Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Eglė Mickevičiūtė

Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno

filogenetiniai tyrimai ir molekulinės biologijos lyginamoji analizė

Phylogenetic and molecular biology comparative analysis of the parvovirus VP-2 gene of the canine clinical samples

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: Doc. dr. Dainius Zienius

Kaunas, 2019

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „

Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno filogenetiniai tyrimai ir molekulinės biologijos lyginamoji analizė

1. yra atliktas mano paties (pačios).

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)

3

TURINYS

SANTRAUKA ...5

SUMMARY...6

SANTRUPOS...7

ĮVADAS...8

1. LITERATŪROS APŽVALGA...10

1.1. Epidemiologiniai duomenys...10

1.2. Rizikos faktoriai...10

1.3. Viruso šeimininkai/rezervuarai...10

1.4. Šunų parvovirusai kačių populiacijoje...11

1.5. Motininiai antikūniai………...11

1.6. Prevencija...12

1.7. Parvovirusų atžvilgiu taikoma kontrolė...12

1.8. Parvoviruso genetinė sandara...13

1.9. VP-2 geno funkcija ir diagnostinė reikšmė...13

1.10. Parvovirusinės infekcijos laboratorinės diagnostikos metodai...14

1.10.1 Imunochromatografiniai tyrimai...14

1.10.2. Hemagliutinacija...15

1.10.3. Elektronų mikroskopija...15

1.10.4. Imunofermentinė analizė...15

1.10.5. Viruso izoliacija...15

1.10.6. Latekso agliutinacijos testas...15

1.10.7. Polimerazės grandininė reakcija...16

1.10.8. Realaus laiko PGR...16

1.10.9. Filogenetinė analizė...17

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA...18

2.1. Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai...18

2.2. Patologinės medžiagos mėginių ėmimas...19

2.3. Mėginių paruošimas PGR analizei...20

2.3.1 Viruso DNR išskyrimas...20

2.3.2. Parenkami primeriai, PGR...20

2.3.3. Agarozės gelio elektroforezė ir PGR produktų gryninimas...21

2.3.4. DNR sekvenavimas ir filogenetinė analizė...21

4

3. REZULTATAI...24

REZULTATŲ APTARIMAS...32

IŠVADOS...34

LITERATŪROS SĄRAŠAS...35

5

SANTRAUKA

Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno filogenetiniai tyrimai ir molekulinės biologijos lyginamoji analizė

Eglė Mickevičiūtė Magistro baigiamasis darbas

Darbo apimtis: 42 puslapiai, 5 lentelės, 3 paveikslai.

Šunų parvovirusai išlieka svarbūs patogenai, sukeliantys aukštą sergamumo ir mirtingumo lygį jaunų šuniukų subpopuliacijoje. Ištirta 50 šunų ir 3 katės. Galimai parvovirusiniu enteritu sergantys tiriamieji šunys ištirti imunochromatografijos testais ir PGR (VP-2 geno dalinis regionas), katės ištirtos PGR. Atliktas PGR VP-2 geno produktų sekvenavimas ir gauti rezultatai išanalizuoti MEGAX programoje. Identifikuoti ir programoje analizuoti lietuviškų šunų parvovirusų VP-2 geno produktai palyginti su referentinėmis užsienio ŠPV analogiškomis sekomis, referentinėmis kačių ir ŠPV vakcinų padermių virusų VP-2 geno dalinėmis sekomis. Nubraižyti filogenetiniai medžiai.

N=28 (56,0 proc.) mėginių buvo teigiami PGR ir imunochromatografijos testų atžvilgiu. N=22 (44,0 proc.) mėginių imunochromatografijos teste ir PGR buvo neigiami. Visi kačių mėginių n=3 (5,7 proc.) PGR analizės rezultatai šunų parviruso atžvilgiu buvo neigiami. Atlikus PGR su VP-2 geno dalinio produkto pradmenimis buvo gautas 681 nukleotidų sekų produktas, kuris buvo išvalytas, sekvenuotas ir analizuotas MEGAX programoje. Lietuviškos ŠPV VP-2 gene grupavosi į 2 filogenetines grupes. pCPV2 11 LT grupavosi toliau nuo lietuviškų ŠPV. Lietuviškų ŠPV sekų, KPV ir referentinių sekų filogenetinis medis susigrupavo į dvi pagrindines filogenetines grupes: į 1 – visos lietuviškos sekos, į 2 – Kinijos, Suomijos, Indijos ir Italijos ŠPV VP-2 gene sekos. 8 lietuviškos sekos grupavosi į vieną pogrupį kartu su Italijos, Vokietijos, Pietų Korėjos šunų parvoviruso sekomis. pCPV2 20 LT giminingiausia Pietų Korėjos ŠPV-2c (EF599098.2CPV2c South Korea). pCPV2 11 LT giminingiausia Turkijos ŠPV2a (KF500497.1CPV2a Turkey). pCPV2 45 LT giminingiausia Vokietijos ŠPV-2a (AY742953.1CPV2a Germany). pCPV2 45 LT ir pCPV2 11 LT rodė didžiausią panašumą 2 vakcinoms (FJ197846.1 CPVint vaccine ir FJ222822.1 Duramune DAPPI+LC vaccine), likusios lietuviškos ŠPV VP-2 sekos filogenetiškai grupavosi toliau nuo vakcinų sekų. Lietuviškų šunų parvovirusų grupė VP-2 dalinio sekvenavimo produktų nt sekos yra santykinai konservatyvios (nt tapatumo vidurkis 99,87 proc.). pCPV 11 LT VP-2 seka sugrupavo į atskirą filogenetinę šaką, kuri nėra santykinai statistiškai panaši (skirtumas 0,85 proc.) su pirmąja filogenetine grupe. Visos lietuviškos ŠPV VP-2 nukleotidų sekos 112Tyr nukleotidų sekos pozicijoje turėjo TAC, kuri koduoja Tiroziną (Tyr), tačiau pCPV2 42 LT VP-2 geno 112His nukleotidų sekos pozicijoje turėjo CAC nukleotidų seką, kuri koduoja Histidiną (His).

Raktažodžiai: Šunų parvovirusas, PGR, filogenetika, VP-2 genas, sekvenavimas

6

SUMMARY

Phylogenetic and molecular biology comparative analysis of the parvovirus VP-2 gene of the canine clinical samples

Eglė Mickevičiūtė Master’s Thesis

Scale and supplementary material: 42 pages, 5 tables, 3 figures.

Canine parvovirus remains an important pathogen causing high levels of morbidity and mortality among young puppies. 50 dogs and 3 cats were examined. Sick test dogs were investigated by immunochromatography and PCR (VP-2 gene partial region), cats by PCR. The CPV VP-2 gene partial product sequencing was performed. The results were analyzed by MEGAX program. Lithuanian canine parvoviruses VP-2 gene partial sequence products were compared with identical foreign referential sequences, referential cat and referential vaccine CPV sequences. N=28 (56,0%) CPV samples were positive for PCR and immunochromatography. N=22 (44,0%) CPV samples were negative for immunochromatography and PCR. All samples taken from cats n=3 (5,7%) were negative for PCR. PCR with primers of the VP-2 gene partial product yielded a product of 681 nucleotide sequences which was purified, sequenced and analyzed in the MEGAX program.

Lithuanian CPV VP-2 gene grouped into 2 main clades. pCPV2 11 LT clustered further away from Lithuanian CPV. Phylogenetic tree of the Lithuanian CPV sequences, referential FPV and identical foreign sequences grouped into two main clades: first - all Lithuanian sequences and the second - Chinese, Finnish, Indian and Italian CPV VP-2 gene sequences. 8 Lithuanian sequences grouped together into one cluster together with the Italian, German and South Korean dog parvovirus sequences. pCPV2 20 LT is the most closely related South Korean CPV-2c (EF599098.2 CPV2c South Korea). pCPV2 11 LT is most closely related to Turkey's CPV-2a (KF500497.1 CPV2a Turkey). pCPV2 45 LT is most closely related to German CPV-2a (AY742953.1CPV2a Germany).

pCPV2 45 LT and pCPV2 11 LT showed the highest similarity to 2 vaccines (FJ197846.1 CPVint vaccine ir FJ222822.1 Duramune DAPPI+LC vaccine). Remaining Lithuanian CPV VP-2 sequences grouped further away from vaccine sequences. Lithuanian canine parvovirus VP-2 partial sequencing product nt sequences are relatively conservative (nt identity average 99.87%). VP-2 sequence of pCPV 11 LT grouped into a separate phylogenetic branch, which is not relatively statistically similar (difference 0.85%) to the first phylogenetic group. All Lithuanian CPV VP-2 nucleotide sequences at the 112Tyr nucleotide sequence position had TAC encoding Tyrosine (Tyr), but 112His nucleotide sequence position of pCPV2 42 LT VP-2 gene had the CAC nucleotide sequence encoding Histidine (His).

