LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
Kristina Draudvilaitė
ŽEMAITUKŲ MITOCHONDRINĖS DNR KONTROLINĖS
SEKOS NUSTATYMAS IR PALYGINIMAS SKIRTINGOSE
ARKLIŲ VEISLĖSE
Magistro darbas
Darbo vadovė:
dr. J. Kučinskienė
Magistro darbas atliktas 2003-2005 metais Lietuvos veterinarijos akademijos Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje ir nuo 2003 10 01 iki 2003 12 19 Hanoverio veterinarijos aukštosios mokyklos, Gyvūnų veisimo ir genetikos instituto laboratorijoje, Vokietijoje.
Magistro darbą paruošė: Kristina Draudvilaitė
Magistro darbo vadovas (ai): dr. Jūratė Kučinskienė (LVA Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)
Recenzentas (ai) : doc. A. Januškevičius (LVA Gyvūnų mitybos katedra)
TERMINŲ IR SUTRUMPINIMŲ PAAIŠKINIMAI mtDNR – mitochondrinė DNR
bp – bazės porų skaičius
aps/min – apsisukimai per mintutę ml – 1 mililitras
µl – 1 mikrolitras
PGR – polimerazės grandininė reakcija
DNR – deoksiribonukleorugštis, iš nukleotidų sudarytas polimeras RFIP – restrikcinių fermentų ilgio polimorfizmas
SSCP - single strand confirmation polymorphism Ponytyp- poni tipas
Wüstentyp – dykumų tipas Steppentyp – stepių tipas Gebirgstyp- kalnų tipas Waldtyp-miškų tipas Freq. –dažnis
Constant- pastovi kreivė Expansion-išsiplėtimo kreivė
Genų dreifas - tai atsitiktinis alelių dažnio genofonde pasikeitimas, susijęs su populiacijos sumažėjimu.
“Butelio kaklelio” efektas - kai dėl gamtinės nelaimės populiacija labai sumažėja. Išgyvenusieji individai sudaro vadinamąjį genetinį “butelio kaklelį”.
Genetinis polimorfizmas - kai vienoje populiacijoje aptinkami ne mažiau kaip du vienos
TURINYS
TERMINŲ IR SUTRUMPINIMŲ PAAIŠKINIMAI ...3
1. ĮVADAS...5
2. LITERATŪROS APŽVALGA ...7
2.1. Pirmykščių arklių evoliucija... 7
2.2. Arklių prijaukinimas... 9
2.3. Mitochondrijų DNR ypatumai ir sandara ... 10
2.4. Arklių mtDNR įvairovė... 12
2.5. Arklių veislės naudotos mtDNR analizei ... 15
3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI...24
3.1. DNR skyrimas iš plaukų (1 metodas)... 24
3.2. DNR skyrimas iš plaukų (2 metodas)... 25
3.3. DNR skyrimas iš kaulų... 25
3.4. Mitochondrinės DNR D-kilpos PGR... 26
3.5. D-kilpos sekvenavimas... 27
3.5.1. Poliakrilamido gelio gamyba... 28
3.6. Sekvenavimo duomenų matematiniai skaičiavimai ... 29
4. REZULTATAI ...30
5. IŠVADOS ...36
6. PADĖKA ...37
7. SUMMARY...Error! Bookmark not defined.
8. NAUDOTŲ LEIDINIŲ SĄRAŠAS...39
1. ĮVADAS
Arklių rūšis (lot. Equidae, Equus) apima tokius porūšius, kaip tikrieji arkliai (Equus caballus), zebrai (Equus zebra), asilai (Equus asinus), pusiau asilai (Equus hemionus). Arklių vystymasis prasidėjo prieš 60 milijonų metų, kai drėgnuose atogrąžų miškuose gyveno lapės dydžio gyvūnas (Bökönyi, 1987).
Prieš 6000 metų buvo pirmieji bandymai sunamininti laukinius arklius ir panaudoti juos savo tikslams. Iškasenos Ukrainoje rodo, kad arkliai buvo prijaukinti prieš 4000 pr.m.e. Nėra tiksliai nustatyta ar arklys jau tada tarnavo kaip nešulinis ir kinkomasis, ar tik kaip maisto šaltinis. Centrinėje Azijoje arkliai galėjo būti sunamininti kaip ir Šiaurės elniai, kurie Stepių tautų buvo prijaukinti 5000 m. prieš Kristų. Nes pakinktai ir balnai abiem gyvulių rūšims buvo vienodi (Ryder, 1993).
Į senąją Europą arkliai išplito dėl kurganų kultūros žmonių veržimosi iš rytų Europos - vidurio Azijos zonų. Nuvilnijusios trys kurganų bangos, pakeitė senosios Europos proistorės eigą. Iki tol egzistavusi sėsli ir taiki matriarchalinė kultūra, kuriai nežinomi ginklai ir žirgai, buvo asimiliuota kurganų kultūros, kuri iš Vidurio Europos buvo atnešta į Rytų Pabaltijį bei Vidurio Europą 3000-2500 pr.m.e. Susiliejus senosios Europos ir kurganų kultūroms, indoeuropiečių atvesti arkliai tūkstančius metų buvo auginami Lietuvos teritorijoje. Būsima veislė formavosi kartu su lietuvių tauta ir viduramžiais išgarsėjo kaip viena geriausių pasaulyje kovinių arklių veislių – žemaitukai (Gimbutienė, 1985).
Lietuvoje arklys buvo labai svarbus mitologijoje, ūkinėje bei karinėje veikloje. Šis nepaprastas reiškinys ir meilė žirgui matyti iš archeologinių iškasenų, tūkstančiai žirgų įmantriai ir ištaigingai išpuoštų, palaidota su šeimininkais ir atskiruose kapinynuose. Žirgas buvo šventas dangaus šviesos Dievo gyvulys. Iš tirtų kaulų matyti, kad arkliai daugiausia buvo nedideli, bet labai ištvermingi, Rytų Europos Prževalskio arklio tipo palikuonys (Gimbutienė, 1985; Nakaitė, 1991).
Šiandieninių arklių veislių vystymasis ir genetinė įvairovė atsirado vykstant migracijai, dėl klajoklinio protėvių gyvenimo būdo ir karų. Esant įvairiems žmonių poreikiams, laukinių arklių prisitaikymas prie vietinių sąlygų ir šimtmečius trunkanti selekcija buvo priežastimi, kad pasireikštų norimi požymiai, tai lėmė daugelio skirtingų arklių veislių, tame tarpe ir mūsų senosios žemaitukų veislės atsiradimą (Ryder, 1993).
visame pasaulyje labai intensyvūs, tam plačiai naudojami mitochondrinės DNR (mtDNR) kontrolinės sekos, kurios paveldimos iš motinos pusės duomenys. Viduveislinė įvairovė parodo inbridingo laipsnį arklių populiacijoje bei apibūdina demografinių veikslių įtaką populiacijoms. Tarpveislinis arklių populiacijų ir jų genetinių skirtumų įvertinimas, tokių kaip Prževalskio, Arabų grynakraujų, Soraja arklių, žemaitukų bei arklių iškasenų, leidžia pavaizduoti ir palyginti įvairių populiacijų genetinę įvairovę, jos struktūros skirtumus, bendrumus bei kilmę.
Lietuva 1992 metais pasirašydama Rio de Ženeire Biologinės įvairovės konvenciją pradėjo įgyvendinti naminių genetinių išteklių išsaugojimo programą. Žemaitukų arklių augintojų asociacija (ŽAAA) 2005-2007 metams išleido žemaitukų arklių veislės išsaugojimo programą, kurios tikslas – saugoti, plėsti, propaguoti unikalią ilgaamžę žemaitukų veislę, įtraukti į genetinių išteklių išsaugojimo sistemą. Genetinė analizė ir kontrolė yra viena iš efektyviausių žemaitukų veislės išsaugojimo programos prioritetų.
Darbo tikslas:
Įvertini žemaitukų veislės genetinę įvairovę mitochondrinės DNR sekos palyginimo pagalba, tyrimui pasirenkant laukines ir prijaukintas arklių veisles.
Uždaviniai
:1. Įsisavinti DNR skyrimo ir sekvenavimo metodus. 2. Nustatyti žemaitukų mtDNR kontrolinę seką. 3. Įvertinti žemaitukų viduveislinę genetinę įvairovę.
2. LITERATŪROS APŽVALGA 2.1. Pirmykščių arklių evoliucija
Veisiant arklius susiformavo mažiausiai keturi pagrindiniai tipai ir jų tarpe potipiai (1 pav.):
1 pav. Geografinis pirmykščių arklių tipų pasidalijimas. Prieiga per internetą http://www.payer.de/entwicklung/entw084a.htm. 2004 lapkričio 19d.
Ponių tipas
Šiaurinėse pelkėse, tundrose, skurdžiuose kraštovaizdžiuose susiformavo mažas, stiprus arkliukas. Šis pirmykštis ponis turėjo platų liemenį, stiprius virškinimo organus ir stiprius dantis, kad galėtų krimsti sumedėjusius augalus. Be abejonės ponis turėjo šiurkštų, tankų kailį, vešlius karčius ir uodegos plaukus. Pasak mokslininkų iš šios ponio formos, vadinamos
Equus przewalskii gracilis, kilo šiauriniai poniai. Daugelis naminių ponių veislių susiformavo
veikiamos kitų įliejant svetimą kraują, neprarasdamos savo esminių požymių. Eksmūro poniai Šiaurės vakarų Anglijoje nuo ledynmečio laikų išsilaikė beveik nepaliesti (Dossenbach, 1999).
Šaltakraujų tipas
Šalia judraus ponių tipo Šiaurėje buvo didelis, masyviomis formomis, sunkia galva arklys. Pirmykščio tipo aukštis ties gogu siekė 180 cm. Šis
Equus przewalskii robustus buvo aiškus šaltakraujų arklių veislių
Kalnynų tipas
Kalnuotose vietovėse Šiaurės vakarų Afrikoje susiformavo santykinai masyvus, lengvas arklys, kurio pagrindinis požymis ilga galva su išgaubtu nosies profiliu bei dideliu atstumu tarp akių ir šnervių. Iš šio kalnuotų dykumų tipo susiformavo Berberio arklys, kuris išsiskiria savo didele jėga ir savo risčia. Berberai su islamų užgrobėjais patekę į pietvakarių Europą suformavo tenai kilmingą Andaluzijos arklių veislę. Iš Andaluzų veislės kilo tokios žinomos veislės, kaip Neapolitaneriai, Lipicanai, Frederiksborgai, Knabstrubai ir Kladrubai. Iš šių arklių taip pat kilo amerikiečių Mustangai ir kitos vakarinės arklių veislės (Dossenbach, 1999).
