Capitolo 2
L’importanza degli S-nitrosotioli
2.1 Ruolo degli S-nitrosotioli
Nel precedente capitolo è stato sottolineato che NO può reagire nel plasma con moltissime sostanze, come Fe-proteine, radicali liberi, varie specie riducenti, l’emoglobina dei globuli rossi,ecc. Appare dunque evidente che il NO debba esistere sottoforma di specie più stabili rispetto ad NO stesso.
La prima scoperta del coinvolgimento di specie diverse dall’NO nei processi biologici, risale all’osservazione dell’attivazione della guanilato ciclasi ad opera di una molecola donatrice di NO, il sodio nitroprussiato.42
Nel 1988 Fung et al.43, notarono che somministrando nitroglicerina si otteneva la formazione di RSNO nel sangue e la contemporanea vasodilatazione. Essi, dunque, attribuirono l’effetto vasodilatatorio al rilascio di NO da parte di S-nitrosotioli (RSNO).
All’inizio degli anni ’90, Stamler e Gaston riuscirono a dimostrare la presenza in vivo dell’S-nitrosoglutatione (GSNO) e dell’S-nitrosoalbumina (AlbSNO).44,45
Essi notarono che le NOS non producevano RSNO, ma, inibendo la loro attività, si verificava una contemporanea diminuizione anche della produzione di RSNO. Era evidente, dunque, che dovesse esistere un percorso attraverso il quale il NO prodotto dalle NOS veniva successivamente convertito nella specie più stabile RSNO. Poiché, inoltre, gli RSNO sono molecole stabili ma capaci di rilasciare NO mediante numerosi meccanismi ed esibiscono in vivo le medesime proprietà fisiologiche del monossido di azoto, esse sono state definite come le molecole atte al trasporto e alla conservazione del NO.
Attualmente il coinvolgimento degli S-nitrosotioli nel metabolismo e nel trasporto del NO, è avallato da numerosi dati sperimentali.51
Figura 2.1: principali funzioni biologiche degli RSNO
Queste attività fisiologiche sono comuni a tutti i nitrosotioli, dimostrando ancora una volta che tali funzioni debbano dipendere dal rilascio di NO da parte del nitrosotiolo, piuttosto che dal nitrosotiolo stesso.
Gli S-nitrosotioli sono tioesteri di struttura generica R-S-N=O. Formalmente possono essere considerati formati dal legame covalente tra l’anione tiolato di proteine o peptidi e lo ione nitrosonio. Tuttavia lo ione nitrosonio è altamente reattivo, ed in condizioni fisiologiche ha un tempo di emivita di circa 10-10 s,46 (a pH fisiologico, l’acqua attacca il catione formando nitriti).46
I nitrosotioli possono essere ad alto peso molecolare (nitrosoalbumina e nitrosoemoglobina) e a basso peso molecolare (nitrosocisteina e nitrosoglutatione), e si formano attraverso reazioni di transnitrosilazione tra un nitrosotiolo meno stabile ed un tiolo dando luogo ad un nuovo nitrosotiolo più stabile. La Figura 2.2 mostra la reazione di transnitrosilazione tra AlbSNO e un tiolo generico RSH, ad esempio GSH o Cys che sono i tioli più abbondanti presenti nelle cellule. Poiché la nitrosoalbumina è più stabile del nitrosotiolo a basso peso molecolare, la reazione di Figura 2.2 non ha una buona resa,47 ma il coinvolgimento del nitrosotiolo in molti processi fisiologici, anche enzimatici, sposta l’equilibrio a favore della reazione di transnitrosilazione.47
Figura 2.2: Transnitrosilazione tra nitrosoalbumina e nitrosotioli a più basso peso molecolare.