Keywords: Canine parvovirus, PCR, phylogenetics, VP-2 gene, sequencing

7

SANTRUPOS

ŠPV - šunų parvovirusas;

KPV- kačių panleukopenijos virusas;

n- imties dydis p-patikimumas

PGR - polimerazės grandininė reakcija;

DNR - deoksiribonukleorūgštis;

MA- motininiai antikūniai;

CPV - šunų parvovirususas (canine parvovirus) Ser- Serinas

Ala-Alaninas Asn-Aspargininas Asp- Aspartinė rūgštis Glu-Glutaminė rūgštis Tyr-Tirozinas

His-Histidinas

EDTA-Etilendiamintetraacto rūgštis

MEGA- Molekulinė evoliucinės genetikos analizė F- (forward; sekvenavimas į priekį)

R-(reverse; sekvenavimas grįžtamąja eiga) TriZol- TRI reagentas

TDCI – audinių kultūrų infekcinė dozė (Tissue Culture Infectious Dose)

HA- hemagliutinacija

Tris-HCl – druskos rūgštis

d NTPS – deoksiribonukleotidų 5’-trifosfatai Taq-TAE- tris acetate etilendiamintetraacto rūgštis

FASTA – DNR ir proteinų nukleotidų sekoskaitos sulygiavimo programa

mM- milimoliai a.a.- aminorūgštis n.t.- nukleotidai

ID -identifikacijos kodas

8

ĮVADAS

Šunų parvovirusų 2 tipas (ŠPV-2) pirmą kartą užfiksuotas 1978 metais. Per artimiausius dešimt metų ŠPV-2 sukėlė pandemijas įvairiose šalyse, kurios pasireiškė sunkiais gastroenterito klinikiniais požymiais. Dėl santykinai greitos ŠPV-2 viruso evoliucijos, visame pasaulyje atsirado įvairių genetinių ir antigeninių viruso variantų, kurie pavadinti subtipais: subtipu 2a (ŠPV-2a), subtipu 2b (ŠPV-2b) ir subtipu 2c (ŠPV-2c) (1,4-6,16-18).

ŠPV-2 virionai dažniausiai persiduoda fekaliniu – oraliniu keliu, per infekuotų šunų išmatas.

Patekęs virusas į šeimininko organizmą pradeda daugintis mitotiškai aktyviuose audiniuose: žarnų epitelyje, kaulų čiulpuose, naujagimių širdyse. Inkubacinis periodas trunka nuo 3 iki 7 dienų (1,13,19,21). Klinikiniai požymiai panašūs naminiams ir laukiniams gyvūnams: vėmimas, kraujinga diarėja, leukopenija, apatiškumas, hipertermija/hipotermija (1,13,19). Sergamumas gali siekti iki 100 proc., mirtingumas gali siekti 10,0 - 91,0 proc. Infekcija gali pasireikšti vakcinuotuose ir nevakcinuotuose šunyse (26). Apsaugai nuo infekcijos ypač svarbų vaidmenį atlieka motininiai antikūniai, kurie kovoja su į organizmą patekusiu virusu. Infekcija dažniausiai pasireiškia po to, kai motininių antikūnių kiekis sumažėja organizme, dažniausiai 2-4 mėn. šuniukams (39). Dėl didelio cirkuliuojančių motininių antikūnių titro organizme po vakcinacijos sutrikdomas aktyvaus imuniteto susiformavimas (46). Šunų parvovirusų VP-2 genas – tai struktūrinis baltymas, kuris yra atsakingas už virusinį ląstelių topizmą. Pasaulyje vyraujančiuose šunų parvovirusų skirtingose subtipuose (ŠPV-2a, ŠPV-2b, ŠPV-2c) VP-2 gene pastebimas santykinai aktyvus aminorūgščių struktūrinės kaitos laipsnis, kuris tiesiogiai įtakoja skirtingų virusų antigeniškumo savybes (15).

Apie Lietuvoje šunų parvovirusų (ŠPV-2) sukeltus hemoraginio enterito atvejus pirmą kartą

pranešta 1995 - 1996 metais, vėliau 2002 metais tyrimai buvo tęsiami, tačiau buvo apsiribota

epidemiologinės analizės duomenimis (32,33). Esant santykinai greitai parvovirusų filogenetinei

evoliucijai, šių virusų VP-2 geno atliekami moksliniai tyrimai yra labai aktualūs, siekiant įvertinti

ŠPV-2 antigeninių savybių tyrimus skirtinguose regionuose ir skirtingais tyrimo periodais. Šiame

magistriniame darbe ištyrėme lietuviškų klinikinių mėginių ŠPV-2 VP-2 genų dalinio sekvenavimo

produktų molekulinę struktūrą ir filogenetiškai palyginome produktų sekų giminingumo laipsnius

su kitų pasaulio šalių parvovirusų, vakcinų, KPV referentinėmis VP-2 genų sekomis panaudojant

MEGAX kompiuterinio modeliavimo programą.

9 Darbo tikslas: Atlikti parvovirusų VP-2 geno dalinio sekvenavimo sekų filogenetinius palyginamuosius tyrimus iš surinktų šunų klinikinių mėginių, panaudojant filogenetinės analizės MEGAX kompiuterinio modeliavimo programą.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti parvovirusinės infekcijos diagnostinius tyrimus (PGR) VP-2 geno daliniame regione ir identifikuoti reakcijos produktus.

2. Įvertinti natyvinių parvovirusų VP-2 geno dalinio sekvenavimo rezultatus ir paruošti filogenetinių tyrimų ataskaitą MEGAX kompiuterinio modeliavimo programa.

3. Atlikti lietuviškų šunų parvovirusų VP-2 geno dalinio sekvenavimo produktų duomenų statistinę

analizę SPSS programa.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 . Epidemiologiniai duomenys

Šunų parvovirusas pirmą kartą identifikuotas 1978 metais Jungtinėse Amerikos valstijose ir Australijoje. 1980 metais buvo identifikuoti du nauji ŠPV- 2 antigeniniai suptipai: ŠPV-2a ir ŠPV- 2b. 2000 metais, dar vienas naujas antigeninis tipas ŠPV-2c su VP-2 gene pasikeitusia Asp426Glu, identifikuotas Italijoje (1,4-6,41,40). Europoje atlikti tyrimai parodė, jog ŠPV-2c dominuoja Italijoje bei Vokietijoje. ŠPV-2c kartu su ŠPV-2a ir ŠPV-2b cirkuliuoja Portugalijoje ir Prancūzijoje (9,41). 2008 metais atliktuose tyrimuose mokslininkai priėjo išvadą, kad ŠPV-2c keičia anksčiau atsiradusius ŠPV-2a ir ŠPV- 2b (11). Turkijoje cirkuliuoja ŠPV-2a ir ŠPV-2b (8).

Per pastaruosius metus Australijoje ŠPV-2b išplito ir pradėjo dominuoti prieš ŠPV-2a (26).

Bulgarijoje cirkuliuoja visi ŠPV-2 subtipai: ŠPV-2a, ŠPV-2b, ŠPV-2c (10). 2017 metais Kolumbijoje mokslininkai atrado parvovirusą, kurio VP-2 gene pasikeitusios aminorūgštys:

Asn428Asp ir Ala514Ser. Tyrėjai priėjo išvadą, jog cirkuliuoja naujas ŠPV-2a subtipas (28).

Asimptomatiniai šunys, kurie turi kontaktą su laukiniais mėsedžiais gali būti šunų parvoviruso rezervuarais (27). Europoje parvovirusas gali būti randamas vienas ar su mišria infekcija (29), taip pat, nustatyta jog originalus – „protėvinis“ ŠPV-2 jau neįdentifikuojamas, jį yra pakeitę trys minėti subtipai (9).

1.2. Rizikos faktoriai

Parvovirusinis enteritas dažniausiai pasireiškia nevakcinuotų šunų subpopuliacijose dėl šeimininkų aplaidumo, brangių vakcinų, biosaugos nesilaikymo. Nuolatinis virusų buvimas aplinkoje ir didelis atsparumas aplinkoje daro šį virusą endeminiu kai kuriuose regionuose. Kitas rizikos faktorius yra nepakankamas antikūnių susidarymas po vakcinacijos, galimai dėl likutinių motininių antikūnių cirkuliavimo organizme, dėl netinkamų vakcinacijos schemų ir/ar dėl nepakankamo individualaus imuninio vakcinuojamų šunų statuso (74).

1.3. Viruso šeimininkai/rezervuarai

Visų veislių, lyčių ir amžiaus šunys yra jautrūs šunų parvovirusui. Mirtis dažniausiai ištinka dėl stiprios dehidratacijos ir hipovoleminio šoko. Dažniausiai stipri infekcija pasireiškia 6 savaičių iki 6 mėnesių šuniukams. Pastebėta, kad mišrūnai yra mažiau jautrūs infekcijai negu grynaveisliai.

