Indice Generale

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III

Indice Generale

INDICE GENERALE

SOMMARIO ... I INDICE GENERALE ... III INDICE DELLE FIGURE ... VII INDICE DELLE TABELLE ... XII

INTRODUZIONE ... 1

CAPITOLO 1: Generalità botaniche ... 2

1.1 La famiglia delle Rubiaceae ... 3

1.2 Il genere Arcytophyllum ... 5

1.2.1 Usi tradizionali e medicinali del genere Arcytophyllum ... 7

1.3 La specie Arcytophyllum thymifolium ... 9

1.3.1 Inquadramento tassonomico ... 9

1.3.2 Descrizione botanica ... 10

1.3.3 Diffusione ed habitat ... 11

1.3.4 Usi tradizionali ... 11

CAPITOLO 2: Fitochimica ... 12

2.1 Precedenti studi fitochimici sul genere Arcytophyllum ... 13

2.1.1 Terpenoidi ... 13

2.1.1.1 Iridoidi ... 13

2.1.1.2 Triterpeni e steroli ... 14

2.1.2 Composti fenolici ... 17

2.1.2.1 Flavonoidi ... 17

2.2 Precedenti studi biologici sul genere Arcytophyllum ... 19

2.3 Precedenti studi sulla specie Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 20

CAPITOLO 3: Risultati e discussione ... 21

3.1 Isolamento ed identificazione dei composti ... 22

3.2 Frazionamento dell’estratto cloroformico (RC) ... 24

3.3 Frazionamento dell’estratto metanolico (RM) ... 25

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IV Indice Generale 3.4.1 Composto 11... 26 3.4.2 Composto 12... 28 3.4.3 Composto 13... 29 3.4.4 Composto 14... 31 3.4.5 Composto 15... 33 3.4.6 Composto 17... 34

3.4.7 Composto 18: nuovo iridoide naturale ... 36

3.4.8 Composto 19... 41 3.5 Cumarine ... 42 3.5.1 Composto 1 ... 43 3.5.2 Composto 2 ... 44 3.5.3 Composto 5 ... 46 3.5.4 Composto 6 ... 47 3.5.5 Composto 8 ... 48

3.5.6 Composto 9: nuova cumarina naturale ... 49

3.6 Flavonoidi ... 56

3.6.1 Composto 3 ... 56

3.6.2 Composto 7: nuovo flavonoide naturale ... 58

3.6.3 Composto 23... 62

3.6.4 Composto 25... 64

3.6.5 Composto 26... 66

3.6.6 Composto 27... 68

3.6.7 Composto 28... 69

3.7 Derivati dell’acido caffeico ... 71

3.7.1 Composto 21... 71

3.7.2 Composto 24... 72

3.8 Acetofenoni ... 73

3.8.1 Composto 4 ... 73

(3)

V

Indice Generale

CAPITOLO 4: Parte sperimentale ... 76

4.1 Materiale vegetale ... 77

4.2 Estrazione ... 77

4.2.1 Estrazione e precipitazione per la ricerca di alcaloidi ... 78

4.3 Studio dell’estratto cloroformico (RC) ... 80

4.3.1 Analisi della frazione RC/7... 83

4.3.1.1 Analisi della frazione RC/7/10-11 ... 84

4.3.4.1 HPCPC della frazione RC/13 ... 90

4.4 Studio dell’estratto metanolico (RM) ... 95

4.4.1 Analisi della frazione RM/4 ... 97

4.5 Attività biologica: inibizione enzima lattato deidrogenasi (LDH) ... 111

CAPITOLO 5: Materiali e metodi ... 113

5.1 Metodi cromatografici ... 114

5.1.1 Cromatografia su strato sottile ... 114

5.1.2 Cromatografia su colonna ... 114

5.1.2.1 Cromatografia ad esclusione molecolare ... 114

5.1.2.2 Cromatografia flash con strumentazione Biotage®_{Isolera™ Spektra ... 115}

5.1.3 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ... 116

(4)

VI

Indice Generale

5.2 Metodi chimico-fisici ... 118

5.2.1 Potere ottico rotatorio ... 118

5.2.2 Spettri UV ... 119

5.2.3 Spettri di massa ... 119

5.2.4 Spettri di risonanza magnetica nucleare ... 120

5.3 Metodi biologici ... 121

5.3.1 Inibizione dell’enzima lattato deidrogenasi ... 121

CONCLUSIONI ... 123

BIBLIOGRAFIA ... 125

(5)