In assenza di ossigeno e a pH 7, il NO non nitrosila i tioli (RSH), mentre in presenza di O2 forma diossido di azoto e triossido di diazoto.48 Quest’ultimo, che in soluzione
acquosa si trova come acido nitroso, è l’effettivo agente nitrosilante: 49
2NO + O2 2 NO2
NO2 + NO N2O3
N2O3 + H2O 2 HNO2
Figura 2.3: schema di formazione del triossido di diazoto
La formazione degli S-nitrosotioli è una reazione di terz’ordine che consta di tre tappe, di cui la prima è quella limitante (NO è nel range nanomolare, O2 in quello
micromolare):
2 NO + O2 2 NO2
NO + NO2 N2O3 = +ON…NO2 -+
ON…NO2 - + RSH RSNO + NO2 - + H+
Figura 2.4: meccanismo ipotizzato per la formazione degli S-nitrosotioli
La reazione diretta tra NO e tiolo, invece, è molto lenta e porta alla formazione di disulfuro e anione nitrossile25:
2 NO + 2 RSH RSSR + 2 NO- + 2 H+
Poiché la concentrazione del NO in vivo in condizioni fisiologiche è inferiore a 100 nM ed essendo la velocità di tale reazione proporzionale al quadrato della concentrazione di NO, si può assumere che in vivo questo percorso non sia rilevante. Tuttavia la formazione di NO2 ad opera dell’azione ossidante della perossidasi sui
nitriti, può essere un meccanismo per favorire la produzione di N2O3 e, dunque, la
formazione di nitrosotioli.50
Gli S-nitrosotioli possono essere facilmente sintetizzati in vitro per nitrosilazione del tiolo con acido nitroso a 4°C:25
HNO2 + RSH RSNO +H2O
Questa reazione, però, non avviene a pH fisiologici, bensì richiede pH piuttosto bassi (<2), e non è applicabile a tioli ad alto peso molecolare, sia perché le condizioni acide denaturerebbero la molecola, sia perché altri gruppi funzionali (ammine, anelli aromatici, alcoli) potrebbero reagire. Gli S-nitrosotioli a più alto peso molecolare, si formano per reazioni di transnitrosilazione con S-nitrosotioli a più basso peso molecolare.
Si ritiene che nel plasma la concentrazione degli RSNO vari tra 0,5 e 7 µM, di cui circa l’80% in forma di S-nitrosoalbumina.51 Tuttavia la mancanza di un metodo analitico di riferimento validato fa sì che in letteratura siano riportati valori di concentrazione per i nitrosotioli variabili da 1 nM a 62 nM in soggetti sani52-,93,,95,94.
E’ stato dimostrato che in vivo l’albumina e l’emoglobina sono i substrati preferenziali per la creazione di legami S-NO.104 Il meccanismo di nitrosilazione per queste molecole viene catalizzato dalla superossido dismutase (SOD) e dalla ceruplasmina. La ceruplasmina catalizza il rilascio di NO da GSNO, mentre la SOD fissa l’NO sulla Cysβ93 dell’emoglobina o dell’albumina.
Come già anticipato, gli S-nitrosotioli a basso peso molecolare più rilevanti in
condizioni fisiologiche sono la S-nitroso-L-cisteina (CysNO) e, soprattutto, l’S-nitroso-L-glutatione (GSNO). Come verrà descritto meglio in seguito, altri nitrosotioli
importanti da un punto di vista fisiologico sono l’S-nitroso-cisteinilglicina (CysGlyNO) e l’S-nitrosoomocisteina (HcysNO). Le formule dei quattro S-nitrosotioli citati sono riportate in Figura 2.5:
Figura 2.5. La struttura degli S-nitrosotioli fisiologicamente più rilevanti: CysGlyNO, HcysNO, CysNO e GSNO
Riassumendo, l’importanza degli RSNO risiede nel fatto che in vivo queste molecole esibiscono le stesse proprietà fisiologiche dell’NO rispetto al quale, però, sono molto più stabili. Ad esempio, gli RSNO non reagiscono con i superossidi prodotti da tessuti danneggiati, mentre l’NO reagirebbe producendo molecole molto tossiche (perossinitriti). Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che il NO non diffonde tal quale attraverso le membrane cellulari, bensì attraverso reazioni di transnitrosilazione dei gruppi tiolici situati sulla superficie della cellula.55
In Figura 2.6 sono illustrati tre probabili meccanismi attraverso i quali il NO può permeare attraverso le membrane.