Dykumų tipas
Pietvakarinės Azijos šykščiose dykumose išsivystė ketvirta mažo, smulkaus, žavaus arklio forma. Atviruose kraštovaizdžiuose, nebuvo kur pasislėpti ir geriausia apsauga nuo plėšrūnų visuomet buvo staigus pabėgimas. Karštas temperamentas padėjo žaibiškai reaguoti į gręsiantį pavojų. Tipui būdinga plati krūtinės ląsta, talpinanti gerai išvystytus plaučius ir stiprią širdį. Šiame dykumų tipe nei kitose arklio formose daugiausiai viskas orientuota į vikrumą ir greitį. Iš jų kilo dykumų Arabų arklių veislės bei šiltakraujų arklių veislės (Dossenbach, 1999).
Dažniau nei šie, pagrindiniai keturi tipai buvo tarpinės formos t.y. arkliai, kuriems reikėjo mažiau prisitaikyti prie ekstremalių gyvenimo sąlygų, kurie mažiau specializavosi ir galėjo paplisti didesnėse teritorijose (Dossenbach, 1999).
Stepių tipas
Stepių tipui priklauso Prževalskio arklys esantis tarp šaltakraujų ir dykumų tipo, aiškiai išlaiko formas tarp daugelio Azijos arklių veislių ir daugelio Mongolijos ponių. Šis paskutinis dar gyvenantis laukinis arklys nėra mūsų naminių arklių protėvis (Dossenbach, 1999).
Miškų tipas
2.2. Arklių prijaukinimas
Pasak archeologinių tyrimų – arklys buvo prijaukintas maždaug prieš 6000 metų Eurazijos stepių srityje, kur arkliai būdavo sugaunami ir veisiami norimiems tikslams (Clutton-Brock, 1999). Seniausia rasta naminio arklio molinė figūrėlė, manoma, buvo pagaminta maždaug 2300 m. pr. Kr. Ji buvo rasta 300 km prie šiaurės rytų Damasko (Bower, 1993).
naminiams arkliams. Taigi, protėvių ryšys su naminiu arkliu dar kartą nepasitvirtino. Vienoje šakoje susiskirstė Eksmūro, Fiordo, Islandijos ir Škotijos ponių veislės. Islandijos ponių veislėje tarp rastų kitų haplotipų rastas ir iberiškas haplotipas. Iberiškoje šakoje susigrupavo Luzitanai, Andalūzai, Berberai. Mokslininkus nustebino tai, kad Soraja arklys nesigrupavo su moderniosiomis Iberijos arklių veislėmis, bet tai turbūt atsitiko dėl butelio kaklelio efekto, po kurio išliko tik du Soraja mtDNR haplotipai, kurie galėjo turėti įtakos iberiškiems arkliams, tačiau nėra tiesioginiai jų protėviai. Daugiausia Sorajos mtDNR tipų buvo rasta pas Konikus. Manoma, kad ne tik Konikai, bet ir Soraja yra Tarpanų palikuonys (nėra įrodyta). Arabai ir Berberai nėra artimai giminingi, Berberai turi daugiau bendrų protėvių su iberiškais arkliais. Devyni iš dešimties tirtų Dulmenerių parodė iberišką genotipą, tai reiškia, kad Dulmeneriai turėjo iberišką kilmę (Oakenfull ir Ryder, 1998, Jansen ir kt., 2002).
Jansen ir kt. (2002) įvertino minimalų mutacijos koeficientą 350 000 metų mutacijos laikotarpyje. Vila ir kt. (2001) remdamiesi šiais rezultatais manė, kad pirmasis caballine arklys kildinamas maždaug prieš 300 000 metų. Kumelių skaičius, kurios perdavė mtDNR naminiams arkliams, buvo nustatytas pasitelkus mtDNR mutacijos koeficientą ir archeologinį prijaukinimo laiko vienetą. Šis tyrimas parodė, jog mažiausiai 77 sėkmingai veislę platinančios kumelės buvo prijaukintos iš laukinių arklių. Teigiama, kad prijaukinti arklį prireikė kelių arklių populiacijų. Pasak Vila’os ir kt., (2001) išvadų arklių panaudojimas buityje pirmiausiai atsirado dėl technikos pakitimo gaudant, jaukinant ir dauginant laukinius gyvūnus. Naminių arklių eksportas buvo vykęs panaudojant motinines linijas, kurių įvairovė buvo labai ribota. Nagrinėjant arklių veislių evoliuciją ir prijaukinimą reikia atsižvelgti į tai, kad mitochondrinės DNR D-kilpa turi aukštą mutacijos koeficientą ir yra paveldima iš motinos (Aquadro ir Greenberg, 1983). Be to, mtDNR teikia daug informacijos nagrinėjant veislės motininę seką, atsekant genealogiją ir kumeles - veislės pradininkes.
Užsienio autorių atliktų įvairių arklių veislių mtDNR fragmentų apžvalga pateikiama 43 psl. prieduose 1 lentelėje.
2.3. Mitochondrijų DNR ypatumai ir sandara
Arklių genetinės istorijos duomenis nuolat papildo mikrostelitų, Y chromosomos ir mtDNR tyrimų duomenys. Šių tyrimų dėka išaiškinama veislės struktūra, filogeografija bei lyties apspręstas genų dreifas. MtDNR gali būti naudojama viduveisliniams ir tarpveisliniams tyrimams bei koncentruotas į kilmės ir evoliucijos išaiškinimą. Tam naudojami RFIP ir D-kilpos sekos analizės metodai.
grupės labai smarkiai skiriasi, iš to galima spręsti, jog paskutiniai bendrieji protėviai turėjo egzistuoti dar prieš arklių prijaukinimą.
Manoma, kad mitochondrijos susidarė iš α- rausvųjų bakterijų, kurios buvo simbiozėje su ankstyvaisiais eukariotais. Evoliucijos eigoje, svetima ląstelė perėmė svarbias funkcijas, eukariotai prarado atitinkamus genus ir perdavė juos svetimos ląstelės (bakterijos) branduoliui. Intensyviau mitochondrijų genai pradėti tirti tik nuo 1963 m., kai mitochondrijose buvo aptikta DNR. 1981 metais Barell’as su grupe bendradarbių visiškai iššifravo žmogaus mitochondrijų DNR nukleotidų seką. Pagrindinė mitochondrijų funkcija yra adenozinotrifosfato (ATF) - universalaus cheminės energijos pernešėjo ir pagrindinio jos kaupėjo gyvose ląstelėse, reikalingo organizmo energetikai, sintezė (riebalų ir angliavandenių apykaitoje), ląstelės žūties reguliavimas (apotopozė) ir DNR/RNR sintezė (Kučinskas, 1998).
Kiekviena eukarioto ląstelė gali turėti tūkstančius mitochondrijų, o kiekvienoje mitochondrijoje aptinkamos 2-10 žiedo formos dvigubos dvigrandės DNR molekulės. MtDNR sudaryta iš maždaug 16500 nukleotidų porų, 13 proteinus koduojančių genų, 22 tRNR genų ir 2 ribosominių genų, pasiskirsčiusių tarp dviejų DNR grandžių (H-sunkios ir L-lengvos). Papildomai prie šių 37 genų yra trumpa 1,18 kb trigrandė sritis, vadinama D-kilpa, kuri nekoduoja jokios svarios informacijos ir yra labai polimorfiška. MtDNR skiriasi nuo branduolinės DNR. Ji paveldima citoplazminiu būdu, mitochondrijų mutacijos gali vykti 5-10 kartų dažniau nei ląstelės branduolio DNR. Mitochondrijų genomas labai vientisas – beveik nėra pasikartojančių nukleotidų sekų ir intronų. Dėl dažnų mtDNR mutacijų susidarė didelė mtDNR įvairovė (Kučinskas, 1998). Šiuo reiškiniu remiamasi tiriant arklių populiacijas ir sprendžiant arklių evoliucijos problemas. D-kilpa esanti tarp tRNRPhe ir tRNRPro genų yra svarbiausia
reguliuojančioji vieta DNR ekspresijai (2 pav.) D-kilpa yra padalinta į tris sritis: dešiniąją, centrinę ir kairiąją.
2 paveikslas. Arklio mitochondrija.
(http://www.meb.uni-bonn.de/anatomie/cellbio/teaching/mitochondrien/mitochondrien_d.htm prieita per internetą 2004 kovo 24 d.).
Kadangi mtDNR yra santykinai maža, gausi ir lengvai išskiriama molekulė, ji yra mėgiamas daugelio rūšių genomo sekvenavimo objektas, taikomas genomo sekvenavimo projektuose. Pasinaudodami mtDNR polimorfizmu, galima analizuoti arklių paveldimumą bei nustatyti jų kilmę. Norint suvokti arklių evoliuciją, nepakanka žinoti evoliucijos raidą, bet būtina suprasti kaip formavosi rūšys, veislės su joms būdingais morfologiniais paveldimais požymiais. Dabartiniai arkliai, nežiūrint didelio polimorfizmo yra bendros kilmės. Organizmų polimorfizmas atsirado populiacijai prisitaikant prie konkrečių aplinkos sąlygų ir išplitus kai kuriems genams izoliatuose (Desagher ir Martinou, 2000).
2.4. Arklių mtDNR įvairovė
nuo 22 iki 27 bp. Ishida ir kt., (1994) atsekant motininių linijų išsidėstymą ir atskleidžiant mtDNR įvairovę tarp skirtingų arklių populiacijų, naudojo kitokią techniką. Pasitelkę polimerazės grandininės reakcijos-restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmo (PGR-RFIP) metodą jie patvirtino motininį paveldą ir ištyrę 40 arklių, atrado tris ~ single strand confirmation
polymorphism (SSCP) atvejus. Wang ir kt. (1994) tyrinėdami nedidelės arklių populiacijos
Yunnano provincijoje Kinijoje mtDNR variaciją, panaudojo RFIP metodą. Kiekvienas iš šešių tyrime panaudotų arklių turėjo tik sau budingus individualius mtDNR genotipus, kas galėjo reikšti, kad jų motinos buvo skirtingos. Marklund ir kt. (1995) rado 15 skirtingų variantų 78-iuose motiniškai nesusijus78-iuose arkl78-iuose, priklausanč78-iuose penkioms skirtingoms veislėms. Tai buvo atlikta didesniame SSCP fragmente nei tai padarė Ishida ir kt. (1994). Marklund ir kt. (1995) neatrado heteroplazmijos nukrypimų nuo iš motinos paveldėtų savybių ir patvirtino paprastą atrankos metodą, skirtą nustatyti arklių mtDNR tipus, kuriuos pasitelkus galima atsekti motininę geneologiją, o taip pat panaudoti kitoms panašios srities studijoms. Ishida ir kt. (1995) buvo pirmieji, kurie tyrinėjo pačią painiausią D-kilpos sritį tam, kad nustatytų poligenetinį ryšį
Equus rūšyje. Jie numanė, kad tiriamosios srities vienos vietovės metinis evoliucijos koeficientas
turėtų būti tarp 2 iki 4 x 10-8
. Gauta nauja informacija apie naminių ir Prževalskio arklių
evoliuciją, leido padaryti išvadą, jog Prževalskio laukinio arklio linija yra artima kaimyninėms
E.caballus šakoms. Ši šakų topologija aiškiai nenurodo naminio arklio kilimo iš Prževalskio
Dar viena tyrimą atliko Mirol ir kt. (2002). Jie tyrinėjo ryšį tarp argentiniečių Kreolo ir ispanų arklio, pasitelkdami SSCP analizę ir tiesioginį palyginimą. Kaip ir tikėtasi iš anksčiau aprašytų tyrimų – buvo pastebėtas labai didelis kintamumas tarp veislių ir pačioje veislėje, tačiau filogenetiniame medyje nebuvo pastebėtas glaudesnis ryšys tarp pietų Amerikos ir kitų arklių veislių populiacijų.
