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CAPITOLO 5: DISCUSSIONE
L’epitelio delle vie aeree partecipa attivamente nella difesa contro i patogeni, così come nella modulazione delle reazioni infiammatorie che caratterizzano le patologie polmonari. Il reclutamento dei leucociti dal sangue periferico nel sito del tessuto danneggiato rappresenta uno step cruciale in questi processi e richiede l’azione combinata di numerosi mediatori pro-infiammatori, tra i quali IL-8 e MCP-1. Questi mediatori, ad azione chemiotattica, vengono liberati nelle fasi precoci del processo infiammatorio e non intervengono direttamente ma hanno il compito di dare le coordinate esatte di dove è localizzato il danno ad altre molecole e cellule che poi lo ripareranno. E’ stato precedentemente dimostrato che i monociti umani liberano MP in grado di modulare alcuni dei meccanismi infiammatori descritti. In particolare, queste MP aumentano la sintesi di IL-8 ed MCP-1 da parte di cellule di epitelio delle vie aeree (Cerri, 2006).
Questa caratteristica delle MP mi ha spinto ad indagare sui possibili meccanismi di trasduzione del segnale indotti dalle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree. In letteratura sono disponibili risultati discordanti sui possibili meccanismi d’azione delle MP. MP derivate da neutrofili stimolati con f-MLP attivano cellule endoteliali con un meccanismo NF-κB indipendente (Mesri, Altieri, 1999); al contrario, MP liberate da linfociti T stimolati con actinomicina D mostrano in cellule muscolari lisce un meccanismo NF-κB dipendente (Tesse, 2008). Partendo da questi dati nel mio lavoro di tesi ci siamo soffermati sul fattore di trascrizione NF-κB e abbiamo voluto vedere se le MP generate da monociti/macrofagi stimolati con calcio ionoforo A23187 mostravano nelle cellule epiteliali delle vie aeree effetti legati a tale fattore di trascrizione. A questo proposito nei primi esperimenti abbiamo stimolato cellule dell’epitelio delle vie aeree con MP per 1h ed estratto le proteine nucleari che abbiamo inviato ad un laboratorio esterno che ha effettuato un analisi elettroforetica dello spostamento di mobilità (EMSA). Il risultato che abbiamo ottenuto con questa metodica è stato che MP di origine monocitaria nelle cellule epiteliali delle vie aeree mostrano un meccanismo d’azione NF-κB dipendente. Le MP probabilmente attivano l’NF-κB che è in grado di traslocare nel nucleo e regolare la trascrizione di geni bersaglio.
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Riguardo alle tesi discordanti che compaiono in letteratura sul meccanismo d’azione delle MP, in alcuni casi NF-κB dipendente e in altri NF-κB indipendente, riteniamo che siano molte le variabili che lo possono influenzare: il tipo di cellula che libera le MP, lo stimolo utilizzato per generarle e le cellule bersaglio delle MP stesse.
Dimostrato il coinvolgimento del fattore di trascrizione NF-κB nell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree, abbiamo effettuato un'altra serie di esperimenti per meglio caratterizzare i meccanismi intracellulari indotti dalle MP che portano al rilascio di citochine. A questo proposito abbiamo indagato sul ruolo di agonisti PPAR-γ come il Rosiglitazone e il 15-deoxi-∆12,14 -PGJ2 (15d-PGJ2) sulla modulazione dell’espressione di IL-8 ed MCP-1 indotta da
MP sull’epitelio delle vie aeree. Abbiamo scelto per i miei esperimenti gli agonisti dei recettori PPAR-γ poiché dalla letteratura si evince che questi recettori attivati possono modulare la sintesi di mediatori della flogosi, regolando la trascrizione di geni bersaglio con vari meccanismi che coinvolgono sia l’interazione diretta con sequenze specifiche sul DNA, denominate PPRE, sia l’inibizione funzionale del fattore di trascrizione NF-κB (Belvisi, 2006; Scher,
2005). Precedenti saggi immunoenzimatici fatti nel nostro laboratorio hanno evidenziato che MP di origine monocitaria stimolano l’espressione di IL-8 e MCP-1 in misura maggiore rispetto al basale. Nei miei saggi immunoenzimatici invece, abbiamo osservato una riduzione nella sintesi di IL-8 e MCP-1 da parte di cellule A549 pretrattate con Rosiglitazone prima di essere incubate con le MP; inoltre in analisi a livello trascrizionale anche i livelli di mRNA di IL-8 e di MCP-1 si abbassano nelle cellule pretrattate con il Rosiglitazone e successivamente stimolate con MP. Questi risultati dimostrano che l’agonista sintetico, Rosiglitazone, contrasta l’azione pro-infiammmatoria delle MP, facendo diminuire l’espressione di mediatori dell’infiammazione come IL-8 e MCP-1 indotti da MP nelle cellule epiteliali delle vie aeree. Ulteriore conferma del ruolo antinfiammatorio del Rosiglitazone è data da un altro risultato in cui questo agonista inibisce l’espressione di IL-8 indotta dalle MP anche in un'altra linea cellulare le BEAS-2B che a differenza delle cellule A549 che sono alveolari e tumorali, sono cellule bronchiali e fenotipicamente normali.