Figura 2.6: Probabili meccanismi del trasporto degli RSNO attraverso le membrane cellulari: (1) il passaggio avviene attraverso specifici canali; (2) il nitrosotiolo viene ridotto sulla membrana, l’NO diffonde al suo interno e viene ossidato ad NO+ e reagendo
con un altro tiolo forma un altro nitrosotiolo. (3) l’RSNO transnitrosila una proteina della membrana che a sua volta nitrosila un altro tiolo.
Ad oggi molti aspetti riguardanti la formazione di S-nitrosotioli in vivo non sono ancora chiari e sono oggetto di studio da parte di molti gruppi di ricerca. D’altro canto la comprensione dei meccanismi di rilascio dell’NO da parte degli S-nitrosotioli, è fondamentale per poter comprendere le cinetiche di azione di farmaci a rilascio di NO.
2.2 La decomposizione degli S-nitrosotioli in vitro ed in vivo
Data l’importanza degli S-nitrosotioli come molecole coinvolte nel metabolismo del monossido di azoto, numerosi gruppi di ricerca hanno dedicato i loro studi alla comprensione dei meccanismi e dei fattori che possono influenzarne la velocità di decomposizione.
L’attenzione è stata concentrata principalmente sul GSNO e sulla CysNO in quanto sono i nitrosotioli a basso peso molecolare maggiormente rappresentati in vivo, data l’elevata concentrazione dei corrispettivi tioli ridotti nei fluidi biologici.
La velocità di decomposizione degli RSNO e i parametri che la possono influenzare è relativamente semplice da studiare in vitro ma la stessa cosa non può dirsi in vivo a causa della concomitante presenza di molteplici fattori. La Figura 2.7 mostra in sintesi le principali vie di decomposizione non enzimatiche degli RSNO:
Figura 2.7: reazioni di decomposizione non enzimatiche dei nitrosotioli. Rilascio di NO, di NO- e transnitrosilazione
2.2.1 L’effetto degli ioni rame sulla decomposizione degli RSNO
Gli ioni Cu (II) sono presenti nell’organismo in concentrazioni relativamente alte. Cu+ + viene ridotto a Cu+ da vari anioni tiolati presenti come impurità o come sottoprodotti dell’idrolisi dei nitrosotioli e, in linea di principio, da qualsiasi agente riducente.56 Mentre quantità catalitiche di tioli catali aumentano la velocità di decomposizione degli RSNO, quantità più elevate (≥ 10-4 M) ne rallentano la decomposizione, probabilmente perché gli ioni rameici vengono complessati dai tioli.58Il meccanismo col quale Cu+ reagisce con RSNO non è del tutto chiaro. Tra i prodotti della reazione si ritrovano anche Cu++ e RS-, che perciò agiscono come catalizzatori. Un meccanismo proposto è mostrato in Figura 2.8.57
Figura 2.8: Meccanismo di decomposizione degli RSNO ad opera di ioni rame
Il coinvolgimento dell’anione tiolato è dimostrabile dalla riduzione della velocità di decomposizione che si verifica riducendo la sua concentrazione. Mentre per basse concentrazioni di tiolato, la velocità di formazione del rame rameoso risulta aumentata, ad alte concentrazioni di tiolato la velocità diminuisce, probabilmente a causa della complessazione del rame rameico da parte del tiolo stesso.58
A testimonianza dell’importanza degli ioni rame nella decomposizione degli S-nitrosotioli, Williams ha dimostrato che in presenza di un agente chelante, come l’EDTA, ed in assenza di ogni altro fattore che possa promuovere la decomposizione dell’RSNO stesso, come la presenza di tioli o di ascorbato, le soluzioni di S-nitrosotioli si mantengono stabili nell’arco della giornata lavorativa.58
E’ stato dimostrato che anche in vivo avviene la decomposizione degli RSNO rame-catalizzata perche’ a pH fisiologico Cu+ si forma per riduzione degli ioni rameici ad opera di vari tiolati.58
2.2.2 Decomposizione degli S-nitrosotioli per via enzimatica
E’ stato dimostrato che la decomposizione del GSNO avviene in vivo anche ad opera di un enzima, la γ-glutamiltranspeptidasi (γ-GT o GGT), presente soprattutto nel fegato ma anche nei reni, nella milza e nell’intestino tenue. Di norma i valori di questo enzima nel sangue sono piuttosto bassi, e valori alti denotano disfunzioni a carico dei dotti biliali (i canali attraverso i quali la bile passa dal fegato all’intestino per la digestione dei grassi).