Rotveileriai, Dobermano pinčeriai, Anglų Springer spanieliai, Amerikos pitbuliai ir Vokiečių

aviganiai yra labiau jautrūs parvovirusinio enterito pasireiškimui (1,47).

11

1.4. Šunų parvovirusai kačių populiacijoje

In vitro ŠPV gali efektyviai replikuotis tiek kačių, tiek šunų ląstelėse. In vivo originalus ŠPV- 2 visiškai nesireplikuoja katėse, tačiau ŠPV-2a ir ŠPV-2b įgyjo savybę daugintis in vivo ir kačių ląstelių sistemose (19). Šunų parvovirusas 2 ir jo subtipai gali prisijungti prie šunų ir kačių pirmo tipo transferino receptoriaus (19, 44). Parvoviruso VP-2 gene atiradus mutacijai, virusas įgyja padidėjusį afinitetą prisijungti prie šunų transferino receptoriaus ir sukelti infekciją. Ši savybė atsirado virusui mutavus, dėl VP-2 gene atsiradusių aminorūgščių pozicijų pokyčių. Virusui sukelti ligą užtenka 1-5 transferino receptorių kiekvienoje kapsidėje (64). ŠPV-2a, ŠPV-2b ir ŠPV-2c įgyjo sąvybę replikuotis katėse ir sukelti klinikinius požymius, kuriuos sunku atskirti nuo kačių panleukopenijos. Italijoje praneštas pirmas atvejis, kuomet ŠPV-2c išskirtas ir iš katės išmatų, tačiau nebuvo žinoma apie pasireiškusius klinikinius požymius, kraujo tyrimų rezultatus ir ligos baigtį (42). Esfandiari J. (35)

3 kačių mėginiai, kurie turėjo aminorūgščių pasikeitimus 93, 375, ir 426 a.a. pozicijose. Šie pasikeitimai yra būdingi šunų parvovirusams, dėl to, galima prieiti išvadą, jog katės dažniausiai užsikrečia kačių panleukopenijos virusu, tačiau galima mišri ŠPV ir KPV infekcija. Parvoviruso patogeniškumas katėms dar nėra iki galo išaiškintas, tačiau ŠPV-2a ir ŠPV-2b subtipais eksperimentiškai užkrėstoms katėms, kurių sutrikęs sveikatingumas, atsirado parvoviruso klinikiniai simptomai (41). ŠPV dažnai išskiriamas iš kliniškai sveikų kačių išmatų, tai rodo, kad virusas gali sukelti subklinikinę ar labai lengvą ligos formą, nes antikūnio vienos sekos kintantys fragmentai nesutrukdė prisijungti prie ląstelių receptorių (44). VP-2 gene atsiradus 5-6-ių aminorūgščių pasikeitimams ŠPV-2a ir ŠPV-2b įgyjo savybę replikuotis in vivo ir in vitro ne tik šunyse, bet ir katėse. Nishar A. (47) iš trijų šunų išskyrė ŠPV ir KPV virusus. Mokslininkai nežino ar abiejų virusų cirkuliavimas organizme turi mokslinės reikšmės, tačiau, jei tai iš tikrųjų koinfekcija, tai ŠPV gali pagreitinti KPV infekcijos pasireiškimą, replikavimąsi šeimininke bei ligos patogenezę (47).

1.5. Motininiai antikūniai

Parvoviruso infekcijos pasireiškimo laipsnis priklauso nuo nesusiformavusios imuninės

sistemos ar nepakankamo imuninės sistemos atsako (55). Parvovirusas gali sukelti miokarditą, kuris

dažniausiai pasireiškia šuniukams iki 3 mėnesių (26). T ląstelių reguliuojamas imuninis atsakas

atlieka svarbų vaidmenį tolimesniuose ligos etapuose (39). Dėl aminorūgščių pasikeitimo VP-2

gene, didėja ŠPV-2 subtipų patogeniškumas. ŠPV-2 antigeniniai variantai ŠPV-2a ir ŠPV-2b,

palyginus su originaliu ŠPV-2, su išmatomis pasišalina didesniais titrais, taip pat, ligai sukelti

reikalingas mažesnis ŠPV-2a ir ŠPV-2b titras. ŠPV-2a ir ŠPV-2b subtipai sukelia stipresnius

12 klinikinius simptomus negu orginalus ŠPV-2. Eksperimentinio užkrėtimo tyrime nustatyta, kad šuniukai, kurių motininių antikūnių titras 1:160, vis tiek gali užsikrėsti ŠPV, taip pat šuniukų, kurių motininių antikūnių tiras ≤ 1:80, rodė stiprius parvoenterito klinikinius simptomus (39,38,46).

Pasaulio regionuose, kur yra galimai didelė viruso koncentracija aplinkoje, kalės įgauna aukštą antikūnių titrą ir jį perduoda šuniukams, dėl to, cirkuliuojančių motininių antikūnių sukeltas imunitetas trukdo ŠPV vakcinos veiksmingumui. Parvovirusinis enteritas gali pasireikšti ir vakcinuotuose šunyse, tačiau, dažniausiai dėl nepilno vakcinacijos kurso (51). Naujų mutacijų atsiradimas (ypač VP-2 geno regionuose), rodo kad ŠPV padermės patiria nuolatinę evoliucinę atranką, nuolatinis skirtingos apimties mutavimas, sąlygojo naujesnių ŠPV subtipų atsiradimą ir evoliucinę atranką. Nepakankamas virusus neutralizuojančių antikūnių titras ar nepilnas vakcinacijos kursas galėjo įtakoti parvovirusų aktyvią persistenciją jautrioje šunų populiacijoje ir galimai aukštą virusų mutacijų dažnį, dėl to, atsirado nauji parvovirusų subtipai. Šuniukai, neturintys pakankamo motininių antikūnų (MA) titro arba neturintys parvoviruso antikūnių titro, yra labiau linkę užsikrėsti parvovirusu. Šunys yra apsaugoti nuo parvovirusinio enterito, kurių kraujo serumo hemagliutinacijos slopinimo (HS) titras yra 1:320 ar didesnis (53,60,63,64).

Parvoviruso izoliatuose aptikus Glu-426 mutaciją (ŠPV-2c tipas) yra manoma, kad klinikinė eiga yra lengvesnė, mažesnis mirtingumas, palyginus su ŠPV-2a ar ŠPV-2b (64).

1.6. Prevencija

Prevencija yra vienintelis būdas užtikrinti šuniuko sveikatingumą iki kontrolės taikymo, nes liga yra labai užkrečiama ir virulentiška. Virusas geba išgyventi išmatose ir dirvožemyje metus laiko. Jis išgyvena labai didelius šalčius ir karščius. Vienintelės dezinfekcinės priemonės užtikrinančios viruso sunaikinimą yra priemonės su chloru. Didžiausias rizikos faktorius - išmatos su virusu. Po vakcinacijos veiksmingas antikūnų kiekis susidaro tik po kelių dienų, dėl to maži, nevakcinuoti šuniukai turėtų būti karantinuojami: neturėti kontakto su kitais šunimis iki kol bus vakcinuoti, nes geriausia prevencinė priemonė prieš parvovirusus išlieka vakcinacija (73).

1.7. Parvovirusų atžvilgiu taikoma kontrolė

Šunų parvoviruso infekcijos kontrolė daugiausiai priklauso nuo intensyvios, nepertraukiamos

vakcinacijos. Vakcinacijai panaudojamos modifikuotos nusilpnintos gyvo viruso vakcinos, kadangi

inaktyvuotos vakcinos sukelia tik trumpalaikį imunitetą. Šios vakcinos, paruoštos naudojant ŠPV-2

arba subtipą ŠPV-2b. Vakcinos gali apsaugoti šunis nuo parvovirusinės infekcijos ir ligos

pasireiškimo, taip pat, šioms vakcinoms labai retai stebimos šalutinės reakcijos. 2007 metais atliktas

tyrimas parodė, kad dauguma šunų, kuriems po vakcinacijos kilo į parvovirusinį enteritą panašūs

simptomai (viduriavimas, vėmimas), buvo užkrėsti vien tik epizootiniu aplinkos virusu arba

13 nusilpnintu vakcinos virusu (19). 2016 metais atliktame tyrime nustatyta, kad viruso išskyrimas į aplinką yra retas reiškinys, kadangi vakcinos izoliatai nebuvo išskirti po vakcinacijos praėjus 10 dienų ir atsiradus ligos klinikiniams požymiams (51). Daugelis šiuo metu rinkoje esančių komercinių vakcinų, kuriose yra gyvų nusilpnintų ŠPV-2 ar ŠPV-2b, gali apsaugoti nuo visų ŠPV subtipų, užtikrindamos kryžminę apsaugą (51,52). Eksperimentinėmis sąlygomis vakcinos apsaugojo nuo šunų parvoviruso 2c infekcijos pasireiškimo, tačiau tyrimas atliktas kontroliuojamomis sąlygomis: praėjus kelioms savaitėms po vakcinacijos, kuomet antikūniai pasiekia aukščiausią titrą (68). Tačiau, 2014 metais atlikto tyrimo metu nustatyta, kad ŠPV-2 mutuoja šunų organizmuose, dėl to, potencialiai vakcinos gali tapti neveiksmingos (31). Pagal literatūrą šunis rekomenduojama vakcinuoti nuo 6-8 savaičių amžiaus, kuomet organizme cirkuliuoja statistiškai mažiausias motininių antikūnių titras. Intervalas pasirenkamas kas 2-4 savaites priklausomai nuo epidemiologinės situacijos regione. Paskutinę vakciną šuniukas turėtų gauti 16 savaičių amžiaus. Veterinarinės medicinos gydytojai vakcinaciją dažniausiai atlieka be serologinių tyrimų, tačiau, įrodymais grįstos veterinarinės medicinos principu, gydytojams yra rekomenduojama prieš vakcinaciją atlikti serologinius tyrimus, tam kad, būtų įvertintas cirkuliuojančių antikūnių titras (72).

