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Studi condotti su modelli sperimentali per HIV/AIDS hanno evidenziato che vaccini a subunità, a DNA o basati sul virus intero inattivato si sono dimostrati parzialmente o totalmente inefficienti nell’indurre una risposta immunitaria protettiva (Bogers et al., 2000). Su questa base sono state intraprese strategie atte allo sviluppo di vaccini vivi attenuati, capaci di indurre una risposta immunitaria più duratura ed a largo spettro. Utilizzando il sistema FIV/gatto come modello animale, nel nostro laboratorio sono stati condotti esperimenti in vivo con cloni molecolari derivati dall’isolato Petaluma del virus geneticamente attenuati per una cospicua delezione di una porzione codificante della regione genetica ORF-A (Pistello et al., 2002). Rispetto alla controparte wild-type, questi mutanti hanno indotto infezioni di basso grado e si sono dimostrati significativamente e stabilmente attenuati. La risposta che hanno indotto è stata tuttavia flebile, non in grado di conferire protezione assoluta quando gli stessi cloni sono stati valutati come candidati vaccinali sfidando gli animali vaccinati con un ceppo primario virulento del virus (Pistello et al., 2005). E’ concepibile quindi che aumentando l’immunogenicità dei cloni vaccinali si possa migliorare l’entità della protezione ed aumentare quindi il potenziale dei cloni attenuati con questa strategia genetica come candidati vaccinali.
Uno degli approcci possibili per aumentare l’induzione della risposta immune antivirale deriva proprio dalle modalità del ciclo replicativo dei lentivirus. Uno degli antigeni più immunogenici e verso il quale vengono indotti anticorpi neutralizzanti e linfociti ad attività citotossica è la glicoproteina Env che, durante le ultime fasi del ciclo replicativo dei lentivirus, viene esposta sulla superficie delle cellule infette per poi venire in parte endocitata e degradata all’interno di vescicole citoplasmatiche (Boge et al., 1998; Bowers et al., 2000). Studi condotti su HIV e SIV hanno evidenziato che mutanti con delezioni o sostituzioni
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della glicina e della tirosina presenti nella sequenza segnale della regione intracitoplasmatica della glicoproteina TM, oltre ad incrementare l’espressione della proteina sulla superficie delle cellule infette e sui virioni prodotti, inducono in vivo titoli di anticorpi anti-Env superiori rispetto a quelli indotti dagli stessi costrutti wild-type (Ye et al., 2004; Fultz et al., 2001).
Scopo di questa tesi è stato quello di aumentare le capacità immunogeniche di cloni FIV, precedentemente deleti in ORF-A, modificandoli nella sequenza segnale per l’endocitosi della glicoproteina Env, affinché questa venga maggiormente espressa sulle cellule infette.
Recenti studi hanno dimostrato che, come in HIV-1 e SIV, anche nella regione citoplasmatica della TM di FIV la glicina e la tirosina, rispettivamente in posizione 820 e 821, costituiscono gli aminoacidi cardine della principale sequenza segnale per il processo di endocitosi (Hosie et al., 2005). Nel nostro studio è stato utilizzato come controllo il clone ∆00, che contiene l’intero genoma di FIV-Pet, ed il clone ∆23 che esprime una proteina ORF-A tronca. Entrambi sono stati mutati nella sequenza segnale per l’endocitosi di Env. Tramite mutagenesi per PCR i codoni codificanti per glicina e tirosina sono stati deleti o mutagenizzati per codificare rispettivamente alanina ed isoleucina.
I cloni così prodotti sono stati saggiati in esperimenti di trasfezione su cellule CrFK ed osservati al microscopio ottico per la produzione di sincizi a tre giorni dalla trasfezione. Come atteso, i mutanti con delezione o sostituzione di glicina e tirosina hanno prodotto un numero di sincizi sensibilmente più elevato rispetto ai cloni di controllo ∆00 e
∆23. In particolare, il clone ∆00AI ha indotto la produzione di molti più sincizi rispetto al wild-type ed al ∆00XX, pur avendo valori di p25 simili a questi ultimi. Anche il clone ∆00XX, sebbene in misura minore rispetto a ∆00AI, ha prodotto più sincizi rispetto al wild-type.
