et al., 1998) con funzioni specifiche

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CAP. 1 GENERALITA’ SULLA MALATTIA

¾ 1.1 EZIOLOGIA

Maedi-Visna è un’infezione persistente degli ovini causata da un virus a Rna appartenente alla famiglia Retroviridae: i generi facenti parte di questa famiglia hanno in comune la presenza di un enzima, la trascrittasi inversa, che durante la replicazione virale prende parte al processo di retrotrascrizione del genoma formato da Rna in Dna. Il nome della famiglia deriva pertanto dalla presenza di questa Dna-polimerasi Rna-dipendente.

Il MVV appartiene al genere Lentivirus che comprende virus con caratteri morfologici comuni: le particelli virali appaiono sferiche con un diametro approssimativo di 80-100 nm, sono provviste di envelope, che deriva dalla membrana della cellula ospite al momento della loro liberazione, che avviene per gemmazione (budding). Sono quindi sensibili ai solventi dei lipidi, vengono inattivati a 56°C in 3° minuti, mentre sono piuttosto resistenti ai raggi UV, forse grazie alla diploidia del loro genoma (Poli G., 2005).

II genoma virale è costituito da Rna lineare a singolo filamento ed a polarità positiva, lungo da 7 a 10 kb, è presente in duplice copia e

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rappresenta l’unico caso di patrimonio diploide tra i virus (www.pg.izs.it) in quanto le due molecole di Rna sono geneticamente identiche.

Il genoma comprende tre geni di struttura codificanti per l’envelope (env), per il capside (gag = group specific antigen) e per gli enzimi virali (pol = polymerase) (Pepin M. et al., 1998) con funzioni specifiche:

* gene env codifica per un precursore gp160^env che, scisso ad opera delle proteasi cellulari, dà luogo a due subunità: la glicoproteina di superficie gp135 e la glicoproteina di transmembrana gp44 (Poli G., 2005) costituenti, con le proteine della membrana cellulare, l’envelope virale (Bellet V., 2003);

* gene gag codifica per proteine di struttura essenziali nell’assemblaggio delle particelle virali; a partire da un precursore proteico Pr55^gag si ottengono la proteina di matrice p17, del capside p25 e la nucleoproteina p14 (Bellet V., 2003) (Pepin M. et al., 1998);

* gene pol codifica gli enzimi necessari alla replicazione ed all’assemblaggio delle particelle virali; il precursore Pr^gag-envviene scisso in più enzimi quali l’integrasi che è associata all’Rna virale e permette l’integrazione del genoma sottoforma di Dna bicatenario, la proteasi che è implicata nella maturazione delle proteine virali, la dUTPasi che sembra avere un ruolo nel diminuire la frequenza delle mutazioni del virus (Bellet V., 2003). Il gene pol codifica inoltre per la trascrittasi inversa (Poli G., 2005).

Sono anche presenti dei geni accessori rappresentati dalle proteine regolatrici tat (transactivator of transcription) che codifica per l’attivazione della espressione genica (Poli G., 2005) e rev (regulator of virion protein expression) che interviene nel trasporto dell’mRna dal nucleo al citoplasma

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(Pepin M. et al., 1998); la proteina accessoria vif (virion infectivity factor) sembra avere un ruolo nelle fasi finali di replicazione facilitando l’ingresso del virus in magrofagi e linfociti ma la sua funzione non è ancora ben definita.

A livello dell’envelope il virus Maedi-Visna presenta dunque due proteine la gp135, glicoproteina di superficie che si localizza sui recettori della cellula colpita e la gp44, glicoproteina che partecipa alla fusione e penetrazione del virus (Bellet V., 2003); queste glicoproteine hanno un ruolo fondamentale perché contengono gli epitopi capaci di indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti, nonché di determinare l’interazione del virus con il recettore delle cellule colpite (Pepin M. et al., 1998). A livello del capside si hanno invece la p25, proteina principale, responsabile durante l’infezione della risposta immunitaria dell’organismo, la p17 che si localizza tra envelope e capside stesso e la p14 direttamente associata alle molecole dell’Rna (Pepin M. et al., 1998) (Bellet V., 2003).

Fig. 1 Struttura del virus Maedi-Visna (Bellet V., 2003).

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Il Maedi-Visna determina negli ovini un’infezione latente in quanto il provirus resta integrato nel genoma della cellula ospite per molto tempo durante il quale la replicazione virale avviene a bassi livelli (www.pg.izs.it) ed anche la stimolazione alla produzione di anticorpi è piuttosto limitata.

Infatti la lentivirosi è contraddistinta da uno stadio preclinico piuttosto lungo in cui l’animale non manifesta i sintomi della malattia ma è in grado di eliminare il virus e di produrre anticorpi specifici che però non sono in grado di contrastarlo in maniera efficace, in questo modo l’infezione è in grado di progredire fino alla fase clinica propriamente detta.

Gli anticorpi nei confronti delle proteine virali sono prodotti in fasi ben precise dell’infezione e si differenziano in:

anticorpi gruppo-specifici, fissanti il complemento, la cui formazione è indotta dalla proteina p25 codificata dal gene gag: compaiono a 3-4 settimane dall’esordio della malattia raggiungendo la massima concentrazione dopo pochi mesi e restando nell’animale per anni;

anticorpi stipite-specifici, neutralizzanti, la cui produzione è indotta dalla proteina gp135 codificata dal gene env: compaiono dopo circa 3 mesi, sono al massimo livello dopo un anno e permangono per tutta la vita del soggetto;

anticorpi precipitanti la cui formazione è indotta sia dalla proteina gp135 che dalla gp 25 (Rizzi V. et al., 1998).