Kavar ir kt. (1999, 2002), Bowling ir kt. (2000) ir Hill ir kt. (2002) apibrėžė mitochondrinės D-kilpos sekos variaciją tarp Lipicano, Arabų ir kitų grynaveislių arklių motininių linijų. Šešiolika Lipicano arklio motininių linijų buvo sugrupuotos į 13 skirtingų mitochondrinių haplotipų, tačiau nebuvo pastebėta jokių pakitimų sekose, kurioms paprastai būdingos motininių linijų mutacijos. Istorinius duomenis apie daugiapradę Lipicanų arklių veislės kilmę patvirtino poligenetinis tyrimas, bei dendograma, kurioje parodytos trys atskiros šakos. Sekvenuojant 212 Lipicanų veislės arklių mtDNR, buvo rasti 37 haplotipai (Kavar ir kt., 2002). Lyginant šį susigrupavimą su 136 naminių ir laukinių arklių susekvenuotomis sekomis, gautomis iš genų banko, pastebėta, jog daugelyje kitų naminių arklių haplotipų pogrupiuose yra gana daug susikaupę Lipicano arklių veislės haplotipų. Šie atradimai sutampa su istoriniais duomenimis, kuriuose nurodoma, jog gausios Lipicano motininės linijos, kildinamos iš kelių skirtingų kumelių – veislių pradininkių. Todėl autoriai mano, kad naminiai arkliai yra kilę ne iš vienos didelės bandos, o iš kelių bandų, atsižvelgdami į tai, jog ankstyvoji prijaukinimo fazė buvo susijusi su didelėmis migracijomis. 11 % Lipizzanų veislės arklių kilmė nebuvo išaiškinta.
Bowling ir kt. (2000), JAV tyrinėdami 34 kumelių motinines linijas atrado 27 haplotipus bei atsekė Arabų arklio kilmę. Dvejose linijose jie tyrinėjo pavienius bazių skirtumus, kurie buvo interpretuojami kaip seniau atliktos heteroplazmijos pataisymai ir teigė, kad tos pačios bandos Arabų arkliai dalinasi ta pačia motinine pradininke. 19-oje pagrindinių grynaveislių arklių patelių šeimų buvo rasta 17 haplotipų (Hill ir kt., 2002). Naudodamasis SSCP ir tiesioginio grupavimo analizėmis, Hill ir kt. (2002) lygino grynaveisles šeimas su 13-ka kitų skirtingų arklių populiacijų. Jis nerado reikšmingesnių variacijų, kurios galėtų duoti užuominų apie įvairovę tarp skirtingų geografinių arklių populiacijų. Beveik pusė patelių šeimų neturėjo pastovios, nekintančios kilmės, turbūt dėl to, kad kumelės pirmajame etape buvo mišrinamos. Dar vieną motininės linijos kintamumo tyrimą atliko Luis ir kt. (2002), dirbęs su Soraja arklių veisle. Motininėse linijose jis atsekė tik dvi išlikusias skirtingas linijas ir du haplotipus, iš kurių vieną turi vokiečių arklių populiacijos. Tuo tarpu Aberle ir kt. (2003) rado dar vieną portugališką haplotipą vokiečių šaltakraujų arklių populiacijoje. Tai reiškia, kad dar yra vieną išlikusią motininę liniją, arba dar vieną kumelę, kuri buvo kryžminama kuriant populiaciją.
gana sunku. MtDNR tyrimai padeda įsigilinti ir suprasti arklių evoliucijos ir prijaukinimo procesą.
2.5. Arklių veislės naudotos mtDNR analizei
Kiekviena šalis turi savo vietines arklių veisles, kurios prisitaikiusios gyventi savo gimtosiose vietose ir turinčios specifinį panaudojimą. Lietuvoje buvo suskurtos trys vietinių arklių veislės. Seniausia iš jų yra senojo tipo žemaitukai, žinomi jau nuo VI – VII a., (Šveistienė, 2000).
Žemaitukai
Susiliejus senosios Europos ir kurganų kultūroms, indoeuropiečių atsivesti arkliai tūstančius metų buvo auginami Lietuvos teritorijoje. Lyginant žemaitukus su kitomis senomis arklių veislėmis (Gotlando, Estijos, Lenkijos, Islandijos, Mongolijos, huculų ir kt.), matyti, kad žemaitukus jau žiloje senovėje veikė kryptinga, kūrybinga žmogaus įtaka. Tačiau paplitus atvežtoms iš Vakarų Europos arklių veislėms (anglų, arabų, trakėnų ir kt.), be jokios sistemos pradėta žemaitukus su jomis mišrinti. Žemaitukai ėmė sparčiai nykti. Pirmieji susirūpinę, grynaveislių žemaitukų išsaugojimu, kunigaikščiai Irenėjus, Mykolas ir Bogdanas Oginskiai. Jie įkūrė 1881 m. žemaitukų augintojų draugiją. Tais pačiais metais buvo įsteigti kergimo punktai Kauno, Šiaulių, Panevėžio, Zarasų apskrityse. Sudėjus žirgyno ir draugijos narių laikomus arklius viso buvo 14 žemaitukų: 8 eržilai ir 6 kumelės. Jau 1901 m. buvo 210 veislinių žemaitukų arklių: 20 eržilų, 113 kumelių ir 77 kumeliukai. Parodose Varniuose diplomais ir medaliais buvo apdovanojami tik žemaitukai. 1879 metais B. Oginskis demonstravo 5 žemaitukus Sankt Peterburgo parodoje. Žemaitukus dėl gerų savybių (ištvermingumo, nereiklumo, didelės jėgos) noriai pirko latviai, belgai, vokiečiai ir anglai. Iki Pirmojo pasaulinio karo Lietuva parduodavo iki 30 tūkstančių arklių. Prasidėjus Pirmajam pasauliniam karui sunyko žemaitukų žirgynas, kergimo punktai. Lietuva neteko 60-70 % savo arklių. 1921 m. Žemės ūkio ministerija nusprendė įsteigti žemaitukų žirgyną M. Oginskio arklidėse, kuris 1934 metais buvo perkeltas į Gruzdžius, šiame žirgyne žemaitukų veislės arkliai buvo veisiami susilaikant nuo svetimo kraujo įliejimo (Garbačiauskaitė- Macijauskienė, 2002).
įkuriama žemaitukų arklių veislinė banda. Ši banda 1959 metais perkeliama į Vilniaus valstybinį žirgyną. Per 10 metų eržilas Erelis paliko 45 palikuonis, kurie išliko ir turi reikšmės tolesnei veislės raidai (Garbačiauskaitė- Macijauskienė, 2002).
1990 metais dukterinių bandų žemaitukai, kaip pajinis turtas, buvo išdalintas privatiems asmenims. Nepaliesta liko tik Vilniaus valstybinio žirgyno žemaitukų arklių veislinė banda. Taip trečią kartą žemaitukų arklių veislę reikėjo gelbėti nuo išnykimo. 1994 metais profesorius J. Šveistys su moksliniais bendradarbiais žemaitukus perkėlė į Gyvulininkystės institutą. Be to kelias kumeles institutui pardavė Vilniaus valstybinis žirgynas bei išnuomojo veislinį eržilą. Taip buvo sukurta Gyvulininkystės instituto žemaitukų banda. Parengta žemaitukų veislės arklių išsaugojimo programa bei kitos veislininkystės priemonės, kurios atvėrė galimybę išsaugoti žemaitukus. Populiacija buvo atkurta iš vieno eržilo ir keleto kumelių, taikant grynąjį veisimą (Garbačiauskaitė- Macijauskienė, 2002).
Daugelis žemaitukų yra gražaus eksterjero, harmoningo kūno sudėjimo, masyvūs, plačios ir gilios krūtinės arkliai. Šiuo metu veisiamų žemaitukų gogo aukštis eržilų – 133-136 cm, kumelių – 131-136 cm; eržilų krūtinės apimtis – 171-180, kumelių – 168-177 cm; eržilų plaštakos apimtis – 18-19 cm, kumelių – 17-18 cm. Eksterjeras: galva maža, sausa, žemyn smailėjanti, su plačia kakta, tiesaus profilio; akys išraiškingos, guvios; ausys mažos, stačios, judrios; kaklas trumpas arba vidutinio ilgio, platus, raumeningas, eržilų - su riebaline ketera. Gogas neaukštas, bet žymus, neilgas, krūtinė plati ir gili, nugara tiesi ir plati, šonkauliai gerai išlenkti ir ilgi, juosmuo tvirtas ir platus; strėnos gražiai apvalios, normaliai nuleistos. Žemaitukų kojos plonos, bet tvirtos ir sausos, be šepetėlių arba jie nedideli. Kanopa nedidelė, beveik apvali, gili. Sprendžiant iš kūno matmenų, indeksų ir savybių, žemaitukai yra universalūs, tinka važiuoti greita risčia, joti šuoliais, traukti svorį (Garbačiauskaitė- Macijauskienė, 2002).
Pirmuosius arklių imunogenetinius tyrimus Lietuvoje pagal kraujo grupes atliko B. Kriščiūnas 1990 metais. Šveistienė R. 2002 metais atliko Lietuvos vietinių veislių arklių populiacijų analizę tik su į registrą įtrauktais veisliniais arkliais, remiantis FAO organizacijos veislių vertinimo sistema, apibrėžiant populiacijos pažeidžiamumą ir veiksmų reikalingumą specialios populiacijos išsaugojimui. Ji nustatė, kad vietinių veislių populiacijos, sparčiai mažėja, išskyrus senojo tipo žemaitukus. Lietuvos sunkiųjų arklių per 2000 metus sumažėjo net 15,6 %, o stambiųjų žemaitukų –5 %. Senojo tipo žemaitukų veislinių arklių skaičius per 2000 metus padidėjo 9,3 %. Pasak Šveistienės senojo tipo žemaitukai yra kritinėje – palaikomojoje būklėje, t.y. veislė palaikoma per visuomenines išsaugojimo programas. Apskaičiavusi Lietuvos vietinių veislių rizikos stovį pagal efektyvios populiacijos skaičių (Ne), kuris Lietuvos sunkiųjų arklių yra
pradeda sparčiai mažėti populiacijos genetinė įvairovė, o sumažėjus žemiau 50, heterozigotiškumas sumažėja daugiau nei 1%. Šveistienės paskaičiavimais pagal efektyvios populiacijos skaičių (Ne) tam, kad vietinės arklių veislės pereitų iš rizikos kategorijos į mažiau
pažeidžiamą, gyvulių skaičius pagal lyčių santykį turėtų būti 32 eržilai ir 128 kumelės (santykiu 1/4) arba 192 kumelės (santykiu1/6). Juro R. 2003 metais nustatytas žemaitukų veislės efektyvus populiacijos skaičius (Ne) yra 66,9. Leidžia daryti prielaidą, kad padėtis gerėja, tačiau tai tik
pakankamas skaičius trumpalaikiam veislės išsaugojimui.