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Anche l’agonista naturale dei recettori PPAR-γ, il 15d-PGJ2 presenta un
comportamento anti-infiammatorio nei confronti dell’azione delle MP: esso infatti provoca la riduzione dell’espressione della proteina MCP-1 indotta da MP nelle cellule A549. A differenza del Rosiglitazone il 15d-PGJ2 contrasta l’azione
pro-infiammatoria delle MP in maniera più marcata; è possibile che questo fenomeno sia dovuto al suo duplice meccanismo di azione, di cui si parla in letteratura; si pensa infatti che oltre ad attivare il recettore PPAR-γ, il 15d-PGJ2 possa esso
stesso inibire direttamente NF-κB (Scher, 2005).
Dimostrato l’effetto inibitorio dei due agonisti PPAR-γ nei confronti dell’azione a favore dell’infiammazione delle MP abbiamo voluto verificare se questo effetto inibitorio fosse legato alla dose di agonista; abbiamo potuto costruire una curva dose risposta sia per Il Rosiglitazone che per il 15d-PGJ2 nei confronti della
chemochina MCP-1 indotta nelle cellule A549 da MP. In queste curve si nota che all’aumentare della concentrazione di agonista aumenta l’inibizione della sintesi di MCP-1 indotta dalle MP, ovvero aumenta l’inibizione dell’azione pro-infiammatoria delle MP.
Nel tentativo di costruire due curve dose-risposta anche per l’IL-8, abbiamo riscontrato che per questa chemochina i due agonisti assumono un comportamento diverso da quello assunto per MCP-1. Il Rosiglitazone inibisce la sintesi di IL-8 indotta da MP non in modo dose-dipendente: infatti, l’entità della inibizione della sintesi di IL-8 sembra essere un fenomeno “tutto-o-nulla” e non varia al variare delle concentrazioni di agonista.
Per quanto riguarda il 15dPGJ2, questo assume un comportamento bifasico nei
confronti di IL-8 indotta da MP; infatti a basse concentrazioni inibisce l’espressione di IL-8 indotta dalle MP ma a più alte concentrazioni stimola la sintesi di IL-8 potenziando l’effetto pro-infiammatorio delle MP. Questo risultato evidenzia che il 15dPGJ2 non ha un effetto interamente anti-infiammatorio nei
confronti della sintesi IL-8 indotta da MP su cellule epiteliali delle vie aeree . Nel mio lavoro di tesi il 15dPGJ2 complessivamente inibisce la sintesi di MCP-1
indotta dalle MP ed ha un comportamento bifasico nei confronti della sintesi di IL-8 indotta dalle MP. Questi risultati sono parzialmente in linea con dati disponibili in letteratura relativi alla modulazione dell’espressione di citochine da parte di 15dPGJ2 che dimostrano che questo agonista ha comportamenti differenti
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in senso pro-infiammatorio e anti-infiammatorio a seconda della sua concentrazione, del tipo cellulare, dello stimolo e del mediatore indagato (Scher,
2005). Particolarmente rilevante, a questo proposito, l’osservazione che 15dPGJ2
induce sintesi di mRNA per IL-8 su monociti umani non precedentemente stimolati con un andamento bifasico che mostra massima attività attorno a 10 µM
(Zhang, 2001).
In conclusione, le MP esercitano un’azione pro-infiammatoria con meccanismo NF-κB dipendente e gli agonisti PPAR-γ Rosiglitazone e 15dPGJ2 attivando i
recettori PPAR-γ modulano la sintesi di mediatori dell’infiammazione indotti da MP, interagendo a livello del DNA e probabilmente inibendo la traslocazione del fattore NF-κB nel nucleo.
In prospettiva, questi risultati possono contribuire a proporre un ruolo terapeutico per gli agonisti dei recettori PPAR-γ nelle patologie infiammatorie croniche del polmone.