Il ciclo di replicazione del virus Maedi-Visna è stato osservato in vitro su cellule di plesso coroideo di montone; la fase iniziale consiste nell’interazione tra virus e recettore cellulare che determina una modifica nella conformazione della glicoproteina di superficie con esposizione dei

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siti di legame per i recettori; dopo la fissazione della glicoproteina gp135 al recettore cellulare e la fusione dei lipidi virali con quelli cellulari, si ha penetrazione del virione attraverso la membrana citoplasmatica della cellula degradata. Si ha a questo punto la svestizione dell’Rna virale che penetra nel citoplasma associato alle proteine virali. L’Rna genomico pur essendo a filamento positivo non funziona direttamente da messaggero, ma viene retrotrascritto ad opera della trascrittasi inversa (Dna-polimerasi Rna- dipendente) in un filamento di Dna. La trascrittasi inversa ha anche attività ribonucleasica (ribonucleasi H) e distrugge il filamento di Rna dell’ibrido formatosi, liberando in tal modo il Dna, su cui si forma il filamento complementare. A questo punto il dsDna lineare viene trasportato al nucleo dove le estremità sono congiunte dando luogo alla formazione di molecole circolari (e in questa forma si ritrova nel nucleo della cellula) e, tramite un’integrasi virale, si inserisce nel genoma virale sottoforma di provirus.

Dopo un periodo più o meno lungo di latenza, il Dna si attiva, produce mRna, le varie proteine enzimatiche e strutturali (in genere generate per clivaggio da precursori inattivi) e l’Rna genomico .

La replicazione in vitro del virus Maedi-Visna si ha su cellule di sinovia di capretto di un giorno, su cellule di plesso coroideo ovino o su colture di macrofagi ottenuti da latte e siero ovini. L’effetto citopatico che si osserva è dato dalla comparsa di cellule rifrangenti e tondeggianti e di sincizi cellulari dovuti alla fusione delle membrane plasmatiche.

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Fig. 2 Particelle virali in una coltura Fig. 3 Particelle virali in una coltura di plesso coroideo di agnello di plesso coroideo di agnello

(www.pg.isz.it). (www.pg.isz.it).

I lentivirus presentano una notevole variabilità genetica, che influenza le proprietà biologiche, come virulenza e caratteristiche di crescita in vitro, e le proprietà antigeniche degli isolati virali (Tolari F., 2000). I virus possono assumere caratteri diversi soprattutto in relazione al potere citopatico, alla capacità di indurre anticorpi, alla patogenicità e al tropismo per i diversi organi:

* Ceppi islandesi hanno un elevato potere citopatico, sono capaci di indurre su colture cellulari la produzione di sincizi in circa 24 ore e determinano lisi cellulare in 3 giorni p.i.; hanno un’elevata capacità di indurre la produzione anticorpale (Ac neutralizzanti), sono dotati di elevata patogenicità e gli organi più colpiti sono il polmone e il sistema nervoso (Legrottaglie R. et al., 1996).

* Ceppi europei che rispetto ai precedenti hanno scarsa replicazione in vitro e scarsa capacità di indurre reazioni anticorpali (Ac neutralizzanti); la

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patogenicità è elevata nei ceppi olandesi, media in quelli francesi e scarsa negli italiani mentre per quel che riguarda il tropismo, i ceppi olandesi prediligono l’apparato mammario e gli italiani danno coinvolgimento polmonare e mammario così come gli spagnoli (Rizzi V. et al., 1998).

* Ceppi americani hanno scarso potere citopatico e scarsa capacità di indurre anticorpi, media patogenicità e tropismo polmonare, mammario ed articolare (Legrottaglie R. et al., 1996).

¾ MODALITA’ DI TRASMISSIONE

La principale via di trasmissione del MVV è orizzontale diretta attraverso secrezioni nasali e lacrimali che permettono la rapida diffusione negli allevamenti, favorita anche dallo stretto contatto in cui gli animali sono costretti a vivere nelle stalle .

Un ruolo chiave nella diffusione del virus è attribuito alla trasmissione mediante l’assunzione di colostro e latte da madri infette: l’agente infettante è infatti presente nel secreto mammario quindi il contatto tra madre ed agnelli post-partum favorisce la propagazione della lentivirosi negli allevamenti.

Infrequente, ma possibile, è il contagio per via venerea tramite il seme di maschi contaminati visto che il virus, presente in tutti i fluidi corporei, potrebbe passare alle femmine durante l’accoppiamento.

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La via orizzontale indiretta attraverso veicoli, quali ad esempio l’acqua contaminata, è piuttosto infrequente in quanto il virus ha scarsa resistenza nell’ambiente esterno e questo conferisce scarsa rilevanza a questo tipo di trasmissione mentre è stata dimostrata la trasmissione iatrogena attraverso strumenti sporchi di sangue infetto.

Sembra confermata la via verticale congenita transplacentare con una maggiore frequenza in pecore giovani e con pochi parti (De La Concha- Bermejillo et al., 1994) anche se la questione è ancora controversa.

La diffusione dell’infezione può essere influenzata da una serie di fattori quali:

età: appaiono essere più recettivi gli ovini sotto i 3 anni anche se la sintomatologia compare tardivamente (infezione lenta);

gravidanza: il virus determina aborto nelle femmine gravide o nascita di agnelli deboli;

movimentazione degli animali: la transumanza, ad esempio, molto diffusa nelle nostre zone contribuisce alla trasmissione del virus ad ovini di altre greggi;

allattamento: il colostro ed il latte sono tra le principali fonti di contagio;

stabulazione permanente: la elevata densità degli ovini associata alla stretta convivenza negli allevamenti, soprattutto nei mesi invernali, può favorire la diffusione dell’infezione.

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¾ 1.3 PATOGENESI

Le principali cellule bersaglio del Maedi-Visna virus sono rappresentate da monociti circolanti (linea monocitaria-macrofagica); i macrofagi sono una fonte di virioni per tutta la durata della malattia (Sanna E. et al., 2001) in quanto persistentemente infetti e pertanto in grado di diffondere il virus in modo continuo. Infatti nel genoma delle cellule colpite il virus resta quiescente allo stato di provirus e, veicolato agli organi bersaglio, si replica solo in concomitanza della maturazione in macrofagi che, pur non subendo importanti modificazioni citologiche, hanno un ruolo fondamentale nella patogenesi. Dopo la loro contaminazione si verifica infatti la formazione dei patognomonici manicotti perivascolari e peribronchiali dovuti all’infiltrazione linfocitaria che caratterizzano la malattia a livello istologico.