1.8. Parvoviruso genetinė sandara

Šunų parvovirusas (ŠPV) priklauso Protoparvovirus genčiai, Parvoviridae šeimai (7).

Filogenetinė analizė parodė, jog ŠPV mutavo iš vieno protėvio - kačių panleukopenijos viruso (KPV), kuris replikuojasi katėse, audinėse ir meškėnuose. Kačių panleukopenijos virusas nuo šunų parvoviruso skiriasi 0,5 procentais deoksiribonukleorūgščių (DNR) nuleotidų sekoje (53). ŠPV mutavo iš KPV atsiradus 5-6 aminorūgščių pozicijų pasikeitimams kapsidės proteino gene (36,53,54). Šunų parvovirusas sudarytas iš viengubos linijinės DNR grandinės, kuri turi apie 5000 nukleotidų. DNR genomas turi du atviro skaitymo rėmelius. Šie rėmeliai koduoja 4 proteinus.

Pirmasis rėmelis koduoja du nestruktūrinius proteinus (NS-1, NS-2). Antrasis rėmelis koduoja du struktūrinius proteinus (VP-1, VP-2) (2,21). ŠPV kapsidė yra 25nm diametro, sudaryta iš dviejų genų: VP-1 ir VP-2. ŠPV antigenetiškai ir genetiškai skirasi nuo minutinio parvoviruso (ŠPV-1), kuris sukelia naujagimių mirtis (55). Originalų ŠPV-2 visiškai pakeitė evoliuciniai subtipai ŠPV-2a, ŠPV-2b ir ŠPV-2c, kurie šiuo metu cirkuliuoja visame pasaulyje (56).

1.9. VP-2 geno funkcija ir diagnostinė reikšmė

VP-2 genas yra struktūrinis baltymas, atsakingas už virusinį ląstelių tropizmą. Žarnose

esantys limfiniai audiniai ir žarnyno kriptos yra audiniai -taikiniai, kuriuose vyksta šunų

parvovirusų replikacija (13). VP-2 yra didžiausias struktūrinis proteinas, užimantis 90,0 proc. viruso

14 kapsidės. Šiame gene yra du pagrindiniai antigeniniai epitopai: epitopas A ir epitopas B. Epitopas A susideda iš lokuso 1, lokuso 2 ir lokuso 4, epitopas B susideda iš lokuso 3. Aminorūgščių pozicijos ir konfigūracijos pakitimai VP-2 gene klasifikuoja ŠPV į subtipus: ŠPV-2a, ŠPV-2b ir ŠPV-2c (3,43,15). ŠPV-2a ir ŠPV-2b diferencijuojasi atsiradus dviejų nukleotidų polimorfizmui kapsidės proteino VP-2 geno sekoje (53). ŠPV-2c ir ŠPV-2b subtipai mutuoja greičiau negu ŠPV-2a, dėl to, didėja tikimybė, kad vis daugiau šunų užsikrės šiais subtipais (27). Antigeniniai pokyčiai atsirandantys VP-2 gene gali mažinti vakcinų veiksmingumą. Tačiau, šiuo metu esančios komercinės vakcinos, kuriose yra gaminamos iš gyvų nusilpnintų ŠPV-2 ar ŠPV-2b, suteikia pakankamą apsaugą nuo ŠPV-2a (51,57,58). Šunų parvovirusas VP-2 geno filogenetinių pakitimų pagrindu gali būti grupuojamas į 6 filogenetines grupes, nepaisant geografinių skirtumų: GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI. Aminorūgščių pasikeitimai VP-2 geno 297 pozicijoje galimai turi įtakos viruso prisitaikymui replikuotis šeimininko jautrių ląstelių sistemose. Aminorūgščių pozicijų pasikeitimas 324 regione turi įtakos viruso šeimininko atrankai, taip pat turi tiesioginę įtaką prisijungimui prie šunų transferino receptoriaus ir yra atsakingi už viruso biologinę adaptaciją.

Mutacija T324I pasireiškia tuose regionuose, kurie yra antigeniškai svarbūs epitopai. Aminorūgščių pasikeitimai 93 ir 323 pozicijose yra ypač svarbūs šunų parvoviruso šeimininko parinkimo kontroliavimui. VP-2 geno 324 pozicijoje dažniausiai aptinkamos tirozino ir izoleucino aminorūgštys (61,62). Aminorūgščių pasikeitimai 300 pozicijoje gali turėti įtakos viruso kapsidės stabilumui (65,66,67). VP-2 gene atsiradusios mutacijos gali pagerinti viruso biologines savybes:

geresnė adaptacija naujose ląstelių sistemose, padidėjęs antigeniškumas, kuomet viruso negali neutralizuoti monokloniniai antikūniai (64).

1.10. Parvovirusinės infekcijos laboratorinės diagnostikos metodai

Šunų parvo viruso diagnostikai gali būti naudojami keli metodai: imunochromatografiniai tyrimai, hemagliutinacija, elektronų mikroskopija, imunofermentinė analizė, viruso izoliacija, latekso agliutinacija, PGR ir realaus laiko PGR, filogenetinė analizė.

1.10.1 Imunochromatografiniai tyrimai

Vienas dažniausiai veterinarijos gydytojų klinikoje naudojamų metodų yra

imunochromatografijos testai, kadangi jie greiti, nebrangūs, paprasti naudoti (34). Tačiau, pastebėta,

kad šie testai nors labai specifiški, bet nėra jautrūs, dėl to, diagnozės patvirtinimui reikėtų naudoti

labiau jautrius tyrimo metodus (12,13). Gali pasitaikyti tokių atvejų, kuomet praėjus 3-10 dienų po

vakcinavimo gyva nusilpninta ŠPV vakcina, atlikus imunochromatografinį testą, gali pasirodyti

klaidingai teigiami rezultatai (23). 2015 metais atliktas tyrimas parodė, jog testo jautrumas 72.2

proc. ir specifiškumas 92.9 proc., (p>0.05), dėl to testui esant neigiamui, negalime atmesti, kad nėra

15 infekcijos (24,12). Nedidelis ŠPV viruso kiekis ir prisijungiantys antikūniai turi įtakos klaidingai neigiamiems rezultatams, dėl to, esant klinikiniams požymiams diagnozė turėtų būti patvirtinta polimerazės grandinine reakcija (13).

1.10.2. Hemagliutinacija

Hemagliutinacijos testas yra greitas, jautrus ir specifiškas tyrimo būdas nustatyti ŠPV, tačiau jį gali atlikti tik specializuota laboratorija (19,24). Hemagliutinacija yra viena svarbiausių šunų parvoviruso sąvybių. ŠPV gali prisijungti prie sialinės rūgšties receptorių ant ląstelės paviršiaus ir agliutinuoti eritrocitus. Tačiau, serologiniai tyrimai gali parodyti teigiamus rezultatus dėl endeminio viruso pobūdžio, subklininės ligos eigos ir nežinant antikūnų titrų šunų populiacijoje (34).

1.10.3. Elektronų mikroskopija

Šis metodas morfologiškai identifikuoja ŠPV-2. Šio tyrimo metu gali būti matoma vieno viriono dalelė arba virionų grupė. Šiam tyrimui turi būti pasirinktas tinkamas ligos periodas, dažniausiai 3-9 dieną, kuomet virusai išsiskiria dideliais kiekiais, nes elektronų mikroskopijai reikalingas didelis kiekis virionų norint patvirtinti, kad mėginys yra teigiamas. Šis metodas yra labai brangus, palyginus su kitais molekuliniais testais (35).

1.10.4. Imunofermentinė analizė

Imunofermentinės analizės metu, antikūnis ir antigenas yra užfiksuojami fluoresuojančiais dažais, norint aptikti specifinį antigeną. Testas gali būti tiesioginis ir netiesioginis, priklauso ar fluorescuojantys dažai fiksuojasi ant pirminio, ar antrinio antigeno. Tiesioginio testo atveju, antikūnis tiesiogiai prisijungdamas prie specifinio antigeno specifiškai fluorescuoja. Naudojami šaldyti ir formalinu fiksuoti audiniai (19).