Macijauskienė V. ir Šveistienė R. 2002 metais atliko tyrimą bei palygino žemaitukų ir stambiųjų žemaitukų arklių eksterjerą, kūno matus, indeksus bei kumeliukų augimo spartą bei pateikė išvadas apie šių arklių išsivystymą. Pasak jų, žemaitukai ir stambieji žemaitukai skiriasi kūno matais, indeksais, augimo sparta, temperamentu ir turėtų būti vertinami bei naudojami kaip dviejų skirtingų lietuviškų veislių arkliai. Juras R. (2003) atliko tyrimą su Lietuvos arklių vietinėmis veislėmis bei palygino su kitomis prijaukintomis arklių veislėmis, pagal 7 arklių kraujo grupes, kraujo serumo baltymus, fermentų polimorfizmą bei 24 mikrosatelitinius DNR žymeklius. Kraujo grupių, kraujo serumo ir eritrocitų baltymų bei fermentų polimorfizmo tyrimai parodė žemaitukų ir stambiųjų žemaitukų arklių populiacijų genetinę įvairovę. Iš kraujo grupių, kraujo serumo ir eritrocitų baltymų bei fermentų polimorfizmo duomenų filogenetinis medis rodo Lietuvos vietinių veislių genetinį panašumą. Filogenetiniame medyje sudarytame iš mikrosatelitinių lokusų genų dažnio duomenų, panaudoti anglų ir arabų grynakraujai, Eksmūro ir Skyros poniai, Andalūzai, Cheju, Garanai, Lipicanai, Sufolkai, Hanorverio, Soraja, Haflingeriai, Lenkijos vietiniai arkliai. Filogenetiniame medyje Lietuvos vietiniai arkliai sudarė atskirą klasterį.
Europos šalių FAO organizacijos konferencijoje žemaitukų veislė pripažinta saugotina tarptautiniu mastu ir įtraukta į Pasaulio žemės ūkio gyvūnų katalogą. Šiuo metu yra 191 arklys (Žirgai, 2005).
Žemaitukų genetinių ryšių tarp veislių įvertinimui ir palyginimui buvo panaudos laukinių ir prijaukintų arklių veislių iš Azijos, šiaurės ir vidurio Europos. Daugelis šių primityvių veislių XX a. pradžioje buvo beveik išnykusios. Kultūros atžvilgiu jos yra labai svarbios istorijai, šiandieninėms prijaukintoms arklių veislėms. Veislės buvo pasirinktos, atsižvelgiant ir į Lietuvos istorijos šaltinių duomenis.
Prževalskio arklys
Mikailovičiaus Prževalskio garbei (Bouman, 1994). Prževalskio arklys arba laukinis Azijos arklys gyvenęs europinėse ir centrinės Azijos stepėse yra tarsi tarpinis narys tarp ankstesnių arklio formų ir dabartinių arklių veislių (Ryder, 1993).
Pagrindinis šių Azijos laukinių arklių požymis, tai kad turi 2n=66 chromosomų rinkinį, kai prijaukinti arkliai turi 2n=64 chromosomas (Benirschke ir kt., 1965).
Laukinio Azijos arklio aukštis vidutiniškai siekia 131 cm, kailio spalva - gelsva, juodos kojos, dažni dryžiai bei juodi, statūs 20 cm karčiai. Šie arkliai pasižymi agresyviu ir karštu temperamentu bei klajokliniu gyvenimo būdu, bandose vyrauja hierarchija vienas eržilas su 3 - 6 kumelėmis bei jų palikuonimis. Arklio galva ilga ir sunki su tiesia arba šiek tiek išlenkta nosies linija, ir aukštai beveik ties ausimis esančiomis akimis. Arklys turi tiesią nugaros liniją (Groves, 1994). Šiuo metu yra apie 600 šių arklių 95-uose viso pasaulio zoologijos soduose. Mongolijos dykynėse šie arkliai jau nebesutinkami. Paskutinis laukinis arklys buvo užregistruotas 1968 metais. Kai kurie zoologijos sodai Vokietijoje, Nyderlanduose, Prancūzijoje ir Amerikoje pagal projektą stengiasi arklius pratinti prie dykviečių bei gražinti arklius į natūralią gamtą. Prževalskio arklys panašus į Equiden asinų grupės arklius, tai rodo, kad abi grupės turi tas pačias šaknis, jie yra Equus caballus porūšis (Groves, 1994).
Kazachai
Mokslininkai patvirtino kazachų ryšį su ankstyvaisiais Stepių gyventojų normandų prijaukintais mažais arkliukais. Kazachai darė įtaką mongolų, karabairų, arabų ir akal-tekų (akhal-teke) arklių veislėms. XX amžiuje Kazachai buvo gerinami grynaveisliais arkliais. Eržilų aukštis ties gogu siekia 144 cm, krūtinės apimtis 180 cm, kumelių atitinkamai 142 cm ir 178 cm. Atsižvelgiant į nedidelius išmatavimus arklio svoris svyruoja nuo 400 iki 500 kg. Turi tiesaus profilio sausą galvą, kaklas trumpas arba vidutinio ilgio, tiesus, raumeningas, liemuo santykinai siauras, gilus, nugara tiesi, plati, strėnos gražios su giliai prisegta uodega. Sąnariai stabilūs tvirti, stiprios pasagos. Kazachai pasižymi dideliu atsparumu ir yra tipiškas stepių arklys (Dmitriez, 1989).
Mongolų arklys
nuo 125 iki 145 cm. Arkliai turi paveldėję primityvius požymius, gana masyvią galvą, plačią krūtinę, trumpą kaklą, būdingus laukiniams arkliams. Mongolų arkliui būdingos beveik visos spalvos, ypatingai vyrauja tamsi juosta einanti išilgai nugaros ir zebro dryžiai ant kojų. Arkliai taikaus charakterio, ištvermingi, turi gerą risčią (Hermsen, 2002).
Cheju
Manoma, kad Cheju arklys galėjo egzistuoti dar priešistoriniais laikais. Kai mongolų Krya dinastija (1276-1376) užgrobė Cheju salą (Pietų Korėja) atsigabeno 160 savo arklių, bei kryžmino su vietiniais poniais. Cheju arkliai iš salos buvo eksportuojami į Kiniją ir Korėją. Iš 20 000 ponių 1989 metais saloje buvo likę tik 2500. 1987 metais Korėjoje Cheju vietinių ponių veislė yra pripažinta saugotina kaip nacionalinis turtas. Cheju poniai nedidelio ūgio 130 cm, tvirti ir stiprūs. Dažniausiai sutinkamos spalvos kaštono ir juoda, rečiau pilka, kreminė, kerša. Eksterjeras: tiesaus profilio graži galva su trumpomis ausimis, trumpas kaklas ir strėnos, dažniausiai turi stačius karčius, raumeningus pečius (Hendricks, 1995).
Tsushima
Ši veislė vystėsi gana kalvotuose kraštuose Japonijoje netoli Tsushimos Nagasakyje. Arklių aukštis ties ketera siekia 125 cm. Dažniausiai rudi atspalviai. Arklio galva gana didelė, plati kakta, mažos ausys. Kaklas kiek stambokas. Nugara trumpa ir tiesi. Kojos ir kanopos stiprios. Uodega vešli, išaugusi gana žemai. Arkliai draugiški, gerai dirbantys ir patikimi. Buvo naudojamas kaip nešulinis arklys bei sunkiems darbams (FAO, 1995).
Eksmūro poniai
būdinga elegantiška galva, didelės, atviros šnervės, išraiškingos akys ir trumpos ausys. Kaklas trumpas ir tvirtas, kūnas stiprus, vidutinio ilgio. Kojos trumpos su grakščiomis kanopomis.
Antro pasaulinio karo metu poniai buvo beveik išnaikinti, iš likusių 50 individų veislė buvo išsaugota (FAO, 1999).
Portugalų Soraja arklys
Viena iš paskutinių senųjų arklių veislių, kuri priskiriama senų pirmykščių arklių tipui. Veislė nepriklauso poniams, nors dažnai maišoma su vietiniais Šiaurės Iberijos poniais Garanais (Oom, Cothran, 1994).
Arkliai yra nuo 140 iki 145 cm aukščio, eržilai sveria 400 kg, kumelės 350 kg. Kailis yra nuo pilkos iki gelsvos spalvos su įstrižomis zebrų juostomis ant kojų (FAO, 1994).
Veislė neišnyko dėka portugalų zoologo Dr. Rui de Andrade, kuris atrado 1925 m. rytų Portugalijoje 30 laukinių arklių bandą, gyvenančią labai skurdžioje dykvietėje. Zoologas Rui de Andrade ir Michael’as Schafer’is siekė išlaikyti šių arklių tipą ir vykdė kilmės bei giminingumo tyrimus su iberų arkliais, kaip Lusitanos ir Andaluseriais. Tyrimai parodė, kad daugelyje šiandieninių arklių veislių teka Soraja arklių kraujas, taip pat yra įrodyta, kad šiaurės amerikiečių Mustangai kilę iš Soraja arklių (Oom, Cothran, 1994).
Norikas
Lipicas
Viena seniausių Europos arklių veislių. Veislė kilo iš Slovėnijos ir Austrijos. Žirgų aukštis ties ketera 157-160 cm. Dauguma lipicų yra širmi, tačiau Slovėnijos arklių būna juodų ir rudų. Turi išraiškingą galvą, kuri baigiasi suplota nosimi. Kaklas žemas, neilgas. Kūnas kompaktiškas, tvirtas, plačia krūtine, sunkiais pečiais, apvaliu pasturgaliu bei tiesiu uodegos prisegimu. Kojos trumpos ir tvirtos, nedidelės, gražiomis kanopomis. Lipicai yra protingi arkliai, noriai mokosi ir ypač gerai elgiasi (Hermsen, 2002).