Solamente alcuni epitopi (CD8+) presenti nelle lesioni alveolari ed interstiziali sono da mettere in relazione alla gravità delle lesioni; la produzione dell’interferone LV-IFN è responsabile dell’andamento del quadro reattivo in quanto potenzia la risposta linfoproliferativa e ritarda la maturazione dei monociti in macrofagi (Sanna E. et al., 2001).

Quando la trasmissione dell’infezione avviene per via respiratoria il virus replica principalmente nel sito di ingresso, soprattutto a livello della mucosa nasofaringea e delle tonsille, più raramente a livello polmonare, segue poi la viremia con diffusione del virus agli organi bersaglio. Se il virus entra nell’organismo associato ai monociti presenti in colostro e latte, arriva all’intestino tramite la via digerente e si diffonde. Infine se si ha

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l’ingresso diretto di monociti infetti nell’organismo dell’ospite (ad esempio per aghi sporchi di sangue contaminato) si parla di diffusione a “cavallo di Troia” in quanto il virus, nascondendosi nelle cellule infettate, vi penetra in modo subdolo.

Altri tipi cellulari possono essere bersaglio del virus, con particolare riferimento ai linfociti, ma con percentuali sensibilmente inferiori rispetto ai monociti circolanti.

¾ 1.4 ASPETTI CLINICI

L’infezione da MVV viene anche definita “malattia degli ovini adulti”

in quanto contraddistinta da uno stadio preclinico piuttosto lungo in cui l’animale non manifesta i sintomi della malattia ma è in grado di eliminare il virus. Il sistema immunitario non è in grado di contrastare il virus in maniera efficace in quanto le produzioni anticorpali in questa fase sono a bassi livelli e l’infezione può pertanto progredire lentamente fino alla fase clinica propriamente detta che si manifesta generalmente intorno all’età di 3 anni con lesioni a livello polmonare, nervoso, mammario e articolare.

Il quadro clinico si evince anche analizzando il nome della patologia Maedi che, come già ricordato, in islandese significa dispnea e Visna che significa deperimento e sta ad indicare un’affezione nervosa.

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Nell’introduzione abbiamo detto che si tratta di un’unica patologia causata da due virus identici ma con tropismo differente (Sigursson et al., 1952, 1958) ed in grado di determinare due diverse forme cliniche:

• respiratoria presente in Italia;

• nervosa per ora mai rilevata nel nostro Paese.

La forma respiratoria si manifesta clinicamente con andamento molto lento a partire da sintomi aspecifici quali compromissione dello stato generale, abbattimento e dispnea sotto sforzo. Con il progredire della malattia compare dimagrimento, affaticamento, congestione delle mucose, dispnea costante anche a riposo, narici dilatate e testa estesa sul collo (“atteggiamento a fame d’aria”) (Rizzi V. et al., 1998), incapacità a seguire il gregge, scolo nasale e tosse secca.

A complicare il quadro polmonare spesso intervengono infezioni secondarie batteriche, favorite dalla scarsa igiene riscontrabile in molti allevamenti e dalla compromissione delle condizioni generali, che contribuiscono all’aumento della percentuale di mortalità da MVV.

La forma nervosa è caratterizzata da atassia locomotoria, movimenti anomali della testa, tremori dei muscoli facciali, paresi degli arti posteriori, cadute improvvise, progressiva cachessia e paralisi che rendono l’animale incapace di alzarsi e di nutrirsi e lo conducono progressivamente alla morte che può sopraggiungere dopo mesi o anni dalla comparsa della sintomatologia.

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Fig. 4 Paralisi degli arti posteriori nella forma nervosa di Maedi-Visna (Perea A. et al., 1999).

Gli altri organi bersaglio del virus sono rappresentati da mammella e articolazioni in cui i segni clinici sono meno evidenti rispetto ai due quadri sopracitati.

La mammella può essere spesso colpita da mastite linfocitaria, con accumulo di linfociti attorno ai dotti galattofori ed iperplasia connettivale;

si verifica un indurimento mono o bilaterale, non dolente, evidenziabile solo attraverso un accurato esame di palpazione dell’organo cui si accompagna un aumento di volume a livello linfonodale.

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Fig. 5 Mastite indurativa in ovino Fig. 6 Mammella in corso di MV

affetto da MV (www.uoguelph.ca).

(www.dlab.colostate.edu).

A livello articolare talvolta si può rilevare gonfiore per iperemia ed iperplasia a carico soprattutto del carpo, con dolorabilità alla palpazione e zoppia che, con il progredire della malattia, è causata dall’anchilosi dell’articolazione dovuta all’aumento della componente fibroblastica e necrosi delle altre strutture articolari.

Si segnalano inoltre aumentata mortalità neonatale, scarso accrescimento degli agnelli ed aborto nelle femmine gravide.

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¾ 1.5 ASPETTI ISTOLOGICI E ANATOMOPATOLOGICI

I due quadri prevalenti, polmonare e nervoso, sono caratterizzati rispettivamente da polmonite interstiziale cronica e da leucoencefalomielite cronica demielinizzante.

La polmonite interstiziale ha carattere linfoproliferativo per l’abbondante infiltrazione di linfociti e di cellule della linea monocitaria- macrofagica a livello alveolare; si ha quindi aumento di volume a livello dei setti interalveolari ed iperplasia linfoide peribronchiale e intersettale (www.3.unileon.es).

Fig. 7 Polmone ovino: ingrossamento dei setti interalveolari, con presenza di cellule infiammatorie mononucleate. Iperplasia linfoide peribronchiale e intersettale

(www.3.unileon.es).