1.10.5. Viruso izoliacija

Šis metodas retai naudojamas, atliekamas tik laboratorijoje panaudojant šunų plaučių ir inkstų audinių kultūras. Tai yra ilgas ir nepakankamai specifiškas būdas, atliekamas tik laboratorijoje. Taip pat parvovirusas sunkiai dauginasi skirtingais kiekiais organų audinių ląstelėse (24).

1.10.6. Latekso agliutinacijos testas

Latekso agliutinacijos testo metu latekso mikro granules apgaubia virusai, kurie yra specifiški

antigenui arba antikūniui. Prisijungus, virusas įdentifikuojamas, vykstant agliutinacijos reakcijai

(24).

16 1.10.7. Polimerazės grandininė reakcija

PGR yra labiausiai patikimas ŠPV diagnozavimui pasitelkiamas tyrimas (13). PGR panaudoja specifinę DNR sekos replikaciją, parenkant specifinius pradmenis ir DNR polimerazės fermentą.

Šis tyrimas gali aptikti virusus esant ankstyvai infekcijai prieš sureaguojant imuniniam atsakui ir klinikinių simptomų atsiradimui. PGR gali aptikti šunų parvovirusą iš mėginių, turinčių santykinai mažą viruso kiekį. PGR amplikonai yra panaudojami nukleino rūgšties sekvenavimui ir filogenetiniam tyrimui, atsekant viruso evoliucionavimo istoriją (19). Polimerazės gandininė reakcija ir realaus laiko polimerazės grandinės reakcija yra plačiai naudojami tyrimai aptikti ŠPV viruso DNR iš kraujo ar išmatų. Dėl PGR jautrumo, specifiškumo ir našumo, šis tyrimas pakeis tradicinius metodus, tokius kaip viruso izoliacija ar antikūnių aptikimas (64). PGR naudojamas norint nustatyti ŠPV-2 subtipus (27). Kiekvienam PGR sekos nubraižymui reikalingi viruso DNR, pradmenys, nukleotidai ir fermentas - DNR polimerazė. DNR polimerazė yra atsakinga už kiekvieno nukleotido (adenino-A, timino-B, citozino-C ir guanino-G) sujungimą, kad galėtų susiformuoti PGR produktas. Pradmenys yra trumpos DNR sekos fragmentai, kurie papildo tiriamą DNR ir yra sekos pratęsimo taškai ant kurių DNR polimerazė formuoja produktą. V-1 pradmenys yra panaudojami rutininiam parvoviruso infekcijos identifikavimui. Panaudojant V-1 pradmenis, išskiriami trumpi amplifikacijos produktai, kurie yra svarbūs norint išskirti ŠPV-2 DNR iš senų išmatų (sumažėjęs viruso kiekis) ar tiesiogiai iš išangės imtų mėginių (59). Visi komponentai yra sumaišomi ir įdedami į amplifikavimo mašiną, kuri generuoja pakartotinius DNR amplifikacijos ciklus, pakeldama ar sumažindama temperatūrą (70). Iš pradžių, viena kitą atitinkančios DNR sekos yra pakaitinamos iki lydymosi temperatūros. Užkilus tinkamai lydymosi temperatūrai sekos yra atskiriamos (denatūruojamos). Tuomet temperatūra yra sumažinama, specifiniai pradmenys prisijungia prie DNR, tik tuo atveju, jei atitinka nukleotidai. Šis procesas vadinamas hibridizacija.

Tuomet, vėl pakeliama temperatūra, kad DNR polimerazė galėtų prailginti pradmenis, sujungdama atitinkamus nukleotidus ir taip suformuodama DNR seką. Su kiekvienu ciklu DNR molekulių kiekis dvigubėja. Norint vizualizuoti PGR suformuotą produktą pasitelkiami du metodai: amplifikuotos DNR nudažymas (etidžo bromidu), kuris įsiskverbia tarp nukleotidų arba koduojant pradmenis/nukleotidus su fluoresenciniais dažais (fluoroforai) prieš PGR amplifikaciją. PGR produkto analizei pasitelkiamas elektroforezės metodas, kuris atskira DNR produktus pagal dydį ir įkrovą. Kontrolei pasitelkiami standartizuoto dydžio DNR produktai (69).

1.10.8. Realaus laiko PGR

Realaus laiko PGR naudojama PGR produkto kiekybiniam įvertinimui. Realaus laiko PGR

pranašumas yra tas, kad nereikia papildomai analizuoti PGR produkto agarozės gelio elektroforezės

17 būdu. Šunų parvovirusas aptiktas laukinių vilkų išmatose, panaudojant realaus laiko PGR. Tyrimas buvo 100 proc. jautrus ir specifiškas, esant minimaliam aptikimo slenksčio lygiui (19).

1.10.9. Filogenetinė analizė

Filogenetinė analizė atliekama norint išaiškinti evoliucinį giminingumą tarp virusų (19).

Molekulinė evoliucinės genetikos analizė (MEGA) programa yra skirta palyginamajai homologinių

genų sekų analizei iš dauginių šeimų ar iš skirtingų rūšių. Programa naudojama išaiškinti

evoliuciniam giminingumui, DNR ir proteinų sekų evoliucijai. MEGA programa yra patogi naudoti,

joje yra vaizdinė paruoštų duomenų analizė, filogenetinių medžių braižymas, evoliucinio

kintamumo duomenys. Ši programa nuolatos atnaujinama (pati pirmoji MEGA1, vėliau sekė

MEGA3.1, MEGA4.1, MEGA5.2, MEGA6, MEGA7, MEGAX), siekiant gautus didelius duomenų

kiekius apdoroti naujais kompiuteriniais metodais. Šiuo metu MEGAX yra pats naujausias

programos variantas (2018). MEGA programa leidžia nustatyti genų ir rūšių funkcijas, evoliuciją ir

prisitaikymą (71).

18

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

Tyrimai buvo atliekami LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2015-2019 metais. Iš viso ištirta 50 šunų ir 3 katės. Patologinės medžiagos (fekalijos) mėginiai buvo paimti X gyvūnų prieglaudoje (Kauno raj.) (n=53). Išmatų mėginiai buvo imami tiesiai iš analinės angos su vatos tamponėliu.

2.1. Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai

Gyvūnų prieglaudoje šunims, kuriems atsirado parvoviruso klinikiniai simptomai (vėmimas, viduriavimas, hipertermija) atliekama bendra klinikinė apžiūra: išmatuota kūno temperatūra, įvertinta gleivinių spalva, dehidratacijos laipsnis, pilvo palpacija siekiant nustatyti skausmingumą.

Esant poreikiui ir galimybėms, papildomai atliktas kraujo morfologinis tyrimas. Jei gyvūnai buvo atiduoti šeimininkų, išsiaiškinama gyvūno gyvenimo anamnezė (dehelmintizacija, vakcinacija, amžius, kontaktas su kitais gyvūnais). Įtarus parvovirusinį enteritą, buvo atliekami greitieji imunochromatografiniai tyrimai Anigen firmos CPV Ag/CCV Ag (Bio Note, Pietų Korėja). Jie skirti parvovirusų ir koronavirusų antigenų išmatose nustatymui. Tyrimai atlikti vadovaujantis gamintojo instrukcija. 48 šunų duomenys apie vakcinaciją nebuvo žinomi, 1 šuniui ( 6sav. amžiaus) atlikta 1 vakcinacija. Visi gyvūnai turėjo kontaktą su kitais prieglaudoje esančiais šunimis. Gyvūnai sugrupuoti į 3 grupes pagal amžių:

• 1 grupę (1-3mėn) sudarė 32 šunys

• 2 grupę (4-6mėn) sudarė 14 šunys

• 3 grupę (7mėn ir daugiau) sudarė 4 šunys

Grupės parinktos pagal WASAVA (87) organizacijos vakcinacijos amžiaus rekomendacijas. 1

grupę sudarė nuo 1 iki 3 mėnesių šunys, 2 grupę sudarė nuo 4 iki 6 mėnesių šunys, 3 grupę sudarė

nuo 7 mėnesių ir daugiau mėnesių šunys. Tiriamųjų amžius surašytas mėnesiais. Pagal WASAVA

(87) organizacijos rekomendacijas šuniukų vakcinacija turi prasidėti nuo 6 savaičių, kuomet MA

organizme yra mažiausia koncentracija. Taip sudaromos sąlygos susidaryti aktyviam imunitetui. Iki

16 savaičių šuniukams turi būti atlikta pilna vakcinacija ir būti susidaręs pakankamas imunitetas

(72). Tiriamųjų grupėje jauniausias gyvūnas buvo 1 mėnesio, o vyriausias – 11 metų. Katės nebuvo

grupuojamos pagal amžių.

