Ringraziamenti Riferimenti bibliografici Capitolo-4: Risultati Capitolo-5: Discussione Capitolo-3: Materiali e metodi Capitolo-2: Scopo della tesi Capitolo-1: Introduzione Abstract Riassunto INDICE

INDICE

Riassunto I

Abstract III

Capitolo-1: Introduzione pag 1

1.1 FIV come modello animale per lo sviluppo e validazione di approcci vaccinali

1.2 Esperimenti di vaccinazione 1.3 Vettori virali

1.4 I Foamy-Virus

Capitolo-2: Scopo della tesi pag 19

Capitolo-3: Materiali e metodi

3.1 Biologia molecolare 3.2 Biologia cellulare

Capitolo-4: Risultati pag 32

Capitolo-5: Discussione

Ringraziamenti pag 51

Riferimenti bibliografici

RIASSUNTO

Fra le recenti terapie antiretrovirali attualmente in studio, particolare attenzione è stata volta negli ultimi anni allo sviluppo di peptidi derivati dai domini N- o C-terminali derivati dalla proteina transmembrana (TM) dell’envelope virale (Env). Questi peptidi, oltre a essere utilizzati per bloccare la fusione e l’entrata del virus all’interno della cellula bersaglio nella fase iniziale dell’infezione, se opportunamente veicolati possono essere utilizzati come immunogeni per indurre anticorpi ad attività neutralizzante. Nel virus dell’immunodeficienza felina (FIV), un lentivirus simile al virus dell’immunodeficienza umana (HIV) è stato individuato un piccolo peptide di 8 aminoacidi (aa), denominato C8, contenente un motivo ricco in triptofani (Trp) che esercita un potente effetto antivirale su tutti gli isolati studiati. Inoltre, se compreso in una regione più estesa di 44 aa (peptide ETrp44m) è capace di evocare la produzione di anticorpi neutralizzanti. Da studi strutturali e considerato l’elevato grado di conservazione tra i lentivirus, è stato ipotizzato che questo motivo Trp eserciti un ruolo essenziale per l’entrata del virus nella cellula e che sia uno degli epitopi criptici normalmente celati dal virus e contro i quali è difficile indurre anticorpi neutralizzanti.

Obbiettivo di questo lavoro è la produzione di un vettore derivato dal Foamy-Virus (FV) felino (FFV) per la veicolazione in vivo del peptide ETrp44m. Questa strategia offre alcuni importanti vantaggi: i FV non sono patogeni negli ospiti infettati nonostante l’alta prevalenza riscontrata in natura e hanno un ampio tropismo cellulare permettendo l’espressione e il rilascio del transgene in diversi tessuti. Inoltre, rispetto all’immunizzazione con il solo peptide che richiede alte dosi e ripetute somministrazioni, i vettori FFV prodotti allo scopo sono replicazione competenti garantendo così l’espressione continua nel

tempo dell’immunogeno. Scopo di questo lavoro di tesi è la caratterizzazione in vitro del costrutto vettore FFV ricombinante per valutare stabilità, capacità di replicazione e livelli di espressione del peptide.

