CAPITOLO 4: RISULTATI

CAPITOLO 4: RISULTATI

4.1 L’azione pro-infiammatoria delle MP nelle cellule A549

coinvolge l’attivazione del fattore di trascrizione NFκB (EMSA)

Per verificare se le MP fossero in grado di attivare il fattore di trascrizione NFκB nelle cellule A549, sono stati condotti esperimenti con la metodica EMSA. In questi esperimenti è stato usato come controllo positivo il TNF-α, agente pro-infiammatorio con meccanismo d’azione NFκB dipendente; infatti nelle cellule A549 stimolate per 1h con TNF-α si è verificata attivazione di NFκB e quindi la sua presenza nel nucleo. Questo risultato è stato ottenuto anche nelle cellule stimolate per 1h con MP dimostrando che le MP mostrano un meccanismo d’azione NFκB dipendente nelle cellule A549 (Fig.6).

Basale MP TNF-α (1h)

Fig.6: Valutazione dei complessi DNA-NFκB ottenuti con la tecnica EMSA in

cellule A549 in condizioni basali per 1h, in cellule A549 stimolate per un 1h con MP e in cellule A549 stimolate per 1h con TNF-α. Si nota che come nel caso di cellule stimolate con TNF-α anche nelle cellule stimolate con MP aumentano i complessi NFκB-DNA rispetto al basale.

4.2 Il Rosiglitazone inibisce la sintesi di IL-8 e MCP-1 indotta

dalle MP sulla linea cellulare A549

Sono stati condotti esperimenti per valutare il ruolo dell’agonista PPAR-γ Rosiglitazone sulla sintesi di IL-8 e MCP-1 indotta dalle MP, generate con calcio ionoforo A23187 da monociti/macrofagi, sulle cellule A549. La chemochina presente nei sovranatanti di A549 è stata dosata mediante la tecnica immunoenzimatica ELISA. La concentrazione di IL-8 e MCP-1 aumenta quando le cellule A549 vengono stimolate con MP ovvero con il sovranatante di monociti trattati con calcio ionoforo A23187 (12µm) per 15-20 min. La concentrazione di IL-8 e MCP-1 diminuisce di circa il 50%, quando le cellule A549 vengono pretrattate con il Rosiglitazone per 2h prima di essere incubate con MP. Questa riduzione delle due citochine in presenza del Rosiglitazone dimostra un ruolo inibitorio di questo agonista PPAR-γ nell’induzione dell’infiammazione.

Il Desametazone è stato utilizzato come controllo positivo in questo tipo di esperimenti, in quanto rappresenta un noto agente anti-infiammatorio; pretrattando le A549 con Desametazone per 2h e successivamente incubandole con MP originate da monociti/macrofagi sempre con calcio ionoforo A23187 si assiste ad una diminuzione della sintesi delle due chemochine superiore al 50% (Fig. 7-8).

Fig. 7: Sintesi di IL-8 nel sovranatante di cellule A549 in condizioni basali, in cellule stimolate con MP, in cellule pretrattate con Rosiglitazone per 2h e successivamente incubate con MP e in cellule pretrattate con Desametazone per 2h e successivamente stimolate con MP. Si nota che la sintesi di IL-8 diminuisce nelle cellule pretrattate con il Rosiglitazone e dopo incubate con MP a dimostrare il ruolo contrastante di questo agonista sintetico nei confronti dell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle A549.

Fig. 8: Sintesi di MCP-1 nel sovranatante di cellule A549 in condizioni basali, in

cellule stimolate con MP, in cellule pretrattate con Rosiglitazone per 2h e successivamente incubate con MP e in cellule pretrattate con Desametazone per 2h e successivamente stimolate con MP. Si nota che la sintesi di MCP-1 diminuisce nelle cellule pretrattate con il Rosiglitazone e dopo incubate con MP a dimostrare il ruolo contrastante di questo agonista sintetico nei confronti dell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle A549.

4.3 Il Rosiglitazone inibisce la sintesi di mRNA per IL-8 e MCP-1

indotta dalle MP sulla linea cellulare A549 (RT-PCR)

A confermare l’azione inibitoria del Rosiglitazone sull’attività pro-infiammatoria delle MP sono state fatte indagini molecolari che hanno dimostrato le variazioni di IL-8 e MCP-1 anche a livello trascrizionale (Fig.9).

Basale MP MP+Rosi

IL-8

Basale MP MP+Rosi

MCP-1

4.4 Il Rosiglitazone inibisce la sintesi di mRNA per IL-8 e MCP-1

indotta dalle MP sulla linea cellulare A549 (REAL TIME)

L’inibizione da parte del Rosiglitazone a livello trascrizionale nelle cellule A549 stimolate con MP è confermata dalla Real Time PCR.