19 Statistinė surinktų mėginių analizė atlikta naudojantis SPSS programa (85). Apskaičiuotas sergančių šunų amžiaus vidurkis, tiriamųjų imunofermentiniu testu ir PGR patikimumas, kačių mėginių PGR patikimumas, daugiausiai sirgusių pagal amžiaus grupę, inkubacinio periodo vidurkio periodas, lyties, amžiaus priklausomybė nuo ligos baigties. Statistiniams rezultatams gauti naudotas Chi-kvadrato testas. Jis naudojamas hipotezėms apie kintamojo skirstinį populiacijoje tikrinti. Chi- kvadrato kriterijus parodo, ar empirinio ir teorinio skirstinių skirtumas yra reikšmingas (76).

Apskaičiuotos procentinės išraiškos. Gauti rezultatai laikomi patikimais, jei patikimumas mažesnis nei p<0,05.

2.2. Patologinės medžiagos mėginių ėmimas

Mėginiai imti atlikus klinikinį tyrimą. Mėginys imamas iš analinės angos su vatos tamponėliu.

Tamponėlis įvedamas pro išangę ir patrinamas į tiesiosios žarnos gleivinę. Paimtas mėginys patalpinamas į specialų mėgintuvėlį kuriame yra 1,0 ml fosfatinio buferinio tirpalo, prieš tai nukirpus vatos galiuką (kiekvieną kartą, prieš nukirpimą, žirklės yra sterilizuojamos ugnies liepsna).

Ant mėgintuvėlio užrašomas identifikavimo numeris. Mėginiai laikomi +4°C temperatūroje iki pristatymo į laboratoriją. Laboratorijoje mėginiai buvo užšaldyti iki -20 °C temperatūros ir laikomi šaldiklyje iki tolimesnių tyrimų. Atrinkti imunochromatografiniu testu teigiami mėginiai, vėliau naudojami PGR analizei.

1 lentelė. Atrinktų mėginių PGR VP-2 geno dalinio sekvenavimo produktų analizei epideminiai duomenys

Eil.nr. Mėginio ID kodas Veislė Amžius Vakcinacija (+/-,nežinoma)

Mėginio tipas

ŠPV/KKV Antikūnių testas

(+/-)

1. pCPV2_2_LT mišrūnas 3 mėn. nežinoma Išmatos +

2 pCPV2_5_LT mišrūnas 1 mėn nežinoma Išmatos +

3. pCPV2_7_LT mišrūnas 3 mėn. nežinoma Išmatos +

4. pCPV2_11_LT mišrūnas 7 metai nežinoma Išmatos +

5. pCPV2_17_LT mišrūnas 5 mėn. nežinoma Išmatos +

6. pCPV2_20_LT mišrūnas 7 mėn nežinoma Išmatos +

7. pCPV2_32_LT mišrūnas 3 mėn. nežinoma Išmatos +

8. pCPV2_39_LT mišrūnas 4 mėn. nežinoma Išmatos +

9. pCPV2_41_LT mišrūnas 5 mėn nežinoma Išmatos +

10. pCPV2_42_LT mišrūnas 8 metai nežinoma Išmatos +

11. pCPV2_45_LT mišrūnas 2 mėn. nežinoma Išmatos +

20

2.3. Mėginių paruošimas PGR analizei

2.3.1. Viruso DNR išskyrimas

Viruso DNR išskirta iš išmatų mėginių fosfatiniame 10 proc. buferiniame tirpale naudojant TRIzol metodą (Invitrogen, Life Technologies, MD, USA) Atlikta pagal gamintojo instrukcijas.

Gautas DNR supernatantas perkeliamas į naują mėgintuvėlį ir laikomas -20°C iki kol bus panaudotas PGR analizei.

2.3.2. Parenkami pradmenys, PGR

PGR reakcija sukurta panaudojant specifinių šunų parvovirusų 2-ab pradmenų grupę. pŠPV- 2ab pradmenų grupė padaugina dalį VP-2 geno abiejuose ŠPV-2a ir ŠPV-2b subtipuose. ŠPV VP-2 geno pozicijos: 3025 iki 3706 nukleotidų DNR sekoje, produkto dydis 681 kb. PGR atliekama pagal Kumar (94) pradmenis su keletų pakeitimų. 5 µl DNR mėginio sumaišomas su 34,5 µl vandens be nukleazės (Thermo Scientific, Lietuva); 10xPGR buferio (100 mMTris-HCl (pH 8.8 25°C), 500 mM KCl, 0.8 proc. (v/v) Nonidet P40) 5 µl; 25 mM Mg

Cl

µl (1,5 mmol/l); dNTP (10 mM) 1 µl;

Taq DNR polimerazė (Thermo Scientific, Lietuva) (5U/µl) 0,5µl. PGR panaudoti pradmenys (po 10 pmol) pateikiami 2 lentelėje: CPV-2abcF (71) ir CPV-2abc-F/PERL (VP-2 nt 3025-3045) ir CPV- 2abcR (71) CPV-2abc-R/PERL (VP-2 nt pozicija 3685-3706). PERL pradmenys buvo sugeneruoti pradmenų atrankos programoje PerlPrimer (SourceForge (72). Pradmenų dizainas buvo atliekamas pagal ŠPV2b referentinę seką (GenBank Nr. M38245.1).Termomašinoje denatūracija vyko 95°C/5 min; 35 amplifikacijos ciklai vyko 95°C/30s, atvėsinamos 55°C/60s, ir prailginamos 72°C/60 s;

galutinė inkubacija vyko 72°C/7 min. Komercinė Nobivac DHP vakcina, kurioje yra ŠPV-154

padermė, paimta 107 TDCI50/1ml, imta audinių ląsteles infekuojanti dozė (Intervet International

B.V., Nyderlandai), ji laikoma teigiama kontrole, vanduo be nukleazės – neigiama kontrole. (Thermo

scientific, Lithuania)

21 2 lentelė. Naudoti pradmenys PGR analizei

Pradmenys Seka Pozicija Dydis

CPV-2abcF 5’– GAA GAG TGG TTG TAA ATA ATA – 3’ 3025-3045 20 bp CPV-2abcR 5’– CCT ATA TAA CCA AAG TTA GTAC – 3’ 3685-3706 21 bp CPV-2abc-F/PERL 5‘ – GAA GAG TGG TTG TAA ATA ATT – 3‘ 3025–3045 20 bp CPV-2abc-R/ PERL 5‘–CCT ATA TAA CCA AAG TTA GTAC –3‘ 3685–3706 21 bp

2.3.3. Agarozės gelio elektroforezė ir PGR produktų gryninimas

Amplifikuoti PGR produktai (25 µl) iš kiekvieno mėginio atskirti 1.5 proc. agarozės gelyje TAE buferyje (40 mM Tris, 20 mM acetinės rūgšties, 1 mM EDTA), ir nudažomi etidžio bromidu (10 µl), po nudažymo vizualizuojami po ultravioletine lempa. Nuo agarozės gelio PGR produktai atskirti panaudojant genų JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Lithuania), naudojantis gamintojo instrukcijomis. The GeneJET™ išgryninimo stulpelis pašalinamas ir išgryninta DNR laikoma -20°C.

2.3.4. DNR sekvenavimas ir filogenetinė analizė

Sekvenosena atliekama panaudojant BigDye Terminatorių v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster, Kalifornija, Jungtinės Amerikos valstijos) naudojantis gamintojo instrukcijomis. Sekvenosena atlikta su tais pačiais pradmenimis, kurie panaudoti ankstesniuose etapuose. Reakcijai panaudotos medžiagos: terminacijos reakcijai paruoštas mišinys 1,0 ml, šablonas 10 ng, pradmuo 3.2 pmol ir jonizuotas vanduo iki 10 ml. Atlikti 25 ciklai, iš pradžių vyko denatūracija 96°C /1 min, po to 96°C /10 s, 50 °C /5 s ir 60°C /4 min. Išgrynintos DNR prailginimui panaudotas etanolis/EDTA precipitacijos metodu. ABI Prism 310 genetinis analizatorius panaudotas duomenų analizavimui. Sekvenuotos sekos paruoštos ABI formatu (chromatograma), išanalizuojamos Chromas analizatoriumi (versija 2.01, gamintojas:

Technelysium, Australija), ir išsaugotos FASTA (95) formatu. Evoliuciniai medžiai nubraižyti

MEGAX programa (41). Sekos sulygiuojamos panaudojant ClustralW programą. Evoliuciniai

lietuviškų sekų; lietuviškų sekų ir identiškų referentinių ŠPV sekų; lietuviškų sekų, vakcinų ir KPV

22 medžiai nubraižyti pagal Tamura-Nei 1993 metų modelį (91). Visų ŠPV ir KPV porų atstumų matrica nubraižyta panaudojant Tamura-Nei modelį (91). Lietuvos sekos (1 lentelė) palygintos tarpusavyje (1 pav.) palygintos su refentinėmis ŠPV ir KPV (2pav.); vakcinomis ir KPV sekomis (3 pav.). Visos referentinės užsienio, vakcinų ir KPV sekos atrinktos iš GENBank duomenų bazės ir išsaugotos FASTA formatu (93,95).

