Scopo della tesi
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5.0 Scopo della tesi.
Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono cellule clonogeniche multipotenti, in grado di differenziare, sia in vitro che in vivo, verso molteplici lineages. La loro fonte principale è il midollo osseo, ma sono state ritrovate anche in molti altri tessuti sia adulti che embrionali. Inoltre le MSCs possono secernere un ampio spettro di molecole trofiche e immunoregolatorie. Queste caratteristiche, associate alla semplicità con la quale possono essere coltivate ed espanse in vitro, hanno reso le MSCs interessanti per un potenziale impiego in terapia cellulare. L’impiego clinico richiede però una conoscenza dettagliata, non ancora raggiunta, della biologia delle MSCs.
Evidenze recenti hanno mostrato come un numero ristretto di geni regoli diversi tipi di cellule staminali, agendo tramite meccanismi comuni. Tra questi stem cell genes è compreso Kit che codifica il recettore tirosina-chinasico per lo Stem Cell Factor (SCF). L’attività di Kit è stata riscontrata in diversi tipi di cellule staminali e progenitori come quelli ematopoietici, cardiaci, germinali e nei melanoblasti. Tuttavia in letteratura, il coinvolgimento di Kit nelle MSCs risulta ancora molto controverso. Studi precedentemente svolti nel nostro laboratorio hanno evidenziato una bassa espressione dell’mRNA di Kit in MSCs umane e murine indifferenziate e una sua modulazione durante i processi differenziativi, con un aumento in MSCs spinte verso un destino adipogenico. Scopo della mia tesi è stato, quindi, quello di indagare l’espressione della proteina Kit in MSCs murine (mMSCs) indifferenziate e indotte in senso adipogenico. In particolare, il mio lavoro è stato articolato in due fasi. Durante la prima fase, ho avuto come obbiettivi specifici verificare l’espressione proteica di Kit, in MSCs sia indifferenziate che durante la differenziazione adipogenica, tramite Western Blot; indagare la sua distribuzione all’interno delle colture di mMSCs a diversi stadi dell’induzione adipogenica (0d, 3d, 7d, 14d) tramite immunocitochimica. In una seconda fase ho utilizzato il topo transgenico Kit/GFP in cui parte degli elementi regolatori di Kit sono posti a monte del gene per la Green Fluorescent Protein (GFP). Studi precedenti, svolti nel nostro laboratorio, avevano mostrato la corretta espressione del transgene in alcuni dei tipi cellulari in cui è normalmente espresso Kit, facendo del topo transgenico un ottimo modello per lo studio del recettore. Obbiettivo specifico di questa seconda fase è stato indagare l’espressione del transgene tramite analisi della fluorescenza, sia al microscopio che al citofluorimetro, di colture di MSCs derivate da topi Kit/GFP, allo stato indifferenziato e a diversi stadi della differenziazione adipogenica (3d, 7d, 14d). In seguito alla verifica della corretta espressione
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del transgene anche nelle cellule staminali e precursori mesenchimali, sarà possibile, infatti, usare il topo transgenico Kit/GFP per analisi più approfondite e a tempi più ravvicinati durante tutta la differenziazione adipogenica, facilitando, quindi, lo studio dell’attività di Kit nelle MSCs.