I livelli di mRNA di IL-8 nelle A549 pretrattate con il Rosiglitazone e successivamente incubate con MP si riducono del 50% rispetto ai livelli di mRNA di IL-8 indotti nelle cellule stimolate solo con MP; invece i livelli di mRNA di MCP-1 nelle stesse condizioni si riducono del 75% (Fig. 10).

Fig. 10: Valutazione dei livelli di mRNA di IL-8 e MCP-1 nelle cellule pretrattate

con Rosiglitazone e successivamente incubate con MP, rispetto ai livelli di mRNA delle due proteine nelle cellule stimolate solo con MP. Si nota una diminuzione dei livelli di mRNA di entrambe le proteine rispetto ai livelli di mRNA nelle cellule stimolate solo con MP.

4.5 Il Rosiglitazone inibisce la sintesi di IL-8 indotta dalle MP

sulla linea cellulare BEAS-2B

Sono stati condotti esperimenti per valutare il ruolo dell’agonista PPAR-γ Rosiglitazone sull’azione pro-infiammatoria delle MP anche nelle linea cellulare BEAS-2B. Queste sono cellule bronchiali fenotipicamente normali e immortalizzate. La chemochina presente nei sovranatanti di questa linea cellulare è stata dosata mediante la tecnica immunoenzimatica ELISA. In queste cellule abbiamo dimostrato che la concentrazione di IL-8 nel sovranamente di cellule pretrattate con Rosiglitazone e successivamente incubate con il sovranatante di monociti/macrofagi stimolati con calcio ionoforo A23187 diminuisce rispetto alla concentrazione della chemochina nel sovranamente delle cellule stimolate solo con MP. Questa riduzione della chemochina IL-8 in presenza del Rosiglitazone anche nelle BEAS-2B, è un ulteriore conferma del ruolo inibitorio di questo agonista PPAR-γ nell’induzione dell’infiammazione (Fig. 11).

Fig.11: Sintesi di IL-8 nel sovranatante di cellule BEAS-2B in condizioni basali,

in cellule stimolate con MP e in cellule pretrattate con Rosiglitazone per 2h e successivamente incubate con MP. Si nota che la sintesi di IL-8 diminuisce nelle

ruolo contrastante di questo agonista sintetico nei confronti dell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle BEAS-2B.

4.6 IL 15dPGJ

inibisce l’espressione di MCP-1 indotta dalle MP

sulle cellule A549

Sono stati condotti esperimenti per valutare il ruolo dell’agonista naturale PPAR-γ 15dPGJ2 sull’azione pro-infiammatoria delle MP nelle cellule A549. La

chemochina presente nei sovranatanti delle cellule è stata dosata mediante la tecnica immunoenzimatica ELISA. Abbiamo dimostrato che la concentrazione di MCP-1 nel sovranamente di cellule pretrattate con 15dPGJ2 e successivamente

incubate con il sovranatante di monociti/macrofagi stimolati con calcio ionoforo A23187 (con MP) diminuisce rispetto alla concentrazione della chemochina nel sovranatante delle cellule stimolate solo con MP. Questo risultato dimostra che agonisti PPAR-γ strutturalmente differenti contrastano l’azione pro-infiammatoria delle MP. (Fig. 12).

Fig. 12: Sintesi di MCP-1 nel sovranatante di cellule A549 in condizioni basali, in

cellule stimolate con MP e in cellule pretrattate con 15d-PGJ2 per 2h e

successivamente incubate con MP. Si nota che la sintesi di MCP-1 diminuisce nelle cellule pretrattate con il 15d-PGJ e dopo incubate con MP a dimostrare il

ruolo contrastante di questo agonista naturale nei confronti dell’azione pro-infiammatoria delle MP nelle A549.

4.7 Nelle cellule A549 il Rosiglitazone e il 15d-PGJ

esercitano l’

inibizione della espressione di MCP-1 indotta dalle MP in

maniera dose-dipendente

Mediante la tecnica immunoenzimatica ELISA sono stati condotti esperimenti con lo scopo di verificare se l’effetto inibitorio operato dai due agonisti nei confronti dell’azione pro-infiammatorio delle MP nelle cellule A549 dipendesse dalla dose di agonista; a questo proposito si sono pretrattate cellule A549 con concentrazioni crescenti di Rosiglitazone e 15dPGJ2 per 2h, successivamente le

cellule sono state incubate con le MP. Le concentrazioni di Rosiglitazone utilizzate per questo esperimento sono state 5µM, 20µM, 40µM, e 80µM, mentre le concentrazioni usate per il 15dPGJ2 sono state 2µM, 4µM, 8µM, 16µM e

20µMg. Si sono potute costruire due curve dose-risposta per entrambi gli agonisti nei confronti della chemochina MCP-1, dove all’aumentare della concentrazione sia di Rosiglitazone che di 15dPGJ2 diminuisce la concentrazione di MCP-1