3 lentelė. GenBank duomenų bazėje atrinktos referentinės ŠPV ir KPV

Eil.nr. ŠPV izoliato pavadinimas, Genbank identifikacija Šalis Metai

1. CPV2c,C105-030/16;Genbank KX421789.1 Taivanas 2017 Nepublikuotas 2. CPV2a,CPV/CN/SD19/2014;Genbank:KX425921.1 Kinija 2016 Nepublikuotas 3. CPV2c,CPV-2b/2010/Ind; Genbank:KX425921.1 Indija 2017 Nepublikuotas

4. CPV2a,UY315;GenBank:KM457136.1 Urugvajus 2014 77

5. CPV2b,ME20_ECU2012; GenBank:KF149985.1 Ekvadoras 2013 78 6. CPV2b,HNI-1-18; GenBank:AB120728.1 Vietnamas 2004 79

7. CPV2,H-212; GenBank:KF539804.1 Vengrija 2014 80

8. CPV2, RDPV122; GenBank:MN451693.1 Suomija 2019 Nepublikuotas 9. CPV2c,CPV_IZSSI_52238_12;GenBank:KX434460.1 Italija 2019 81

10. CPV2c,ARG68; GenBank:JF414826.1 Argentina 2012 82

11. CPV2c,PT262/14; GenBank:KT275256.1 Portugalija 2016 Nepublikuotas

12. CPV2a,CPV-15); GenBank:M24003.1

1993 Nepublikuotas

13. CPV2b, isolate39; GenBank:M74849.1

1995 Nepublikuotas

14. CPV2c,Pome; GenBank: EF599098 Pietų

Korėja

2008 83 15. CPV2a,CPV-435; GenBank:AY742953.1 Vokietija 2016 84 16. CPV2c,G133/97; GenBank:FJ005198.1 Vokietija 2009 86

17. CPV2c,67/06; GenBank:FJ005214.1 Ispanija 2009 86

18. CPV2c,67/07-11; GenkBank:FJ0052635.1 Amerika 2009 86 19. CPV2c,195/08; GenkBank:FJ005247.1 Belgija 2009 86 20. CPV2c, 42/05-49; GenBank:FJ005263.1 Italija 2009 86 21. CPV2b, G82/97; GenBank:FJ005260.1 Vokietija 2009 86 22. CPV2b,42/05-49; GenBank:FJ005263.1 Italija 2009 86

23. CPV2a; GenBank:AJ698134.1 Indija 2005 Nepublikuotas

24. CPV2b, GenBank:Z46651.1 Lenkija 2006 Nepublikuotas

23 3 lentelė. GenBank duomenų bazėje atrinktos referentinės ŠPV ir KPV. 3 lentelės tęsinys

25. CPV2b, TR/CPV/K20-KM; GenBank:KF500499.1 Turkija 2016 87 26. CPV2b, K031; GenBank:EU009206.1 Pietų Korėja 2008 88

27 CPV2b, CPV-ZD35;GenBank: EU483517.1 Kinija 2016 Nepublikuotas 28. CPV2a, TR/CPV/K12-A;GenBank: KF500497.1 Turkija 2016 87

29. CPV2a, GenBank:AY742935.1 Vokietija 2005 84

30. CPV2b, IIL P20; GenBank:DQ182623.1 Indija 2016 89 31. CPV2c, GR09/09; GenBank:GQ865519.1 Graikija 2011 90

32. CPV2a, 04S17; GenBank DQ025986.1 Prancūzija 2008 Nepublikuotas 33. CPV2b, 04S23, GenBank:DQ025992.1 Prancūzija 2008 Nepublikuotas 34. CPV2c, GR51/08, GenBank:GQ865518.1 Graikija 2011 90

35. FPV, FPV-GD12/09/YGP, GenBank:KC473946.1 Kinija 2013 Nepublikuotas

36. FPV, FPLV/cat/31609/PT06,GenBank:EU221281.1 Portugalija 2008 Nepublikuotas

24

3. REZULTATAI

Visi tiriamieji šunys (100 proc.), kuriems pasireiškė klinikiniai parvoviruso infekcijos požymiai (vėmimas, viduriavimas, hipertermija) buvo ištirti imunochromatografiniu testu (Anigen CPV/CCV Ag, Bio Note, Šiaurės Korėja). N=28 (56,0 proc.) mėginių buvo teigiami PGR ir imunochromatografijos testų atžvilgiu. N=22 (44,0 proc.) mėginiai imunochromatografijos teste ir PGR buvo neigiami. N=3 (5,7 proc.) mėginiai (katės) nebuvo tirtos greituoju testu. Visi kačių mėginių PGR analizės rezultatai šunų parviruso atžvilgiu buvo neigiami (p>0,05, statistiškai nepatikima), dėl to, jos nebuvo įtrauktos į tolesnį tyrimą. Imunochromatografinių tyrimų rezultatai kartu su PGR rezultatais yra statistiškai patikimi, p<0,05. Daugiausiai sirgusių sudarė 1 grupę (1- 3mėn) n= 32 (64,0 proc.). 2 grupę (4-6mėn) sudarė n= 14 (28,0 proc.), 3 grupę (7mėn ir daugiau) sudarė n= 4 (8,0 proc.). Tiriamųjų amžiaus vidurkis 2 mėnesiai. Pasveikusių iš viso n=22 (44,0 proc.), gaišusių iš viso n= 28 (56,0 proc.). Gaišusių patinų užfiksuota n=15 (62,5 proc.), pasveikusių patinų n=9 (37,5 proc.), gaišusių patelių n=7 (26,9 proc), pasveikusių patelių n=19 (73,1 proc.).

Ligos baigtis (gaišo, pasveiko) pagal lytį buvo statistiškai reikšmingos, p<0,05. Pirmoje amžiaus grupėje n=13 (40,6 proc.) pasveiko, n=19 (59,4 proc.) gaišo. Antroje amžiaus grupėje: n= 6 (42,3 proc.) pasveiko, n= 8 (57,1 proc.) gaišo, trečioje grupėje: n=3 (75,0 proc.) pasveiko, n= 1 (25,0 proc.) gaišo. Amžiaus grupė ir ligos baigtis (pasveiko, gaišo) nebuvo statistiškai patikimos, p>0,05.

Pirmoje amžiaus grupėje trumpiausias ligos inkubacinis periodas 3 dienos, ilgiausias 13 dienų, vidurkis 7 dienos. Antroje amžiaus grupėje trumpiausias inkubacinis periodas 3 dienos, ilgiausias 20 dienų, vidurkis 8 dienos, 3 amžiaus grupėje trumpiausias inkubacinis periodas 4 dienos, ilgiausias inkubacinis periodas 13 dienų, vidurkis 11 dienų.

Atlikus lietuviškų ŠPV PGR su amplifikacijos pradmenimis gavome 41-vieną 681 bp produktą. Geriausius 28 PGR produktus atrinkome sekvenavimui, iš jų sekvenuoti 22. Iš 22 sekvenuotų sekų atrinkome 11 filogenetinei analizei. MEGAX programa 681 bp sekas apdorojo iki 643 nukleotidų sekų. Šių nukleotidų eilės panaudotos filogenetinei analizei. Visos sekos, kuriose buvo nukleotidų informacijos trūkumų - pašalintos. Lietuviškos ŠPV VP-2 sekos (n=11), referentinės ŠPV VP-2 sekos (n=34), kačių KPV VP-2 sekos (n=2) ir referentinės vakcinų sekos (n=7) buvo identifikuotos ir analizuotos filogenetinės analizės programoje. Referentinės sekos ir kačių panleukopenijos sekos atrinktos iš įvairių kontinentų (Europa, Amerika, Azija). (3 lentelė).