Le lesioni anatomo-patologiche del Maedi sono rappresentate innanzitutto dall’assenza di collassamento polmonare all’apertura del

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torace, con impronte costali e piccole lesioni miliari grigiastre peri- intralobulari soprattutto a livello del lobo basilare (Taccini E. et al., 1993);

i polmoni sono grigio-rosacei con sfumature giallastre, sodi, aumentati di peso, di consistenza e di volume.

Fig. 8 Confronto tra polmone sano e polmone affetto da MVV (www.dlab.colostate.edu).

Fig. 9 Aumento di volume in polmoni affetti da polmonite

interstiziale da MVV

(www.vein.library.usyd.edu).

.

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(16)

Fig. 10 Superficie pleurica polmonare con diffuso

infiltrato lobulare

(www.vein.library.usyd.edu)

La leucoencefalomielite cronica demielinizzante caratterizza istologicamente la forma nervosa con fenomeni infiltrativi linfocitario- macrofagici a livello perivascolare e formazione di tipici manicotti; si ha interessamento della sostanza grigia con progressiva degenerazione di neuroni ed assoni che giustifica il quadro di demielinizzazione che contraddistingue il Visna.

Fig. 11 Manicotto perivascolare formato Fig. 12 Encefalo con MVV: infiltrato da macrofagi e linfociti in encefalo di infiammatorio e degenerazione di

ovino colpito da Visna (www3.unileon .es). neuroni ed assoni (www3.unileon.es).

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¾ DIAGNOSI

Diagnosi clinica

L’esame clinico, che in altre virosi può essere utile, non assume particolare significato se non a livello indicativo in quanto i sintomi sono comuni ad altre patologie (adenomatosi polmonare e broncopolmoniti parassitarie) e, quando presenti, non sono particolarmente eclatanti; si può infatti notare compromissione delle condizioni generali, dispnea, all’auscultazione del torace respirazione difficile e soffiante ed alla percussione suono sub-ottuso.

Diagnosi di laboratorio

Indiretta:

la sierologia rappresenta la tecnica più utilizzata per la diagnosi di MVV negli animali in vita. Attualmente i tests sierologici di maggiore impiego sono AGID ed ELISA (per le manualità di esecuzione si rimanda a testi specifici).

* AGID: è un test valido, economico e di semplice esecuzione pertanto adatto ad essere usato come test di screening; confrontato con l’Elisa presenta una minore sensibilità.

* ELISA: è un test che richiede particolari attrezzature e più manualità ma possiede specificità e sensibilità elevate.

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Possono essere utilizzati anche altri tests quali fissazione del complemento (FDC) ed immunoblotting (IB) ma il loro impiego è limitato alla ricerca.

Diretta:

l’isolamento del virus dall’animale in vita si ottiene tramite la cocoltura dei leucociti del sangue periferico in cellule di plesso coroideo ovino o di membrana sinoviale di capretti appena nati. L’isolamento da pecore morte è realizzato mediante colture in vitro di espianti di organi infetti (polmone, plesso coroideo, mammella, linfonodi, sinovie articolari). La comparsa dell’effetto citopatico, caratterizzato dalla formazione di sincizi multinucleati e dalla comparsa di cellule stellate, fa sospettare la presenza del virus.

Si può anche intervenire con la ricerca del genoma virale attraverso la PCR ma l’utilizzo è limitato rispetto ai sistemi descritti soprattutto perché i lentivirus hanno la capacità di mutare facilmente il proprio genoma.

Allo stato attuale, come vedremo nel capitolo relativo alla profilassi, le uniche forme di lotta nei confronti del MVV rimangono la prevenzione dell’infezione nelle greggi indenni e il risanamento nelle greggi infette.

Questo implica la necessità di disporre di metodi diagnostici affidabili e di semplice realizzazione; l’isolamento del virus è una tecnica piuttosto laboriosa per cui molte delle attuali ricerche sono orientate a elaborare tests diagnostici indiretti con la più alta sensibilità e specificità possibile.

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¾ 1.7 PROFILASSI

La profilassi dell’infezione è fondamentalmente di tipo diretto, basata cioè sul controllo delle condizioni ambientali e dello stato sanitario degli allevamenti; particolare attenzione va rivolta all’ingresso di nuovi capi in greggi indenni con controlli accurati prima dell’acquisto affinché non si abbia l’ introduzione del virus.

Possiamo affermare che le principali strategie di controllo della lentivirosi siano:

- prevenzione dell’infezione nei gruppi liberi da MVV tramite rimonta interna ed introduzione di animali provenienti solo da allevamenti indenni, intendendo come tali quelli in cui i soggetti risultano negativi a 3 controlli sierologici consecutivi a distanza di 6 mesi;

- risanamento attraverso piani regionali o nazionali di eradicazione, intesa come eliminazione totale dell’agente patogeno da una popolazione e/o da un ambiente. Il risanamento delle greggi infette prevede differenti piani di intervento in relazione alla prevalenza del virus:

* bassa prevalenza: si devono macellare tutti i capi sieropositivi e la loro progenie, facendo poi controlli sierologici a distanza di 6 mesi l’uno dall’altro fino ad ottenere 3 risultati negativi consecutivi;

* media prevalenza: si sacrificano i soggetti che presentano i sintomi ed i capi anziani mentre gli agnelli vengono separati dalle madri ed allattati con colostro e latte artificiali, risanati o provenienti da femmine indenni;

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* alta prevalenza: si procede come sopra provvedendo alla rimonta con soggetti giovani e sani (negativi a 3 controlli consecutivi) tenuti isolati dal resto dell’allevamento.