Šyrai
Šyrai yra geriausi žinomi angliški sunkieji darbiniai arkliai. Jie yra anglų juodžių palikuonys (ši veislė buvo pati svarbiausių viduramžių Anglijoje), vėliau buvo kryžminti su fryzų arkliais, o XVI ir XVII amžiuje – su flamandų arkliais. Aukštis ties gogu siekia nuo 170 iki 195 cm. Kailis juodas, bėras, širmas. Tamsesnių spalvų arkliai būna su baltomis žymėmis. Šyrai atrodo kaip darbiniai, tik daug didesni: galva labai didelė, plati kakta, suplota nosis, kaklas gana ilgas, nugara trumpa stipri, pasturgalis paltus ir raumeningas, aukštas uodegos prisegimas, kojos ilgos su stipriomis kanopomis ir šepetukais kojų apačioje. Žirgai yra draugiški, ramūs. Anksčiau buvo naudojami ūkio darbams, dabar populiarūs parodose ir kitoms pramogoms, kai papuošti tradiciniais variu kaustytais pakinktais, traukia tautiškus vežimus (Hermsen, 2002).
Šetlendo ponis
Šetlendo poniai yra labai sena veislė. Ponių liekanos Šetlendo salose datuojamos jau 500 m. pr. Kr. Jie yra tundros ponių palikuonys, o pastarieji iš Skandinavijos į Škotiją pateko maždaug prieš 10 000 metų. Mažo ūgio dėka Šetlendo poniai išgyvena be pastogės vėjų gairinamose Šetlendo ir Orknio salų šlaituose.
naudojami jodinėti vaikams, tačiau jie gerai tarnauja ir pakinkyti į vežimą (Boomhower, 1989; Hermsen, 2002).
Fell poniai
Ponių tėvynė yra laikoma Šiaurės Anglijos Apeninų kalnų grandinė, kuri ribojasi su Škotija. Romėnai atkeliavę į šiaurės Angliją ponius siekė padidinti kryžmindami juos su fryzais. Rezultate buvo gautas arklys visiškai panašus į dabartinį Fell ponį. Fell ponių aukštis ties gogu siekia 135 cm maksimaliai 140 cm. Spalvos būdingos poniams bėra, sarta, nėra būdingos baltos žymės, tačiau turi žilutes, įvairių formų žvaigždutes kaktoje. Galva maža, proporcinga, plati kakta, išsišokusios akys, mažos ausys, žandikauliai siauri, kaklas vidutinio ilgumo, nugara tiesi ilga, juosmuo raumeningas. Atšiaurus klimatas ir šykšti vegetacija leido prieš šimtmečius atsirasti šiai veislei. Fell ponis buvo šimtus metų valstiečių pagalbininkas žemės ūkyje, avių ganyme. Jų stiprumas, risčios tvirtumas akmenuotose vietovėse, taip pat geras charakteris pelnė pripažinimą. Fell poniai 1960 metais yra įrašyti į nykstančių naminių gyvulių veislių sąrašą (Hermsen, 2002).
Grynakraujai arkliai
Veislė išvesta Anglijoje. Aukštis ties ketera iki 172 cm. Gali būti visų lygių spalvų, leistinos baltos žymės. Anglų grynakraujis grakščiai sudėtas, stiprus raumeningas arklys. Atskirų linijų arklių aukštis ir sudėjimas gali skirtis. Galva kilnių formų, tiesaus profilio, kaklas lenktas, ryškus gogas, trumpa tiesi nugara. Užpakalinė dalis raumeninga, tvirtos kojos, plonas kailis. Anglų grynakraujai arkliai žinomiausi dėl jų tinkamumo lenktynėms. Be to jie tinkami dresavimui, šuoliams per kliūtis ir medžioklei. Šio arklio žingsnis platus dėl jo ūgio, risčia lygi. Anglų grynakraujų veislės pradininkai buvo trys arabų veislės eržilai, atgabenti į Angliją XVII ir XVIII šimtmetyje (Hermsen, 2002).
Frederiksborgas (danų šiltakraujis)
aukščiausios klasės jojamųjų ir kavalerijos arklių tiekėjų. Vėliau įlieta žymi arabų ir anglų grynakraujų arklių kraujo dalis. Aukštis ties ketera 155-162 cm. Paprastai šios veislės arkliai yra kaštoniniai. Arkliai yra judrūs, vidutinio svorio, temperamentingi. Šio arklio galva maža, lygi nosis ir tiesus kaklas, pečiai ir krūtinė yra ypač stiprūs, nugara plati, o šlaunys ir pasturgalis raumeningi, kojos taisyklingos (Hermsen, 2002).
Dulmeneriai
Vieninteliai Vokietijos tikrieji primityvūs arkliai. Pirmą kartą šie arkliai paminėti 1316 metais. Iki vėlyvųjų viduramžių laukiniai Dulmeneriai ganėsi derlingose pelkynėse šiaurės vakarų Vokietijoje. Aukštis ties gogu 125 - 135 cm. Kailio spalva gelsva, pilkšva, ruda. Balti piešiniai pasitaiko labai retai ir tai tik labai maži. Dažniausiai pasitaiko primityviems arkliams būdingi požymiai, tai išilgai nugaros einantis dryžis ir zebro dryžuotumas. Dulmeneriai turi paprastą, tačiau malonų eksterjerą. Kojos didelėmis kanopomis, plati krūtinės ląsta, stiprus liemuo su gerai išsivysčiusiomis mentėmis, vidutinio ilgumo kaklas su tipiškai poniams galva. (Hermsen, 2002).
Fiordo ponis
Islandijos ponis
Islandijos ponių protėviai buvo keltų ir germanų poniai, kuriuos dar 9 šimtmečio viduryje vikingai atgabeno į salą. Nuo 13 šimtmečio į salą nebuvo daugiau įvežami arkliai, taip kad veislė galėjo netrukdomai vystytis. Islandijos ponis dažniausiai būna juodas ar tamsiai rudas, tačiau pasitaiko ir kaštoninių, širmų, netgi keršų bei margų. Aukštis 125-135 cm. Palyginti su kūno dydžiu, Islandijos ponio galva gana didelė ir sunki, ausys mažos, kūnas storas, kojos stiprios. Pagal kilmę ponis kalnų gyvulys, ištveriantis atšiaurias sąlygas. Ištisus šimtmečius buvo naudojami darbui kaip nešuliniai ir kinkomieji arkliai. Islanderiai yra stiprūs, tvirti, temperamentingi, draugiški (Hermsen, 2002).
3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI
Tyrimams 10 žemaitukų veislės arklių plaukų mėginiai buvo surinkti iš Vilniaus žirgyno bei pavienių augintojų. DNR tyrimo metodai įsisavinti Lietuvos veterinarijos akademijos, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje bei Hanoverio veterinarijos aukštosios mokyklos, Gyvulių veisimo ir genetikos instituto laboratorijoje, Vokietijoje.
3.1. DNR skyrimas iš plaukų (1 metodas)
Metodas įsisavintas LVA Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Nukirpti 4-5 plaukų svogūnėliai buvo patalpinami į mėgintuvėlį. Paruošiamas lizuojantis mišinys (Proteinazė K: lizuojantis buferis = 1:5) ir užpilamas mėgintuvėlio turinys. Mėgintuvėlis su mišiniu buvo maišomas 30 s maišykle “Vortex”. Vėliau centrifuguojamas 13500 aps/min greičiu 10 s. Mėginys inkubuotas termostate 56 ˚C temperatūroje. Po inkubacijos mėginys buvo 10 min. pakaitinamas iki 94 ˚C temperatūros, atšaldomas iki kambario temperatūros bei centrifuguojamas 13 500 aps/min greičiu 10 s.
3.2. DNR skyrimas iš plaukų (2 metodas)
Metodas įsisavintas Vokietijoje Hanoverio veterinarijos aukštosios mokyklos, Gyvulių veisimo ir genetikos instituto laboratorijoje.
DNR buvo išskirta iš 10 Žemaitukų arklių veislės plaukų svogūnėlių panaudojant DNEasy®
Tissue Kit (Qiagen) mėgintuvėlius.
Plaukų svogūnėliai buvo trumpai nukirpti ir patalpinti į 1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlį bei įpilama 300 µl X1 buferio su DTT bei fermentu proteinaze K. Mėginiai buvo inkubuojami 55°C temperatūroje per naktį. Vėliau mėgintuvėliai buvo maišomi ir įpilama 200 µl AL buferio bei 200 µl etanolio. Vėliau 700 µl mišinio perkeliama į DNEasy mėgintuvėlius su filtru ir centrifuguojama 6000 apsk. greičiu 1 min., o filtratas išpilamas. Filtras patalpinamas į naują 2 ml mėgintuvėlį ir įpilama 500 µl AW1 buferio. Mėgintuvėliai centrifuguojami 6000 apsk./min. greičiu, o nufiltruotas skystis išpilamas. Filtras patalpinamas į naują 2 ml mėgintuvėlį bei įpilama 500 µl AW2 buferio ir centrifuguojama visu greičiu 3 min. Centrifugatas išpilamas, o DNEasy Spin Columns filtras patalpinamas į 1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlį. Į mėgintuvėlius įpilama 200 µl AE buferio ir centrifuguojama 6000 apsk. greičiu 1 min. Filtratas neišpilamas, jame yra išskirta DNR.
3.3. DNR skyrimas iš kaulų
Metodas atliktas Vokietijoje. DNR buvo skiriama iš 2000 metų senumo arklio kaulų iškasenų, iškastų Vokietijoje Sarstedt’o apylinkėse, siekiant gautus duomenis įtraukti į arklių mtDNR tyrimus.
įpilama 4 µl fermento RNazės A (100mg/ml) ir maišoma 15 s bei inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje, vėliau trumpai centrifuguojama ir įpilama 200 µl buferio AL. Mėginys maišomas 15 s ir inkubuojamas 70 °C 10 min. Įpilama 200 µl etanolio (96-100 %) ir 15 s maišoma. Po to trumpai centrifuguojama, kad lašeliai nuo sienelių nusileistų į mėgintuvėlio apačią. Vėliau mišinys buvo perkeliamas į naują 2 ml QIAamp Spin Column mėgintuvėlį su filtru ir centrifuguojamas 6000 apsk. greičiu 1 min., o filtratas išpilamas. Filtras patalpinamas į naują 2 ml mėgintuvėlį ir įpilama 500 µl AW1 buferio. Mėgintuvėliai centrifuguojami 6000 apsk./min. greičiu, o nufiltruotas skystis išpilamas. Filtras patalpinamas į naują 2 ml mėgintuvėlį bei įpilama 500 µl AW2 buferio ir centrifuguojama visu greičiu 3 min. Filtras patalpinamas į 1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlį. Į mėgintuvėlius įpilama 200 µl 15 % AE buferio. Inkubuojama kambario temperatūroje 5 min. ir centrifuguojama 6000 apsk./min. greičiu. Filtratas neišpilamas nes tūrėtų būti išskirta DNR. Kad neįvyktų amino rūgščių hidrolizė mėginys inkubuojamas – 20 °C.
Atlikus eilę bandymų, teigiamo rezultato nebuvo sulaukta, DNR išskirti nepavyko, manoma dėl metodikos neatitikimo arba kauluose neišlikusios DNR.