MEGAX programoje panaudojant maksimalaus panašumo metodą ir Tamura- Nei modelį (91,92)

nubraižytas lietuviškų sekų (1 pav.) ir filogenetinės lyginamosios analizės su referentinėmis ŠPV

sekomis medžiai (2 ir 3 pav.). Lietuviškų ŠPV filogenetiniame medyje (1 pav.) užfiksuotas

25

maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo -929,57, išanalizuotos 11 nukleotidų sekų, 643 nt

pozicijos. Maksimalaus panašumo algoritmo medyje lietuviškos sekos susigrupavo tarpusavyje į

vieną filogenetinę grupę (1pav.). Tačiau pCPV2 11 LT VP-2 sekoje grupavosi atskirai nuo likusių

lietuviškų sekų, sudarydama aiškiai apibrėžtą išorinę divergentišką seką. 10 lietuviškų ŠPV

(pCPV2 2 LT, pCPV2 5 LT, pCPV2 7 LT, pCPV2 17 LT, pCPV2 20 LT, pCPV2 32 LT, pCPV2

39 LT, pCPV2 41 LT, pCPV2 42 LT, pCPV2 45 LT) grupavosi į vieną glaudžiai asocijuotą

filogenetinę grupę. MEGAX programoje panaudojant maksimalaus panašumo algoritmą pagal

Tamura-Nei modelį (91,92) nubraižytas lietuviškų sekų ir referentinių užsienio ir KPV sekų medis

(2 pav.). Maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo užfiksuotas -2161,02, išanalizuotos 47

nukleotidų sekos, 660 nt pozicijos. Lietuviškų ŠPV VP-2 sekų ir referentinių sekų maksimalaus

panašumo filogenetinis medis susigrupavo į dvi pagrindines filogenetines grupes (1 ir 2 grupė)

(2pav.). Į pirmąją susigrupavo visos lietuviškos sekos, į antrąją susigrupavo Kinijos, Suomijos,

Indijos ir Italijos ŠPV VP-2 sekos (KR002805.1 CPV2a China, MN451693.1 CPV2 Finland,

KX425921.1 CPV2b India, KX434460.1 CPV2c Italy.) Pirmojoje filogenetinėje grupėje programa

sugeneravo 9 filogenetinius pogrupius. Lietuviškos sekos filogenetiniame medyje grupavosi į

skirtingus pogrupius: 1, 5, 6, 9. Pogrupyje 1 pCPV2 11 LT VP-2 geno seka grupavosi kartu su

Turkijos ŠPV-2a seka (KF00497.1 CPV2a Turkey). 5 pogrupyje pCPV2 45 LT VP-2 geno seka

grupavosi su Vokietijos ŠPV-2a (AY742953.1 CPV2a Germany). 7 lietuviškos ŠPV (pCPV 2 7

LT, pCPV2 39 LT, pCPV2 41 LT, pCPV2 42 LT, pCPV2 2 LT, pCPV2 17 LT, pCPV2 5 LT)

grupavosi į vieną filogenetinį pogrupį kartu su Italijos ŠPV2a, Vokietijos ŠPV2a ir Pietų Korėjos

ŠPV2c (FJ005252.1 CPV2a Italy, AY742935.1 CPV2a Germany, EF599098.2 CPV2c

SouthKorea). pCPV2 20 LT VP-2 geno seka giminingiausia Pietų Korėjos ŠPV-2c (EF599098.2

CPV2c SouthKorea). pCPV2 32 LT ŠPV VP-2 seka grupavosi atskirai nuo lietuviškų ir referentinių

sekų. Lietuviškų ŠPV, referentinių KPV ir referentinių vakcinų ŠPV VP-2 geno sekos

maksimalaus panašumo filogenetinis medis (3 pav.) sugeneruotas naudojant MEGAX programą,

panaudojant maksimalaus panašumo ir Tamura-Nei metodus (91,92). Maksimalaus panašumo

nukleotidų porų rodmuo -1131,34, filogenetinei analizei panaudotos 20 nukleotidų sekos, 646

pozicijos. Referentinių vakcinų, kačių panleukopenijos viruso ir lietuviškų ŠPV VP-2 genų sekų

filogenetinis medis grupavosi į dvi pagrindines filogenetines grupes (3 pav.). Visos lietuviškos ŠPV

grupavosi į pirmąją filogenetinę grupę. 2 filogenetinę grupę sudarė tik kačių panleukopenijos

virusai (EU221281.1 FPV Portugal ir KC473946.1 FPV China). 1 filogenetinę grupę sudarė 3

pogrupiai. 1 pogrupyje grupavosi 9 lietuviškos ŠPV (pCPV 2 LT, pCPV 5 LT, pCPV 7, pCPV 17

LT, pCPV 20 LT, pCPV 32 LT, pCPV 39 LT, pCPV 41 LT, pCPV 42 LT). 2 pogrupyje grupavosi

2 vakcinų sekos (FJ222822.1 Duramune DAPPI+LC vaccine, JF1978847.1 CPVpf vaccine) ir 2

lietuviškos ŠPV (pCPV2 11 LT ir pCPV2 45 LT). pCPV2 45 LT ir pCPV2 11 LT giminingiausios

26 2 vakcinoms (JF1978847.1 CPVpf vaccine ir FJ222822.1 Duramune DAPPI+LC vaccine).

Lietuviškos sekos grupavosi filogenetiškai žymiai toliau nuo vakcinų sekų, išskyrus pCPV2 45 LT ir pCPV2 11 LT VP-2 sekas. Visos lietuviškos ŠPV VP-2 112Tyr nukleotidų pozicijoje turėjo TAC nukleotidų seką, kuri koduoja Tiroziną (Tyr), tačiau pCPV2 42 LT VP-2 112His nukleotidų pozicijoje turėjo CAC nukleotidų seką, kuri koduoja Histidiną (His). Referentinių užsienio sekų skirtumų lentelė nubrėžta naudojant Tamura-Nei modelį (91). Maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo -2161,02, filogenetinei analizei panaudotos 47 nukleotidų sekos, 660 nt pozicijos.

Didžiausias nukleotidų skirtumas (16,0 proc.) lietuviškų ŠPV VP-2 sekų, vakcinų ŠPV VP-2 sekų ir KPV sekų nukleotidų skirtumų lentelėje buvo nustatytas tarp pCPV2 11 LT ir kačių panleukopenijos viruso (EU221281.1 FPV Portugal). Tarp visų lietuviškų ŠPV VP-2 sekų (pCPV2 2 LT, pCPV2 5 LT, pCPV2 7 LT, pCPV2 11 LT, pCPV2 17 LT, pCPV2 20 LT, pCPV2 32 LT, pCPV2 39 LT, pCPV2 41 LT, pCPV2 42 LT, pCPV2 45 LT) ir visų vakcinų sekų (FJ222823.1 strain29/97 vaccine, MG764511.1 FPV China, JN625223.1 vac5 vaccine, FJ222822.1 Duramune DAPPI+LC vaccine, FJ197847.1 CPVpf vaccine, FJ197846.1 CPVint vaccine, FJ011098.1 Intervet06 vaccine, EU914139.1 Pfizer06 vaccine) nukleotidų sekų statistinis skirtumas siekė 0,85 proc. (p<0,05). Didžiausias nukleotidų sekos statistinis skirtumas (0,82 proc.) buvo tarp lietuviško pCPV2 2 LT VP-2 sekos ir Kinijos ŠPV-2a VP-2 sekos (KR002805.1 CPV2a China). Mažiausiais nukleotidų sekų skirtumas (0,14/0,12/0,12/0,12proc.) buvo tarp lietuviškos pCPV2 45 LT VP-2 sekos ir Vokietijos ŠPV-2a (AY742953.1 CPV2a Germany), tarp lietuviškos pCPV2 20 LT VP-2 sekos Pietų Korėjos ŠPV-2c VP-2 sekos (EF599098.2 CPV2c SouthKorea); tarp lietuviškos pCPV2 7 LT VP-2 sekos ir Italijos ŠPV-2a VP-2 sekos (FJ005252.1 CPV2a Italy); lietuviško pCPV2 11 LT ir Turkijos ŠPV-2a (KF500499.1 CPV2b Turkey).

1 pav. Maksimalaus panašumo ŠPV VP-2 geno dalinio sekvenavimo (n.t. 643bp) filogenetinis medis, rodantis giminingumą tarp lietuviškų 11 ŠPV izoliatų.

Maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo

I

II

27

Maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo

9 3

5

6

I

1

7 4

8

II

2

28

rodantis giminingumą tarp lietuviškų 11 ŠPV izoliatų, KPV ir referentinių ŠPV. (

Maksimalaus panašumo nukleotidų porų rodmuo -1131,34

II

I

3

2

1

29

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

1.pCPV2_2_LT

2.pCPV2_5_LT 0,13

3.pCPV2_7_LT 0,13 0,13

4.pCPV2_11_LT 0,85 0,85 0,85

5.pCPV2_17_LT 0,13 0,13 0,13 0,85

6.pCPV2_20_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13

7.pCPV2_32_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13 0,13

8.pCPV2_39_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13 0,13 0,13

9.pCPV2_41_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13 0,13 0,13 0,13

10.pCPV2_45_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13

11.pCPV2_42_LT 0,13 0,13 0,13 0,85 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13

12.MH559110.1_FPV_India 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 13.FJ222823.1_strain_29/97_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 14.MG764511.1_FPV_China 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 15.JN625223.1_vac5_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 16.FJ222822.1_Duramune_DAPPI+LC_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,09 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,09 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 17.FJ197847.1_CPVpf_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 18.FJ197846.1_CPVint_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,09 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,09 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 19.FJ011098.1_Intervet06_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 20.EU914139.1_Pfizer06_vaccine 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 21.EU221281.1_FPV_Portugal 0,85 0,85 0,85 16,0 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 22.EU018142.1_FPV_Argentina 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,85 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11