La γ-GT favorisce il rilascio del NO da parte del GSNO. Infatti, in seguito alla rimozione del gruppo γ-glutamil il GSNO si trasforma in S-nitrosocisteinilglicina, una molecola a ridotta stabilita’ rispetto al GSNO, capace di liberare NO in presenza di ione Cu+.59,60. La Figura 2.11 mostra il meccanismo d’azione della GGT:61
Figura 2.9: Meccanismo di decomposizione del GSNO ad opera della GGT.59
Oltre alla γ-GT, sono stati individuati altri enzimi attivi nella decomposizione degli RSNO, come la GSNO-liase, la glutatione perossidasi, la tioredoxin reduttase, la superossido ossidasi (SOD), la ceruplasmina. I loro meccanismi di azione non sono ancora del tutto chiari. La Figura 2.10 riporta una schematizzazione dei possibili meccanismi di azione del GSNO.
Figura 2.10: azione del GSNO62
2.2.3 Decomposizione ad opera di reazioni di transnitrosilazione
Un’altra tipologia di reazioni importante in vivo sono le reazioni di transnitrosilazione, nelle quali un S-nitrosotiolo relativamente stabile (come il GSNO), nitrosila un tiolo per dar luogo ad un S-nitrosotiolo più reattivo (tipicamente CysNO).
Vengono distinte le reazioni di transnitrosilazione:
e reazioni di S-nitrosilazione:
L’anione nitrossile può quindi subire varie trasformazioni chimiche secondo quanto riportato nella precedente Figura 1.3.
Queste reazioni non risentono della presenza di rame o dell’EDTA, dunque possono essere condotte in presenza di un agente chelante per evitare prodotti di decomposizione dovuti all’azione del rame stesso.63
Da studi condotti a differenti pH è stato dimostrato che la specie reattiva è l’anione tiolato, e la reazione consta di un’attacco nucleofilo all’atomo nitroso secondo lo schema riportato in Figura 2.11:
Figura 2.11: Ruolo dell'anione tiolato sulla decomposizione degli RSNO
In seguito alle reazioni di transnitrosilazione, gli S-nitrosotioli vengono erroneamente definiti donatori di NO+, ma la rapida idrolisi a pH fisiologico di questo ione, con conseguente formazione di nitriti, ne impedirebbe ogni ruolo fisiologico. L’anione nitrossile, invece, ha un tempo di emivita significativo.
2.2.4 Decomposizione termica e fotochimica
Negli RSNO il legame S-N è poco polare, con tendenza a dissociare se irradiato direttamente a 334 nm od a 560 nm (energia di legame= 80 Kcal/mol).
Sono stati proposti due meccanismi: il primo prevede la formazione di un intermedio attivato RSNO*,64 il secondo prevede direttamente la scissione omolitica dell’RSNO65 secondo gli schemi riportati in Figura 2.12.
Figura 2.12: Decomposizione termica e fotochimica degli RSNO
Sembra probabile che anche la decomposizione termica avvenga attraverso questi due meccanismi.
2.2.5 Il ruolo dell’ascorbato (vitamina C) nella decomposizione degli
RSNO
Lo studio della decomposizione degli RSNO in presenza di ascorbato assume notevole importanza data la sua cospicua presenza nell’organismo (nel plasma è circa 50 µM)66
e considerato il suo ruolo attivo nel metabolismo degli stessi S-nitrosotioli e del NO.
L’ascorbato infatti:
(i) favorisce la decomposizione, ovvero il rilascio del NO, degli S-nitrosotioli sia a basso peso molecolare, come il GSNO, sia ad alto peso molecolare, come la S-nitrosoalbumina.