3.4. Mitochondrinės DNR D-kilpos PGR
Kad atlikti žemaitukų veislės arklių filogenetinę analizę, buvo paimtos 49 skirtingos arklių mtDNR sekos iš genų banko (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). 20 veislių arkliai buvo atrinkti atsitiktinai - Cheju (N=3), Mongolų (N=3), Yunanas (N=1), Tsuchima (N=2), Kazachų arklys (N=1), Prževalskio arkliai (N=3), Širai (N=3), Norikai (N=3), Lipicai (N=2), Soraja (N=2), Dulmeneriai (N=3), Anglų grynakraujai (N=3), norvegų Fiordai (N=3), Islandai (N=3), Frederiksborgas (N=1), Šetlendo poniai (N=4), Fell ponis (N=1), Eksmūro poniai (N=2), Pleistoceno laikų iškasenos (N=3), senovinės Antikinės iškasenos (N=3). Iš Genų Banko panaudotų duomenų nuorodos AJ413903; AJ413904; AJ413919; AJ413920; AJ413898; AJ413896; AJ413893; AJ413831; AJ413828; AJ413827;AJ413826; AJ413703; AJ413704; AJ413717; AJ413721; AJ413723; AJ413698; AJ413676; AJ413674; AJ413672 (Jansen ir kt., 2002), D23665; D14991 (Ishida ir kt., 1994), AF169009; AF169010 (Oh ir kt., 1999), AF014408; AF014408 (Kim ir kt., 1999).
Buvo padauginta 1280 bp ilgio mitochondrinės DNR D-loop sritis, panaudojant du pradmenis 1 pradmuo F 5´- AAC GTT TCC TCC CAA GGA CT- 3´ ir 2 pradmuo R
2 5´- GCA TTT TCA
GTG CCT TGC TT- 3´. Vėliau buvo daromas PGR mišinys, vienam mėginiui 20 µl: 77 µl H2O
27,5 µl 10 x PGR buferis (15 mM MgCl2)
22 µl 1 pradmuo 5´- AAC GTT TCC TCC CAA GGA CT- 3´ (20 pM)
22 µ 2 pradmuo 5´- GCA TTT TCA GTG CCT TGC TT- 3´ (20 pM) 11 µl dNTP (300 μM)
5,5 µl 2 U Taq polimerazė (Qbiogene, Heidelberg, Vokietija) 5 μl DNR
Paruoštas amplifikacijos mišinys buvo gerai maišomas, išskirstomas į kiekvieną mėgintuvėlį su genomine DNR. Amplifikavimui buvo naudojamas PTC - 100TM termocikleris (MJ Researsch, Inc., Watertown, Mass., JAV), kuriame užprogramuota sekanti temperatūrų ir laiko režimų ciklinė programa: denatūracija 94°C 4 min., toliau seka 31 ciklas: 94°C 40 s, 62°C 60 s, 72°C 55 s ir atšaldoma iki 4°C 10 min.
Elektroforezinis išskirtos DNR, PGR padauginto produkto frakcionavimas buvo atliekamas horizontalios elektroforezės aparate Midicell PRIMO EC330 (JAV), 1% agarozės gelyje. DNR elektroforezei agarozės gelis buvo ruošiamas sekančiai: agarozė išlydoma TAE buferyje, verdant mikrobangų krosnelėje, vėstant agarozei įvedama 4 µl etidžio bromido, vėliau supilama į formą ir įstatomos "šukutės". Kai gelis sustingsta, "šukutės" ištraukiamos, gelis talpinamas į aparatą su elektroforezės 1xTAE buferiu. Į gautus šulinėlius mikropipetės pagalba buvo įvedama 5µl mėginio ir 2µl bromfenolio tirpalo (3 pav.) Srovės stiprumas 100 mA 45min. Išfrakcionuoti fragmentai buvo analizuojami, fotografuojami kompiuterizuota UV vaizdo dokumentavimo sistema.
3 paveikslas. Agarozės gelis 3.5. D-kilpos sekvenavimas
prasideda žymėtu pradmeniu, o baigiasi ddNTP nukleotidu. DNR polimerazė prijungia nukleozidtrifosfatus, bet retkarčiais atsitiktinumo principu prijungiamas atitinkamas ddNTP, ten, kur jis prijungiamas, tolesnė antrosios grandinės sintezė nutrūksta. Susidaro įvairaus ilgio fragmentų mišinys, kuris tiriamas elektroforeziškai. Kiekvieno reakcijos mišinio su ddATP, arba ddCTP, arba ddGTP, arba ddTTP atskirai.
1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėliai buvo sužymimi. Kiekvienam buvo ruošiamas mišinys: 21 µl H2O
1 µl 0,3% DMSO
2 µl DNR (PGR produktas)
2 µl pradmuo mitochondrinei D-kilpai DNR IRD 700 5` -CTA GCT CCACCA TCA ACA CC-3´
Vėliau ant plokštelės buvo sužymimi nukleotidai A, C, G, T ir įvedama 2µl ddNTP su Taq polimeraze (25 mM dATP, 25 mM dCTP, 25 mM dGTP, 25 mM dTTP). Amplifikatoriuje padaugintas mitochondrinės DNR D-kilpos 400 bp dydžio fragmentas.Į 4 plokštelės įdubimus įvedama 6 µl ddNTP mišinio. Sekvenavimo principas yra panašus, kaip ir PGR t.y.: denatūracija 94°C 3min., 31 ciklas 94°C 45 s, anilinimo temperatūra 57°C 45 s, 70°C 45 s ir 10 min. mėginiai atvėsinami iki 4°C. Po sekvenavimo mėginiai pastatomi į šaldytuvą.
3.5.1. Poliakrilamido gelio gamyba
Dvi 47 cm stiklo plokštės buvo kruopščiai nuplaunamos su distiliuotu vandeniu ir izopropanoliu. Tarp stiklų buvo dedamos plokštelės 0,3 mm, bei uždedami rėmai. Poliakrilamido gelio tirpalas:
24 ml poliakrilamido sekvenavimo gelis (SequaGel® XR, Hessle Hull, Anglija) 6 ml buferio reagentas
350 µl DMSO (dimetilsulfoksidas) 350 µl 10 % APS (amoniopersulfatas)
10 µl TEMED (tetra-metiletilendiaminas) katalizatorius C6H16 N2
Gelis sušvirkščiamas tarp stiklų ir įstatomos šukutės. Paliekama polimerizuotis 60 min.
C A A T G T C A A A C C G T T T G T T A A A A A T G T C A A A C C A T T T G T T A A A C Tier 1 Tier2 C A A T G T C A A A C C G T T T G T T A A A A A T G T C A A A C C G T T T G T T A A A A A T G T C A A A C C A T T T G T T A A A C Tier 1 Tier2
3.6. Sekvenavimo duomenų matematiniai skaičiavimai
Dauguma sekų buvo lyginamos CLUSTAL X 1.8 (Thompson ir kt. 1997) programos pagalba. Programa ProSeq v2.9 beta (Filatov, 2001) buvo panaudota genetinės įvairovės įvertinimui, paskaičiuotas haplotipų skaičius. Haplotipų įvairovė kiekvienai veislei atskirai paskaičiuota naudojant ARLEQUIN V 2.0 (Schneider ir kt., 2000) programą žemaitukų mtDNR sekų ir kitų naminių arklių veislių artumas pateiktas kaimyninės – jungties medyje (Saitou ir Nei, 1987), kuris buvo sukonstruotas pagal Jukes-Cantor atstumus, apskaičiuotus kaip nurodyta MEGA programoje (Kumar ir kt. 1993). Porinio nukleotidų neatitikimo pasiskirstymo analizė atlikta DnaSP v. 3.53 (Rozas ir Rozas, 1999) programą. Grafiniam atvaizdavimui, teorinė staigaus išplitimo modelio kreivė (Schneider ir Excoffier, 1999) apskaičiuota kaip nurodyta ARLEQUIN v. 2.0 (Schneider ir kt., 2000) programoje.
4 paveikslas. Sekvenavimo gelis
4. REZULTATAI
Mitochondrinės DNR tyrimams pasirinktos veislės buvo istoriškai artimos žemaitukų veislei. Viso buvo pasirinkti 59 arkliai priklausantys 20 laukinių ir prijaukintų arklių veislėms. Mitochondrinės DNR kontrolinės srities 243 bp fragmento seka nustatyta 10-čiai žemaitukų veislės arklių. Žemaitukų arklių mtDNR D-kilpos sekose buvo identifikuoti 6 haplotipai (2 lentelė), kurių susidarymą nulėmė 19 polimorfinių nukleotidų sekos pozicijų. Dešimties žemaitukų veislės individų lygmenyje 1 hplotipas aptiktas keturiuose žemaičiuose, dar vienas haplotipas dvejuose individuose, keturi individai turėjo skirtingus haplotipus. Vidutinė haplotipų įvairovės vertė buvo 0,844, vidutinė nukleotidų įvairovės vertė žemaitukų veislėje buvo 0,024. Pasak Macijauskienės (2002) žemaitukų veislėje yra išlikusios penkios kumelių šeimos. Individai iš vienos motininės linijos turi turėti po vieną mtDNR haplotipą. Mūsų tirtų 2-jų tos pačios motininės kilmės (šeimos) individų tarpe aptikti du haplotipai. MtDNR kontrolinė sritis greitai mutuoja, tad per kelias kartas toje pačioje linijoje gali atsirasti polimorfinių sekų šioje srityje. Toks reiškinys vadinamas mtDNR heteroplazmija. Aberle ir kt. (2003) rado Prževalskio arklio keturis haplotipus, kai tuo tarpu Oakenfull ir Ryder (1998) ir Jansen ir kt. 2002 buvo radę tik du. Aberle ir kt. (2003) teigia, kad tai galėjo būti pasekmė ankstesnėse kartose įvykusios fiksuotos heteroplazmijos.
2 lentelė. Žemaitukų haplotipai.
111111111122 12444011244556713 1364149401426676303 h refseka TAAACATGTGTTTAATACG ZEM2 1 ...C..A.C..G.G.A ZEM4 2 ...C....CC.G.GT. ZEM5 3 ..GG.GC....CC.G.GT. ZEM6 2 ...C....CC.G.GT. ZEM7 4 ... ZEM9 4 ... ZEM10 4 ... ZEM11 5 CG..T.CAC..C.G..GT. ZEM12 6 ...CA..CC...CGT. ZEM14 4 ...
Vidupopuliacinės struktūros analizei atlikti buvo sudarytas 10 žemaitukų mtDNR sekų kaimyninės jungties medis (6 pav.). Šio medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo bootstrap vertes. Kaimyninės jungties medyje individai susiskirstė į tris genetines grupes, kurioms būdingas vidinis polimorfizmas. Dviejų individų ŽEM12 ir ŽEM11 haplotipai grupavosi atskirai nuo likusių. Tai parodo aukšta alelių persiskirstymo vertė 86 %. Toks atsiskyrimas įvyko dėl pakankamai skirtingo haplotipo lyginant su likusių žemaitukų haplotipais.