VII

Indice delle Figure

INDICE DELLE FIGURE

Fig. 1.1 Distribuzione Rubiaceae ... 3

Fig. 1.2 Pseudoverticilli in Galium album Mill. ... 5

Fig. 1.3 Coffea arabica L. ... 5

Fig. 1.4 Distribuzione del genere Arcytophyllum ... 5

Fig. 1.5 Aggregati simili a “tappeti” nel genere Arcytophyllum ... 6

Fig. 1.6 Arcytophyllum vernicosum Standl. ... 6

Fig. 1.7 Páramo in Ecuador ... 7

Fig. 1.8 Arcytophyllum lavarum K.Schum. ... 7

Fig. 1.9 Arcytophyllum nitidum (Kunth) Schltdl. ... 8

Fig. 1.10 Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 10

Fig. 1.11 Infiorescenza di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 11

Fig. 1.12 Distribuzione geografica di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 11

Fig. 2.1 Unità isoprenica e isoprene ... 13

Fig.2.2 Iridano e iridoide ... 14

Fig.2.3 Asperuloside ... 14

Fig. 2.4 Steroli con nucleo base dell’ergosterolo in Arcytophyllum nitidum (Kunth) Schltdl. ... 15

Fig. 2.5 Steroli con nucleo base del colesterolo in Arcytophyllum nitidum (Kunth) Schltdl. ... 15

Fig. 2.6 Steroli con nucleo base dello stigmasterolo in Arcytophyllum nitidum (Kunth) Schltdl. ... 16

Fig. 2.7 β-amirina (11) e acido 3β, 6β-diidrossi-olean-12-en-28 oico (12) ... 16

Fig. 2.8 α-amirina (13) ... 17

(6)

VIII

Indice delle Figure

Fig. 2.10 Scheletro del γ-benzopirone ... 17

Fig. 2.11 Rutina (15) ... 18

Fig. 2.12 Naringenina (16) ... 18

Fig. 2.13 Quercetina-3-O-glucoside (17) ... 18

Fig. 3.1 Schema di frazionamento dell’estratto cloroformico RC ... 24

Fig. 3.2 Schema di frazionamento dell’estratto metanolico RM ... 25

Fig. 3.3 Struttura composto 11: acido asperulosidico ... 26

Fig. 3.4 Struttura composto 12: estere metilico dell’acido deacetil asperulosidico o deacetil daphylloside ... 28

Fig. 3.5 Struttura composto 13: estere metilico dell’acido asperulosidico o daphylloside ... 30

Fig. 3.6 Struttura composto 14: scandoside ... 32

Fig. 3.7 Struttura composto 15: asperuloside ... 33

Fig. 3.8 Struttura composto 17: estere metilico del 10-O-p-idrossibenzoil scandoside ... 35

Fig. 3.9 Struttura composto 18: estere metilico dell’acido 10-O-p-idrossibenzoil deacetilasperulosidico ... 37

Fig. 3.10 Spettro HRESIMS in modalità negativa del composto 18 ... 37

Fig. 3.11 Spettro 1_{H-NMR del composto 18 ... 38}

Fig. 3.12 Spettro HSQC del composto 18 ... 39

Fig. 3.13 Spettro 1D-TOCSY dell’aglicone del composto 18 ... 39

Fig. 3.14 Spettro 1D-TOCSY del glucoside del composto 18 ... 40

Fig. 3.15 Struttura composto 19: deacetil asperuloside ... 41

Fig.3.16 Struttura composto 19: hedyotiscone A ... 43

Fig. 3.17 Struttura composto 2: hedyotiscone B ... 45

Fig.3.18 Struttura composto 5: cneorum-cumarina B ... 46

Fig. 3.19 Struttura composto 6: toddanina ... 47

Fig. 3.20 Struttura composto 8: fraxetina ... 49

(7)

IX

Indice delle Figure

Fig. 3.22 Spettro HRESIMS in modalità positiva del composto 9 ... 50

Fig. 3.25 Spettro HMBC del composto 9 ... 52

Fig. 3.26 Struttura composto 10: 7-idrossi-8-[2’,3’-diidrossiisopentil]-6-metossicumarina .... 53