Figura 2.13: Decomposizione degli RSNO ad opera dell'anione ascorbato
(ii) protegge l’NO dall’azione di perossidi (Figura 2.14): com’è noto, dal metabolismo aerobico dei mitocondri e del citoplasma, si ottengono specie superossido che possono reagire con NO producendo perossinitriti. L’ascorbato, reagendo con i perossidi, impedisce questa reazione:
Figura 2.14: Il ruolo della vitamina C nella riduzione dei perossidi nei mitocondri; Arg: arginina, Citr: citrullina, ASC: ascorbato, eNOS: NOS endoteliale, GTP: guanosina trifosfato, cGMP: guanosina monofosfato ciclica, GC: guanosina ciclasi.
(iii) riduce i nitriti ad NO: come già detto, i nitriti sono il principale prodotto di decomposizione del NO in soluzione acquosa.25 I nitriti vengono ridotti dall‘ascorbato, garantendo un riciclaggio parziale locale del NO (Figura 2.15).
Figura 2.15: Riduzione dei nitriti ad opera dell'acido ascorbico. AH: acido idroascorbico; DHA: acido deidroascorbico.
(iv) stimola l’attività delle eNOS aumentandone l’affinità nei confronti del cofattore tetraidrobiopterina, sia perché preserva i gruppi tiolici delle eNOS adibiti a legare il cofattore da eventuali ossidazioni, sia perché, diminuendo la concentrazione di perossinitriti e superossidi, preserva l’integrità della biopterina stessa.
In tutti questi meccanismi, l’ascorbato funge da agente riducente ossidandosi ad anione deidroascorbato. In effetti l’ascorbato e il GSH sono i riducenti più efficaci presenti nelle cellule.67,68
L’acido deidroascorbico, prodotto dal metabolismo dell’ascorbato, e il GSH sono coinvolti in un ciclo che, almeno in parte, ripristina l’ ascorbato nei tessuti, come mostrato in Figura 2.16.
La decomposizione dei nitrosotioli ad opera dell’ascorbato può essere seguita mediante spettroscopia UV/visibile sia a 330 nm che a 545 nm. Quest’ultima lunghezza d’onda ha la caratteristica di non risentire dell’effetto di deriva dovuta all’assorbimento dei prodotti di decomposizione del DHA. Tuttavia, il coefficiente di estinzione molare degli RSNO a 545 nm è circa 20 M-1 cm-1 ovvero di gran lunga inferiore al coefficiente di assorbimento a 334 nm (103 M-1 cm-1 )58.
L’ascorbato reagisce con gli RSNO in un ampio intervallo di pH (da 3 a 13), secondo due meccanismi diversi a seconda della concentrazione dell’ascorbato stesso: a basse concentrazioni (10-4 M o inferiori) di ascorbato viene favorita la formazione di NO e disolfuro, mentre ad alte concentrazioni (10-2 M o superiori) viene favorita la formazione di NO e del tiolo69.
La prima reazione è dipendente dal Cu++, per cui risente della presenza di agenti chelanti, come l’EDTA, mentre la seconda reazione è indipendente dal rame. Nella prima reazione, l’ascorbato agisce da riducente nei confronti del rame riducendolo a Cu+. Quest’ultimo reagisce con RSNO generando NO e RS- , che a sua volta si ossida a disulfuro, RSSR. Nella seconda reazione, invece, l’anione ascorbato agisce come nucleofilo nei confronti del nitrosotiolo liberando il tiolo e dando O-nitrosoascorbato, che successivamente si decompone per via radicalica liberando DHA e NO. La velocità della reazione rame-indipendente viene influenzata dal pH poiché dipende dalla concentrazione dell’anione ascorbato.
Sembra probabile che la reazione dell’ascorbato con il nitrosotiolo possa passare attraverso la formazione di un intermedio ciclico. Questa ipotesi è avallata anche da alcune evidenze sperimentali:
• se la funzione amminica del nitrosotiolo è acetilata, la costante di velocità è minore. A pH 7.4, infatti, l’ammina è protonata e può interagire con l’anione ascorbato secondo un qualche intermedio ciclico. Se l’ammina è acetilata, la formazione di questo intermedio è sfavorita;
• la reazione risente di un effetto dimetilico-geminale: per esempio la costante di velocità della reazione di decomposizione diminuisce nel caso della S-nitrosoacetil penicilammina (SNAP) rispetto alla CysNO. Cio’ dimostra che se il gruppo amminico è ingombrato stericamente la formazione dell’intermedio ciclico è sfavorita e, dunque, la reazione risulta più lenta.