ZEM10 ZEM7 ZEM14 ZEM9 ZEM2 ZEM6 ZEM4 ZEM5 ZEM11 ZEM12 39 78 86 48 97 0.005
6 paveikslas. 10 žemaičių mtDNR sekų kaimyninės jungties medis
Vidupopuliacinės struktūros duomenų papildymui buvo sudarytas žemaitukų haplotipų tinklinis grafikas (7 pav.). Jame apskritimų dydis nusakė haplotipų dažnį 10 individų tarpe. Grafike skaičiai ant linijų nurodo nukleotido vietą, kurioje įvyko mutacija. mv1 mv2 ir mv3- taškai parodo tarpinius haplotipus, kurių žemaitukuose neaptikta, bet kurie turėjo egzistuoti, kad įvyktų toks perėjimas iš vieno haplotipo į kitą.
Porinio nukleotidų kitimo pasiskirstymo analizei žemaitukų veislėje (8 pav.) buvo imamos visos turimos žemaitukų sekos ir skaičiuojama keliomis polimorfinėmis sekomis jos tarpusavyje skiriasi. Palyginimai parodė, kad kai kurios sekos skyrėsi 1 nukleotidu, kai daugelis turėjo nuo 4 iki 13 skirtumų. Gauti duomenys buvo naudojami grafiko braižymui, kur y ašyje yra nurodytas dažnis - kaip dažnai 4 ar 5 ar t.t. skirtumai buvo aptikti. Grafike yra 2 papildomos kreivės. Viena jų yra teorinė pastovaus populiacijos dydžio modelio kreivė, kita teorinė staigaus išplitimo modelio kreivė. Staigų praeityje įvykusi populiacijos išplitimą parodo varpo formos kreivė, o jei populiacija neaugo, tada grafike kreivė būna nuolaidi, šiame grafike pažymėta punktyrine linija. Turėdami abi kreives lyginome, kurią iš jų atitinka mūsų žemaitukų nukleotidų kitimo dažnių pasiskirstymas. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Freq. Obs. constant expansion
8 paveikslas. Porinio nukleotidų kitimo pasiskirstymo analizė žemaitukų veislėje.
Įvairių šalių mokslininkai tyrinėja senųjų vietinių arklių veislių kilmę ir lygina su kitomis prijaukintų ir laukinių arklių veislėmis. Jansen ir kt. (2002 m.) suskirstę 25 Azijos ir Europos arklių veisles, įskaitant ir Amerikos mustangus tyrinėjo mtDNR, sukonstravę kaimyninės-jungties medį, iš viso panaudojo 652 sekas, 93 skirtingų haplotipų susigrupavo į skirtingas 17 filogenetines šakas. MtDNR sekos 65 Cheju arklių gyvenančių Korėjos saloje parodė apie 6 % polimorfizmą ir 17 skirtingų haplotipų (Yang ir kt., 2002). Tyrimai atlikti su 104 Ispanijos ir Šiaurės Amerikos arklių sekomis parodė 61 polimorfinių nukleotidų sekų pozicijas, tai sudarė 16 % visų sekų (Mirol ir kt., 2002). Hill ir kt. (2002) grynakraujų arklių 385 bp mtDNR D-kilpos sekose rado 39 polimorfines vietas ir nustatė 19 haplotipų, devyniolikoje kumelių šeimų. Aberle ir kt. (2003) tyrinėjusi 65 arklius iš kurių 27 arkliai priklausė devynioms skirtingoms sunkiųjų arklių veislėms. MtDNR D-kilpos 610 bp sekose rado 70 porimorfinių vietų ir nustatė 47 haplotipus, iš jų buvo 24 haplotipai sunkiųjų arklių veislių, kurie parodė labai aukštą kintamumą. Senųjų Europos kultūrinių arklių Lipicanų veislėje mtDNR kontrolinėje (385 ir 695 bp) srityje buvo rasti 37 haplotipai (Kavar ir kt., 2002).
35 radiniai giminiški Vidurio Švedijos (Birkos) bei Gotlando radiniams. Tai patvirtina, kad Skandinavijos arklių genetinė medžiaga turėjo įtakos žemaitukams.
Kaimyninės-jungties medžio C3 grupėje Šetlendo, Fell, Islandijos poniai, Norikai, anglų grynakraujai, Tsushima, Cheju, Mongolijos laukiniai arkliai, žemaitukai. C4 grupėje susigrupavo Prževalskio arkliai, norvegų Fiordai, Soraja, Cheju, Frederiksborgai (danų), Lipicanai, Šetlendo poniai ir keturi žemaičių halpotipai.
Pasak Bjornstad ir kt. (2003) centrines Azijos gyventojai turėjo ne tik gyvulių maistui ir susisiekimui, bet ir tiekė genetinę medžiagą rytų Europos gyventojams, tokiu būdu rytietiški arklių genai galėjo paplisti tarp šiaurės Europos arklių. Bjornstad ir kt. (2001) lygino vietinių Mongolijos arklių mikrosatelitų duomenis ir pastebėjo glaudžius ryšius tarp vietinio Mongolijos arklio ir šiaurės Europos arklių veislių. Pastebimai didesni genetiniai skirtumai buvo nustatyti tarp šiaurės Europos arklių veislių ir standartinių arklių veislių, kurias atstovauja arkliai iš pietų. Taigi, rytų arklių genetinė medžiaga turėjo įtakos šiaurės ir rytų Europos arkliams.
5. IŠVADOS
1. Žemaitukų arklių penkiose kumelių šeimose rasti šeši skirtingi haplotipai.
2. Filogenetinė analizė atspindi žemaitukų veislėje esantį įvairovės buvimą mitochondrinėje motininėje linijoje ir tai įrodo šios veislės unikalumą.
3. Žemaitukų arklių veislei yra giminingos senojo haplotipo ir senųjų Šiaurės Europos bei Azijos arklių veislės.
4. Kaimyninės jungties medis suteikia informacijos apie veislių evoliuciją, genų migraciją tarp skirtingų populiacijų ir genetinius skirtumus tarp veislių, tai svarbu formuojant gyvūnų įvairovės išsaugojimo prioritetus.
PRAKTINIS PRITAIKYMAS
37
6. PADĖKA
Labai nuoširdžiai dėkoju savo magistrinio darbo vadovei dr. J. Kūčinskinei už pagalbą rašant darbą, už kritiką, už padėjimą surenkant žemaitukų arklių mėginius, už pagalbą
apdorojant duomenis.
Dėkoju, Vokietijos Hanoverio veterinarijos aukštosios mokyklos, Gyvūnų ir veisimo genetikos instituto prof. dr. C. Drögemüller ir prof. habil. dr. dr. O. Distil už šiltą priėmimą ir suteiktą galimybę atlikti praktiką laboratorijoje. Doktorantei K. Aberle už pagalbą įsisavinant sekvenavimo metodą ir įvertinant sekvenuotas sekas.
Esu dėkinga Lietuvos veterinarijos akademijos, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedros, K. Janušausko Gyvūnų genetikos laboratorijos kolektyvui ir jos vedėjai doc. N. Miceikienei.
7.
SUMMARY
Kristina Draudvilaitė
ŽEMAITUKAI MITOCHONDRIAL DNA CONTROL REGION IDENTIFY AND GENETIC RELATIOSHIPS BETWEEN SOME OTHER BREEDS
Advisor. dr. Jūratė Kučinskienė
Department of Animal Breeding and Genetics. K. Janušauskas laboratory of Animal Genetics, Lithuanian Veterinary Academy 2003-2005 and 2003 10 01-2003 12 19 Institute of Animal Breeding and Genetics, School of veterinary medicine Hannover, Germany.
Master’s work have a 43 leaves, 1 diagram, 8 picture and 2 table.
The objective - To identify Zemaitukai mtDNA D-loop region and genetic relationships
between Zemaitukai and some other breeds based on mtDNA sequence variation.
Methods - To perform a phylogenetic analysis of 10 Zemaitukai, mtDNA D-loop 49 horses in
the 20 different horse breeds sequence were included from GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). DNA was extracted from hair roots using the DNEasy® Tissue Kit (Qiagen). 1,280 bp fragment of mtDNA D-loop were amplify out in
PTC-100™ termocycler. Amplified products were sequenced on a LI-COR® 4200S-2 automated sequencer. Sequencher v 4.1.4. software package was used to generate the actual DNA sequence for each of the animals. Multiple alignments of sequences were performed with CLUSTAL X 1.8 (Thompson et al., 1997). The Neighbor-joining tree (Saitou and Nei, 1987) of mtDNA sequences was constructed from Jukes-Cantor distances, performed on the pairwise deletion using the MEGA software (Kumar et al., 1993).
Results –Within Zemaitukai breed 19 polymorphic sites were detected and 6 haplotypes. At
39
8. NAUDOTŲ LEIDINIŲ SĄRAŠAS
1. Aberle K., Untersuchung der Verwandschaftverhaltnisse, Inzucht und genetischen Distanzen bei den deutschen Kaltblutpferdenrassen. Disertation.Hannover. 2003. P. 139-144.
2. Aquadro C., Greenberg B. D. Human mitochondrial DNA variation and evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics 103. 1983. P. 287-312.
3. Basche A. Geschichte des Pferdes. Künzelsau: Sigloch. 1999. P. 447.
4. Benirschke K., Malouf N., Low R. J., Heck H. Chromosome complement: differences between Equus caballus and equus przewalski, Poliakoff. Science 148. 1965. P. 382-383.
5. Benirschke K., Malouf N., Low R.J., Heck H. Chromosome complement:differences between Equus caballus and Equus przewalski, Poliakoff. Science 148. 1965. P.382-383.
6. Binns M., Swineburne J., Breen M. Molecular Genetics of the Horse. Walingford. UK: CABI Publishing. 1999. P. 109-118.
7. Bjornstad G., Gunby E., Roed K. H. Genetic structure of Norwegian horse breeds. / Journal of Animal Breeding and Genetics 117. 2001. P. 307-317.
8. Bjornstad G., Nilsen O., Roed K.H. Genetic relationship between Mongolian and Norwegian horses. Animal Genetics 34. 2003. P. 55-58.
9. Bökönyi S. History of horse domestication. / Animal Genetic Resources Information 6. 1987. P. 27-32.
10. Bouman I. The history of Przewalski’s Horse. In Przewalsi’s Horse – The history and biology of an endangered species, ed. Boyd L. & Houpt K.A., Albany, NY, USA: State University of New York Press. 1994. P. 5-38
11. Bower B. Ancient figurine lifts horses’ profile. Science News 143. 1993. P.22.
12. Bowling A.T., Del Valle A., Bowling M. A pedigree-based study of mitochondrial D-loop DNA sequence variation among Arabian horses. Animal Genetics 31. 200. P.1-7. 13. Clutton-Brock J. A Natural History of Domesticated Mammals.
Cambridge:Cambridge University Press. 1999. P. 12-16.