Similmente, il clone ∆23AI presentava il maggior numero di sincizi rispetto agli altri due cloni ed a sua volta il clone con doppia delezione aveva più sincizi rispetto al clone wild-type. Questi risultati fanno
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supporre che nelle cellule trasfettate con i cloni ∆00AI e ∆23AI vi sia un contenuto superiore in Env rispetto ai cloni con la doppia delezione indicando che la sostituzione dei due aminoacidi, più che la loro delezione, è in grado di rallentare il normale processo di endocitosi di Env.
Per verificare se effettivamente all’aumento del numero di sincizi corrisponde un incremento del contenuto di Env sulla superficie cellulare, è stato condotto un saggio di immunofluorescenza sulle cellule trasfettate. Mentre per i cloni wild-type Env si localizzava prevalentemente nel citoplasma delle cellule e comunque all’interno dei sincizi, per i cloni mutati la fluorescenza era particolarmente concentrata sulla membrana citoplasmatica a conferma quindi di una predominante localizzazione di superficie di Env. Questa osservazione è stata confermata anche da una serie di esperimenti successivi nei quali le cellule trasfettate sono state marcate con anticorpo primario anti-Env ed un secondario fluoresceinato ed analizzate in citofluorimetria a flusso. L’analisi ha confermato che le cellule trasfettate sia con i cloni deleti nei due aminoacidi sia con quelli esprimenti due diversi aminoacidi presentavano un più alto contenuto di Env della membrana plasmatica.
Nel loro complesso i risultati indicano che entrambe le mutagenizzazioni incidono sull’efficienza di endocitosi di Env dalla superficie delle cellule infette. I due riarrangiamenti non sono tuttavia equivalenti, in quanto nei cloni con doppia sostituzione l’internalizzazione delle proteine avviene in misura molto più ridotta rispetto ai cloni con i due aminoacidi deleti. E’ concepibile ipotizzare, quindi, che la sostituzione dei due aminoacidi perturbi la struttura della proteina in modo tale che questa non venga più riconosciuta dalle proteine cellulari deputate all’internalizzazione (endocitosi) delle proteine di superficie. La doppia delezione potrebbe invece solo ridurre l’affinità di legame delle molecole coinvolte riducendo l’efficienza del processo che comunque avviene in una certa misura.
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Dalle evidenze raccolte in questa tesi, si deduce quindi che anche in FIV, come in HIV e SIV, mutazioni della sequenza segnale di endocitosi inducono una maggiore espressione di Env sulla superficie delle cellule infette.
Infine, in tutte le analisi condotte e a conferma degli studi precedentemente effettuati (Pistello et al., 2002; 2005), vi è una sensibile differenza nelle capacità replicative dei cloni ∆23XX e ∆23AI rispetto agli stessi cloni non mutagenizzati. La mutagenizzazione di ORF-A riduce l’efficienza di replicazione dei cloni FIV di oltre il 50% a giudicare dai livelli di p25 rilasciata nel supernatante delle colture. Ciò tuttavia non sembra incidere molto sul contenuto di Env sulla superficie delle cellule infette. Le differenze riscontrate per numero di sincizi, percentuale di cellule Env-positive e contenuto di Env in superficie rispetto agli omologhi cloni ∆00 sono infatti molto più ridotte.
Questo aspetto, unito alla stabilità delle mutazioni inserite, valutata per propagazione a lungo termine dei virus mutanti in vitro, fanno ben sperare riguardo ad una possibile applicazione in vivo dei cloni ∆23 difettivi per endocitosi quali potenziali vaccini anti-FIV.
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