La stechiometria della reazione Cu-dipendente mediata dall’acido ascorbico è stata studiata per la CysNO.58 Mantenendo costante la concentrazione del nitrosotiolo e valutando spettroscopicamente la sua decomposizione in funzione di varie concentrazioni di ascorbato è emerso che la percentuale massima di decomposizione si ha per rapporti [CysNO]/[Ascorbato] ≤ 2, perciò 2 molecole di CysNO reagiscono con 1 molecola di ascorbato.
Tutte le cinetiche degli RSNO con ascorbato in eccesso risultano, a pH 7.4, del primo ordine rispetto all’ascorbato stesso, cioè sono del tipo
koss=k*[AA] + cost
dove l’intercetta è un valore piccolo ed attribuibile alla decomposizione termica del nitrosotiolo.
Poiché l’AA è un acido bivalente (pKa1= 4,86; pKa2= 11,2), per cui a pH fisiologico
esiste come anione, la reazione è favorita dall’interazione elettrostatica tra l’ascorbato stesso ed il gruppo nitrosotiolo (in cui l’azoto ha una parziale carica positiva).
2.2.6 Considerazioni sulla decomposizione degli RSNO in vivo
E’ difficile riuscire a stabilire in che misura i meccanismi sopra citati influenzino la decomposizione degli RSNO in vivo. Ad esempio, è stato trovato che la velocità di decomposizione degli RSNO in vitro segue l’ordine: proteina < peptide < amminoacido. Tuttavia in vivo non c’è corrispondenza tra la capacità di rilasciare il NO in soluzione e l’effetto vasodilatatore che ne dovrebbe conseguire. Questo suggerisce che in vivo le cinetiche sono verosimilmente influenzate da molteplici fattori.70
Ascorbato e ione rame sono presenti in alte concentrazioni in vivo, e la presenza di rame rameoso può sicuramente favorire il rilascio di NO. Gli S-nitrosotioli subiscono transnitrosilazione con la cisteina63 che a sua volta viene decomposta da Cu+. GSNO è probabilmente coinvolto nel metabolismo enzimatico mediato dalla GGT per dare S-nitrocisteinilglicina71 che viene decomposto a relativo disulfuro ed NO da Cu+. Anche la decomposizione fotochimica gioca un ruolo importante: nel muscolo liscio sono presenti cellule fotosensibili capaci di promuovere il rilascio di NO se irradiate con luce UV o visibile.72
La decomposizione rame-catalizzata appare ad oggi il meccanismo principale di decomposizione degli S-nitrosotioli in vivo.73
La decomposizione degli S-nitrosotioli nel plasma è molto rapida, fondamentalmente a causa di due processi: nel primo NO liberato dall’S-nitrosotiolo (per azione di un agente riducente, come il rame o altri tioli) reagisce con ossigeno molecolare dando il triossido di diazoto, il quale nitrosila altri tioli ridotti (principalmente Alb). Il secondo meccanismo è la transnitrosilazione, ovvero il passaggio (formale) dello ione nitrosonio da un tiolo ad un altro. Il largo eccesso di albumina rispetto agli S-nitrosotioli a basso peso molecolare fa pensare che tale equilibrio sia spostato verso la formazione di AlbSNO. A supporto di tale ipotesi, è stato trovato che in presenza di albumina la costante di velocità per la decomposizione di GSNO e di CysNO nel plasma è 7,9 e 19,0 M-1 s-1 rispettivamente, valori molto simili a quelli trovati in vitro per le reazioni di transnitrosilazione dell’Alb a partire da GSNO, CysNO.
Inoltre, in presenza di eccesso di tiolo (Cys) l’equilibrio si sposta verso la formazione di CysNO, a testimonianza che i nitrosotioli a basso peso molecolare sono specie più efficienti nel rilascio del NO nel sistema circolatorio. Come verrà meglio spiegato nel capitolo successivo, dal punto di vista analitico, nel caso della determinazione di RSNO
nel plasma questo comporta la necessità di dover controllare accuratamente la fase di campionamento per evitare la decomposizione dell’analita stesso.