14. Desagher, S. and Martinou, J.-C. Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends in Cell Biology 10. 2000. P. 369-377.
15. Dmitriez N.G., Ernst L.K. Animal Genetic Resources of the USSR. Animal Production and Health Paper Publ: FAO, Rome. 1989. P. 517.
17. Filatov D.A. 2001. Processor of sequences manual. University of Birmingham, England. (Available at: http://www.biosciences.bham.ac.uk/labs/filatov/proseq.html) 18. Garbačiauskaitė - Macijauskienė V. Žemaitukai: istorija, tyrimai, išsaugojimas.
Kaunas: Aušra, 2002.
19. Gimbutienė M. Baltai priešistorinis laikais. Vilnius: Mokslas, 1985. P.190.
20. Gleß J.E.F.K. Kleinpferde. VEB.Deutschen Landwirtschaftvertrag, Berlin. 1989. P. 208.
21. Groves C.P. Morphology, Habitat, and Taxonomy. In Przewalski’s Horse – TheHistory and Biology of an Endangered Species. USA: State University of New York Press. 24 Horse Population Diversity. 1994. P.39-60.
22. Grünbauer M. Molekulare Untersuchungen zur Domestikationsgeschichte der Equiden im Vorderen Orient. / Forschungsprojekt. Universität Tübingen. Stand: 02.2002.
23. Hendricks B.L. International Encyclopedia of Horse Breeds. Univ of Oklahoma Press. 1995. P. 12-15.
24. Hermsen J. Arkliai:enciklopedinis žinynas.Vilnius: Aktėja, 2002. P. 150.
25. Hill E.W., Bradley D.G., Al-Barody M., Ertugrul O., Splan R.K., Zakharov I., Cunningham E.P. History and integrity of thoroughbred dam lines revealed in equine mtDNA variation. Animal Genetics 33. 2002. P. 287-294.
26. Holder M., Lewis P. Phylogeny estimation: Traditional and Bayesian approaches. Nature Reviews 4. 2003. P. 275-284.
27. Yang Y.H, Kim K.I., Cothran E.G., Flannery A.R. Genetic Diversityof Cheju Horses (Equus caballus) Determined by Using Mitochondrial DNA D-loop Polymorphism.Biochemical Genetics 40 (5/6). 2002. P.175-186.
28. Ishida A, N., Oyunsuren T., Mashima S., Mukoyama H., Saitou N.Mitochondrial DNA Sequences of Various Species of the Genus Equus with Special Reference to the Phylogenetic Relationship Between Przewlakii’s Wild Horse and Domestic Horse. Journal of Molecular Evolution 41. 1995. P.180-188.
29. Ishida N., Hasegawa T., Oyunsuren T., Mukoyama H. PCR-RFLP analysis of the cytochrome b gene in horse mitochondrial DNA. Animal Genetics 27. 1996. P. 359-363.
41 31. Ishida N., Hirano T., Mukoyama H. Detection of aberrant alleles in the D-loop region
of equine mitochondrial DNA by single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Animal Genetics 25. 1994. P. 287.
32. Jansen P., Forster M., Lvine H., Oelke M., Hurles C., Renfrew J., Weber K., Olek. Mitochondrial DNA and the Origins of the Domestic Horse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (16). 2002. P.10905-10910.
33. Juras R., Cothran E.G., Klimas R. Genetic analsis of three Lithuanian native horse breeds. Animal Science, 53. 2003. p. 180-185.
34. Kavar T., Brem G., Habe F., Solkner J., Dovc P. History of Lipizzan horse maternal lines as revealed by mtDNA analysis. Genetics Selection Evolution 34. 2002. P.635-648.
35. Kavar T., Habe F., Brem G., Dovc P. Mitochondrial D-loop sequence variation among the 16 maternal lines of the Lipizzan horse breed. Animal Genetics 30. 1999. P.423-430.
36. Kidd J. Kidd’s Enzyklopadie des Pferdes. Berlin, Hamburg: Parley, 1982. P. 12-32. 37. Kim K.-I., Yang Y.-H., Lee S.-S., Park C., Ma R., Bouzat J.L., Lewin H.A.
Phylogenetic relationships of Cheju horses to other horse breeds as determined by mtDNA D-loop sequence polymorphism. Animal Genetics 30. 1999. P.102-108. 38. Kučinskas V. Tu ir tavo genai. Kaunas: Šviesa, 1998. P. 35.
39. Kumar S., Kumar K. and Nei M. MEGA, Version 1.1. The Pennsylvania State University, University Park, PA. 1993.
40. Lister A.M., Kadwell M., Kaagan L.M., Jordan W.C., Richards, M.B., Stanley H.F. Ancient and modern DNA in a study of horse domestication. AncientBiomolecules 2. 1998. P. 267-280.
41. Luis C., Bastos-Silveira C., Cothran E.G., Oom M.M. Variation in the mitochondrial control region sequence between the two maternal lines of the Sorraia horse breed. Genetics and Molecular Biology 25(3). 2002. P.309-311.
42. Macijauskienė V., Šveistienė R. Žemaitukų ir stambiųjų žemaitukų arklių eksterjero bei augimo spartos palyginimas. Veterinarija ir zootechnika. T. 19(41). 2002.
43. Marklund S., Chaudhary R., Marklund L., Sandberg K., Andersson L. Extensive mtDNA diversity in horses revealed by PCR-SSCP analysis. Animal Genetics 26. 1995. P. 193-196.
44. Miceikienė I., Paulauskas A., Grigaliūnaitė I., Malevičiūtė J., Tubelytė- Kirdienė V. DNR polimorfizmo tyrimo metodai. /Genetikos praktikumas. Kaunas. 2002. P. 25-35. 45. Nakaitė L. Žalvarinių senolių laiškai. Vilius:Vyturys, 1991. P. 130.
47. Oakenfull E.A., Ryder O.A. Mitochondrial control region and 12 S rRNA variation in Przewalski’s horse (Equus przewalskii). Animal Genetics 29. 1998. P. 456-459.
48. Oom M.M., Cothran E.G. The genetic variation of an endangered breed: the Sorraia horse. Animal Genetics 27(Suppl. 2).1994. P.35.
49. Ryder O.A. Przewalski’s horse: prospects for reintroduction into the wild. Conservation Biology 7(1). 1993. P.13-15.
50. Rozas J. and Rozas R. DnaSP version 3: an integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis. Bioinformatics 15.1999. P. 174-175.
51. Saitou N. and Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. 4: 1987. P. 406-425.
52. Schneider S. and Excofier L.. Estimation of past demographic parameters from the distribution of pairwise differences when the mutation rates vary among sites: application to human mitochondrial DNA. Genetics. 152. 1999. P. 1079-1089.
53. Schneider S., Roesseli D. and Excofier L. ARLEQUIN Ver 2.0: A Software for Population Genetics Data Analysis. University of Geneva, Geneva, Switzerland. 2000. 54. Šveistienė R. Lietuvos vietinių arklių populiacijos ir veisimo ypatumai. Lietuvos
gyvulininkystės institutas. Baisogala. 2002.
55. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. and Higgins D.C. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25. 1997. P. 4876-4882.
56. Vila C., Leonard J.A., Gotherstrom A., Marklud S., Sandberg G. K., Liden K., Wayne R.K., Ellegen H. Widespread Origins of Domestic Horse Lineages. Science 291. 2001. P. 474-477.
57. Wang W., Liu A., Lin S., Lan H., Su B., Xie D., Shi L. Multiple Genotypes of Mitochondrial DNA Within a Horse Population from a Small Region in Yunnan Province of China. Biochemical Genetics 32. 1994. P. 371-378.
43
9. PRIEDAI
1 lentelė. Užsienio autorių atliktų įvairių arklių veislių mtDNR fragmentų apžvalga
Autorius
PopuliacijamtDNR D- kilpos
fragmento ilgis
Hill ir kt. (2002) Grynakraujai, Tuvalu, Anatolijos, Cukorova,Egipto, Šetlendo; Mongolijos, Cheju, Tsushima, Yunano, Belgijos arkliai ir Lipicanai iš genų banko.
381 bp grynakraujai 343 bp kitos veislės; 306 bp (SSCP, tik grynakraujai)
Luís ir kt. (2002) Soraja, Švedijos arkliai 360 bp Yang ir kt. (2002) Cheju, Mongolijos, arabų,
Belgijos, Tsushima, Yunano, Prževalskio arkliai, grynakraujai
968 bp
Kavar ir kt. (2002) Lipicanai, 136 sekos iš genų banko; Xu ir
Arnason (1994) MtDNR D-kilpos pradžios (385 bp) ir pabaigos (310 bp) dalys
Jansen ir kt. (2002) 25 veislės, visi duomenys iš genų banko 246 bp Mirol ir kt. (2002) Argentiniečių Kreolo arklys, Peru, Paso,
Arabų, Lozinos, Potoka, Andalūzų arkliai
Apie 460 bp (SSCP), 381 bp (sekvenuota)
Vilà ir kt. (2001) Genų banko ir 10 kitų veislių;arkliu iškasenos rastos Aliaskoje, arklių liekanos rastos pietų Švedijoje ir Estijoje.
616 bp iš genų banko paimti šiuolaikinės arkliai; 355 bp iš šiuolaikinių arklių ir iškasenų.
Bowling ir kt.,
(2000) Arabai, Švedijos arkliai, asilai 397 bp Kim ir kt., (1999) Cheju, Mongolijos, Yunanai, Prževalskio
arkliai, Švedų arkliai, asilai, Ishida ir kt. (1994), Xu ir Arnason (1994)
1102 bp
Kavar ir kt. (1999) Lipicanai 444 bp (SSCP); mt DNR D-
kilpos srities abiejų galų sekvenavimas
(378 bp ir 310 bp) Oakenfull ir Ryder
(1998)
Prževalskio arkliai, Ishida ir kt.. (1994), Xu ir Arnason (1994), asilas, raganosis
998 bp (kontroliuojama sritis), 388 bp (12SrRNA) Lister ir kt.. (1998) 14 veilsių, Prževalskio arklys Apie 590 bp
Ishida ir kt. (1996) Grynakraujai, Hokaido, Kiso, Misaki,
Korėjos, Mongolijos vietiniai arkliai 590 bp (PCR-RFIP) Marklund ir kt.
(1995) Grynakraujai, negrynakraujai švedų, Šiaurės Švedijos ristūnai, Islandijos arkliai Apie 440bp (PCR-SSCP) Ishida ir kt. (1995) E. zebra, E. grevyi, E. asinus, E. caballus
(prijaukinti arkliai, Prževalskio arklys, Mongolų laukinis arklys)
270 bp
Wang ir kt. (1994) Kinijos Yunano provincijos arkliai 56 fragmentais iš vidutiniškai 6 bp ilgio (RFIP)
Ishida ir kt. (1994a) Grynakraujai 1,114; 1,115; 1,146 bp; 232 bp (RFIP)