Malgrado l’eradicazione rappresenti la sola possibilità di controllo del virus (non sono infatti possibili interventi vaccinali sia per la caratteristica integrazione del provirus nel Dna delle cellule colpite sia per le frequenti mutazioni cui esso va incontro nell’organismo animale) non sempre sono realizzabili piani di eradicazione dell’infezione soprattutto a causa della diffidenza di molti allevatori che, non rilevando una sintomatologia conclamata né decrementi produttivi nella fase iniziale della malattia, non credono all’effettiva utilità del programma proposto e non sono disposti a sacrificare capi apparentemente sani né a farsi carico delle laboriose procedure di intervento (separazione dei capi, latte e colostro risanati). Si viene così a creare una condizione di adattamento dei pastori che accettano passivamente la situazione di sieropositività dei loro animali senza comprendere le cause effettive del danno economico. E’ proprio a causa di questa situazione che spesso in Italia i tentativi di applicazione di programmi di risanamento sono andati falliti come nel caso dell’indagine condotta nel 1992 nella zona di Livorno (Seriacopi L., 1993).

In altri Paesi invece la loro realizzazione è stata possibile e, in taluni casi, ha portato alla completa eliminazione del MVV: è il caso dell’Islanda, primo Paese a dover fare i conti con l’infezione da Maedi-Visna che stava decimando gli allevamenti ovini, che nel 1967 in seguito a rigorosi programmi di eradicazione è stata dichiarata indenne (Palsson P. A. et al, 1976).

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La Danimarca ha cominciato un piano di controllo dell’infezione nel 1979 e, viste le basse percentuali di positività riscontrate, ha raggiunto facilmente in molti allevamenti la qualifica di indennità da MVV (Hoff- Jorgensen R. et al., 1985).

In Francia sono stati attuati piani volontari a partire dagli anni “80 allo scopo di risanare gli allevamenti colpiti ma malgrado la validità dei protocolli attuati sono state riscontrate delle difficoltà di eradicazione nelle greggi altamente infette (Remond M. et al., 1985).

Anche nel Regno Unito i piani applicati sono stati volontari a partire dal 1982, lo Stato ha imposto l’abbattimento dei soggetti sieropositivi facendosi però carico di parte delle spese da sostenere per il programma e questo ha rappresentato un incentivo per gli allevatori che hanno aderito in alte percentuali ed hanno consentito di avere, allo stato attuale, più di duemila allevamenti indenni (Pritchard G. C. et al., 2001).

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CAP. 2 OBIETTIVO DELLA TESI

Un’indagine condotta nel 1996 da Legrottaglie et al. sull’influenza dell’infezione Maedi-Visna su alcuni parametri di produttività in ovini sardi aveva dimostrato una mancata correlazione tra lo stato di malattia e i parametri produttivi degli animali colpiti: non era stato cioè rilevato un peggioramento quali-quantitativo nella produzione di latte, nel peso degli agnelli nati e nel loro incremento ponderale giornaliero. Nel gruppo campione esaminato non era stata osservata l’insorgenza di una sintomatologia clinica evidente ma alcuni ovini avevano manifestato gravi forme di mastiti batteriche. Secondo i citati autori la prevalenza delle mastiti batteriche era apparentemente superiore nel gruppo dei sieropositivi. Questo li aveva portati ad ipotizzare che l’infezione da MVV avesse predisposto l’apparato mammario ad infezioni secondarie di tipo batterico.

Alla luce di questi dati il principale obiettivo di questa tesi è stato stabilire se esiste una correlazione tra la condizione di sieropositività nei confronti di MVV e la presenza di mastiti rilevabili clinicamente. La zona è stata scelta sulla base di alcune ricerche già condotte nell’area dell’Alta Toscana (Legrottaglie R. et al., 1997) che avevano confermato la presenza dell’infezione da Maedi-Visna.

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CAP. 3 MATERIALI E METODI

L’indagine è stata condotta a partire dall’anno 2000 e la popolazione bersaglio è stata rappresentata da 11 allevamenti ovini della provincia di Massa Carrara su un totale di circa 200 allevamenti ovi-caprini.

Per la realizzazione di questa tesi è stata stabilita una convenzione tra il Dipartimento di Patologia Animale dell’Università di Pisa e la Asl 1 di Massa Carrara, Area Sanità Animale. La presenza di veterinari della Asl, forti della fiducia degli allevatori, ha permesso l’avvicinamento all’ambiente degli allevatori, per alcuni versi “tabù” per persone estranee ed ha garantito la possibilità di svolgere le indagini sulle condizioni igienico-sanitarie degli allevamenti, i prelievi di sangue e l’esame clinico delle mammelle.

¾ 3.1 CAMPIONAMENTO

I parametri adottati per il campionamento sono quelli previsti dal Piano Nazionale di Eradicazione della Brucellosi ovi-caprina che prevede:

• negli allevamenti con numero di capi fino a 50 il campionamento del sangue di tutti gli animali che hanno raggiunto i 6 mesi di età;

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• negli allevamenti con numero di ovini superiore a 50 esame di tutti i maschi presenti più il 25% delle femmine totali oltre i 6 mesi di età.

Al momento del prelievo si effettuava un doppio campione, uno per il controllo della Brucella ed uno per il controllo del Maedi-Visna; questa tecnica ha permesso di effettuare un solo salasso sull’animale in esame con notevole risparmio di tempo.

Tra gli allevamenti più numerosi della provincia di Massa Carrara ne abbiamo selezionati in modo casuale 11. Su un totale di 1542 ovini sono stati raccolti 539 (34,95%) campioni, di cui 400 provenienti da pecore di razza massese e 139 da pecore di razza sarda. Tutti gli animali erano di età superiore a 6 mesi.

Nelle analisi statistiche effettuate, poiché l’età non rappresentava al test Kolmovorog-Smirnov una distribuzione normale, essa è stata categorizzata in 4 fasce (> 6 ⁪ 12; > 12 ⁪ 24; > 24 ⁪ 48; > 48), sulla base dei quartili della sua distribuzione.

Gli allevamenti sono stati identificati con numeri progressivi e di ognuno sono state valutate le principali caratteristiche sulla base di una

“scheda di stalla” nella quale, dopo l’identificazione mediante numero di stalla e nome del proprietario, abbiamo inserito dati quali le condizioni igienico-sanitarie, il tipo di lettiera, di allevamento, di alimentazione, di mungitura, la frequenza di mungitura e la presenza di mastiti in modo da avere un quadro globale della situazione in cui stavamo operando.