Fig. 3.27 Struttura composto 22: 6-demetil-4'-idrossi-2'-diidrotoddanina o 2',4'-diidrossinorbrailina ... 55

Fig. 3.28 Struttura composto 3: O-(3''-metilbut-2''-enil)-ossi naringenina o 7-prenilossinaringenina ... 57

Fig. 3.29 Struttura composto 7: 7-O-(3''-metillbut-2''-enil)-ossi eriodictiolo o 7 prenilossieriodictiolo ... 58

Fig. 3.30 Spettro HRESIMS in modalità positiva del composto 7 ... 59

Fig. 3.33 Spettro HMBC del composto 7 ... 61

Fig. 3.34 Struttura composto 23: kaempferolo 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D galattopiranoside ... 63

Fig. 3.35 Struttura composto 25: quercetina 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D galattopiranoside ... 65

Fig. 3.36 Struttura composto 26: quercetina 3-O-β-D-galattopiranoside ... 67

Fig. 3.37 Struttura composto 27: quercetina 7-O-metiletere o ramnetina ... 68

Fig. 3.38 Struttura composto 28: quercetina ... 70

Fig. 3.39 Struttura composto 21: acido 3-caffeoilchinico metilestere o estere metilico dell’acido neoclorogenico ... 71

Fig. 3.40 Struttura composto 24: acido 5-caffeoilchinico o acido clorogenico ... 72

Fig. 3.41 Struttura composto 4: p-idrossiacetofenone ... 73

Fig. 4.1 Diagramma della procedura di estrazione di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 77

(8)

X

Indice delle Figure

Fig. 4.2 Risultati delle estrazioni delle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.)

Standl. ... 78

Fig. 4.3 Procedimento per la separazione degli alcaloidi dalle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ... 79

Fig. 4.4 Schema di riunione dell'estratto RC dopo cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra ... 82

Fig. 4.5 Schema di riunione dell'estratto RC/7 dopo cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra ... 84

Fig. 4.6 HPLC della frazione RC/7/10-11 ... 85

Fig. 4.7 HPLC della frazione RC/9 ... 87

Fig. 4.10 HPCPC della frazione RC/13 ... 91

Fig. 4.13 Schema di riunione dell’estratto RM dopo cromatografia ad esclusione molecolare su Sephadex LH-20 in MeOH ... 96

Fig. 4.14 HPLC della frazione RM/4 ... 98

Fig. 5.1 TLC ... 114

Fig. 5.2 Colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare ... 115

(9)

XI

Indice delle Figure

Fig. 5.4 Strumentazione HPLC ... 117

Fig. 5.5 Strumentazione HPCPC ... 118

Fig. 5.6 Polarimetro ... 118

Fig. 5.7 Spettrofotometro UV e rispettive cuvette ... 119

Fig. 5.8 Spettrometro di massa... 119

Fig. 5.9 Strumentazione NMR ... 120

Fig. 5.10 Lettore di micropiastre ... 121

(10)

XII

Indice delle Tabelle

INDICE DELLE TABELLE

Tab. 2.1 Inibizione della crescita di batteri Gram (+) ... 19 Tab. 2.2 Inibizione della crescita di batteri Gram (-) ... 19 Tab. 3.1 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

3OD) del composto 11 ... 27

Tab. 3.2 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

Tab. 3.7 Dati 1_{H-NMR (600 MHz in CD}

3OD) e 13C-NMR (150 MHz in CD3OD) del composto 18

... 40 Tab. 3.8 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

Tab.3.10 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

Tab.3.13 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD}

... 53 Tab. 3.15 Dati 1_{H-NMR (600 MHz in CD}

... 54 Tab. 3.16 Dati 1_{H-NMR (600 MHz in CD}

(11)

XIII

Indice delle Tabelle

Tab. 3.22 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in DMSO-d} 6) del composto 27 ... 69

Tab. 3.23 Dati 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (250 MHz in CD} 3OD) del composto 28 ... 70

Tab. 3.25 Dati 1_{H-NMR (250 MHz in CD} 3OD) del composto 24 ... 73

Tab. 4.1 Cromatografia flash con Biotage® Isolera™ _{Spektra di R} C ... 81

Tab. 4.2 Cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra di Rc/7 ... 83

Tab. 4.3 Attività inibitoria dei composti 1, 2, 3, 6, 8 e 15 nei confronti dell’enzima LDH ... 112