Il costrutto vettore (pCF-7∆U3) è stato realizzato a partire dal clone FFV wild-type per sostituzione della regione U3 dell’LTR in 5’ col promotore del citomegalovirus e inserimento della sequenza codificante ETrp44m nel multiple cloning site ed in frame con il gene bet. Quest’ultimo è un gene regolatorio ed è importante per l’infettività del virus. Per valutare stabilità e competenza per replicazione è stato utilizzato il vettore contenente il gene reporter Green Fluorescence Protein (GFP) fuso al gene bet. Fra le sequenze codificanti di bet e quelle della GFP e del 44mer è stato inserito un linker che contiene un sito di taglio per una proteasi cellulare che consente il rilascio della proteina dalla cellula infettata. L’espressione dei costrutti con GFP ed ETrp44m è stata confrontata in parallelo col costrutto wild-type. I costrutti sono stati trasfettati su cellule feline (CrFK), e il virus rilasciato nel surnatante è stato propagato serialmente in CrFK. Dall’analisi delle cellule infettate, tramite western-blot e citometria a flusso del costrutto con GFP, e del surnatante tramite saggi di infettività β-Gal, è risultato che il costrutto Bet-GFP tende a subire riarrangiamenti con delezioni o perdita dell’intera GFP a causa probabilmente della sua grossa dimensione. ETrp44 si è invece dimostrato stabile ed esprime il peptide per periodi protratti. E’ in fase di valutazione il rilascio del peptide nel surnatante di coltura. La caratterizzazione in vitro costituirà premessa indispensabile alla successiva analisi in vivo nella quale si valuterà l’efficacia del vettore FFV/ETrp44m come possibile vaccino anti-FIV. Considerate le notevoli similarità strutturali e patogenetiche tra FIV e HIV, questo approccio vaccinale potrebbe avere importanti applicazioni nello sviluppo di vaccini anti-HIV, agente causale dell’AIDS nell’uomo.

ABSTRACT

Recent antiretroviral therapies have focused on the development of peptides derived from amino-terminal (N-peptides) and carboxy-terminal (C-peptides) of the trans-membrane protein (TM) of the viral envelope (Env). These peptides can be used both to block the fusion and entry of the virus into the target cell and, if appropriately engineered, to induce an humoral neutralizing response. Thus, these peptides are extensively evaluated for their therapeutic and prophylactic potentials. In the feline immunodeficiency virus (FIV) a small peptide of 8 aminoacids (aa), designated C8, was identified. It contains a tryptophan (Trp)-rich sequence with strong antiviral effect on all viral isolates tested. Furthermore, if this peptide is included in a 44 aa-long region (ETrp44m), it induces neutralizing antibodies. Given the sequence and structure similarities among lentiviruses, it has been hypothesized that the Trp sequence plays a fundamental role during the entry of the virus into target cells and that it is one of the cryptic antigens usually hidden into the virion and against which neutralizing antibodies are difficult to induce.

The aim of the present study is the production of a Feline Foamy Virus (FFV)-derived vector for the delivery of ETrp44 in vivo. This strategy offers several advantages: in spite of their high prevalence in nature, FVs are not pathogen and have a wide cellular tropism thus allowing expression and release of transgenes into different tissues. Additionally, compared to the immunization with the peptide alone that would require high doses and repeated somministrations, the FFV vectors produced here are replication-competent ensuring continuous expression of the immunogen. Objective of this research is the in vitro characterization of the recombinant vector FFV to evaluate stability, replication ability and expression levels of this peptide.

Vector construct (pCF-7∆U3) was been obtained from an FFV wild type clone by substitution of the region U3 of the 5’ LTR with the cytomegalovirus promoter and by insertion of the codifying ETrp44 sequence into the multiple cloning site and in frame with the bet gene. This is a regulatory gene important for virus infectivity. To evaluate stability and replication competence of the FFV vector the Green Fluorescence Protein (GFP) linked to the bet gene was used as reporter gene. Between bet and GPF or Etrp44m, a linker cellular protease recognistion site was inserted to allow release of the proteins from infected cell. Expression of GFP and ETrp44 constructs was compared with wild-type clone analysed in parallel. Constructs were transfected into Crandell feline kidney cells (CrFK), and the virus released in the supernatant serially propagated in CrFK. Infected cells were analysed by western-blot and in flow cytometry (GFP construct); viral titer supernatants by β-Gal assay: results showed that Bet-GFP tends to rearrange by deleting GFP probably because of its big size. On the other hand, ETrp44m proved stable and produced the peptide for a long period of time. Peptide release into the cell supernatant is still in evaluation. In vitro characterization is an essential step before going in vivo where the FFV/Etrp44m vector will be evaluated as a potential anti-FIV vaccine. Given the high structural and pathogenetic similarities between FIV and HIV, this vaccine approach could be exploited for developing vaccines against HIV, tha causal agent of AIDS in human