Di ogni gregge sono stati poi rilevati il numero totale degli ovini, dei campioni, dei sieropositivi, la prevalenza di Maedi-Visna, la prevalenza delle mastiti e la eventuale presenza di sintomi clinici riportabili al quadro respiratorio caratteristico del virus quali tosse, lacrimazione e scolo nasale.

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Riportiamo di seguito l’elenco degli allevamenti analizzati:

ALLEVAMENTO N° 1: 175 OVINI DI RAZZA MASSESE 53 CAMPIONI

Condizioni igienico-sanitarie: buone Lettiera: permanente

Allevamento: semibrado

Mungitura: manuale 2 volte al dì Alimentazione: assistita

ALLEVAMENTO N° 2: 156 OVINI DI RAZZA MASSESE 39 CAMPIONI

ALLEVAMENTO N° 3: 76 OVINI DI RAZZA MASSESE

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19 CAMPIONI

+

9 OVINI DI RAZZA SARDA 9 CAMPIONI

ALLEVAMENTO N° 4: 50 OVINI DI RAZZA MASSESE 50 CAMPIONI

ALLEVAMENTO N° 5: 51 OVINI DI RAZZA MASSESE

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(27)

51 CAMPIONI

+

37 OVINI DI RAZZA SARDA 37 CAMPIONI

Condizioni igienico-sanitarie:

sufficienti

Lettiera: permanente Allevamento: semibrado

ALLEVAMENTO N° 6: 170 OVINI DI RAZZA MASSESE 43 CAMPIONI

37

(28)

ALLEVAMENTO N° 7: 401 OVINI DI RAZZA SARDA 101 CAMPIONI

Condizioni igienico-sanitarie:

sufficienti

ALLEVAMENTO N° 9: 62 OVINI DI RAZZA MASSESE

16 CAMPIONI

Condizioni igienico-sanitarie: buone

38

(29)

Lettiera: permanente Allevamento: semibrado

ALLEVAMENTO N° 10: 45 OVINI DI RAZZA MASSESE 45 CAMPIONI

Allevamento: semibrado Mungitura: manuale Alimentazione: assistita

39

(30)

Fig.13 Pecore di razza massese Fig. 14 Ovini massesi al pascolo (www.agraria .org). (www.agraria.org).

Fig. 15 Ovino di razza sarda (www.agraria.org).

40

(31)

Allevamento ovino

Proprietario _____________________________________

Codice Identificativo Allevamento (C.I.A.) ______________________

Condizioni igienico sanitarie

1 Scadenti

2 Sufficienti

3 Buone

4 Ottime

Lettiera

1 Permanente

2 rimossa ogni

Tipo allevamento

1 Brado

2 Semi brado

3 Stabulazione

Tipo di mungitura

1 Manuale

2 Meccanica

Frequenza mungitura

1 1 al dì

2 2 al dì

Tipo di alimentazione

1 Libera

2 Assistita

Alimentazione assistita

1 Mangimi

2 Farine

3 Fioccati

4 Mista

Riscontrata mastite

1 Si

2 No

Fig. 16 Scheda di stalla utilizzata durante le indagini negli allevamenti.

41

(32)

La localizzazione degli allevamenti sopra citati è abbastanza eterogenea ed è stata riportata nella cartina della provincia di Massa Carrara (Fig. 17).

Ciascun gregge è stato contrassegnato con il numero progressivo corrispondente e, come si può notare, la distribuzione comprende l’area di Fosdinovo, la zona di Carrara e quella di Massa.

3

7

11

9

5 4 2 8 10

6 1

42

(33)

¾ 3.3 ESAME SIEROLOGICO

Il test diagnostico da noi utilizzato per il riconoscimento dei capi sieropositivi è stato il test immunoenzimatico o test ELISA (Innotest MVV Innogenetics - Belgio) che garantisce una specificità del 99.3% ed una sensibilità del 99.4% per il MVV.

Dopo le fasi di prelievo il sangue veniva sottoposto a centrifugazione per separare i sieri da utilizzare nella tecnica ELISA; i sieri venivano poi conservati mediante congelamento e successivamente trasportati ai laboratori Asl, presso i quali sono stati effettuati i tests.

Venivano considerati positivi tutti i sieri la cui densità ottica superava il valore soglia ottenuto con metodo standard.

¾ 3.2 ESAME CLINICO

Ciascun animale componente il campione selezionato è stato sottoposto ad un attento esame ispettivo al fine di rilevare le condizioni generali con particolare attenzione alla presenza di sintomi respiratori quali scolo nasale, tosse, lacrimazione e respirazione difficoltosa; attraverso un’accurata palpazione della mammella si constatava la presenza o meno di indurimenti a carico dell’apparato mammario riferibili a mastite.

43

(34)

I risultati ottenuti di volta in volta sono stati annotati su un’apposita scheda compilata per ogni singolo ovino (Fig. 18), sulla quale sono stati riportati i dati identificativi dell’animale ed i risultati ottenuti dalla visita clinica.

ALLEVAMENTO OVINO PROPRIETARIO

C.I.A

OVINO N°

ETA' RAZZA

SEGNI CLINICI MAMMELLE INDURIMENTO MONOLATERALE

BILATERALE DIMAGRAMENTO PRESENTE

ASSENTE

SINTOMI

RESPIRATORI PRESENTI SCOLO NASALE

ASSENTI TOSSE

CALO PRODUZIONE PRESENTE ASSENTE

Fig. 18 Scheda utilizzata per l’esame clinico.

Un importante contributo in questa fase è venuto dal dialogo con gli allevatori che, superata la diffidenza iniziale, in molti casi ci hanno esposto

44

(35)

le problematiche sanitarie dell’allevamento indirizzandoci al rilevamento di sintomi o mastiti anche tra capi non facenti parte del campione selezionato.

