plateau ottenuto grazie all’azione contratturante del KCl sono state costruite delle curve concentrazione – risposta riferite alle molecole saggiate al fine di valutarne l’attività vasorilasciante.