2.3 Altri nitroderivati e loro impiego in farmacologia
Oltre ai nitrosotioli endogeni è sempre più riconosciuto e studiato l’effetto di nitrosotioli esogeni. I nitroderivati sono composti contenenti NO caratterizzati dalla capacità di poter rilasciare NO e di incrementare la concentrazione di cGMP nel citoplasma delle cellule del tessuto bersaglio.
La tipologia dei nitroderivati e’ schematizzata in Figura 2.17 .
Figura 2.17: I nitroderivati
Molte patologie (come l’arteriosclerosi, l’ipertensione arteriosa, gli scompensi cardiaci, ictus) sono caratterizzate da bassi livelli di NO dovuti ad anomalie nell’attività delle NOS.
La ricerca di farmaci a base di nitroderivati capaci di riequilibrare le giuste dosi fisiologiche di NO è, dunque, fondamentale.
E’ altresì importante riuscire a capire il dosaggio e la posologia corretta di somministrazione dei farmaci donatori di NO. E’ stato trovato, infatti, che, in una
percentuale che va dal 20 al 50% di pazienti ischemici trattati con nitrati organici (le molecole più utilizzate nella pratica clinica), si osserva persino un peggioramento dei sintomi col passare del tempo.74
I nitrati organici sono le molecole più usate nella pratica clinica, ma il loro uso è limitato dalla loro scarsa tollerabilità. Tra essi ricordiamo la nitroglicerina.
I nitrati organici richiedono specifici co-fattori per il rilascio del NO: la curva di produzione di NO a partire da questi composti, infatti, ha andamento sigmoidale rispetto alla concentrazione di tioli (ad esempio la cisteina), e questo denota una cooperatività positiva da parte dei tioli stessi nei confronti del rilascio di NO.75
Tra i nitriti organici citiamo la SNAP (S-nitroso-N-acetilpenicillamina). I nitriti organici richiedono cofattori tiolici aspecifici per rilasciare NO. I nitriti organici sono poco usati nella pratica clinica perché più costosi e meno stabili dei nitrati.76
Il sodio nitroprussiato (SNP, Na2[Fe(CN)5NO]) per la sua spiccata azione
vasodilatante viene usato in clinica in condizioni d’urgenza, ma non può essere somministrato a lungo a causa della tossicità dei cianuri in esso contenuti. Il meccanismo di rilascio di NO da SNP non è ancora del tutto chiaro, ma sembra non richiedere gruppi tiolici. Inoltre, mentre in vitro il SNP possiede scarsa tendenza a rilasciare NO, in vivo ha un’elevata capacità farmacologica, indicando che la molecola debba entrare in qualche via metabolica correlata all’NO, oppure agire sul meccanismo di produzione dell’NO stesso.77
Gli RSNO sono molecole prodotte in vivo, e sono dunque maggiormente tollerate.78 Al pari del monossido di azoto, inibiscono la formazione e la formazione e l’aggregazione di piastrine,79 e favoriscono il rilassamento del tessuto muscolare liscio,80 manifestano attività anti-ischemica, anti-trombotica ed anti-ipertensiva.81,82,79 Tra tutti i nitroderivati, sono probabilmente le molecole dagli effetti terapeutici più promettenti.
Uno dei problemi che si incontrano nello studio di farmaci donatori di NO deriva proprio dai molteplici effetti che il monossido di azoto può avere in vivo e dalla difficoltà di sintetizzare una molecola che rilasci specificatamente NO in un tessuto piuttosto che in un altro. A tal scopo, ad esempio, aumentando l’idrofobicità della
aumentandone l’idrofilicità si può agevolarne il suo trasporto nel sistema vascolare periferico, oppure si possono introdurre nella molecola dei gruppi funzionali capaci di legarsi covalentemente a determinati gruppi specifici di un particolare tessuto. In Figura 2.18 sono riportate alcune molecole donatrici di NO comunemente usate nella pratica clinica.