¾ 3.4 ANALISI STATISTICA

Come metodo statistico per verificare la nostra ipotesi abbiamo applicato il metodo della Regressione Logistica Multivariata (Hosmer D.

W., 2000).

Tramite questo test, che rappresenta una tecnica di analisi multivariata che permette di analizzare la coesistenza di più fattori di rischio nel determinismo di un fenomeno (Hosmer D. W., 2000), è stato possibile introdurre come variabili indipendenti, oltre alla sieropositività, anche età e razza, con la presenza o meno di segni clinici di mastite come variabile dicotomica dipendente: in tal modo si è potuto verificare il ruolo dell’infezione da Maedi-Visna nell’insorgenza di mastiti secondarie tenendo conto anche dell’eventuale influenza dell’età e della razza degli ovini analizzati. Al fine di tenere conto in questa valutazione del fatto che le pecore testate appartenevano a 11 greggi e che quindi per gli animali appartenenti allo stesso gregge vi fossero caratteristiche comuni quali la gestione zootecnica e igienico-sanitaria e la densità, il metodo di regressione logistica impiegato è stato quello della “conditional random effects” (Mc Dermott et al., 1994).

45

(36)

Tale metodica genera per ogni variabile indipendente considerata (sierpositività per MVV, età, razza) dei valori di Odd Ratio, che indicano il grado della loro associazione con la variabile indipendente, la mastite.

Sono stati considerati statisticamente significativi valori di Odd Ratio corrispondenti a P ≤ 0,05. Valori di Odd Ratio significativi vanno interpretati nel senso di attribuire alla variabile un effetto sull’insorgenza di mastite, tenendo conto del possibile effetto delle altre variabili considerate.

Il valore di Odd Ratio in particolare indica quante volte aumenta il rischio di mastite all’aumentare del valore della variabile indipendente di un’unità.

Dalle indagini preliminari condotte su un numero più esiguo di animali (Legrottaglie R. et al., 2000) la presenza di mastiti, sulla base dei valori di Odd Ratio ottenuti dalla Regressione Logistica Multivariata (OR=2.75) era risultata associata all’età ma non alla sieropositività per MVV, né alla razza. E’ stato quindi interessante procedere nella nostra indagine al fine di verificare se questo dato potesse essere confermato allargando la popolazione esaminata a 11 allevamenti.

46

(37)

CAP. 4 RISULTATI

Abbiamo calcolato la prevalenza sia della sieropositività che delle mastiti in ogni singolo allevamento nel modo seguente:

PREVALENZASIEROPOSITIVI = n° capi sieropositivi / n n = n° animali esaminati

PREVALENZAMASTITI = n° capi mastite / n n = n° animali sieropositivi

Esponiamo di seguito i risultati ottenuti per ogni singolo allevamento campionato:

ALLEVAMENTO N° 1:

* Esame sierologico: 43 sieropositivi

* Esame clinico: 4 mastiti tra i sieropositivi 1 mastite tra i sieronegativi

Sintomi respiratori caratterizzati da tosse nella quasi totalità degli animali dell’allevamento con scarso scolo nasale rilevato.

47

(38)

* Prevalenza: Psieropositivi = 43/53 = 0.81 Pmastiti = 4/43 = 0.09

ALLEVAMENTO N° 2:

* Esame clinico: 5 mastiti tra i sieropositivi 1 mastite tra i sieronegativi Scarsi sintomi respiratori nell’allevamento.

* Prevalenza: Psieropositivi = 32/39 = 0.82 P_mastiti = 5/32 = 0.16

ALLEVAMENTO N° 3:

* Esame sierologico: 40 sieropositivi tra le massesi 1 sieropositivo tra le sarde

* Esame clinico: 2 mastiti tra i sieronegativi

48

(39)

Molti casi di scolo nasale tra le pecore massesi talvolta associato a tosse. Tra le pecore sarde scolo nasale e tosse nella quasi totalità dei capi.

* Prevalenza: Psieropositivi = 4/19 = 0.21^° Pmastiti = 2/4 = 0.5 Psieropositivi = 1/9 = 0.11^°°

Pmastiti = 0

ALLEVAMENTO N° 4:

* Esame clinico: 8 mastiti tra i sieropositivi 2 mastiti tra i sieronegativi Sintomi respiratori pressoché assenti.

* Prevalenza: Psieropositivi = 36/50 = 0.72 Pmastiti = 8/36 = 0.22

49

(40)

ALLEVAMENTO N° 5:

* Esame sierologico: 22 sieropositivi tra le massesi 20 sieropositivi tra le sarde

* Esame clinico: 4 mastiti tra le massesi sieropositive 3 mastiti tra le sarde sieropositive 4 mastiti tra le massesi sieronegative 1 mastite tra le sarde sieronegative Assenza di sintomi respiratori.

* Prevalenza: Psieropositivi = 22/51 = 0.43^°

Pmastiti = 4/22 = 0.18

Psieropositivi = 20/37 = 0.54^°°

Pmastiti = 3/20 = 0.15

ALLEVAMENTO N° 6:

* Esame clinico: 2 mastiti tra i sieronegativi Assenza di sintomi respiratori.

50

(41)

* Prevalenza: Psieropositivi = 2/43 = 0.05 Pmastiti = 0

ALLEVAMENTO N° 7:

* Esame clinico: Non sono stati rilevati casi di mastite Presenza di tosse e scolo nasale in tutti i capi dell’allevamento.

* Prevalenza: Psieropositivi = 9/101 = 0.09 Pmastite = 0

ALLEVAMENTO N° 8:

* Esame sierologico: 1 sieropositivo

* Esame clinico: 2 mastiti tra i sieronegativi Scolo nasale diffuso.

51

(42)

* Prevalenza: Psieropositivi = 1/17 = 0.06 Pmastiti = 0

ALLEVAMENTO N° 9:

* Esame clinico: Nessun caso di mastite

Animali apparentemente molto sani, scolo nasale appena accennato in alcuni capi.

* Prevalenza: Psieropositivi = 0 Pmastiti = 0

ALLEVAMENTO N° 10:

* Esame clinico: Nessun caso di mastite Nessun sintomo respiratorio

52

(43)

* Prevalenza: Psieropositivi = 0 Pmastiti = 0

ALLEVAMENTO N° 11:

* Esame clinico: 5 mastiti tra i sieropositivi

Scarsi sintomi respiratori con scolo nasale e tosse in pochi capi

* Prevalenza: Psieropositivi = 60/80 = 0.75 P_mastiti = 5/60 = 0.08

° Razza massese negli allevamenti misti °° Razza sarda negli allevamenti misti

La mastite è risultata essere presente in 47 capi (4,72%). Di questi 30 erano anche sieropositivi per MVV, 43 appartenevano alla razza massese, 25 alla classe di età oltre i 48 mesi (Tab. 1).

53

(44)

Tab. 1 Distribuzione per sieropositività per MVV, per classi di età e per razza, della presenza o meno di mastite rilevata clinicamente nelle 539 pecore esaminate.

MASTITE MASTITE

VARIABILI

SI NO

SIEROPOSITIVI 30 185

SIERONEGATIVI 17 307

ETA' > 6 ⁪ 12 5 143

> 12 ⁪ 24 2 132 > 24 ⁪ 48 15 135 > 48 25 82

RAZZA MASSESE 43 357

SARDA 4 135

TOTALE 47 492

Tab. 2 Risultati della regressione logistica multivariata.

FATTORE LIMITI DI

DI CONFIDENZA

RISCHIO

OR

95%

P

SIEROPOSITIVITA' AL MAEDI-VISNA

2.16 1.01 – 4.60 0.046

ETA' 2.50 1.65 – 3.80 P < 0.001

RAZZA 1.63 0.35 – 7.59 0.534

54

(45)

L’analisi multivariata effettuata conferma come l’età (OR = 2.50; P <

0.001) e la sieropositività per MVV (OR = 2.16; P = 0.046) risultino significativi fattori di rischio per mastite. Nella popolazione indagata, il rischio di mastite per una pecora appartenente ad una determinata classe di età, è di 2.5 volte superiore rispetto a quello di una pecora appartenente alla classe di età precedente; quello di una pecora sieropositiva per MVV è di 2.16 superiore rispetto a quello di una pecora sieronegativa. I risultati relativi alla prevalenza di MVV e alla presenza di mastiti nel campione selezionato possono anche essere presentati attraverso i grafici che seguono:

Tab. 3 Confronto tra campioni prelevati e sieropositività riscontrata.

0 20 40 60 80 100 120

all.

1 all.

2 all.

3*

all.

3**

all.

4 all.

5*

all.

5**

all.

6 all.

7 all.

8 all.

9 all.

10 all.

11 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

CAMPIO NI SIERO PO SITIVI % sie ropositivi

55

(46)

Tab. 4 Presenza di mastiti nel campione esaminato.

0 20 40 60 80 100 120

all. 1 all. 2 all.

3*

all.

3**

all. 4 all.

5*

all.

5**

all. 6 all. 7 all. 8 all. 9 all.

10 all.

11 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

CAMPIO NI MASTITI

% mastiti

56

(47)

CAP. 5 CONCLUSIONI

L’indagine che abbiamo condotto sugli 11 allevamenti ha confermato la larga diffusione dell’infezione da Maedi-Visna nella provincia di Massa Carrara con prevalenza che in taluni allevamenti ha raggiunto l’81-82% e mediamente si è stabilizzata attorno al 39%. Anche la mastite rilevabile alla palpazione ha mostrato una prevalenza di rilievo (8,7%).

Come dimostrato da precedenti ricerche (Legrottaglie R. et al., 1996) nel nostro Paese la lentivirosi in oggetto non induce l’insorgenza di forme cliniche manifeste, se non molto tardivamente e poco eclatanti .

Questo fenomeno può essere interpretato con l’aiuto del cosiddetto

“schema dei determinanti di una malattia infettiva/infestiva” (Fig. 19), dove si illustra la variabilità dei ruoli che possono svolgere i vari determinanti.

Le frecce a doppio senso stanno ad indicare come un determinante primario può diventare secondario e viceversa.

Fig. 19 Schema dei determinanti di una malattia infettiva/infestiva (www2.unipr.it/~bottarel/epi).

57

(48)

Il fatto che in Italia, rispetto ad altri Paesi, non ci siano stati riscontri positivi nei rilievi clinici può essere ricercato in fattori legati all’ospite, all’agente infettante e/o all’ambiente.

* Ospite: l’assenza di forme cliniche manifeste può derivare da fattori genetici, in alcune razze si verifica cioè una minore recettività all’agente virale che può quindi influenzare l’evoluzione della malattia verso un decorso subclinico.

* Agente infettante: i ceppi virali circolanti nelle nostre greggi sembrano caratterizzati da una bassa patogenicità quindi pur essendo in grado di infettare gli ovini, non sono in grado di causare cambiamenti delle condizioni sanitarie né compromissione della resa produttiva.

* Ambiente: non si può escludere che le nostre caratteristiche ambientali, quali ad esempio inverni non particolarmente rigidi e la conduzione i semibrada degli allevamenti, possano influenzare l’andamento della malattia.

Alla luce di quanto affermato si può comprendere l’atteggiamento riluttante degli allevatori del nostro campione ad accettare proposte di piani volontari di controllo dell’infezione. Essi non hanno ritenuto opportuno sacrificare ovini normalmente produttivi benché sieropositivi, quindi il nostro tentativo di applicare un piano eradicazione del MVV nella provincia è risultato fallimentare.

Il nostro studio si proponeva come principale obiettivo il rilevamento di eventuali correlazioni tra l’infezione d Maedi-Visna e le mastiti rilevabili clinicamente. I risultati ottenuti suggeriscono che l’associazione tra MVV e le stesse non deve essere sottovalutata: il ruolo della lentivirosi nell’insorgenza di mastiti è risultato però ai limiti della significatività

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